Summary
Dit manuscript schetst de blot-and-plunge-methode om biologische monsters handmatig te bevriezen voor cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje.
Abstract
Het in beeld brengen van biologische monsters met elektronen voor structuurbepaling met hoge resolutie door cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje (cryoEM) vereist een dunne laag glasachtig ijs met de biomoleculen van belang. Ondanks tal van technologische ontwikkelingen in de afgelopen jaren die cryoEM met één deeltje naar de voorhoede van de structurele biologie hebben gedreven, blijven de methoden waarmee monsters worden verglaasd voor beeldvorming met hoge resolutie vaak de snelheidsbeperkende stap. Hoewel tal van recente inspanningen middelen hebben geboden om hindernissen te overwinnen die vaak worden ondervonden tijdens het verglaasen van monsters, waaronder de ontwikkeling van nieuwe monstersteunen en innovatieve vitrificatie-instrumenten, blijft de traditionele handmatig bediende plunjer een hoofdbestanddeel in de cryoEM-gemeenschap vanwege de lage aanschafkosten en het bedieningsgemak. Hier bieden we gedetailleerde methoden voor het gebruik van een standaard, guillotine-achtig handmatig bediende blot-and-plunge-apparaat voor de vitrificatie van biologische monsters voor beeldvorming met hoge resolutie door cryoEM met één deeltje. Daarnaast worden ook veelvoorkomende problemen en aanbevelingen voor het oplossen van problemen beschreven voor wanneer een standaardpreparaat geen geschikt monster oplevert.
Introduction
Cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje (cryoEM) is een krachtige structurele techniek die kan worden gebruikt om structuren van dynamische biologische monsters op te lossen tot een bijna atomaire resolutie1,2,3,4. Inderdaad, recente ontwikkelingen in directe elektronendetectortechnologieën4,5,6,7,8,9,10, verbeteringen in elektronenbronnen4,11,12,13,14 en elektromagnetische lensstabiliteit15, gekoppeld aan de voortdurende ontwikkeling van gegevensverzameling 16,17 en analysesoftwarepakketten18,19 hebben onderzoekers in staat gesteld om nu routinematig structuren van goed opgevoede monsters te bepalen tot een resolutie van 3 Å of beter4,11,13,14,20,21,22,23 . Ondanks deze verbeterde beeldvormings- en gegevensverwerkingsmogelijkheden blijft cryoEM-rastervoorbereiding de grootste belemmering voor succesvolle structuurbepaling met hoge resolutie en dient het vaak als een aanzienlijk knelpunt in de EM-workflow24,25,26,27.
CryoEM vertrouwt op de beeldvorming van biologische monsters in waterige oplossingen die worden ingevroren om een dunne film van "glasachtig" ijs te vormen - een proces dat bekend staat als vitrificatie - dat de inheemse biochemische toestand behoudt. Vitrificatie van biologische monsters voor cryoEM dateert van meer dan 40 jaar28,29,30 en veel technieken en apparatuur die voor dit proces zijn ontwikkeld, zijn gebaseerd op de oorspronkelijk gedetailleerde blot-and-plunge-methode31,32,33,34,35 , waarbij een klein volume monster (bijv. 1-5 μL) wordt aangebracht op een gespecialiseerd EM-raster voordat de overtollige oplossing wordt verwijderd met behulp van fysieke interactie van het raster met vloeipapier. De timing van dit proces wordt meestal empirisch bepaald voor elk monster, omdat een cruciaal onderdeel van vriesmonsters de dikte van de glasvochtijsfilm is - als het ijs te dik is, verslechtert de beeldkwaliteit dramatisch als gevolg van verhoogde verstrooiing van de elektronenbundel, terwijl ijs dat te dun is, eiwitoriëntaties kan beperken en / of deeltjes uit het midden van het rasterfoliegaten kan uitsluiten36 . Deze afhankelijkheid van de perfecte ijsdikte voor cryoEM met één deeltje heeft geleid tot een breed scala aan technieken en apparatuur die monsters kunnen bevriezen, waaronder robotica37,38, microfluïdica42 en ultrasone of spuitapparatuur27,39,40,41,42,43,44 . In de afgelopen jaren vertrouwen enkele van de meest populaire monstervoorbereidingsapparaten op het gebruik van robotica voor het automatisch invriezen van monsters met behulp van de blot-and-plunge-techniek45. Hoewel deze apparaten zijn ontworpen om reproduceerbaar de juiste ijsdikte te creëren voor beeldvorming, blijven ze vaak te duur voor individuele laboratoria om te kopen en te bedienen en worden ze over het algemeen gevonden in cryoEM-faciliteiten tegen uurtarieven voor gebruik. In de afgelopen jaren is de oorspronkelijke handmatige blot-and-plunge-techniek weer in gebruik gekomen3,47,48,49,50,51,52. Inderdaad, een handmatig bediende blot-and-plunge-apparaat kan cryoEM-roosters van hoge kwaliteit bereiken tegen een fractie van de kosten van robotachtige tegenhangers. Bovendien biedt handmatige blotting ook meer controle over blotting, omdat onderzoekers het type blotting (d.w.z. back-blotting van het raster, front-blotting van het raster, enz.) en blottingtijd kunnen aanpassen op basis van elke individuele steekproef en onderzoeksvragen.
In dit artikel geven we details over hoe biologische monsters effectief kunnen worden ingevroren met behulp van een traditioneel handmatig vlek-en-dompel vitrificatie-apparaat in combinatie met een op maat ontworpen dewar-platform53. Best practices, waaronder de voorbereiding van het cryogene, rasterbehandeling, monstertoepassing en blotting, evenals veelvoorkomende valkuilen en aanbevelingen over hoe deze hindernissen kunnen worden overwonnen, worden verstrekt. Advies over het verhogen van de reproduceerbaarheid van de ijsdikte tussen rasterpreparaten en het wijzigen van monstervlekken op basis van het biologische specimentype worden besproken. Gezien de lage kosten die gepaard gaan met de aankoop en bediening van de handmatige plunjer die in dit manuscript wordt beschreven, kunnen laboratoria over de hele wereld biologische monsters op een kosteneffectieve en reproduceerbare manier voorbereiden op cryoEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereid de handmatige stortomgeving voor
OPMERKING: Geschatte bedrijfstijd: 5-30 minuten
- Plaats de handmatige zuiger in een koude ruimte van 4 °C waar een luchtbevochtiger kan worden geplaatst om de ruimte dicht bij 100% relatieve vochtigheid (RV) te houden (figuur 1A).
