Summary
Vi presenterar ett etikettfritt live imaging protokoll med hjälp av överförda lätta mikroskopi tekniker för att fånga bilder, analysera och kvantifiera tillväxt kinetik av filamentous svamp A. nidulaner i både nedsänkta kulturer och fasta medier. Detta protokoll kan användas tillsammans med fluorescensmikroskopi.
Abstract
Det är väl fastställt att kolonitillväxt av filamentösa svampar, främst beroende av förändringar i hyphae/ mycelia apical tillväxttakt, makroskopiskt uppskattas på stelnade medier genom att jämföra kolonistorlek. Att kvantitativt mäta tillväxttakten för genetiskt olika svampstammar eller stammar under olika miljö-/tillväxtförhållanden (pH, temperatur, kol- och kvävekällor, antibiotika osv.) är dock utmanande. Således blir strävan efter kompletterande metoder för att kvantifiera tillväxtkinetik obligatorisk för att bättre förstå svampcellstillväxt. Dessutom är det välkänt att filamentösa svampar, inklusive Aspergillus spp., har distinkta tillväxt- och differentieringssätt under undervattensförhållanden på fasta medier eller nedsänkta kulturer. Här beskriver vi en kvantitativ mikroskopisk metod för att analysera tillväxtkinetik av modellsvampen Aspergillus nidulans, med hjälp av levande avbildning i både nedsänkta kulturer och fasta medier. Vi tar bilder, analyserar och kvantifierar tillväxthastigheter för olika svampstammar på ett reproducerbart och tillförlitligt sätt med hjälp av en öppen källkod, fri programvara för biobilder (t.ex. Fiji), på ett sätt som inte kräver någon tidigare bildanalysexpertis från användaren.
Introduction
Filamentösa svampar är av stor socioekonomisk och ekologisk betydelse, vilket är både avgörande som industriella / jordbruksverktyg för enzym- ochantibiotikaproduktion 1,2 och som patogener hos växtväxter3, skadedjur4 och människor3. Dessutom används filamentösa svampar som Aspergillus nidulaner ofta som modellorganismer för grundforskning, såsom studier i genetik, cell- och evolutionsbiologi samt för studier av hyphalförlängning5. Filamentösa svampar är starkt polariserade organismer som förlänger genom kontinuerlig tillförsel av membranfetter/proteiner och de novo-syntesen av cellväggen vid förlängningsspetsen6. En central roll i hyphalspetstillväxt och polaritetsunderhåll är en specialiserad struktur som heter "Spitzenkorper" (SPK), en högt beställd struktur som mestadels består av cytoskeletala komponenter och den polariserade fördelningen av Golgi6,7,8.
Miljöstimulanser/signaler, sådant vatten-luftgränssnitt, ljus, CO2-koncentration och näringsstatus är ansvariga för de utvecklingsbeslut som fattas av dessa formar9. I nedsänkta (flytande) kulturer undertrycks differentiering av A. nidulaner och tillväxten sker genom hyphalspetsförlängning6. Under vegetativ tillväxt gror asexuella sporer (conidia) i apical förlängning, bildar ett odifferentierat nätverk av sammankopplade hyphalceller, mycelium, som kan fortsätta att växa på obestämd tid så länge näringsämnen och utrymme finns tillgängliga. Å andra sidan, på fasta medier hyphal tips förlänga och efter en definierad period av vegetativ tillväxt (utvecklingskompetens), asexuell reproduktion initieras och antenn conidiophore stjälkar sträcker sig från specialiserade fotceller i mycelium6. Dessa ger upphov till specialiserade utvecklingsmässiga multicellulära strukturer som kallas conidiophores, som producerar långa kedjor av haploid conidia10 som kan starta om tillväxten under gynnsamma miljöförhållanden.
