Summary
Apresentamos um protocolo de imagem ao vivo sem rótulos usando técnicas de microscopia de luz transmitida para capturar imagens, analisar e quantificar a cinética de crescimento do fungo filamentoso A. nidulans em culturas submersas e mídia sólida. Este protocolo pode ser usado em conjunto com microscopia de fluorescência.
Abstract
Está bem estabelecido que o crescimento de fungos filamentosos, principalmente dependentes de mudanças na taxa de crescimento hifa/micáceico, é macroscopicamente estimado em mídia solidificada comparando o tamanho da colônia. No entanto, medir quantitativamente a taxa de crescimento de cepas ou cepas fúngicas geneticamente diferentes sob diferentes condições ambientais/de crescimento (pH, temperatura, fontes de carbono e nitrogênio, antibióticos, etc.) é um desafio. Assim, a busca de abordagens complementares para quantificar a cinética do crescimento torna-se obrigatória para entender melhor o crescimento das células fúngicas. Além disso, é sabido que fungos filamentosos, incluindo aspergillus spp., possuem modos distintos de crescimento e diferenciação sob condições sub-aéreas em mídia sólida ou culturas submersas. Aqui, detalhamos um método microscópico quantitativo para analisar a cinética de crescimento do fungo modelo Aspergillus nidulans, utilizando imagens vivas em culturas submersas e mídia sólida. Capturamos imagens, analisamos e quantificamos as taxas de crescimento de diferentes cepas fúngicas de forma reprodutível e confiável usando um software livre de código aberto para bioimagens (por exemplo, Fiji), de uma forma que não exija qualquer experiência prévia de análise de imagem do usuário.
Introduction
Os fungos filamentosos são de grande importância socioeconômica e ecológica, sendo tanto cruciais quanto ferramentas industriais/agrícolas para a produção de enzimas e antibióticos1,2 e como patógenos de plantas agrícolas3, insetos depragas 4 e humanos3. Além disso, fungos filamentosos como os nidulans Aspergillus são amplamente utilizados como organismos-modelo para pesquisas fundamentais, como estudos em genética, biologia celular e evolutiva, bem como para o estudo da extensão hifal5. Fungos filamentosos são organismos altamente polarizados que alongam o fornecimento contínuo de lipídios/proteínas de membrana e a nova síntese da parede celular na ponta de extensão6. Um papel central no crescimento da ponta hífa e na manutenção da polaridade é uma estrutura especializada chamada 'Spitzenkorper' (SPK), uma estrutura altamente ordenada composta principalmente por componentes citoesqueléticos e distribuição polarizada do Golgi6,7,8.
Estímulos/sinais ambientais, tais interface água-ar, luz, concentração de CO2 e o estado nutricional são responsáveis pelas decisões de desenvolvimento tomadas por esses moldes9. Nas culturas submersas (líquidas) a diferenciação de A. nidulans é reprimida e o crescimento ocorre por alongamento da ponta hiphal6. Durante o crescimento vegetativo, esporos assexuados (conidia) germinam por extensão apical, formando uma rede indiferenciada de células hifamais interconectadas, o micélio, que pode continuar a crescer indefinidamente enquanto nutrientes e espaço estiverem disponíveis. Por outro lado, em pontas higiféricas de mídia sólida alongam e após um período definido de crescimento vegetativo (competência do desenvolvimento), inicia-se a reprodução assexual e os talos de conidiophore aéreo se estendem das células especializadas do pé domicélio 6. Estes dão origem a estruturas multicelulares especializadas de desenvolvimento chamadas conidioforos, que produzem longas cadeias de conidia10 haploide que podem reiniciar o crescimento em condições ambientais favoráveis.
Um método amplamente utilizado para medir o crescimento fúngico filamentoso é inocular esporos em ágar nutrientes contidos em uma placa de Petri e medir macroscopicamente o diâmetro da colônia alguns diasdepois 11. O diâmetro/área da colônia, mais dependente de mudanças na taxa de crescimento micelial e menos na densidade conidiophore12,é então usado como um valor de crescimento. Embora, medir o tamanho da população fúngica (colônia) crescendo em superfícies sólidas seja bastante adequado, não é de forma alguma a medida mais precisa de crescimento. Em comparação com as médias populacionais (médias do tamanho da colônia fúngica), as medições de células únicas podem capturar a heterogeneidade de uma população celular e permitir a identificação de novas subsédias de células, afirma13, dinâmicas, caminhos, bem como os mecanismos biológicos pelos quais as células respondem a mudanças endógenas e ambientais14,15. Monitorar o crescimento e o fenótipo das células fúngicas por microscopia de lapso de tempo é, sem dúvida, a abordagem de observação de células únicas quantitativas mais amplamente empregadas.
Aqui, detalhamos um protocolo de imagem ao vivo sem rótulos usando técnicas de microscopia de luz transmitida (como contraste de fase, contraste de interferência diferencial (DIC) e microscopia polarizada) para capturar imagens, que independentemente do uso combinado de microscopia de fluorescência podem ser empregadas para analisar e quantificar o crescimento polar de cepas de A. nidulans em culturas submersas e mídia sólida.
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Protocol
1. Preparação inóculo
NOTA: Todas as etapas devem ser executadas sob um gabinete de fluxo laminar.
- Estirpe de interesse fúngico, a partir de um estoque de glicerol (-80 °C) utilizando um laço de inoculação estéril, em placas de mídia mínima (MM) complementadas com os requisitos nutricionais adequados relevantes para a cepa examinada [MM: 10,0 g/L de glicose, solução de sal de 20 mL/L (solução de sal: 26 g/L KCl, 26 g/L MgSO4·7H2,O 76 g/L KH2PO4, 2,0 mL/L clorofórmio) e 1 mL/L de traços (elementos de traço: 40 mg/L Na2B4O7· H2O, 400 mg/L CuSO4, 8 g/L ZnSO4, 800 mg/L MnSO4, 800 mg/L FePO4), ajuste o pH para 6,8 com 1 M NaOH, adicione 1 % (w/v) ágar e os suplementos necessários conforme descrito em16 e autoclave] (Figura 1).
NOTA: Solução de sal, solução de elementos de rastreamento e suplementos são autoclaved. - Incubar por 2-3 dias a 37 °C.
- Use um palito estéril (ou um laço de inoculação), transfira um pequeno número de conídios, tocando suavemente uma única colônia, para placas de mídia completa (CM) [CM: 10,0 g/L de glicose, 2,0 g/L peptone, 1,0 g/L extrato de levedura, 1,0 g/L casaminoácidos, solução de sal de 20 mL/L, elementos de traço de 1 mL/L, solução de vitaminas 5 mL/L (solução de vitaminas: solução de vitaminas: 20 mL/L), elementos de traço de 1 mL/L, solução de vitaminas de 5 mL/L (solução de vitaminas: solução de vitaminas: solução de vitaminas: solução de vitaminas: solução de vitaminas: solução de vitaminas: 20 mL/L, elementos de traço de 1 mL/L, solução de vitaminas 5 mL/L (solução de vitaminas: solução de vitaminas: solução de vitaminas: 1 mL/L) 0,1 g/L riboflavina, 0,1 g/L nicotinamida, 0,01 g/L p-amino benzoico ácido, 0,05 g/L piridoxina HCl, 1,0 mg/L biotina), ajuste pH para 6,8 com 1 M NaOH, adicione 1 % (w/v) ágar e os suplementos necessários conforme descrito em16 e autoclave]. Autoclave e armazene a solução de vitaminas em uma garrafa escura a 4 °C.
NOTA: No caso de o crescimento fúngico ser muito denso para identificar e isolar colônias individuais, re-traço em uma nova placa de ágar para obter colônias únicas. - Incubar por 3-4 dias a 37 °C.
- Obtenha uma suspensão conidial de aproximadamente 2 x 106 células/mL, arranhando 1 cm da superfície de uma colônia fúngica conidiada cultivada em placas de ágar CM, utilizando um palito estéril(Figura S1).
NOTA: Quando necessário, conte conidia com um hemótmetro. - Colher conidia de A. nidulans em um tubo de centrífuga de 1,5 mL estéril com 1,0 mL de água autoclavada destilada contendo 0,05% (v/v) Tween 80 para reduzir o número de aglomerados de conidia.
NOTA: Conidia pode ser armazenada por até 2-3 semanas a 4 °C sem uma perda relevante de viabilidade (A. Athanasopoulos e V. Sophianopoulou, dados inéditos). No entanto, recomenda-se filtrar e/ou lavar suspensão conidial para remover partes e nutrientes micelial, a fim de evitar o inchaço conidial.
2. Preparação para fungos filamentosos de imagem crescendo em meios de ágar (sólidos)
NOTA: É utilizada uma versão modificada do método ágar invertido17,18.
- Inicialmente, spot 10 μL alíquotas de conidial vigorosamente vórtice (aproximadamente 2 x 104 células/mL) em vários pontos em placas de Petri (Ø9 cm) 15 mL de MM com 1% (w/v) ágar(Figura 2).
NOTA: Usando a versão modificada do "método ágar invertido", é possível imaginar amostras fúngicas por muitas horas sem efeitos deletérios aparentes no cultivo de hifas. - Incubar a cultura experimental de acordo com o estágio de desenvolvimento destinado a ser investigado.
- Corte um bloco de ágar≈0,8 mm 2 contendo a colônia usando um bisturi estéril.
NOTA: As dimensões do bloco de ágar a ser fatiado dependem das dimensões do equipamento a serem colocadas posteriormente. No presente trabalho, são utilizados 8 slides bem μ (veja abaixo). - Inverta e coloque o bloco de ágar em um poço de μ-slide ou um vidro de cobertura de 8 câmaras semelhante com tampas adequadas para imagens ao vivo.
NOTA: Caso a microscopia de luz transmitida seja usada em combinação com microscopia de fluorescência (rotulagem), o bloco de ágar pode ser invertido em uma gota de meio líquido contendo o corante de coloração de células vivas, pouco antes da imagem.
3. Preparação para fungos de imagem filamentosos crescendo em meio líquido
- Transfira 10 alíquotas de μL de uma suspensão conidial vigorosamente vórtice (aproximadamente 2 x 104 células/mL) nos poços de um slide de 8 poços μ contendo 200 μL de MM (líquido) com os suplementos apropriados (ver acima).
- Incubar para o tempo desejado na temperatura desejada(Figura 3).
NOTA: Se a microscopia luminosa transmitida for usada em combinação com microscopia de fluorescência (rotulagem), as culturas líquidas têm a grande vantagem de que os corantes fluorescentes podem ser adicionados a qualquer ponto de tempo desejado durante o experimento19.
4. Capture imagens
NOTA: A escolha do microscópio depende do equipamento disponível. Em qualquer caso, a configuração do microscópio deve incluir um estágio invertido, uma câmara ambiental ou pelo menos uma sala com controle preciso da temperatura do ar.
- Pré-aqueça a câmara de microscópio termostato a 37 °C (a menos que indicado de outra forma ou adequado para as espécies fúngicas usadas) para estabilizar a temperatura antes de começar. Esta câmara permite a modulação da temperatura da óptica do microscópio e o estágio amostral durante experimentos de lapso de tempo. Esteja ciente de que as aberrações ópticas20 são introduzidas quando óleos normais de imersão (projetados para uso a 23 °C) são usados a 37 °C ou superior.
NOTA: Em um orçamento apertado, as câmaras de incubação podem ser feitas de papelão e material de embalagem isolante21 ou usando uma impressora 3D22. - Ligue o microscópio, a potência do scanner, a potência do laser e o computador, e carregue o software de imagem. Coloque o μ-slide (preparado anteriormente) no estágio do microscópio e no foco.
- Encontre campos de visão que contenham células isoladas/não sobrepostas (ou pelo menos não superlotadas), a fim de facilitar as medições de crescimento durante a análise da imagem. Capture pelo menos 50 células em crescimento por amostra para permitir uma análise estatística robusta.
- Selecione a abordagem de microscopia de luz transmitida desejada. Reduza o tempo de exposição ou a potência do laser e o tempo de moradia dos pixels e/ou aumente os diâmetros do orifício, a fim de minimizar o fotobleaching das células fúngicas, como descrito em outros lugares 23,24.
- Defina microscópio para adquirir imagens nos intervalos de tempo desejados e iniciar a aquisição da série de tempo.
NOTA: Para corrigir a deriva focal ao longo do tempo (especialmente para experimentos longos), devido à deriva térmica, tamanhos de células diversos e movimento celular use uma estratégia de foco automático se disponível em seu software de microscópio.
5. Análise de imagem
NOTA: Esta seção descreve as principais etapas do processamento de imagens de microscopia de lapso de tempo para medir a taxa de crescimento de A. nidulans. Abertura, visualização e processamento de imagens é realizada com o software ImageJ/Fiji de código aberto25.
- Importe as imagens para Fiji usando plugins | Bioformiagens | Importador de bioformitos do menu Fiji com configurações padrão(Figura 4A).
NOTA: Verifique se o Importador de Bioformiagens reconhece corretamente a calibração da imagem. A dimensão da imagem mostrada na janela de imagem do campo de informações superiores deve ser igual às dimensões originais da imagem(Figura 4B). Pressione Shift + P para exibir e alterar propriedades de imagem no software ImageJ/Fiji. - Quando necessário, use histograma correspondente26 para correção de iluminação entre diferentes quadros(Imagem | Ajuste | | de correção de alvejante Histograma correspondente)(Figura 4C).
- Quando necessário, use o algoritmo SIFT(Plugins | | de inscrição Alinhamento linear da pilha com SIFT) para alinhar ou combinar pilhas de imagens(Figura 4D). Selecionar "Tradução" do menu de transformação esperado deve ser suficiente para corrigir qualquer deriva x-y.
NOTA: Outros plugins também podem ser usados para alinhar uma pilha de fatias de imagem, como estabilizador de imagem (https://imagej.net/Image_Stabilizer) ou StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/). - Selecione hifas que crescem paralelamente ao deslizamento de cobertura, evitando aqueles que estão inclinados. Certifique-se de selecionar hifas que se propagam por extensão polar e evitar hifas apresentando ramificações laterais e/ou apical.
- Use MTrackJ (Plugins | Plugin MTrackJ) para rastrear as pontas de higfê-lo em crescimento(Figura 4E)27. Para adicionar uma faixa, selecione o botão Adicionar na barra de ferramentas e coloque o primeiro ponto em uma ponta de hignênfa usando o clique esquerdo do mouse. A série de tempo passará automaticamente para o próximo quadro. Para concluir o processo de rastreamento, clique duas vezes no mouse no ponto final (ou pressione a tecla Esc) (Figura 4F). Mova-se para outro ponto de interesse (ou seja, ponta hignífa em crescimento) no período inicial e reinicie o procedimento medindo a taxa de crescimento de outro hypha.
NOTA: Para instalar o MTrackJ siga as instruções apresentadas em https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ - Clique no botão Medir na caixa de diálogo MTrackJ (Figura 4G) para abrir a tabela de saída. Salvar medidas de faixa(| de arquivos Salve As) para o formato de arquivo desejado (por exemplo, csv), analise e plote-os(Figura 4H).
NOTA: Ao selecionar o botão Filme, um filme é produzido mostrando a imagem e a progressão da faixa.
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Representative Results
Seguindo este protocolo, capturamos e analisamos várias imagens correspondentes a diferentes estágios de crescimento/desenvolvimento do fungo filamentoso A. nidulans. Os dados apresentados neste estudo foram processados e analisados utilizando-se o software Fiji. As medições foram salvas como arquivos csv, estatisticamente analisadas e preparadas como gráficos usando software estatístico comercial e/ou linguagem de programação Python usando bibliotecas de software como pandas, numpy, statsmodels, matplotlib e seaborn. Mais detalhes podem ser encontrados nas publicações originais citadas.
Para interpretar a resposta das populações, é importante determinar a heterogeneidade dos parâmetros-chave dentro das populações e identificar de forma eficiente subpopulações fisiologicamente distintas28. A Figura 5 mostra o crescimento da cepa mutante azhAΔ ngnAΔ, com exclusões em dois genes, dos quais os produtos estão implicados na desintoxicação e assimilação do fitoproduto tóxico L-azetidina-2- ácido carboxílico29,em comparação com a cepa WT. Medindo sua taxa de crescimento em culturas líquidas submersas, detectamos uma taxa de crescimento estatisticamente significativa mais baixa do mutante duplo em comparação com a cepa WT (t(715) = 20,61, p = <0.0001) (Figura 5A-B). Essa diferença de crescimento não foi detectável medindo apenas a área da colônia dessas cepas (Figura 5C-D),enfatizando que a análise microscópica de células únicas é mais eficaz na determinação de pequenas diferenças nas taxas de crescimento que são difíceis de detectar com observação macroscópica da colônia.
A imagem viva de longo prazo de célula única é de valor significativo no esforço para obter informações espaciais e temporais da dinâmica da proteína celular. Imagens de células vivas de longo prazo (Figura 6, Vídeo 1) de germinação conidial co-expressando a proteína eisosômica do núcleo da GFP PilA e o histona MRFP H1 mostra que PilA30 forma estruturas estáticas com baixa mobilidade na membrana de plasma fúngico31,32. Além disso, a Figura 7 mostra que corantes fluorescentes podem ser usados para imagens vivas de cepas cultivadas no meio ágar, a fim de estudar dinâmicas de organelas e estruturas celulares. Aqui, o FM4-6433 foi usado para visualizar a rede mitocondrial e o sistema vacuolar em A. nidulans.
Figura 1: Representação esquemática do procedimento de preparação do inóculo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Representação esquemática do procedimento seguido para imagens de fungos filamentosos crescendo no meio ágar. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Representação esquemática do procedimento seguido para imagens de fungos filamentosos crescendo em meio líquido. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Representação esquemática do procedimento de análise de imagem. Etapas para o processamento de imagens de microscopia de lapso de tempo e medição da taxa de crescimento de A. nidulans. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Comparando as medidas populacionais tradicionais com as medidas de célula única. (A) Imagens representativas de microscopia confocal de azhAΔ ngnAΔ dupla exclusão e cepas WT, cultivadas em culturas líquidas submersas contendo ureia como única fonte de nitrogênio a 25 °C. Todas as cepas foram incubadas por um total de 18 h, a 25 °C e os quadros foram capturados em intervalos de 15 min. Imagens de 2048 × 2048 pixels foram coletadas com um tamanho de pixel de 115,02 x 115,02 nm usando um microscópio TCS SP8 MP (Leica, Alemanha) equipado com hc Plan APO 63x, N.A. 1.40 objetivo de imersão de óleo. (B) As medidas de (A) são plotadas em parcelas de caixa e bigode. A significância estatística foi analisada via t-Test e é retratada com asteriscos (***), indicando p < 0,001. (C) Crescimento a 25 °C de WT e tensão de exclusão dupla em MM sólido. As colônias foram fotografadas em intervalos de tempo diferentes (18 h, 36 h e 72 h), calibradas espacialmente e medidas manualmente com uma régua no programa ImageJ. (D) As medições da área das colônias apresentadas em (C) são traçadas como parcelas de caixa e bigode. As diferenças da área das colônias não foram estatisticamente significantes entre os diferentes pontos de tempo do mutante duplo em comparação com a cepa de TC (18h: t(8) = 0,69, p = 0,50, 36h: t(6) = 0,27, p = 0,5068, 72h: t(6) = 0,39, p = 0,70 ). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Imagens de células vivas de longo prazo da germinação conidial co-expressando proteínas de interesse fundidas com etiquetas fluorescentes geneticamente codificadas. (A) Projeções de intensidade máxima (MIP) de 4 fatias geradas no plano z, de uma cepa co-expressando PilA-GFP e H1-mRFP. Conidia foram avistadas no ágar médio e incubadas por aproximadamente 1 h a 30 °C, a fim de ajudar a adesão das células ao ágar. O bloco de ágar contendo conidia foi cortado, colocado em poços de um μ-slide e incubado por um total de 18 h, a 30 °C. Os quadros foram capturados em intervalos de 25 minutos, utilizando um microscópio TCS SP8 MP (Leica, Alemanha) equipado com HC Plan APO 63x, N.A. 1.40 óleo imersão objetivo (com um tamanho de pixel de 92,26 x 92,26 nm). As imagens foram obtidas pelo emocionante GFP em comprimento de onda de 488 nm e detectando fluorescência na banda espectral variando de 495 a 558 nm, e por mRFP emocionante em 561 nm comprimento de onda e detectando fluorescência na banda espectral variando de 580 a 660 nm. (B) As medidas (velocidade de germinação e extensão da ponta hiphal) de (A) são traçadas como gráfico de linha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Rotulagem FM4-64 de hifa crescendo em meio sólido. Conidia de uma cepa WT foram cultivadas em pratos 1% de ágar MM Petri por 16 h a 30 °C. Os germes de cultivo foram incubados por 20 min com 10 μL de MM contendo 10 μM FM4-64. Após a incubação, um bloco de ágar contendo germlings manchados foi cortado, colocado em 8 μ-slide seguido por uma perseguição de 47 minutos a 30 °C. Os quadros foram capturados a cada 7 minutos a 30 °C usando um microscópio TCS SP8 MP equipado com HC Plan APO 63x, N.A. 1.40 óleo imersão objetivo (com um tamanho de pixel de 184,52 x 184,52 nm). As imagens foram obtidas pelo emocionante FM4-64 em comprimento de onda de 514 nm e detectando fluorescência na banda espectral variando de 596 a 682 nm. O sinal de fluorescência FM4-64 é mostrado como imagem invertida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Estágios iniciais da formação de conidiophore. (A) Conidia de cepa WT foram cultivados em meio de ágar por 136 h a 30 °C, cortados e colocados em poços de um μ-slide. Quadros foram capturados a cada 20 minutos. Imagens de 2048 × 2048 pixels foram coletadas com um tamanho de pixel de 245,2 x 245,2 nm usando um microscópio TCS SP8 MP (Leica, Alemanha), equipado com o HC Plan APO 63x, N.A. 1.40 objetivo de imersão de óleo. As imagens mostram a formação de vesículas conidiophore (seta preta) bem como a formação (seta marrom) e a maturação de metulae (seta azul). (B) As medidas (velocidade de germinação e extensão da ponta hiphal unipolar) de (A) são traçadas como gráfico de linha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: Imagens de células ao vivo de longo prazo de germinação conidial co-expressando PilA-GFP e H1-mRFP. Por favor clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 2: Estágios iniciais de formação conidiophore em A. nidulans. Clique aqui para baixar este Vídeo.
Figura S1: Preparação de suspensão conidial. Raspando com um palito estéril uma superfície de aproximadamente 1 cm2 de uma placa conidiada, uma suspensão de aproximadamente 2 x 106 conidia/ml é obtida. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
Monitorar o crescimento e o fenótipo das células fúngicas por microscopia de lapso de tempo é uma abordagem poderosa para avaliar o comportamento celular em tempo real e quantitativamente e com precisão e determinar com precisão se um tratamento medicamentoso específico e/ou intervenção genética resulta em crescimento celular detectável ou diferenças fenotípicas ao longo do tempo.
Neste estudo, foi descrita uma metodologia confiável de imagem de células vivas para medir e analisar quantitativamente o desenvolvimento fúngico, incluindo a dinâmica do tubo de germe e o crescimento da ponta hífa em A. nidulans. Monitorar alterações morfológicas ao longo do tempo, usando técnicas de microscopia de luz transmitida, pode ser altamente útil para identificar células estressadas, morrendo ou mortas. Um conhecimento detalhado de tais processos dinâmicos no nível unicelular permite avaliar a heterogeneidade dentro de uma população mista de células e, em uma perspectiva de longa data, permite a identificação de caminhos e mecanismos detalhados pelos quais as células respondem a sinais endógenos e ambientais.
Uma vantagem deste método é que ele é baseado em uma abordagem de imagem livre de rótulos (que, no entanto, pode ser facilmente combinada com microscopia de fluorescência) que usa propriedades inerentes de refração de luz das células para criar contraste de imagem sem introduzir corantes/rótulos, o que pode confundir os resultados. Enquanto marcadores fluorescentes podem ser usados para marcar compartimentos celulares e proteínas e facilitar significativamente a segmentação e rastreamento das células, a microscopia de luz transmitida contorna a necessidade de células de engenharia genética, permitindo aos pesquisadores evitar o custo e a otimização de corante/rótulo demorado e também evitar prováveis efeitos fototoxicidade provenientes da fluorescência de imagens13,34.
Este protocolo é adequado para estudar cinética de crescimento de fungos que formam hifa ou pseudohifa. Além disso, essa abordagem é altamente adequada para imagens de diferentes estruturas celulares de diferentes cepas e em diferentes estágios de desenvolvimento. Na Figura 8 e No Vídeo 2,apresentamos os estágios iniciais do desenvolvimento de A. nidulans conidiophore (ou seja, estruturas com esporos assexuados). Deve-se notar, no entanto, que este método não é o mais adequado para a formação de conidiophores de imagem, uma vez que a fome de carbono/nitrogênio e a exposição ao ar, ambas necessárias para o desenvolvimento de conidioforos, não podem ser padronizadas pela nossa abordagem35.
Além disso, este protocolo é pouco adequado para rastrear biofilmes fúnicos, que estão sujeitos à extensão vertical formando uma densa colônia heterogênea, associada à superfície composta por higifética, células pseudohifafas, células de forma de levedura e várias formas de matriz extracelular36. Outra limitação da técnica é que, embora a análise microscópica livre de rótulos represente um método preciso para a análise qualitativa e quantitativa da dinâmica germinação/diferenciação, a avaliação manual desses dados é demorada especialmente quando muitas cepas ou/e condições são examinadas. Assim, os dados da microscopia de imagem de lapso de tempo de alto rendimento devem ser analisados por software computacional adequado, permitindo análise automatizada ou semi-automatizada de imagens do desenvolvimento de higórcias e germinação conidial37,38,39.
Em resumo, aqui apresentamos um protocolo para analisar cinética de crescimento fúngico de forma reprodutível e confiável sem a necessidade de qualquer experiência prévia de análise de imagem do usuário. Este protocolo permite quantificação objetiva e precisa do crescimento fúngico e diferenciação, e fornece uma abordagem de imagem complementar para estudar ciclos de vida fúngicos e patogenicidade fúngica37.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo projeto "Uma Infraestrutura de Pesquisa Grega para Visualização e Monitoramento de Processos Biológicos Fundamentais (BioImaging-GR)" (MIS 5002755) que é implementado sob a Ação "Reforço da Infraestrutura de Pesquisa e Inovação", financiado pelo Programa Operacional "Competitividade, Empreendedorismo e Inovação" (NSRF 2014-2020) e co-financiado pela Grécia e pela E. U.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Imaging slides |
| 4-Aminobenzoic acid | Merck | A9878 | |
| azhAΔ ngnAΔ | Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013 | ||
| Bacto Casamino Acids | Gibco | 223030 | |
| Biotin | Merck | B4639 | |
| Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Merck | C8027 | |
| Glucose | Merck | G8270 | |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | Statistical Software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software | |
| Inoculating Loop | Merck | I8263-500EA | |
| Iron(III) phosphate | Merck | 1.03935 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 63138 | |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Merck | M7899 | |
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Nicotinamide (Niacinamide) | Supelco | 47865-U | |
| Peptone | Millipore | 68971 | |
| Petri Dishes for Microbiology Culture | KISKER | G090 | |
| Potassium chloride | Merck | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | |
| Pyridoxine hydrochloride | Merck | P6280 | |
| Quali - Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile | KISKER | G052-S | |
| Quali - Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile | KISKER | G053-S | |
| Quali - Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL | KISKER | VL004G | |
| Quali - Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL | KISKER | VL700G | |
| Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear | KISKER | GC.TIPS.B | |
| Riboflavin (B2) | Supelco | 47861 | |
| Scalpel blades NO. 11 | OdontoMed2011 | S2771 | |
| Sodium chloride | Merck | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S8045 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Merck | S9640 | |
| VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP) | Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021 | ||
| WT | Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149 | ||
| Yeast Extract | Millipore | 70161 | |
| ZnSO4 |
References
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- Kück, U., Bloemendal, S., Teichert, I. Putting Fungi to Work: Harvesting a Cornucopia of Drugs, Toxins, and Antibiotics. PLoS Pathogens. 10 (3), (2014).
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