LET OP: Raadpleeg de richtlijnen voor milieuhygiëne en -veiligheid van de instelling voor de veilige locatie van de handmatige zuiger en de aanbevolen bewerkingen. - Schakel voorafgaand aan de roostervoorbereiding de luchtbevochtiger in de koelruimte in om ervoor te zorgen dat de RV van de koelruimte ≥ 95% is.
OPMERKING: Roostervoorbereiding bij lage luchtvochtigheid kan leiden tot uitdroging van dunne films, wijziging van buffercomponenten als gevolg van verdamping en een afname van de reproduceerbaarheid van raster naar raster46. Het wordt niet aanbevolen om roosters te bevriezen bij < 80 % RV. - Zorg ervoor dat de temperatuur van de koelcel op 4 °C staat.
- Plaats de handmatige zuiger uit de buurt van sterke luchtstromen (d.w.z. uit de buurt van ventilatieopeningen van de airconditioning) omdat deze kunnen leiden tot turbulentie in de buurt van roosters en / of prominente ijsophoping op koude oppervlakken.
2. Bereid stortmaterialen en accessoires voor
OPMERKING: Geschatte bedrijfstijd: 1-5 minuten
- Gebruik een schone schaar om vloeipapiercirkels te knippen in stroken van 1-1,5 cm breed en ~ 9 cm lang. Raak het midden van het vloeipapier niet aan en gooi de kleinere stukjes uiteinde weg. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de stroken vloeipapier droog, schoon en vrij van verontreinigingen zijn. Scheid de stroken en leg ze in een petrischaaltje van 100 mm.
- Plaats een vierkante glazen afdekplaat van 22x22 mm in een aparte glazen petrischaal van 60 mm. Deze coverslip-bevattende glazen petrischaal zal worden gebruikt voor het opslaan, overbrengen en gloeien van roosters.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een air-duster blik te gebruiken om zichtbaar vuil van de dia te verwijderen voordat u rasters toevoegt. Een antistatisch pistool kan ook worden gebruikt om statische elektriciteit die zich ophoopt te verwijderen. - Monteer en label grid opslagdozen.
- Koop 4 tot 6 schone en droge klempincetten en plaats ze op de handmatige zuiger. Inspecteer elk pincet visueel voordat u het instort om er zeker van te zijn dat ze niet worden beschadigd en vrij zijn van verontreinigingen.
3. Bereid de cryogene dewar en handmatige plunjer voor
OPMERKING: Geschatte bedrijfstijd: 5-15 minuten
- Installeer de platformbasis aan de onderkant van de dewar. Plaats het ethaanvat dewar bovenop de platformbasis, voeg het messing ethaanvat toe en installeer vervolgens het roterende rasteropslagplatform.
- Zodra vloeibare stikstof (LN2) aan de plunging dewar is toegevoegd, kan de hoogte van de platformbasis niet meer worden aangepast. Zorg ervoor dat de roosterbasis correct is geïnstalleerd en waterpas is om schade aan het rooster en /of pincet als gevolg van onjuiste plunjerhoogte te beperken.
- Controleer voor het invriezen de handmatige plunjer en alle aanvullende apparatuur om ervoor te zorgen dat ze goed functioneren om monster- en / of roosterverlies te beperken.
- Vervang vóór elke vriessessie de tape op de handmatige plunjerarm die wordt gebruikt om het pincet vast te houden. De hoge luchtvochtigheid van de kamer kan de tapelijm verslechteren en het vermogen van de tape om het pincet vast te houden verminderen, waardoor de kans op pincetschade en / of roosterverlies toeneemt.
- Stel de lamp(en) in de buurt van de handmatige zuiger af om ervoor te zorgen dat er voldoende licht is om de monsterafvoer te controleren en ervoor te zorgen dat de rasteroverdracht gemakkelijk kan worden gevisualiseerd om schade aan het rooster en/of verlies te voorkomen (zie stap 3.7). Gebruik een ringlamp direct achter de zuiger om de vloeistofbeweging te visualiseren en een flexibel armtaaklampje in de buurt van de dewar om de bevroren roosters te verlichten.
- Pas de voetpedaalspanning aan om ervoor te zorgen dat de dewar-neerklaparm stevig op zijn plaats blijft terwijl hij zich in de verhoogde positie bevindt en volledig wordt losgelaten wanneer het pedaal wordt ingedrukt. Voer verschillende "droge" runs uit voorafgaand aan het aanbrengen van het monster om ervoor te zorgen dat de zuiger goed werkt.
OPMERKING: Onjuiste aanpassing van de voetpedaalspanning zal resulteren in voortijdig loslaten van de plunging arm (d.w.z. spanning is te laag ingesteld) en roosterverlies of onvolledige plunging van het rooster in het ethaanvat (d.w.z. de spanning is te hoog ingesteld). - Plaats de plunging dewar aan de basis van de handmatige plunjer direct onder de plunging arm en zet deze op zijn plaats. Bevestig een pincet aan de plunging arm met behulp van de bijgevoegde tape. Terwijl u de handmatige plunging-arm ingedrukt houdt, drukt u het voetpedaal in om de plunging-arm voorzichtig te laten zakken en past u de verplaatsing van de plunging-arm aan om ervoor te zorgen dat het rooster zich in het midden van het ethaanvat bevindt.
- Gebruik de bumpstop aan de bovenkant van de plunging arm om de uiteindelijke positie van de plunging arm te bepalen wanneer het voetpedaal volledig is ingedrukt (figuur 1B). Pas de hoogte van de bumpstop op de stortarm aan om de locatie van het rooster in het ethaanvat aan te passen (figuur 1C).
OPMERKING: Het onjuist instellen van de hoogte van de instortarm kan leiden tot schade aan het rooster en/of het pincet (bijv. de hoogte van de instortarm is te laag ingesteld) of onvoldoende vitrificatie (bijv. de hoogte van de instortarm is te hoog ingesteld). - Lokaliseer de dewar buiten de koelcel en ga verder met het bereiden van vloeibaar ethaan (stap 4).
4. Bereid het cryogene
OPMERKING: Geschatte bedrijfstijd: 10-30 minuten
- Beoordeel de ethaantank, regelaar, slang en ethaandoseerpunt op tekenen van schade. Meld en corrigeer eventuele tekenen van schade onmiddellijk voordat u verder gaat.
LET OP: Samengeperst ethaan en ethaan:propaangasmengsels zijn ontvlambaar en kunnen een ernstige bedreiging vormen voor het leven en/of letsel veroorzaken als ze onjuist worden gehanteerd. Raadpleeg een expert als u niet zeker weet hoe u gecomprimeerde gastanks moet bedienen of hanteren. Raadpleeg de richtlijnen voor milieugezondheid en -veiligheid van de instelling bij het omgaan met brandbare gecomprimeerde gassen. Bovendien is vloeibaar ethaan een krachtig cryogeen dat een ernstige bedreiging voor het leven en / of letsel kan vormen als het niet op de juiste manier wordt behandeld. Raadpleeg de richtlijnen voor milieugezondheid en -veiligheid van de instelling bij het hanteren van cryogenen. - Verkrijg voldoende LN2 in een geschikte LN2-handling dewar (d.w.z. 3-4 L is typisch voor netvoorbereiding en -opslag).
LET OP: LN2 is een cryogeen dat een ernstige bedreiging voor het leven en/of letsel kan vormen als het niet op de juiste manier wordt behandeld.- Zorg ervoor dat alle persoonlijke beschermingsmiddelen worden gebruikt om het risico op letsel te minimaliseren. De damp van LN2 is een verstikkend middel en moet in goed geventileerde ruimtes worden gehanteerd. Raadpleeg een expert als u niet zeker weet hoe u cryogene vaten en cryogenen moet bedienen of hanteren. Raadpleeg de richtlijnen voor milieugezondheid en -veiligheid van de instelling bij het hanteren van cryogenen. Voor situaties waarin vloeibare stikstof niet kan worden gebruikt in een koude ruimte, raden we aan om in een koele en goed geventileerde ruimte te bevriezen.
- Buiten de koude kamer koelt u de instortende dewar af door LN2 rechtstreeks in het koperen ethaanvat te gieten totdat het vloeibare stikstofgehalte de bovenkant van het ethaanvat bereikt (d.w.z. net boven het platform). Vul de LN2 indien nodig buiten het ethaanvat af. Ga verder met de volgende stap wanneer de LN2 stopt met hevig borrelen (ongeveer 5 minuten).
- Voeg LN2 rechtstreeks toe aan het messing ethaanvat om het vat voldoende af te koelen voordat ethaangas wordt gecondenseerd. Het niet goed koelen van het messing ethaanvat zal de tijd die nodig is om ethaan te condenseren drastisch verlengen.
- Zodra de dewar LN2-temperatuur heeft bereikt, vermijd dan overvulling van de dewar zodanig dat LN2 in het ethaanvat terechtkomt.
- Ethaan wordt geleverd als een gecomprimeerd gas en moet vloeibaar worden gemaakt voor gebruik. De ethaantank maakt gebruik van een zeer zuivere tweetrapsregelaar om de gasstroom te regelen. Sluit de slang aan op de uitlaatklep van de regelaar en gebruik een 14-gauge vlakke metalen doseerpunt die aan het uiteinde is aangesloten voor het doseren van ethaan.
- Voordat u de ethaan hoofdtankklep opent, moet u ervoor zorgen dat de drukregelknop en de uitlaatklep helemaal gesloten zijn. Open de hoofdtankklep volledig en open vervolgens de uitlaatklep tot ~ 50%. Open langzaam de drukregelknop totdat een langzame gasstroom wordt waargenomen. Gebruik de uitlaatklep om de gasstroom te verfijnen.
LET OP: Richt de metalen doseerpunt altijd van zichzelf af bij het openen van kleppen of het aanpassen van de gasstroom. - Start langzaam de gasstroom en beoordeel de stroomsnelheid door de punt van de ethaangasleiding in een klein bekerglas van gedeïoniseerd water in te brengen. Pas de gasstroom aan totdat het debiet het water matig verstoort.
- Pas het gasdebiet aan om ervoor te zorgen dat er een goede ethaancondensatie optreedt - een te langzaam debiet zorgt ervoor dat het ethaangas stolt in de doseertip en een te snel debiet resulteert in intens borrelen en voorkomt bevriezing.
- Voordat u de punt van de ethaangasleiding in het messing ethaanvat steekt, reinigt en veegt u de doseerpunt schoon met delicate taakdoekjes om water te verwijderen.
- Zoek in een soepele en snelle beweging de gasdoseerpunt op de bodem van het messing ethaanvat en begin de doseerpunt in een langzame cirkel rond de bodem van het ethaanvat te bewegen. Vast ethaan zal zich onmiddellijk vormen, maar zal snel vloeibaar worden naarmate er meer ethaangas wordt toegevoegd / gecondenseerd.
- Blijf de metaalethaandoseerpunt op de bodem van het ethaanvat verplaatsen om het vaste ethaan vloeibaar te maken. Vul het ethaanvat tot 3/4 vol vloeibaar ethaan (2-3 draden van bovenaf). Stop de ethaangasstroom door de metaalethaandoseerpunt voorzichtig uit het messing ethaanvat te verwijderen en de uitlaatklep te sluiten.
- Maak de plunging dewar af met LN2 die zachtjes aan de zijkant van de dewar giet om te voorkomen dat LN2 aan het messing ethaanvat wordt toegevoegd, totdat het vloeistofniveau net het koperen ethaanvat raakt. Plaats het schuimdeksel op de plunging dewar om ethaanstolling te vergemakkelijken.
- LN2 moet rechtstreeks contact opnemen met het messing ethaanvat om te helpen bij de stolling van ethaan. Na ongeveer 5 minuten zal het ethaan in het messing vat volledig bevroren vast worden. Voeg meer LN2 toe totdat het net het ethaanvat raakt en ga verder met de volgende stap.
- Als het ethaan niet vast is bevroren, is het koperen ethaanvat niet koud genoeg voor de resterende stappen. Voeg meer LN2 toe totdat het net het ethaanvat raakt en wacht nog eens 5 minuten. Zorg ervoor dat het ethaan in het messing vat volledig vastgevroren is.
- Open de gasuitlaatklep om een ethaangasstroom te produceren met een vergelijkbare snelheid als bepaald in stap 4.6. Plaats de metaalethaandoseerpunt verticaal in het vaste ethaan en blijf de ethaandoseerpunt in een cirkelvormige beweging bewegen om het vaste ethaan te smelten.
- Blijf ethaan toevoegen totdat het waterpas staat met de bovenkant van het messing ethaanvat. Verwijder langzaam de punt van het ethaanvat en sluit de uitlaatklep van de ethaantank. Bedek de dewar met het deksel gedurende ~ 1-4 minuten om het ethaan rond de randen van het messing ethaanvat te laten stollen.
OPMERKING: Een ideaal ethaanvat heeft een symmetrische ring van vast ethaan van 2-3 mm aan de omtrek van het messing ethaanvat met vloeibaar ethaan in het midden (figuur 1D en figuur 2). - Zorg ervoor dat het ethaan zo koud mogelijk is zonder te stollen om een goede vitrificatie van het biologische monster te garanderen. Het niet goed bereiden van het vloeibare ethaan kan leiden tot onvoldoende vitrificatie van het monster, ijsophoping en/of verlies van het monster, wat elk bijdraagt aan de verslechtering van de kwaliteit van het monster voor beeldvorming.
- Als er na 2-3 minuten geen vaste ring van ethaan ontstaat, voeg dan meer LN2 toe aan de dewar en dek nog 2-5 minuten af.
- Als het ethaan te snel stolt, gebruik dan een groot schoon pincet om het ethaanvat en/of vast ethaan voorzichtig op te warmen om volledige ethaanstolling te voorkomen. Zodra het ethaan en LN2 stabiel zijn, sluit u alle ethaantankkleppen en lokaliseert u de plunging dewar naar de handmatige plunjer. Bevestig de plunging dewar aan de handmatige zuiger.
LET OP: Wees extra voorzichtig bij het overbrengen van de dewar, omdat LN2 in het ethaanvat kan morsen en het vloeibare ethaan kan stollen. Indien nodig kan een schoon pincet worden gebruikt om vast ethaan in het midden van het vat te smelten.
- Blijf ethaan toevoegen totdat het waterpas staat met de bovenkant van het messing ethaanvat. Verwijder langzaam de punt van het ethaanvat en sluit de uitlaatklep van de ethaantank. Bedek de dewar met het deksel gedurende ~ 1-4 minuten om het ethaan rond de randen van het messing ethaanvat te laten stollen.
- Test de locatie van het ethaan dewar met een leeg pincet om ervoor te zorgen dat de pincetpunt zich in het midden van het ethaanvat bevindt en dat er voldoende ruimte is voor het rooster en de pincetpunt in het vloeibare ethaan (figuur 1D).
- Als de vaste ethaanring te dik is voor eenvoudige roosterbehandeling, gebruik dan een paar kamertemperatuur, reinig een pincet om het vaste ethaan te smelten en creëer meer vriesgebied in het midden van het ethaanvat.
5. Bereid EM-roosters voor
OPMERKING: Geschatte bedrijfstijd: 1-5 minuten
- Voeg de roosteropslagbox(en) toe aan de dewar, schroef de deksel(s) van de grid storage box los en zorg ervoor dat elk deksel vrij kan draaien naar een nieuwe grid slot.
- Breng roosters voorzichtig over van de rasteropslagdoos naar de rand van de vierkante glazen afdekkingslip met ~ 30-40% van het raster van de schuifrand. Zorg ervoor dat de roosterfolie naar boven gericht is. Zorg ervoor dat roosters worden afgedekt wanneer ze niet in gebruik zijn. Het plaatsen van de roosters over de rand van de vierkante glazen afdekplaat zorgt voor een eenvoudige behandeling van het rooster en vermindert de kans op buigen of beschadigen van het rooster tijdens de overdracht.
OPMERKING: 4-6 roosters worden meestal per keer voorbereid. - Maak roosters hydrofiel met behulp van een gloemontlading of plasmareiniger.
OPMERKING: Raadpleeg de aanbevolen richtlijnen voor roosterreiniging van de fabrikant van de gloeie-ontladingsmachine /plasmareiniger.- Gebruik de roosters binnen 10 minuten na plasmareiniging, omdat de roosters hydrofilie verliezen en de reproduceerbaarheid van raster naar raster na deze tijd afneemt.
6. Bereid cryoEM-monster door invriezen
OPMERKING: Geschatte bedrijfstijd: >10 minuten (~ 1-3 min per rooster)
- Gebruik een schoon en droog klempincet om een gereinigd rooster op te pakken, schuif de plastic klem naar beneden om het rooster op zijn plaats te bevestigen en tik voorzichtig op het pincet om ervoor te zorgen dat het rooster goed is beveiligd.
- Hanteer roosters bij de buitenste ring om schade aan de rasterfolie te voorkomen.
- Breng 1 tot 5 μL monster aan op de voorbereide kant (bijv. voorkant of foliezijde) van het rooster.
OPMERKING: Het optimale volume en de deptijd is afhankelijk van het monster en moet voor elk monster worden geoptimaliseerd; grotere volumes en meer viskeuze monsters vereisen langere vloeitijden. - Bevestig de pincet-grid-sample-assemblage aan de handmatige stortarm door tape rond de pincethandgreep te wikkelen.
- Richt het monster naar de gebruiker voor traditionele front blotting. Als het monster terug moet worden gedempt, zoek het monster dan uit de buurt van de gebruiker.
- Houd een schoon, droog, gesneden stuk vloeipapier tussen de duim en wijsvinger van elke hand.
- Behandel alleen het vloeipapier vanaf de randen en raak nooit het midden aan, omdat oliën en andere verontreinigingen van handen / handschoenen de rasterkwaliteit kunnen veranderen.
- Rust de handen op de rand van de dalende dewar om een stabiele positie te vestigen. Plaats het vloeipapier evenwijdig aan het rasteroppervlak op ongeveer 1 cm afstand van het rasteroppervlak.
- Gebruik het middelste gedeelte van het vloeipapier om volledige vloeistofmobiliteit en zelfs afvoer over het rasteroppervlak mogelijk te maken.
- Schuif en draai de duim en ringvingers voorzichtig naar elkaar toe om het vloeipapier naar het raster te buigen om het dempen te starten. Houd contact tussen het vloeipapier en het rasteroppervlak tijdens het hele dempingsproces.
- Maak rechtstreeks contact met het vloeipapier met het rasteroppervlak en houd consistent contact over het rasteroppervlak.
- Het voorzichtig buigen van het vloeipapier vermindert het buigen van het rooster en/of schade aan het rasteroppervlak en resulteert in consistenter ijs over het raster (figuur 3A).
- Observeer het mobiele vloeistoffront en zodra het stopt met het vorderen in het vloeipapier, begin je 4 tot 6 seconden te tellen.
OPMERKING: Tellen kan plaatsvinden zodra het vloeipapier contact maakt met het rasteroppervlak, maar een lagere raster-naar-raster reproduceerbaarheid kan optreden. De totale vlektijd is afhankelijk van het rastertype, het folietype, de monsterconcentratie en het monstertype (bijvoorbeeld oplosbare versus membraan versus filamenteuze eiwitten). Voor meer viskeuze monsters zijn langere vlektijden (bijv. 5 tot 7 seconden) vereist.- Belangrijk: Ontwikkel een betrouwbaar en consistent telschema om de reproduceerbaarheid tijdens het vriesproces aanzienlijk te verbeteren.
- Beweeg de linker-, rechterduim en wijsvinger in tegengestelde richting om het vloeipapier in een "knakkende beweging" weg te verwijderen van het rasteroppervlak. Druk onmiddellijk het voetpedaal in om de stortarm los te laten en het rooster in vloeibaar ethaan te storten.
- Verwijder tegelijkertijd het vloeipapier en druk op het voetpedaal om het rooster zo snel mogelijk in het ethaan te storten voor het beste vriesresultaat. Hoe langer de tijd tussen het verwijderen van vloeipapier en het storten van papier, hoe meer verdamping van dunne films zal optreden en de reproduceerbaarheid van raster naar raster zal afnemen.
- Gebruik één hand om het klempincet te stabiliseren, wikkel tape voorzichtig af van rond het pincet en de handmatige plunging-arm.
- Houd altijd contact met het pincet om beweging van het pincet-rooster te voorkomen en roosterschade te beperken die optreedt door het rooster tegen het vaste ethaan te slaan.
- Zodra het klempincet vrij is van de handmatige plunging arm, houdt u het pincet in één hand rustend op de top van de plunging dewar, zorg ervoor dat het rooster in het vloeibare ethaan blijft. Schuif de plastic klem voorzichtig weg van het rooster, zodat het rooster kan worden overgebracht. Houd druk op het pincet om het rooster te behouden.
- Breng met één snelle beweging het rooster snel over van het ethaanvat naar het LN2-reservoir . Plaats het rooster voorzichtig in de rasteropslagbox.
OPMERKING: Sommige ethaan kan stollen op het rasteroppervlak. Door het pincet iets te openen, breekt het ethaan en kan het rooster in de rasterdoos worden gedropt.
- Breng met één snelle beweging het rooster snel over van het ethaanvat naar het LN2-reservoir . Plaats het rooster voorzichtig in de rasteropslagbox.
- Wikkel de punt van het pincet in een delicaat taakdoekje om vorstophoping te voorkomen. Zet opzij totdat het pincet weer op kamertemperatuur is.
- Houd 4 tot 6 pincetten bij de hand voor gebruiksgemak. Elk pincet wordt gebruikt voor het invriezen en opwarmen van het monster voor volgend gebruik.
- Herhaal stap 6.1-6.11 voor elk raster.
- Zodra het invriezen is bereikt, sluit u de rasterdoos veilig en brengt u deze over naar een juiste opslaglocatie.
- Gooi het vloeibare ethaan en LN2 voorzichtig weg en bewaar alle materialen op een droge plaats.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Succesvolle uitvoering van het hier beschreven blot-and-plunge-protocol zal resulteren in een dunne, uniforme laag glasachtig ijs die vrij is van hexagonaal ijs, verontreinigingen en grote gradiënten van onbruikbaar ijs die onder de elektronenmicroscoop kunnen worden waargenomen (figuur 3). Inconsistent contact van het vloeipapier met het rasteroppervlak, voortijdig verwijderen van het vloeipapier of het verplaatsen van het vloeipapier tijdens rastercontact kan de kwaliteit van het glasvochtijs verminderen en leiden tot inconsistente ijsdikte over het EM-raster (figuur 4)
Figuur 1: Monsterduikruimte en benodigde apparatuur. A) Geënsceneerde koelruimte voor het handmatig invriezen van biologische specimens met behulp van een traditioneel vlekken-en-dompelapparaat dat in dit artikel wordt beschreven. Benodigde apparatuur wordt dienovereenkomstig weergegeven en gelabeld. B) Om de werkhoogte van de handmatige zuiger aan te passen, past u de hobbelstop aan door deze op en neer te schuiven op de handmatige stortarm en deze vast te zetten door de schroef aan te draaien. C) Ingezoomd zicht op het ethaanvat en het opslagplatform voor het spinrooster om de juiste hoogte en locatie van het klempincet en rooster in het lege messing ethaanvat aan te geven. Het pincet en rooster mogen geen contact maken met de zijkanten of onderkant van het messing ethaan om schade te voorkomen. D) Juiste hoogte en locatie van het klempincet en rooster in vloeibaar ethaan. Het pincet en rooster moeten het vloeibare ethaan in het midden binnendringen en contact met het vaste ethaan aan de omtrek vermijden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Bereid vloeibaar ethaan. Ingezoomd op het instorten van de dewar die de toestand van vloeibaar ethaan in het messing ethaanvat laat zien voordat het monster bevriest. De 2-3 mm ring van vast ethaan in het messing ethaanvat is duidelijk zichtbaar. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve apoferritinebeelden verkregen met behulp van de handmatige blot-and-plunge-techniek. (A) Representatieve atlas van een cryoEM-raster met de ijsdikte en kwaliteit van rastervierkanten die kunnen worden verkregen met behulp van de handmatige blot-and-plunge-techniek. (B) Bewegingsgecorrigeerde micrografie van verglaasd muisapoferritine verkregen met behulp van een 200 kV transmissie-elektronenmicroscoop uitgerust met een directe elektronendetector aan de Universiteit van Californië, San Diego's CryoEM Facility. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve atlas van een suboptimaal cryoEM-raster met inconsistente ijsdikte over het raster, talrijke gebroken vierkanten en gebieden waar het ijs te dik is om het monster in beeld te brengen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De vitrificatie van biologische monsters voor beeldvorming door cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje (cryoEM) blijft een uiterst belangrijke stap voor succesvolle structuurbepaling. De handmatige blot-and-plunge-methode die in dit protocol wordt beschreven, vertegenwoordigt een kosteneffectieve, betrouwbare en robuuste methode voor het snel invriezen van biologische monsters in dunne films van glasachtig ijs voor cryoEM-beeldvorming. Met behulp van de methoden die in het manuscript worden beschreven, kunnen onderzoekers de handmatige plunjer assembleren en bedienen, cryogene producten bereiden die geschikt zijn voor het flash-freezing biologische monsters en handmatig EM-roosters met biologische monsters vlekken en dompelen. Hoewel deze methode vrij robuust is, moet tijdens kritieke stappen in deze procedure voorzichtig worden om een optimale ijsdikte en -kwaliteit te verkrijgen voor beeldvorming met hoge resolutie. We hebben hieronder een aantal van deze kritieke stappen beschreven en geven aanbevelingen voor het oplossen van problemen met deze stappen.
Het is absoluut noodzakelijk om de handmatige stortarm goed te positioneren om ervoor te zorgen dat het rooster zich na het storten in het midden van het vloeibare ethaan in het messing vat bevindt. Onjuiste hoogte of positie van de plunging arm en/of het niet goed vastzetten van het pincet zal leiden tot schade aan het klempincet, het EM-rooster en mogelijk de handmatige plunjer. Zoals hierboven besproken, voeren we altijd ten minste één proefrit uit voordat we biologische monsters voorbereiden om te verifiëren dat het EM-raster zich na succesvolle plons naar het midden van het messing ethaanvat zal lokaliseren (figuur 1C). Daarnaast maken we ook kleine aanpassingen aan de locatie van de plunging dewar na elke roosterbevriezing om de plaatsing van het raster in het ethaanvat te verfijnen (figuur 1D).
De juiste voorbereiding van het ethaan cryogene is van cruciaal belang voor het verkrijgen van dunne films van biologische monsters in glasachtig ijs. We hebben waargenomen dat de aanwezigheid van een ring van 2-3 mm vast ethaan rond de binnenrand van het messing ethaanvat ervoor zorgt dat de temperatuur van het vloeibare ethaan optimaal is voor monsterverglazing (figuur 2). Inderdaad, nadat elk rooster is bevroren, controleren we de kwaliteit van het ethaan en maken we kleine aanpassingen - het vat enigszins verwarmen als te veel ethaan is gestold of het ethaan koelen als het systeem is opgewarmd - indien nodig. We hebben ontdekt dat de rand van een pincet op kamertemperatuur voldoende is om vast ethaan vloeibaar te maken, terwijl het bedekken van de dewar met het schuimdeksel gedurende 1-5 minuten voldoende tijd is om het ethaan te laten afkoelen. Belangrijk is dat we deze aanpassingen maken voordat we het rasteroppervlak voorbereiden (d.w.z. plasmareiniging) en het monster op het rooster aanbrengen, omdat dit een andere variabele in de netvoorbereiding kan introduceren die niet reproduceerbaar is.
Ten slotte raden we aan om een gestandaardiseerde blot-and-plunge-routine te ontwikkelen - monstertoepassing, monstervlekken en blottingtijd - om de reproduceerbaarheid van raster naar raster te vergroten. Het buigen van het vloeipapier naar het EM-raster zorgt voor een uniform contact van het papier met het raster en produceert een consistentere ijsdikte over het hele raster, wat resulteert in een gelijkmatige deeltjesverdeling binnen de rastergaten (respectievelijk figuur 3A en figuur B). Deze methode van blotting is in tegenstelling tot robotachtige blotting-apparaten die onder een hoek met het monster interageren, wat kan resulteren in een gradiënt van ijsdikte over het raster. Bovendien vermindert deze buiging van het vloeipapier ook de kans op beschadiging van het EM-rooster bij contact met het vloeipapier door de door de gebruiker uitgeoefende kracht te bufferen. Na de gewenste vloeitijd maakt u het vloeipapier snel recht door een knakkende beweging uit te voeren om het vloeipapier snel van het roosteroppervlak weg te bewegen voordat u stort om schade aan het rooster te voorkomen bij het loslaten van de handmatige stortarm. We hebben ontdekt dat deze vloeimethode en de knakkende beweging van het vloeipapier, wanneer getimed met de gelijktijdige afgifte van de handmatige plunging-arm via het voetpedaal, de verdamping van de dunne film vóór vitrificatie beperkt en de reproduceerbaarheid van raster naar raster verhoogt.
De handmatige blot-and-plunge-methode die hier wordt beschreven, is een robuuste en betrouwbare methode die helpt een deel van de financiële last te verminderen die cryoEM op opkomende laboratoria kan leggen. Hoewel deze methode reproduceerbaar is, is het creëren van hoogwaardig glasachtig ijs dat geschikt is voor cryoEM afhankelijk van de ervaring en vaardigheid van de individuele onderzoeker. Hoewel robotzuigers en andere opkomende technologieën verschillende aspecten van het vriesproces automatiseren, worden ze over het algemeen beperkt door hoeveel controle ze bieden aan onderzoekers en hebben ze vaak een hoge prijs om te kopen en te bedienen. Met de methode die in dit protocol wordt beschreven, kunnen onderzoekers een betaalbaar en veelzijdig EM-rastervoorbereidingsplatform gebruiken dat flexibiliteit biedt om de stortomstandigheden te optimaliseren (d.w.z. papiersoorten bakken, vloeihoek, vloeiduur, blottingrichtingen, enz.) op basis van monstertypen en -kenmerken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We bedanken de Herzik-lableden voor het kritisch nadenken en het geven van feedback op dit manuscript en de video-inhoud. M.A.H.Jr. wordt ondersteund door NIH R35 GM138206 en als Searle Scholar. H.P.M.N wordt ondersteund door de Molecular Biophysics Training Grant (NIH T32 GM008326). We willen ook Bill Anderson, Charles Bowman en Dr. Gabriel Lander van het Scripps Research Institute bedanken voor hun hulp bij het ontwerpen, assembleren en testen van de handmatige plunjer die in de video wordt getoond.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 slot grid storage box | Ted Pella | 160-40 | |
| 14 gauge flat metal dispensing tip | Amazon | B07M7YWWLT | |
| 22x22 mm square glass coverslip | Sigma | C9802-1PAK | |
| 60 mm glass Petri dish to store grids | Fisher | 08-747A | |
| 100 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747D | |
| 150 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747F | |
| 250 mL beaker | Fisher | 02-555-25B | |
| Blue styrofoam dewar | Spear Lab | FD-500 | |
| Brass ethane vessel | Lasco | 17-4075 | |
| Clamping tweezers | Ted Pella | 38825 | |
| Delicate task wipes | Fisher | 06-666 | |
| Dual-stage regulator with control valve | Airgas | Y12N245D580-AG | |
| Dewer grid base | UCSD | ||
| Ethane platform | UCSD | ||
| Ethane propane tank | Praxair | ET PR50ZU-G | ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank |
| Ethane tank | Praxair | UN1035 | ethane (100%) |
| Flexible arm task light | Amscope | LED-11CR | |
| Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q325AR1.3 | |
| Humidifier | Target | 719438 | |
| Hygrometer | ThermoPro | B01H1R0K68 | |
| Lab coat | UCSD | ||
| Liquid Nitrogen dewar | Worthington | LD4 | |
| Liquid Nitrogen gloves | Fisher | 19-059-925 | |
| Manual plunger stand (black stand + foot pedal) | UCSD | ||
| Mark 5 (plunging platform) | UCSD | ||
| Nitrile gloves | VWR | 82026-424 | |
| P20 pipette | Eppendorf | 13-690-029 | |
| PCR tubes | Eppendorf | E0030124286 | |
| Pipette tips | ibis scientific | 63300005 | |
| Ring lamp | Amazon | B07HMR4H8G | |
| Safety glasses | UCSD | ||
| Scissors | Amazon | Fiskars 01-004761J | |
| Screw driver | Ironside | 354711 | |
| Tape | Fisher | 15-901-10R | |
| Tweezer to transfer grid box | Amazon | LTS-3 | |
| Tygon tubing | Fisher | 14-171-130 | |
| Whatman blotting paper | Fisher | 1001-090 |
References
- Hofmann, S., et al. Conformation Space of a Heterodimeric ABC Exporter under Turnover Conditions. Nature. 571 (7766), 580-583 (2019).
- Fica, S. M., Nagai, K. Cryo-Electron Microscopy Snapshots of the Spliceosome: Structural Insights into a Dynamic Ribonucleoprotein Machine. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (10), 791-799 (2017).
- Hirschi, M., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the Lysosomal Calcium-Permeable Channel TRPML3. Nature. 550 (7676), 411-414 (2017).
- Nakane, T., et al. Single-Particle Cryo-EM at Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
- Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. Influence of Electron Dose Rate on Electron Counting Images Recorded with the K2 Camera. Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).
- Campbell, M. G., et al. Movies of Ice-Embedded Particles Enhance Resolution in Electron Cryo-Microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
- Brilot, A. F., et al. Beam-Induced Motion of Vitrified Specimen on Holey Carbon Film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
- McMullan, G., et al. Experimental Observation of the Improvement in MTF from Backthinning a CMOS Direct Electron Detector. Ultramicroscopy. 109 (9), 1144-1147 (2009).
- Feathers, J. R., Spoth, K. A., Fromme, J. C. Experimental evaluation of super-resolution imaging and magnification choice in single-particle cryo-EM. Journal of Structural Biology: X. 5, 100047 (2021).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: Anisotropic Correction of Beam-Induced Motion for Improved Cryo-Electron Microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-Resolution Protein Structure Determination by Cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
- Fislage, M., Shkumatov, A. V., Stroobants, A., Efremov, R. G. Assessing the JEOL CRYO ARM 300 for High-Throughput Automated Single-Particle Cryo-EM in a Multiuser Environment. IUCrJ. 7 (4), 707-718 (2020).
- Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. Resolving Individual Atoms of Protein Complex by Cryo-Electron Microscopy. Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).
- Danev, R., Yanagisawa, H., Kikkawa, M. Cryo-Electron Microscopy Methodology: Current Aspects and Future Directions. Trends in Biochemical Sciences. 44 (10), 837-848 (2019).
- Herzik, M. A. Jr Cryo-Electron Microscopy Reaches Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 39-40 (2020).
- Cheng, A., et al. Leginon: New Features and Applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
- Suloway, C., et al. Automated Molecular Microscopy: The New Leginon System. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- de la Rosa-Trevín, J. M., et al. Scipion: A Software Framework toward Integration, Reproducibility and Validation in 3D Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for Rapid Unsupervised Cryo-EM Structure Determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Danev, R., Tegunov, D., Baumeister, W. Using the Volta Phase Plate with Defocus for Cryo-EM Single Particle Analysis. eLife. 6, 23006 (2017).
- Naydenova, K., Jia, P., Russo, C. J. Cryo-EM with Sub-1 Å Specimen Movement. Science. 370 (6513), 223-226 (2020).
- Watson, Z. L., et al. Structure of the Bacterial Ribosome at 2 Å Resolution. eLife. 9, 60482 (2020).
- Josephs, T. M., et al. Structure and Dynamics of the CGRP Receptor in Apo and Peptide-Bound Forms. Science. 372 (6538), (2021).
- Tan, Y. Z., et al. Addressing Preferred Specimen Orientation in Single-Particle Cryo-EM through Tilting. Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
- D'Imprima, E., Floris, D., Joppe, M., Sánchez, R., Grininger, M., Kühlbrandt, W. Protein Denaturation at the Air-Water Interface and How to Prevent It. eLife. 8, 42747 (2019).
- Han, Y., et al. High-Yield Monolayer Graphene Grids for near-Atomic Resolution Cryoelectron Microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).
- Dandey, V. P., et al.
- McDowall, A. W., et al. Electron Microscopy of Frozen Hydrated Sections of Vitreous Ice and Vitrified Biological Samples. Journal of Microscopy. 131 (1), 1-9 (1983).
- Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of Microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).
- Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G.
- Depelteau, J. S., Koning, G., Yang, W., Briegel, A. An Economical, Portable Manual Cryogenic Plunge Freezer for the Preparation of Vitrified Biological Samples for Cryogenic Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 26 (3), 413-418 (2020).
- Dobro, M. J., Melanson, L. A., Jensen, G. J., McDowall, A. W. Plunge Freezing for Electron Cryomicroscopy. Methods in Enzymology. 481, 63-82 (2010).
- Cavalier, A., Spehner, D., Humbel, B. M. Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 15 (5), 469-470 (2009).
- Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of Macromolecular Complexes for Cryo-Electron Microscopy. Nat. Protoc. 2 (12), 3239-3246 (2007).
- Carragher, B., et al. Current Outcomes When Optimizing 'Standard' Sample Preparation for Single-particle Cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
- Noble, A. J., et al. Routine Single Particle CryoEM Sample and Grid Characterization by Tomography. eLife. 7, 34257 (2018).
- Resch, G. P., Brandstetter, M., Konigsmaier, L., Urban, E., Pickl-Herk, A. M. Immersion Freezing of Suspended Particles and Cells for Cryo-Electron Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 803-814 (2011).
- Resch, G. P., et al. Immersion Freezing of Biological Specimens: Rationale, Principles, and Instrumentation. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 778-782 (2011).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: A Prototype for an Integrated Inkjet Dispense and Vitrification System for Cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
- Razinkov, I., et al. A New Method for Vitrifying Samples for CryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
- Dandey, V. P., et al. Spotiton: New Features and Applications. Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).
- Lu, Z., et al. Monolithic Microfluidic Mixing-Spraying Devices for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 168 (3), 388-395 (2009).
- Feng, X., et al. A Fast and Effective Microfluidic Spraying-Plunging Method for High-Resolution Single-Particle Cryo-EM. Structure. 25 (4), 663-670 (2017).
- Rubinstein, J. L., et al. Shake-It-off: A Simple Ultrasonic Cryo-EM Specimen-Preparation Device. Acta Crystallographica Section D. 75 (12), 1063-1070 (2019).
- Lawson, C. L., et al. EMDataBank.Org: Unified Data Resource for CryoEM. Nucleic Acids Res. 39, 456-464 (2011).
- Frederik, P. M., Hubert, D. H.
- Dambacher, C. M., Worden, E. J., Herzik, M. A., Martin, A., Lander, G. C. Atomic Structure of the 26S Proteasome Lid Reveals the Mechanism of Deubiquitinase Inhibition. eLife. 5, 13027 (2016).
- Zubcevic, L., et al. Conformational Ensemble of the Human TRPV3 Ion Channel. Nature Communications. 9 (1), 4773 (2018).
- Zubcevic, L., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the TRPV2 Ion Channel. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (2), 180-186 (2016).
- Yoo, J., Wu, M., Yin, Y., Herzik, M. A. Jr, Lander, G. C., Lee, S. -Y. Cryo-EM Structure of a Mitochondrial Calcium Uniporter. Science. 361 (6401), 506-511 (2018).
- Fribourgh, J. L., et al. Dynamics at the Serine Loop Underlie Differential Affinity of Cryptochromes for CLOCK:BMAL1 to Control Circadian Timing. eLife. 9, 55275 (2020).
- Hirschi, M., et al. AcrIF9 Tethers Non-Sequence Specific DsDNA to the CRISPR RNA-Guided Surveillance Complex. Nature Communications. 11 (1), 2730 (2020).
- Herzik, M. A. Jr Manual-Plunging CryoEM Grids | Herzik Lab. Herzik Lab UCSD. , Available at: https://herziklab.com/manual-plunge.html (2021).