En allmänt använd metod för att mäta filamentös svamptillväxt är att inokulera sporer på näringsagar som finns i en petriskål och makroskopiskt mäta kolonins diameter några dagar senare11. Kolonins diameter/område, mest beroende av förändringar i mycelial tillväxthastighet och mindre på conidiophore densitet12, används sedan som ett tillväxtvärde. Även om mätning av svamppopulationens (koloni) storlek som växer på fasta ytor är ganska tillräcklig, är det inte på något sätt det mest exakta måttet på tillväxt. Jämfört med medelvärden på befolkningsnivå (medelvärden av svampkolonistorlek) kan encelliga mätningar fånga heterogeniteten hos en cellpopulation och tillåta identifiering av nya subpopulationer av celler,stater 13, dynamik, vägar samt de biologiska mekanismer genom vilka celler svarar på endogena och miljömässigaförändringar 14,15. Övervakning av svamp cell tillväxt och fenotyp av time-lapse mikroskopi är utan tvekan den mest använda kvantitativa encelliga observation strategi.
Häri beskriver vi ett etikettfritt live imaging-protokoll med hjälp av överförda ljusmikroskopitekniker (såsom faskontrast, differentialinterferenskontrast (DIC) och polariserad mikroskopi) för att fånga bilder, som oberoende av den kombinerade användningen av fluorescensmikroskopi kan användas för att analysera och kvantifiera polar tillväxt av A. nidulansstammar i både nedsänkta kulturer och fasta medier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Inokulatpreparat
OBS: Alla steg ska utföras under ett laminärt flödesskåp.
- Strecka ut svampstam av intresse, från ett glycerollager (-80 °C) med hjälp av en steril inokuleringsslinga, på plattor av minimalt medium (MM) kompletterat med lämpliga näringsbehov som är relevanta för den undersökta stammen [MM: 10,0 g/L glukos, 20 ml/L saltlösning (saltlösning: 26 g/L KCl, 26 g/L MgSO4·7H2O, 76 g/L KH2PO4,2,0 ml/L kloroform) och 1 ml/L spårämnen (spårämnen: 40 mg/L Na2B4O7· H2O, 400 mg/L CuSO4,8 g/L ZnSO4,800 mg/L MnSO4,800 mg/L FePO4),justera pH till 6,8 med 1 M NaOH, tillsätt 1 % (w/v) agar och de nödvändiga tilläggen enligtbeskrivningen i 16 och autoklav] ( figur1).
OBS: Saltlösning, spårämnen lösning och kosttillskott är autoklaverade. - Inkubera i 2-3 dagar vid 37 °C.
- Använd en steril tandpetare (eller en inokuleringsslinga), överför ett litet antal conidia, genom att försiktigt vidröra en enda koloni, till plattor av kompletta medier (CM) [CM: 10,0 g/L glukos, 2,0 g/L pepton, 1,0 g/L jästextrakt, 1,0 g/L casaminosyror, 20 ml/L saltlösning, 1 mL/L spårämnen, 5 ml/L vitaminlösning (vitaminlösning: 0,1 g/L riboflavin, 0,1 g/L nikotinamid, 0,01 g/L p-aminobensoesyra, 0,05 g/L pyridoxin HCl, 1,0 mg/L biotin), justera pH till 6,8 med 1 M NaOH, tillsätt 1 % (w/v) agar och de nödvändiga kosttillskotten enligtbeskrivningen i 16 och autoklaven]. Autoklav och förvara vitaminlösningen i en mörk flaska vid 4 °C.
OBS: Om svamptillväxten är för tät för att identifiera och isolera enskilda kolonier, re-streak på en ny agarplatta för att få enstaka kolonier. - Inkubera i 3-4 dagar vid 37 °C.
- Få en kondatorisk suspension på cirka 2 x 106 celler/ml genom att skrapa 1 cm från ytan på en konidierad svampkoloni som odlas på CM-agarplattor med hjälp av en steril tandpetare (figur S1).
OBS: Vid behov, räkna conidia med en hemocytometer. - Skörda conidia av A. nidulaner i ett sterilt 1,5 ml centrifugeringsrör med 1,0 ml autoklaverat destillerat vatten som innehåller 0,05 % (v/v) Tween 80 för att minska antalet conidiaklumpar.
OBS: Conidia kan lagras i upp till 2-3 veckor vid 4 °C utan relevant förlust av livskraft (A. Athanasopoulos och V. Sophianopoulou, opublicerade data). Det rekommenderas dock att filtrera och/eller tvätta kondiell suspension för att ta bort myceliala delar och näringsämnen, för att förhindra kondial svullnad.
2. Förberedelse för avbildning av filamentösa svampar som växer på agar (fasta) medier
OBS: En modifierad version av den "inverteradeagarmetoden 17,18 används.
- Inledningsvis, punkt 10 μL alikvoter av kraftigt virvelförvirrade kondiater (cirka 2 x 104 celler/ml) vid flera punkter på petriskålar (Ø9 cm) 15 ml MM med 1% (w/v) agar (Figur 2).
OBS: Med hjälp av den modifierade versionen av den "inverterade agarmetoden" är det möjligt att avbilda svampprover i många timmar utan uppenbara skadliga effekter på växande hyphae. - Inkubera den experimentella kulturen enligt det utvecklingsstadium som är avsett att undersökas.
- Skiva ut ett ≈0,8 mm2 block agar som innehåller kolonin med en steril skalpell.
OBS: Storleken på agarblocket som ska skäras ut beror på dimensionerna på den utrustning som ska placeras efteråt. I det aktuella verket används 8 μ-bilder (se nedan). - Vänd och placera agarblocket i en brunn av en μ-slide eller liknande 8 kammade täckglas med täckglas som är lämpliga för levande avbildning.
OBS: Om överförd ljusmikroskopi kommer att användas i kombination med fluorescens (märkning) mikroskopi, kan agarblocket inverteras på en droppe flytande medium som innehåller färgämnet för levande celler, strax före avbildning.
3. Förberedelse för avbildning av filamentösa svampar som växer på flytande medium
- Överför 10 μL alikvoter av en kraftigt virvelförvirrade kondidialupphängning (cirka 2 x 104 celler/ml) i brunnarna på en 8 brunn μ-bild som innehåller 200 μL (flytande) MM med lämpliga kosttillskott (se ovan).
- Inkubera under önskad tid vid önskad temperatur (bild 3).
OBS: Om överförd ljusmikroskopi kommer att användas i kombination med fluorescens (märkning) mikroskopi, har flytande kulturer den stora fördelen att fluorescerande färgämnen kan tillsättas vid önskad tidpunkt under experimentet19.
4. Ta bilder
OBS: Valet av mikroskop beror på tillgänglig utrustning. I vilket fall som helst bör mikroskopinställningen innehålla ett inverterat steg, en miljökammare eller åtminstone ett rum med exakt lufttemperaturreglering.
- Förvärm den termostaterade mikroskopkammaren vid 37 °C (om inget annat anges eller är lämpligt för de använda svamparterna) för att stabilisera temperaturen innan den börjar. Denna kammare tillåter temperaturmodulering av mikroskopoptiken och provstadiet under tidsfördröjningsexperiment. Var medveten om att optiska avvikelser20 införs när normala nedsänkningsoljor (avsedda för användning vid 23 °C) oljor används vid 37 °C eller högre.
OBS: På en stram budget kan inkubationskammare tillverkas av kartong och isolerande förpackningsmaterial21 eller med hjälp av en 3D-skrivare22. - Slå på mikroskopet, skannereffekten, laserkraften och datorn och ladda bildframställningsprogramvaran. Placera μ (förberedd tidigare) i mikroskopstadiet och fokusera.
- Hitta synfält som innehåller isolerade/inte överlappande celler (eller åtminstone inte överfulla), för att underlätta tillväxtmätningar under bildanalys. Fånga minst 50 växande celler per prov för att möjliggöra robust statistisk analys.
- Välj önskad överförd ljusmikroskopimetod. Minska exponeringstiden eller lasereffekten och pixeldrubbartiden och/eller öka pinholediametrarna för att minimera fotoblekning av svampceller, enligt beskrivningen på annat håll 23,24.
- Ställ in mikroskopet för att hämta bilder med önskade tidsintervall och starta tidsserieförvärv.
OBS: För att korrigera för fokal drift över tid (särskilt för långa experiment), på grund av termisk drift, olika cellstorlekar och cellrörelse, använd en autofokusstrategi om den finns i mikroskopprogramvaran.
5. Bildanalys
OBS: I det här avsnittet beskrivs de viktigaste stegen för bearbetning av tidsfördröjningsmikroskopibilder för att mäta tillväxttakten för A. nidulaner. Öppning, visualisering och bearbetning av bilder utförs med open source ImageJ / Fiji programvara25.
- Importera bilderna till Fiji med plugins | Bioformat | Importör av bioformat från Fiji-menyn med standardinställningar (bild 4A).
OBS: Kontrollera om importören för bioformat känner igen bildkalibreringen korrekt. Bilddimensionen som visas i det övre bildfönstret i informationsfältet måste vara lika med de ursprungliga bilddimensionerna (bild 4B). Tryck på Skift + P för att visa och ändra bildegenskaper i ImageJ/Fiji-programvaran. - Använd vid behov histogram som matchar26 för belysningskorrigering mellan olika bildrutor(bild | Justera | Blekmedelskorrigering | Histogrammatchning(figur 4C).
- Om det behövs, använd SIFT-algoritm (Plugins | Registreringsnummer | Linjär stapeljustering med SIFT) för justering eller matchning av bildstaplar (Bild 4D). Att välja "Översättning" från den förväntade omvandlingsmenyn bör räcka för att korrigera alla x-y-drifter.
Andra plugins kan också användas för att justera en stapel med bildsegment, till exempel Bildstabilisator (https://imagej.net/Image_Stabilizer) eller StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/). - Välj hyphae som växer parallellt med coverslip, undvika de som lutas. Var noga med att välja hyphae som förökar sig genom polär förlängning och undvika hyphae presenterar laterala och/eller apatiska förgrening.
- Använd MTrackJ(Plugins | MTrackJ) plugin för att spåra växande hyphal tips (Bild 4E)27. Om du vill lägga till ett spår markerar du knappen Lägg till i verktygsfältet och placerar den första punkten vid en hyphalspets med vänster musklick. Tidsserien flyttas automatiskt till nästa bildruta. Om du vill slutföra spårningsprocessen dubbelklickar du med musen på den sista punkten (eller trycker på Esc-tangenten) (Bild 4F). Flytta till en annan intressant punkt (dvs. växande hyphalspets) under den första tidsramen och starta om proceduren genom att mäta tillväxttakten för en annan hypha.
OBS: För att installera MTrackJ följ instruktionerna som presenteras https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ - Klicka på knappen Mät i dialogrutan MTrackJ (Bild 4G) för att öppna utdatatabellen. Spara spårmätningar (| Spara som) till önskat filformat (t.ex. csv), analysera och rita dem (Bild 4H).
Genom att välja filmknappen produceras en film som visar bilden och spårförloppet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter detta protokoll tog vi och analyserade olika bilder som motsvarar olika tillväxt/ utvecklingsstadier av den filamentösa svampen A. nidulans. De data som presenterades i denna studie bearbetades och analyserades med hjälp av Fiji-programvaran. Mätningar sparades som csv filer, statistiskt analyseras och förbereddes som grafer med hjälp av kommersiell statistisk programvara och /eller Python programmering språk med hjälp av mjukvarubibliotek som pandor, numpy, statsmodels, matplotlib och seaborn. Mer information finns i de citerade originalpublikationerna.
För att tolka populationernas reaktion är det viktigt att fastställa heterogeniteten hos nyckelparametrar inom populationerna och att effektivt identifiera fysiologiskt distinkta subpopulationer28. Figur 5 visar tillväxten av azhAΔ ngnAΔ-mutantstammen, med borttagningar i två gener, vars produkter är inblandade i avgiftning och assimilering av den giftiga fytoprodukten L-azetidin-2- karboxylsyra29, i jämförelse med WT-stammen. Genom att mäta deras tillväxttakt i vätskor under vatten kan vi upptäcka en statistiskt signifikant lägre tillväxthastighet för den dubbla mutanten jämfört med WT-stammen (t(715) = 20,61, p = <0 0001) (Figur 5A-B). Denna skillnad i tillväxt kunde inte detekterlig mäta endast koloniområdet för dessa stammar (Figur 5C-D), betonar att mikroskopisk encellsanalys är effektivare för att bestämma små skillnader i tillväxthastigheter som är svåra att upptäcka med makroskopisk observation av kolonin.
Encellig långsiktig live imaging är av betydande värde i försöket att erhålla rumslig och tidsmässig information om cellulära protein dynamik. Långsiktig levande cellavbildning (Figur 6, Video 1) av conidial spiring co-uttrycker GFP-märkt kärna eisosomal protein PilA och mRFP-histonen H1 visar att PilA30 bildar statiska strukturer med låg rörlighet vid svampplasmamembran31,32. Figur 7 visar dessutom att fluorescerande färgämnen kan användas för levande avbildning av stammar som odlas på agarmedium, för att studera dynamiken hos organeller och cellstrukturer. Här användes FM4-6433 för att visualisera mitokondriellt nätverk och vacuolar-systemet i A. nidulans.
Figur 1: Schematisk representation av inokulatberedningsförfarandet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Schematisk representation av proceduren följt för bildfilamentösa svampar som växer på agar medium. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Schematisk representation av proceduren som följs för avbildning av filamentösa svampar som växer i flytande medium.
Figur 4: Schematisk representation av bildanalysproceduren. Steg för bearbetning av tidsfördröjningsmikroskopibilder och mätning av tillväxthastighet för A. nidulaner. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Jämföra traditionella populationsmätningar med encellsmätningar. a)Representativa konfokala mikroskopibilder av azhAΔ ngnAΔ dubbel borttagning och WT-stammar, odlade i nedsänkta vätskekulturer som innehåller karbamid som enda kvävekälla vid 25 °C. Alla stammar inkuberades för totalt 18 h, vid 25 °C och ramar fångades med 15 minuters intervall. Bilder av 2048 × 2048 pixlar samlades in med en pixelstorlek på 115,02 x 115,02 nm med hjälp av ett TCS SP8 MP -mikroskop (Leica, Tyskland) utrustat med HC Plan APO 63x, N.A. 1.40 oljesänkningsmål. B)Mätningarna avAritas i box-and-whiskers-tomter. Statistisk signifikans analyserades via t-Test och avbildas med asterisker (***), vilket indikerar p < 0,001. (C) Tillväxt vid 25 °C WT och dubbel borttagningsbelastning på fast MM. Kolonier fotograferades med olika tidsintervall (18 h, 36 h och 72 h), rumsligt kalibrerade och mätte manuellt med en linjal i ImageJ-programmet. D)Mätningar av det område av kolonier som presenteras iCritas upp som box-and-whiskers-områden. Skillnaderna i koloniernas område var inte statistiskt signifikanta mellan de olika tidpunkterna för dubbelmutanten jämfört med WT-stammen (18h: t(8) = 0, 69, p = 0,50, 36h: t(6) = 0,27, p = 0,5068, 72h: t(6) = 0,39, p = 0,70 ). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6:Långsiktig levande cellavbildning av konidial grobarhet som uttrycker proteiner av intresse som smälts samman med genetiskt kodade fluorescerande taggar. a)Maximala intensitetsprognoser (MIP) på 4 skivor som genereras i z-planet, av en stam som uttrycker PilA-GFP och H1-mRFP. Conidia sågs på agarmedium och inkuberades i cirka 1 h vid 30 °C för att hjälpa till att vidhäfta cellerna till agar. Agarblocket som innehåller conidia skivades ut, placerades i brunnar av en μ-slide och inkuberades för totalt 18 h, vid 30 °C. Ramar fångades med 25 minuters intervall, med hjälp av ett TCS SP8 MP (Leica, Tyskland) mikroskop utrustat med HC Plan APO 63x, N.A. 1.40 oljesänkningsmål (med en pixelstorlek på 92,26 x 92,26 nm). Bilder erhölls av spännande GFP vid 488 nm våglängd och detekterar fluorescens i spektralbandet från 495 till 558 nm, och genom spännande mRFP vid 561-nm våglängd och upptäcka fluorescens i spektralbandet från 580 till 660 nm. B) Mätningar (hastigheten på spiring och hyphalspetsförlängning) av( A) ritas som linjediagram. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 7:FM4-64 märkning av hyphae som växer på fast medium. Conidia av en WT stam odlades på 1% agar MM Petri rätter för 16 h vid 30 °C. De växande bakterierna inkuberades i 20 min med 10 μL MM innehållande 10 μM FM4-64. Efter inkubation skars ett agarblock som innehåller färgade bakterier ut, placerades i 8 μ-slide följt av en 47 minuters jakt vid 30 °C. Ramar fångades var 7:e minut vid 30 °C med hjälp av ett TCS SP8 MP-mikroskop utrustat med HC Plan APO 63x, N.A. 1,40 oljesänkningsmål (med en pixelstorlek på 184,52 x 184,52 nm). Bilder erhölls av spännande FM4-64 vid 514-nm våglängd och detekterar fluorescens i spektralbandet från 596 till 682 nm. FLUORESCENSsignalen FM4-64 visas som inverterad bild. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 8: Tidiga stadier av konidiophorebildning. (A) Conidia av WT-stam odlades på agarmedium i 136 timmar vid 30 °C, skivades ut och placerades i brunnar av en μ-slide. Ramar fångades var 20:e minut. Bilder av 2048 × 2048 pixlar samlades in med en pixelstorlek på 245,2 x 245,2 nm med hjälp av ett TCS SP8 MP (Leica, Tyskland) mikroskop, utrustat med HC Plan APO 63x, N.A. 1.40 oljesänkningsmål. Bilder visar bildandet av conidiophore vesicles (svart pil) samt bildandet (brun pil) och mognad av metulae (blå pil). B) Mätningar (grobarhet och enpolig hyphalspetsförlängning) av (A) ritas som linjediagram. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Video 1: Långsiktig live cell imaging av conidial spiring co-expressing PilA- GFP och H1-mRFP. Klicka här för att ladda ner denna video.
Video 2: Tidiga stadier av conidiophore formationin A. nidulans. Klicka här för att ladda ner denna video.
Figur S1: Förberedelse av kondiell suspension. Genom att skrapa med en steril tandpetare en cirka 1 cm2 yta av en konidierad platta erhålls en suspension på cirka 2 x 106 conidia/ml. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Övervakning av svampcellstillväxt och fenotyp genom timelapsemikroskopi är ett kraftfullt tillvägagångssätt för att bedöma cellulärt beteende i realtid och kvantitativt och exakt avgöra om en viss läkemedelsbehandling och/ eller genetisk intervention resulterar i detekterbar celltillväxt eller fenotypiska skillnader över tiden.
I denna studie beskrevs en tillförlitlig live-cell imaging metodik för att mäta och kvantitativt analysera svamp utveckling, inklusive dynamiken i bakterie rör och hyphal spets tillväxt i A. nidulans. Övervakning av morfologiska förändringar över tid, med hjälp av överförda ljusmikroskopitekniker, kan vara till stor hjälp för att identifiera celler som är stressade, döende eller döda. En detaljerad kunskap om sådana dynamiska processer på encellsnivå gör det möjligt att bedöma heterogenitet inom en blandad population av celler och i ett långsiktigt perspektiv tillåter identifiering av vägar och detaljerade mekanismer genom vilka celler svarar på endogena och miljömässiga signaler.
En fördel med denna metod är att den bygger på en etikettfri bildbehandlingsmetod (som ändå lätt kan kombineras med fluorescensmikroskopi) som använder inneboende ljusbrytningsegenskaper hos celler för att skapa bildkontrast utan att införa färgämnen / etiketter, vilket kan förvirra resultaten. Medan fluorescerande markörer kan användas för att märka cellulära fack och proteiner och avsevärt underlätta segmentering och spårning av celler, kringgår överförd ljusmikroskopi behovet av gentekniska celler, vilket gör det möjligt för forskare att undvika kostnaden och den tidskrävande färg-/etikettoptimeringen och även för att undvika sannolika fototoxicitetseffekter som kommer från fluorescensavbildning13,34.
Detta protokoll är lämpligt för att studera tillväxt kinetik av svampar som bildar hyphae eller pseudohyphae. Dessutom är detta tillvägagångssätt mycket lämpligt för avbildning av olika cellstrukturer av olika stammar och under olika utvecklingsstadier. I figur 8 och video 2presenterar vi de inledande stadierna av A. nidulans conidiophore (dvs. strukturer med asexuella sporer) utveckling. Det bör dock noteras att denna metod inte är den mest lämpliga för avbildning av konidiophorebildning, eftersom kol/ kväve svält och luftexponering, båda nödvändiga för utveckling av conidiophores, inte kan standardiseras genom vår strategi35.
Dessutom är detta protokoll dåligt lämpat för spår av svampbiofilmer, som är föremål för vertikal förlängning som bildar en tät heterogen, ytkomponerad koloni bestående av filamentös hyphae, pseudohyphalceller, jästformsceller och olika former av extracellulär matris36. En annan begränsning av tekniken är att även om etikettfri mikroskopisk analys representerar en exakt metod för kvalitativ och kvantitativ analys av spirings-/differentieringsdynamik, är manuell utvärdering av sådana data tidskrävande, särskilt när man undersöker många stammar eller/och villkor. Således bör data från högpresterande tidsfördröjningsmikroskopi analyseras av lämplig beräkningsprogramvara som möjliggör automatiserad eller halvautomatisk bildanalys av hyphalutveckling och conidial spiring37,38,39.
Sammanfattningsvis presenterar vi häri ett protokoll för att analysera svamptillväxtkinetik på ett reproducerbart och tillförlitligt sätt utan att användaren behöver någon tidigare bildanalysupplevelse. Detta protokoll möjliggör objektiv och korrekt kvantifiering av svamptillväxt och differentiering, och ger en kompletterande bildbehandlingsmetod för att studera svamplivscykler och svamppatogenicitet37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av projektet "A Greek Research Infrastructure for Visualizing and Monitoring Fundamental Biological Processes (BioImaging-GR)" (MIS 5002755) som genomförs inom ramen för åtgärden "Förstärkning av forsknings- och innovationsinfrastrukturen", finansierad av det operativa programmet "Konkurrenskraft, entreprenörskap och innovation" (NSRF 2014–2020) och medfinansierat av Grekland och E. U.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Imaging slides |
| 4-Aminobenzoic acid | Merck | A9878 | |
| azhAΔ ngnAΔ | Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013 | ||
| Bacto Casamino Acids | Gibco | 223030 | |
| Biotin | Merck | B4639 | |
| Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Merck | C8027 | |
| Glucose | Merck | G8270 | |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | Statistical Software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software | |
| Inoculating Loop | Merck | I8263-500EA | |
| Iron(III) phosphate | Merck | 1.03935 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 63138 | |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Merck | M7899 | |
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Nicotinamide (Niacinamide) | Supelco | 47865-U | |
| Peptone | Millipore | 68971 | |
| Petri Dishes for Microbiology Culture | KISKER | G090 | |
| Potassium chloride | Merck | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | |
| Pyridoxine hydrochloride | Merck | P6280 | |
| Quali - Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile | KISKER | G052-S | |
| Quali - Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile | KISKER | G053-S | |
| Quali - Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL | KISKER | VL004G | |
| Quali - Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL | KISKER | VL700G | |
| Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear | KISKER | GC.TIPS.B | |
| Riboflavin (B2) | