Summary
Dette manuskriptet skisserer blot-and-plunge-metoden for å fryse biologiske prøver manuelt for enpartikkelkryogen elektronmikroskopi.
Abstract
Avbildning av biologiske prøver med elektroner for høyoppløselig strukturbestemmelse ved enpartikkel kryogene elektronmikroskopi (cryoEM) krever et tynt lag med glassaktig is som inneholder biomolekylene av interesse. Til tross for mange teknologiske fremskritt de siste årene som har drevet single-partikkel cryoEM i forkant av strukturell biologi, forblir metodene som prøver er vitrifisert for høyoppløselig avbildning ofte det hastighetsbegrensende trinnet. Selv om mange nylige anstrengelser har gitt midler til å overvinne hindringer som ofte oppstår under prøve vitrifisering, inkludert utvikling av nye prøvestøtter og innovativ vitrifiseringsinstrumentering, forblir det tradisjonelle manuelt opererte stempelet en stift i cryoEM-samfunnet på grunn av de lave kostnadene ved kjøp og enkel betjening. Her tilbyr vi detaljerte metoder for bruk av en standard, giljotin-stil manuelt betjent blot-and-plunge-enhet for vitrifisering av biologiske prøver for høyoppløselig avbildning ved enpartikkelkryoEM. I tillegg er det også beskrevet vanlige problemer og feilsøkingsanbefalinger for når et standardpreparat ikke gir et passende eksemplar.
Introduction
Enpartikkel kryogene elektronmikroskopi (cryoEM) er en kraftig strukturell teknikk som kan brukes til å løse strukturer av dynamiske biologiske prøver til nesten atomoppløsning1,2,3,4. Faktisk, nylige fremskritt innen direkte elektrondetektorteknologier4,5,6,7,8,9,10, forbedringer i elektronkilder4,11,12,13,14, og elektromagnetisk linsestabilitet15, kombinert med fortsatt utvikling av datainnsamling 16,17 og analyseprogramvarepakker18,19, har gjort det mulig for forskere å nå rutinemessig bestemme strukturer av veloppdragne prøver til 3 Å-oppløsning eller bedre4,11,13,14,20,21,22,23 . Til tross for disse forbedrede bilde- og databehandlingsfunksjonene, er cryoEM-nettforberedelse fortsatt det største hinderet for vellykket strukturbestemmelse med høy oppløsning og fungerer ofte som en betydelig flaskehals i EM-arbeidsflyten24,25,26,27.
CryoEM er avhengig av avbildning av biologiske prøver i vandige løsninger som er frosset for å danne en tynn film av "glasslignende" is - en prosess kjent som vitrifisering - som bevarer den innfødte biokjemiske tilstanden. Vitrifisering av biologiske prøver for kryoEM går tilbake over 40 år28,29,30 og mange teknikker og utstyr som er utviklet for denne prosessen, er avhengig av den opprinnelig detaljerte blot-and-plunge-metoden31,32,33,34,35 , der et lite utvalgsvolum (f.eks. 1-5 μL) påføres et spesialisert EM-rutenett før den overskytende løsningen fjernes ved hjelp av fysisk interaksjon av rutenettet med blotting papir. Tidspunktet for denne prosessen er vanligvis empirisk bestemt for hver prøve som en kritisk komponent i fryseprøver er tykkelsen på glasslegemet isfilm - hvis isen er for tykk, forverres bildekvaliteten dramatisk på grunn av økt spredning av elektronstrålen, mens is som er for tynn kan begrense proteinretninger og / eller utelukke partikler fra midten av rutenettfoliehullene36 . Denne avhengigheten av den perfekte istykkelsen for enpartikkelkryoEM har ført til et bredt spekter av teknikker og utstyr som kan fryse prøver, inkludert robotikk37,38, mikrofluidikk42 og ultralyd- eller sprøyteenheter27,39,40,41,42,43,44 . I de senere år er noen av de mest populære prøveforberedelsesenhetene avhengige av bruk av robotikk for automatisert frysing av prøver ved hjelp av blot-and-plunge-teknikken45. Selv om disse enhetene er designet for å reprodusere riktig istykkelse for avbildning, forblir de ofte for dyre for individuelle laboratorier å kjøpe og betjene og finnes vanligvis i cryoEM-anlegg til timepriser for bruk. De siste årene har den opprinnelige manuelle blot-and-plunge-teknikken kommet tilbake til økt bruk3,47,48,49,50,51,52. Faktisk kan en manuelt betjent blot-and-plunge-enhet oppnå høykvalitets cryoEM-rutenett til en brøkdel av kostnaden for robotiske kolleger. Videre gir manuell blotting også flere brukere kontroll over blotting som forskere kan justere typen blotting (dvs. back-blotting av rutenettet, front-blotting av rutenettet, etc.), og blotting tid basert på hver enkelt prøve og forskningsspørsmål.
I denne artikkelen gir vi detaljer om hvordan du effektivt fryser biologiske prøver ved hjelp av en tradisjonell manuell blot-and-plunge vitrification-enhet kombinert med en spesialdesignet dewar-plattform53. Beste praksis, inkludert forberedelse av kryogen, rutenetthåndtering, prøveapplikasjon og blotting, samt vanlige fallgruver og anbefalinger om hvordan du kan overvinne disse hindringene, er gitt. Råd om hvordan du øker istykkelsen reproduserbarhet mellom nettpreparater og hvordan du modifiserer prøveblussing basert på biologisk prøvetype diskuteres. Gitt de lave kostnadene forbundet med kjøp og drift av det manuelle stempelet som er beskrevet i dette manuskriptet, kan laboratorier over hele kloden forberede biologiske prøver for kryoEM på en kostnadseffektiv og reproduserbar måte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbered det manuelle stupemiljøet
MERK: Beregnet driftstid: 5-30 minutter
- Finn det manuelle stempelet i et kaldtrom på 4 °C der en luftfukter kan plasseres samtidig for å opprettholde rommet nær 100 % relativ fuktighet (RH) (figur 1A).
FORSIKTIG: Ta kontakt med institusjonens retningslinjer for miljøhelse og sikkerhet for sikker plassering av det manuelle stempelet og anbefalte operasjoner. - Før nettforberedelse, slå på luftfukteren i kjølerommet for å sikre at RH i kjølerommet er ≥ 95%.
MERK: Nettforberedelse ved lav luftfuktighet kan føre til dehydrering av tynne filmer, endring av bufferkomponenter på grunn av fordampning, og en reduksjon i reproduserbarheten fra rutenett til rutenett46. Det anbefales ikke å fryse gitter ved <80 % RH. - Sørg for at temperaturen på kjølerommet er ved 4 °C.
- Finn det manuelle stempelet vekk fra sterke luftstrømmer (dvs. vekk fra luftkondisjoneringsaggregatventiler) da de kan føre til turbulens nær gitter og / eller fremtredende isakkumulering på kalde overflater.
2. Forbered dykking av materialer og tilbehør
MERK: Beregnet driftstid: 1-5 minutter
- Bruk ren saks til å kutte blotting papir sirkler i 1-1,5 cm brede og ~ 9 cm lange strimler. Unngå å berøre midten av blottingspapiret og kast de mindre endestykkene. Det er viktig å sikre at blotting papirstrimler er tørre, rene og fri for forurensninger. Skill strimlene og legg dem i en 100 mm Petri-tallerken.
- Legg en firkantet glassdeksle på 22x22 mm i en separat Petri-tallerken i glass på 60 mm. Denne coverlipholdige Glass Petri-retten vil bli brukt til å lagre, overføre og glødeutladningsgitter.
MERK: Det anbefales å bruke en luft-dusterkanne for å fjerne synlig rusk fra lysbildet før du legger til rutenett. En antistatisk pistol kan også brukes til å fjerne statisk elektrisitet som akkumuleres. - Sett sammen og merk oppbevaringsbokser for rutenett.
- Skaff 4 til 6 rene og tørre klemme pinsett og plasser dem til det manuelle stempelet. Inspiser hver pinsett visuelt før du stuper for å sikre at de ikke er skadet og er fri for forurensninger.
3. Forbered kryoogen dewar og manuell stempel
MERK: Beregnet driftstid: 5-15 minutter
- Monter plattformbasen på bunnen av den dype dewaren. Plasser etanfartøyets dewar på toppen av plattformbasen, legg til messingetanfartøyet, og installer deretter lagringsplattformen for spinnende rutenett.
- Når flytende nitrogen (LN2) er tilsatt til den dype dewaren, kan ikke høyden på plattformbasen lenger justeres. Forsikre deg om at rutenettbasen er riktig installert og er i vater for å begrense nett- og/eller pinsettskader på grunn av feil stempelhøyde.
- Før frysing må du kontrollere det manuelle stempelet og alt tilleggsutstyr for å sikre at de fungerer som de skal for å begrense prøve- og/eller netttap.
- Før hver fryseøkt må tapen skiftes ut på den manuelle stempelarmen som brukes til å holde pinsettene. Den høye luftfuktigheten i rommet kan forringe tapelimet og redusere båndets evne til å holde pinsettene, noe som øker sannsynligheten for pinsettskade og / eller netttap.
- Juster lampen(e) i nærheten av det manuelle stempelet for å sikre at det er tilstrekkelig lys til å overvåke prøvetransport og sikre at nettoverføringen enkelt visualiseres for å forhindre nettskade og/eller tap (se trinn 3.7). Bruk en ringelampe rett bak stempelet for å visualisere væskebevegelse og et fleksibelt armoppgavelys nær dewar for å belyse de frosne gitterene.
- Juster fotpedalspenningen for å sikre at dewar-stempelarmen holdes godt på plass mens den er i hevet posisjon og frigjøres helt når pedalen trykkes inn. Utfør flere "tørre" løp før prøveapplikasjon for å sikre at stempelet fungerer som det skal.
MERK: Feil justering av fotpedalspenningen vil føre til for tidlig frigjøring av den dype armen (dvs. spenningen er satt for lavt) og netttap eller ufullstendig dypping av gitteret inn i etanbeholderen (dvs. spenningen er satt for høyt). - Plasser den dype dewaren ved foten av det manuelle stempelet rett under den stupe armen og fest den på plass. Fest et par pinsett til den dype armen ved hjelp av den vedlagte tapen. Mens du holder den manuelle stupearmen, trykker du på fotpedalen for å senke den dype armen forsiktig og justere vandringen til den stupe armen for å sikre at rutenettet vil lokalisere seg midt i etanbeholderen.
- Bruk støtstoppet øverst på den stupearmen til å bestemme den endelige posisjonen til den stupearmen når fotpedalen er helt trykket inn (figur 1B). Juster støtstopphøyden på den stupearmen for å justere plasseringen av gitteret i etanbeholderen (figur 1C).
MERK: Hvis du stiller inn høyden på den stupe armen på feil måte, kan det føre til skader på gitteret og/eller pinsett (f.eks. at høyden på den stupe armen er satt for lavt) eller utilstrekkelig vitrifisering (f.eks. dyparmhøyden er satt for høyt). - Finn dewar utenfor kjølerommet og fortsett å forberede flytende etan (trinn 4).
4. Forbered kryogenet
MERK: Beregnet driftstid: 10-30 minutter
- Vurder etantanken, regulatoren, slangen og etandispenseringsspissen for tegn på skade. Rapporter umiddelbart og utbedre eventuelle tegn på skade før du fortsetter.
FORSIKTIG: Komprimerte etan- og etangassblandinger er brannfarlige og kan utgjøre en alvorlig trussel mot liv og/eller føre til skade hvis de håndteres feil. Ta kontakt med en ekspert hvis du er usikker på hvordan du skal betjene eller håndtere komprimerte gasstanker. Se institusjonens retningslinjer for miljøhelse og sikkerhet ved håndtering av brennbare komprimerte gasser. I tillegg er flytende etan et kraftig kryogen som kan utgjøre en alvorlig trussel mot liv og / eller skade hvis det ikke håndteres riktig. Se institusjonens retningslinjer for miljøhelse og sikkerhet ved håndtering av kryogener. - Skaff deg tilstrekkelig LN2 i en passende LN2 håndtering dewar (dvs. 3-4 L er typisk for nettforberedelse og lagring).
FORSIKTIG: LN2 er et kryogen som kan utgjøre en alvorlig trussel mot liv og/eller skade hvis det ikke håndteres riktig.- Sørg for at alt personlig verneutstyr brukes for å minimere risikoen for skade. Dampen av LN2 er et kvelningsmiddel og bør håndteres i godt ventilerte områder. Ta kontakt med en ekspert hvis du er usikker på hvordan du skal betjene eller håndtere kryogene kar og kryogener. Se institusjonens retningslinjer for miljøhelse og sikkerhet ved håndtering av kryogener. I situasjoner der flytende nitrogen ikke kan brukes i et kaldt rom, anbefaler vi å dyppe frysing i et kjølig og godt ventilert rom.
- Utenfor kjølerommet kjøler du ned den dype dewaren ved å helle LN2 direkte inn i messingetanbeholderen til det flytende nitrogennivået når toppen av etanbeholderen (dvs. like over plattformen). Topp av LN2 utenfor etanfartøyet etter behov. Fortsett til neste trinn når LN2 slutter å boble voldsomt (ca. 5 minutter).
- Tilsett LN2 direkte på messingetanbeholderen for å avkjøle fartøyet tilstrekkelig før kondenserende etangass. Unnlatelse av å avkjøle messing etanfartøyet vil dramatisk øke tiden det tar å kondensere etan.
- Når dewar har nådd LN2 temperatur, unngå å overfylle dewar slik at LN2 søler inn i etanfartøyet.
- Etan kommer som en komprimert gass og må flytende for bruk. Etantanken bruker en dual-stage regulator med høy renhet for å kontrollere gassstrømmen. Koble slangen til regulatorutløpsventilen og bruk en 14-gauge flat metalldispenseringsspiss koblet på enden for dispensering av etan.
- Før du åpner etan hovedtankventilen, må du sørge for at trykkjusteringsknappen og utløpsventilen er lukket hele veien. Åpne hovedtankventilen helt og åpne deretter utløpsventilen til ~ 50%. Åpne trykkjusteringsknappen langsomt til en langsom gassstrøm overholdes. Bruk utløpsventilen til å finjustere gassstrømmen.
FORSIKTIG: Rett alltid metallutleveringsspissen bort fra deg selv når du åpner ventiler eller foretar gassstrømjusteringer. - Start gassstrømmen langsomt og vurder strømningshastigheten ved å sette spissen av etangassledningen inn i et lite beger med deionisert vann. Juster gassstrømmen til strømningshastigheten forstyrrer vannet moderat .
- Juster gassstrømmen for å sikre riktig etankondensering - for langsom strømning vil føre til at etangassen størkner i dispenseringsspissen, og for fort av en strømningshastighet vil resultere i intens boblende og forhindre frysing.
- Før du setter spissen av etangassledningen inn i messingetanbeholderen, rengjør og tørk dispenseringsspissen med delikate oppgaveservietter for å fjerne vann.
- I en jevn og rask bevegelse, finn gassdispenseringsspissen på bunnen av messingetanfartøyet og begynn å flytte dispenseringsspissen i en langsom sirkel rundt bunnen av etanbeholderen. Fast etan vil dannes umiddelbart, men vil raskt flytende etter hvert som mer etangass tilsettes/kondenseres.
- Fortsett å flytte metallets etanutleveringsspiss rundt på bunnen av etanbeholderen for å flytende det faste etanet. Fyll opp etanbeholderen til 3/4 full av flytende etan (2-3 tråder fra toppen). Stopp etangassstrømmen ved å forsiktig fjerne metallets etanutleveringsspiss fra messingetanbeholderen og lukke utløpsventilen.
- Topp av den dype dewar med LN2 helles forsiktig på siden av dewar for å unngå LN2 tillegg til messing etan fartøyet, til væskenivået bare berører messing etan fartøyet. Plasser skumlokket på den dype dewaren for å lette etanstørkning.
- LN2 må kontakte messing etanfartøyet direkte for å hjelpe til med størkning av etan. Etter ca. 5 minutter blir etanen i messingfartøyet helt frosset fast. Tilsett mer LN2 til det bare berører etanfartøyet og fortsett til neste trinn.
- Hvis etanet ikke har frosset fast, er messing etanbeholderen ikke kald nok for de resterende trinnene. Tilsett mer LN2 til det bare berører etanfartøyet og vent ytterligere 5 minutter. Sørg for at etanet i messingbeholderen er helt frosset fast.
- Åpne gassutløpsventilen for å produsere en etangassstrøm i samme hastighet som bestemt i trinn 4.6. Plasser metallets etanutleveringsspiss vertikalt inn i det faste etanet og fortsett å flytte etanutleveringsspissen i en sirkulær bevegelse for å smelte det faste etanet.
- Fortsett å legge til etan til det er nivå med toppen av messing etanfartøyet. Fjern spissen langsomt fra etanbeholderen og lukk utløpsventilen for etantanken. Dekk dewar med lokket i ~ 1-4 minutter for å la etanet størkne rundt kantene på messing etanfartøyet.
MERK: Et ideelt etanfartøy vil ha en 2-3 mm symmetrisk ring av fast etan i omkretsen av messingetanbeholderen med flytende etan i midten (figur 1D og figur 2). - Sørg for at etanet er så kaldt som mulig uten å størkne for å sikre riktig vitrifisering av den biologiske prøven. Unnlatelse av å forberede det flytende etanet riktig kan føre til utilstrekkelig vitrifisering av prøven, isakkumulering og / eller tap av prøve, som hver bidrar til forverring av prøvekvaliteten for avbildning.
- Hvis en solid ring av etan ikke dannes etter 2-3 minutter, legg til mer LN2 til dewar og dekk i 2-5 minutter.
- Hvis etanet størkner for raskt, bruk deretter et stort par rene pinsett for å forsiktig varme etanbeholderen og / eller solid etan for å forhindre fullstendig etanfastifisering. Når etanet og LN2 er stabile, lukker du alle etantankventilene og finner den dype dewaren til det manuelle stempelet. Fest den dype dewaren til det manuelle stempelet.
FORSIKTIG: Vær ekstra forsiktig når du overfører dewar da LN2 kan søle inn i etanbeholderen og størkne væskeet etan. Om nødvendig kan et rent sett med pinsett brukes til å smelte et fast etan midt i fartøyet.
- Fortsett å legge til etan til det er nivå med toppen av messing etanfartøyet. Fjern spissen langsomt fra etanbeholderen og lukk utløpsventilen for etantanken. Dekk dewar med lokket i ~ 1-4 minutter for å la etanet størkne rundt kantene på messing etanfartøyet.
- Test plasseringen av etandewaren med et par tomme pinsett for å sikre at pinsettspissen finner i midten av etanfartøyet, og det er tilstrekkelig plass til rutenettet og pinsettspissen inne i væskeet etan (figur 1D).
- Hvis den faste etanringen er for tykk for enkel gridhåndtering, bruk deretter et par romtemperatur, rengjør pinsett for å smelte det faste etanet og skape mer fryseområde i midten av etanbeholderen.
5. Forbered EM-rutenett
MERK: Beregnet driftstid: 1-5 minutter
- Legg til oppbevaringsboksen(e) for rutenett i dewaren, skru av lokket(e) på rutenettet, og pass på at hvert lokk fritt kan rotere til et nytt rutenettspor.
- Overfør rutenettet forsiktig fra oppbevaringsboksen for rutenettet til kanten av det firkantede glassdekslet med ~ 30-40% av rutenettet utenfor glidekanten. Påse at gitterfolien vender opp. Sørg for at gitteret er dekket når de ikke er i bruk. Plassering av gitteret over kanten av det firkantede glassdekslet gir enkel håndtering av rutenettet og reduserer sjansen for å bøye eller skade rutenettet under overføring.
MERK: 4-6 rutenett tilberedes vanligvis om gangen. - Gjør gitter hydrofilt ved hjelp av en glødeutladning eller plasmarenser.
MERK: Se de anbefalte retningslinjene for nettrengjøring fra produsenten av glødeutladningen/plasmarenseren.- Bruk gitteret innen 10 minutter etter plasmarengjøring, da gitteret mister hydrofilisitet og reproduserbarheten fra rutenett til rutenett reduseres etter denne tiden.
6. Forbered cryoEM-prøve ved å stupe frysing
MERK: Beregnet driftstid: >10 minutter (~1-3 min per rutenett)
- Bruk en ren og tørr klemme pinsett for å plukke opp et renset rutenett, skyv plastklemmen ned for å fikse rutenettet på plass, og trykk forsiktig på pinsettene for å sikre at rutenettet er ordentlig festet.
- Håndter gitteret ved den ytre ringen for å forhindre skade på gitterfolien.
- Påfør 1 til 5 μL prøve på den forberedte siden (f.eks. forsiden eller foliesiden) på rutenettet.
MERK: Den optimale volum- og oppblåsthetstiden avhenger av prøven og må optimaliseres for hver prøve; større volumer og flere viskøse prøver krever lengre blottingstider. - Fest pinsett-grid-prøveenheten til den manuelle stupearmen ved å pakke tape rundt pinsetthåndtaket.
- Vene prøven mot brukeren for tradisjonell front blotting. Hvis prøven krever tilbakeblåsing, må du finne prøven vekk fra brukeren.
- Hold et rent, tørt, kuttet stykke blotting papir mellom tommelen og pekefingeren på hver hånd.
- Håndter kun blottingspapirene fra kantene og berør aldri senteret, da oljer og andre forurensninger fra hender/hansker kan endre rutenettkvaliteten.
- Hvil hendene på kanten av den stupende dewar for å etablere en stabil posisjon. Plasser blottingspapiret parallelt med rutenettoverflaten ca. 1 cm fra gitteroverflaten.
- Bruk den midterste delen av blottingspapiret for å muliggjøre fullstendig væskemobilitet og til og med fukttransport over rutenettoverflaten.
- Skyv forsiktig og roter tommelen og ring fingrene mot hverandre for å bøye blotting papir mot rutenettet for å starte blotting. Oppretthold kontakten mellom blottingspapiret og rutenettoverflaten under hele blottingsprosessen.
- Ta direkte kontakt med blottingspapiret til rutenettoverflaten og oppretthold konsekvent kontakt over rutenettoverflaten.
- Hvis du bøyer blottingspapiret forsiktig, reduseres bøyningen av gitteret og/eller skade på gitteroverflaten, og det resulterer i mer konsistent is over nettet (figur 3A).
- Vær oppmerksom på den mobile væskefronten, og når den slutter å gå inn i blottingspapiret, begynner du å telle i 4 til 6 sekunder.
MERK: Telling kan skje når oppblåsthetspapiret kommer i kontakt med rutenettoverflaten, men det kan oppstå lavere reproduserbarhet fra rutenett til rutenett. Den totale flekktiden vil avhenge av rutenetttype, folietype, prøvekonsentrasjon og prøvetype (f.eks. løselig versus membran versus filamentøse proteiner). For flere viskøse prøver vil det være nødvendig med lengre blotter (f.eks. 5 til 7 sekunder).- Viktig: Utvikle en pålitelig og konsistent telleordning for å forbedre reproduserbarheten i stor grad under fryseprosessen.
- Beveg venstre, høyre tommel og pekefinger i motsatte retninger for å fjerne blottingspapiret i en "snapping motion" bort fra rutenettoverflaten. Trykk straks ned fotpedalen for å frigjøre den dype armen og dypp gitteret i flytende etan.
- Fjern samtidig blottingspapiret og trykk på fotpedalen for å kaste gitteret inn i etanet så snart som mulig for best mulig fryseresultat. Jo lengre tid mellom blotting papir fjerning og stuping, jo mer fordampning av tynne filmer vil oppstå og redusere grid-to-grid reproduserbarhet.
- Bruk den ene hånden til å stabilisere klemme pinsettene, vikle tape forsiktig fra rundt pinsettene og den manuelle stupearmen.
- Hold alltid kontakten med pinsett for å forhindre bevegelse av pinsettnettet og begrens nettskaden som oppstår fra å slå rutenettet mot det faste etanet.
- Når klemme pinsett er fri for den manuelle stupearmen, hold pinsetten i den ene hånden hviler på toppen av den dype dewar, sørg for at rutenettet forblir i flytende etan. Skyv plastklemmen forsiktig bort fra gitteret slik at gitteret kan overføres. Oppretthold trykket på pinsettene for å beholde rutenettet.
- Med en rask bevegelse, overfør raskt nettet fra etanfartøyet til LN2-reservoaret . Plasser rutenettet forsiktig i oppbevaringsboksen for rutenettet.
MERK: Noe etan kan størkne på rutenettoverflaten. Å åpne pinsett litt vil bryte etanet og tillate at rutenettet slippes inn i rutenettboksen.
- Med en rask bevegelse, overfør raskt nettet fra etanfartøyet til LN2-reservoaret . Plasser rutenettet forsiktig i oppbevaringsboksen for rutenettet.
- Pakk tweezers spissen i en delikat oppgaveserviett for å forhindre frostakkumulering. Sett til side til pinsettene har kommet tilbake til romtemperatur.
- Ha 4 til 6 pinsett tilgjengelig for brukervennlighet. Hver pinsett vil bli brukt til prøvefrysing og varmes opp før etterfølgende bruk.
- Gjenta trinn 6.1-6.11 for hvert rutenett.
- Når frysingen har kulminert, lukker du rutenettboksen sikkert og overfører til et riktig lagringssted.
- Kast forsiktig det flytende etanet og LN2 og oppbevar alle materialer på et tørt sted.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket utførelse av blot-and-plunge-protokollen som er beskrevet her, vil resultere i et tynt, ensartet lag med glassaktig is som er fri for sekskantet is, forurensninger og store gradienter av ubrukelig is som kan observeres under elektronmikroskopet (figur 3). Inkonsekvent kontakt med blottingspapiret med rutenettoverflaten, for tidlig fjerning av blottingspapiret eller flytting av blottingspapiret under rutenettkontakt kan redusere kvaliteten på glassisen og føre til inkonsekvent istykkelse over EM-rutenettet (figur 4)
Figur 1: Prøverom og nødvendig utstyr. A) Iscenesatt kjølerom for manuell frysing av biologiske prøver ved hjelp av en tradisjonell blot-and-plunge-enhet skissert i denne artikkelen. Nødvendig utstyr vises og merkes deretter. B) For å justere arbeidshøyden på det manuelle stempelet, juster støtstoppet ved å skyve det opp og ned i den manuelle stupearmen og feste den ved å stramme skruen. C) Zoomet inn visning av etanfartøyet og roterende nettlagringsplattform for å indikere riktig høyde og plassering av klemme pinsett og rutenett inne i det tomme messingetanfartøyet. Pinsettene og rutenettet bør ikke kontakte sidene eller bunnen av messingetanet for å unngå skade. D) Riktig høyde og plassering av klemme pinsett og gitter i flytende etan. Pinsettene og rutenettet skal komme inn i det flytende etanet i midten, og unngå kontakt med det faste etanet ved omkretsen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Tilberedt flytende etan. Zoomet inn på den dype dewar som viser tilstanden til flytende etan i messing etanfartøyet før prøvefrysing. Den 2-3 mm ringen av solid etan i messing etanfartøyet er tydelig synlig. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative apoferritinbilder hentet ved hjelp av den manuelle blot-and-plunge-teknikken. (A) Representativt atlas av et cryoEM-rutenett som viser istykkelsen og kvaliteten på rutenettplassene som kan oppnås ved hjelp av den manuelle blot-and-plunge-teknikken. (B) Bevegelseskorrigert mikrograf av vitrifisert musapferritin anskaffet ved hjelp av et 200 kV overføringselektronmikroskop utstyrt med en direkte elektrondetektor ved University of California, San Diego's CryoEM Facility. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representativt atlas av et suboptimalt kryoEM-rutenett som viser inkonsekvent istykkelse over hele rutenettet, mange ødelagte firkanter og områder der isen er for tykk til å avbilde prøven. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vitrifisering av biologiske prøver for avbildning ved enpartikkel kryogene elektronmikroskopi (cryoEM) er fortsatt et kritisk viktig skritt for vellykket strukturbestemmelse. Den manuelle blot-and-plunge-metoden som er beskrevet i denne protokollen representerer en kostnadseffektiv, pålitelig og robust metode for rask frysing av biologiske prøver i tynne filmer av glassaktig is for kryoEM-avbildning. Ved hjelp av metodene som er skissert i manuskriptet, vil forskerne kunne montere og betjene det manuelle stempelet, forberede kryogen egnet for flash-frysende biologiske prøver, og manuelt blot-and-plunge EM-rutenett som inneholder biologiske prøver. Selv om denne metoden er ganske robust, bør du være forsiktig under kritiske trinn i denne prosedyren for å oppnå optimal istykkelse og kvalitet for høyoppløselig avbildning. Vi har skissert flere av disse kritiske trinnene nedenfor og gir anbefalinger om hvordan du feilsøker disse trinnene.
Det er viktig å plassere den manuelle stupearmen riktig for å sikre at gitteret ligger i midten av det flytende etanet i messingbeholderen etter å ha stupt. Feil høyde eller posisjon på stempelarmen og/eller ikke sikring av pinsettene på riktig måte vil føre til skade på klemmestøttene, EM-rutenettet og muligens det manuelle stempelet. Som beskrevet ovenfor utfører vi alltid minst ett prøveløp før vi forbereder biologiske prøver for å verifisere at EM-rutenettet vil lokalisere seg til midten av messingetanfartøyet etter vellykket stuping (figur 1C). I tillegg foretar vi også mindre justeringer av plasseringen av den stupende dewar etter hver rutenettfrysing for å finjustere rutenettplasseringen i etanfartøyet (figur 1D).
Riktig forberedelse av etankryogen er avgjørende for å oppnå tynne filmer av biologiske prøver i glassaktig is. Vi har observert at tilstedeværelsen av en 2-3 mm ring med fast etan rundt den indre kanten av messingetanbeholderen sikrer at temperaturen på væskeetan er optimal for prøvetørrifisering (figur 2). Faktisk, etter at hvert rutenett er frosset, overvåker vi kvaliteten på etanet og gjør mindre justeringer - litt oppvarming av fartøyet hvis for mye etan har størknet eller avkjølt etanet hvis systemet har varmet opp - etter behov. Vi har funnet ut at kanten av en romtemperatur pinsett er tilstrekkelig til å flytende fast etan mens du dekker dewar med skumlokket i 1-5 min er nok tid til å la etanet avkjøles. Det er viktig at vi foretar disse justeringene før vi forbereder nettoverflaten (dvs. plasmarengjøring) og bruker prøven på rutenettet, da dette kan introdusere en annen variabel for nettforberedelse som ikke kan reproduseres.
Til slutt anbefaler vi å utvikle en standardisert blot-and-plunge-rutine - prøveapplikasjon, prøveblussing og blottingstid - for å øke rutenett-til-rutenett-reproduserbarheten. Bøying av blottingspapiret mot EM-rutenettet gir jevn kontakt med papiret med rutenettet og produserer mer konsistent istykkelse over hele rutenettet, noe som resulterer i jevn partikkelfordeling innenfor rutenetthullene (henholdsvis figur 3A og figur B). Denne metoden for blotting står i kontrast til robotiske blottingsenheter som samhandler med prøven i en vinkel som kan resultere i en gradient av istykkelse over rutenettet. I tillegg reduserer denne bøyningen av blottingspapiret også sjansen for å skade EM-rutenettet ved kontakt med blottingspapiret ved å bufre kraften som brukes av brukeren. Etter ønsket blottingstid, rett raskt blottingspapiret ved å utføre en snappingbevegelse for raskt å flytte blottingspapiret bort fra rutenettoverflaten før du stuper for å forhindre skade på rutenettet ved frigjøring av den manuelle stupearmen. Vi har funnet denne blottingsmetoden og snapping-bevegelsen til blottingspapiret, når det er tidsbegrenset med samtidig frigjøring av den manuelle stupearmen via fotpedalen, begrenser fordampning av den tynne filmen før vitrifisering og øker rutenett-til-rutenett-reproduserbarheten.
Den manuelle blot-and-plunge-metoden som er beskrevet her, er en robust og pålitelig metode som bidrar til å redusere noe av den økonomiske byrden cryoEM kan legge på nye laboratorier. Selv om denne metoden er reproduserbar, er det å skape glassaktig is av høy kvalitet som passer for cryoEM avhengig av den enkelte forskers erfaring og dyktighet. Selv om robotstempever og andre nye teknologier automatiserer flere aspekter av fryseprosessen, er de generelt begrenset av hvor mye kontroll de tilbyr forskere og pådrar seg ofte en høy pris for å kjøpe og operere. Med metoden som er skissert i denne protokollen, vil forskere kunne bruke en rimelig og allsidig EM-nettforberedelsesplattform som gir fleksibilitet til å optimalisere de dype forholdene (dvs. blotting papirtyper, blotting vinkel, blotting varigheter, blotting retninger, etc.) basert på prøvetyper og egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Herzik-laboratoriemedlemmene for kritisk tenkning og tilbakemelding på dette manuskriptet og videoinnholdet. M.A.H.Jr. støttes av NIH R35 GM138206 og som Searle Scholar. H.P.M.N støttes av Molecular Biophysics Training Grant (NIH T32 GM008326). Vi vil også takke Bill Anderson, Charles Bowman og Dr. Gabriel Lander ved Scripps Research Institute for hjelp til å designe, montere og teste det manuelle stempelet som vises i videoen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 slot grid storage box | Ted Pella | 160-40 | |
| 14 gauge flat metal dispensing tip | Amazon | B07M7YWWLT | |
| 22x22 mm square glass coverslip | Sigma | C9802-1PAK | |
| 60 mm glass Petri dish to store grids | Fisher | 08-747A | |
| 100 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747D | |
| 150 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747F | |
| 250 mL beaker | Fisher | 02-555-25B | |
| Blue styrofoam dewar | Spear Lab | FD-500 | |
| Brass ethane vessel | Lasco | 17-4075 | |
| Clamping tweezers | Ted Pella | 38825 | |
| Delicate task wipes | Fisher | 06-666 | |
| Dual-stage regulator with control valve | Airgas | Y12N245D580-AG | |
| Dewer grid base | UCSD | ||
| Ethane platform | UCSD | ||
| Ethane propane tank | Praxair | ET PR50ZU-G | ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank |
| Ethane tank | Praxair | UN1035 | ethane (100%) |
| Flexible arm task light | Amscope | LED-11CR | |
| Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q325AR1.3 | |
| Humidifier | Target | 719438 | |
| Hygrometer | ThermoPro | B01H1R0K68 | |
| Lab coat | UCSD | ||
| Liquid Nitrogen dewar | Worthington | LD4 | |
| Liquid Nitrogen gloves | Fisher | 19-059-925 | |
| Manual plunger stand (black stand + foot pedal) | UCSD | ||
| Mark 5 (plunging platform) | UCSD | ||
| Nitrile gloves | VWR | 82026-424 | |
| P20 pipette | Eppendorf | 13-690-029 | |
| PCR tubes | Eppendorf | E0030124286 | |
| Pipette tips | ibis scientific | 63300005 | |
| Ring lamp | Amazon | B07HMR4H8G | |
| Safety glasses | UCSD | ||
| Scissors | Amazon | Fiskars 01-004761J | |
| Screw driver | Ironside | 354711 | |
| Tape | Fisher | 15-901-10R | |
| Tweezer to transfer grid box | Amazon | LTS-3 | |
| Tygon tubing | Fisher | 14-171-130 | |
| Whatman blotting paper | Fisher | 1001-090 |
References
- Hofmann, S., et al. Conformation Space of a Heterodimeric ABC Exporter under Turnover Conditions. Nature. 571 (7766), 580-583 (2019).
- Fica, S. M., Nagai, K. Cryo-Electron Microscopy Snapshots of the Spliceosome: Structural Insights into a Dynamic Ribonucleoprotein Machine. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (10), 791-799 (2017).
- Hirschi, M., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the Lysosomal Calcium-Permeable Channel TRPML3. Nature. 550 (7676), 411-414 (2017).
- Nakane, T., et al. Single-Particle Cryo-EM at Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
- Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. Influence of Electron Dose Rate on Electron Counting Images Recorded with the K2 Camera. Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).
- Campbell, M. G., et al. Movies of Ice-Embedded Particles Enhance Resolution in Electron Cryo-Microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
- Brilot, A. F., et al. Beam-Induced Motion of Vitrified Specimen on Holey Carbon Film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
- McMullan, G., et al. Experimental Observation of the Improvement in MTF from Backthinning a CMOS Direct Electron Detector. Ultramicroscopy. 109 (9), 1144-1147 (2009).
- Feathers, J. R., Spoth, K. A., Fromme, J. C. Experimental evaluation of super-resolution imaging and magnification choice in single-particle cryo-EM. Journal of Structural Biology: X. 5, 100047 (2021).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: Anisotropic Correction of Beam-Induced Motion for Improved Cryo-Electron Microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-Resolution Protein Structure Determination by Cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
- Fislage, M., Shkumatov, A. V., Stroobants, A., Efremov, R. G. Assessing the JEOL CRYO ARM 300 for High-Throughput Automated Single-Particle Cryo-EM in a Multiuser Environment. IUCrJ. 7 (4), 707-718 (2020).
- Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. Resolving Individual Atoms of Protein Complex by Cryo-Electron Microscopy. Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).
- Danev, R., Yanagisawa, H., Kikkawa, M. Cryo-Electron Microscopy Methodology: Current Aspects and Future Directions. Trends in Biochemical Sciences. 44 (10), 837-848 (2019).
- Herzik, M. A. Jr Cryo-Electron Microscopy Reaches Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 39-40 (2020).
- Cheng, A., et al. Leginon: New Features and Applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
- Suloway, C., et al. Automated Molecular Microscopy: The New Leginon System. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- de la Rosa-Trevín, J. M., et al. Scipion: A Software Framework toward Integration, Reproducibility and Validation in 3D Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for Rapid Unsupervised Cryo-EM Structure Determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Danev, R., Tegunov, D., Baumeister, W. Using the Volta Phase Plate with Defocus for Cryo-EM Single Particle Analysis. eLife. 6, 23006 (2017).
- Naydenova, K., Jia, P., Russo, C. J. Cryo-EM with Sub-1 Å Specimen Movement. Science. 370 (6513), 223-226 (2020).
- Watson, Z. L., et al. Structure of the Bacterial Ribosome at 2 Å Resolution. eLife. 9, 60482 (2020).
- Josephs, T. M., et al. Structure and Dynamics of the CGRP Receptor in Apo and Peptide-Bound Forms. Science. 372 (6538), (2021).
- Tan, Y. Z., et al. Addressing Preferred Specimen Orientation in Single-Particle Cryo-EM through Tilting. Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
- D'Imprima, E., Floris, D., Joppe, M., Sánchez, R., Grininger, M., Kühlbrandt, W. Protein Denaturation at the Air-Water Interface and How to Prevent It. eLife. 8, 42747 (2019).
- Han, Y., et al. High-Yield Monolayer Graphene Grids for near-Atomic Resolution Cryoelectron Microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).
- Dandey, V. P., et al.
- McDowall, A. W., et al. Electron Microscopy of Frozen Hydrated Sections of Vitreous Ice and Vitrified Biological Samples. Journal of Microscopy. 131 (1), 1-9 (1983).
- Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of Microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).
- Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G.
- Depelteau, J. S., Koning, G., Yang, W., Briegel, A. An Economical, Portable Manual Cryogenic Plunge Freezer for the Preparation of Vitrified Biological Samples for Cryogenic Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 26 (3), 413-418 (2020).
- Dobro, M. J., Melanson, L. A., Jensen, G. J., McDowall, A. W. Plunge Freezing for Electron Cryomicroscopy. Methods in Enzymology. 481, 63-82 (2010).
- Cavalier, A., Spehner, D., Humbel, B. M. Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 15 (5), 469-470 (2009).
- Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of Macromolecular Complexes for Cryo-Electron Microscopy. Nat. Protoc. 2 (12), 3239-3246 (2007).
- Carragher, B., et al. Current Outcomes When Optimizing 'Standard' Sample Preparation for Single-particle Cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
- Noble, A. J., et al. Routine Single Particle CryoEM Sample and Grid Characterization by Tomography. eLife. 7, 34257 (2018).
- Resch, G. P., Brandstetter, M., Konigsmaier, L., Urban, E., Pickl-Herk, A. M. Immersion Freezing of Suspended Particles and Cells for Cryo-Electron Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 803-814 (2011).
- Resch, G. P., et al. Immersion Freezing of Biological Specimens: Rationale, Principles, and Instrumentation. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 778-782 (2011).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: A Prototype for an Integrated Inkjet Dispense and Vitrification System for Cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
- Razinkov, I., et al. A New Method for Vitrifying Samples for CryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
- Dandey, V. P., et al. Spotiton: New Features and Applications. Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).
- Lu, Z., et al. Monolithic Microfluidic Mixing-Spraying Devices for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 168 (3), 388-395 (2009).
- Feng, X., et al. A Fast and Effective Microfluidic Spraying-Plunging Method for High-Resolution Single-Particle Cryo-EM. Structure. 25 (4), 663-670 (2017).
- Rubinstein, J. L., et al. Shake-It-off: A Simple Ultrasonic Cryo-EM Specimen-Preparation Device. Acta Crystallographica Section D. 75 (12), 1063-1070 (2019).
- Lawson, C. L., et al. EMDataBank.Org: Unified Data Resource for CryoEM. Nucleic Acids Res. 39, 456-464 (2011).
- Frederik, P. M., Hubert, D. H.
- Dambacher, C. M., Worden, E. J., Herzik, M. A., Martin, A., Lander, G. C. Atomic Structure of the 26S Proteasome Lid Reveals the Mechanism of Deubiquitinase Inhibition. eLife. 5, 13027 (2016).
- Zubcevic, L., et al. Conformational Ensemble of the Human TRPV3 Ion Channel. Nature Communications. 9 (1), 4773 (2018).
- Zubcevic, L., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the TRPV2 Ion Channel. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (2), 180-186 (2016).
- Yoo, J., Wu, M., Yin, Y., Herzik, M. A. Jr, Lander, G. C., Lee, S. -Y. Cryo-EM Structure of a Mitochondrial Calcium Uniporter. Science. 361 (6401), 506-511 (2018).
- Fribourgh, J. L., et al. Dynamics at the Serine Loop Underlie Differential Affinity of Cryptochromes for CLOCK:BMAL1 to Control Circadian Timing. eLife. 9, 55275 (2020).
- Hirschi, M., et al. AcrIF9 Tethers Non-Sequence Specific DsDNA to the CRISPR RNA-Guided Surveillance Complex. Nature Communications. 11 (1), 2730 (2020).
- Herzik, M. A. Jr Manual-Plunging CryoEM Grids | Herzik Lab. Herzik Lab UCSD. , Available at: https://herziklab.com/manual-plunge.html (2021).
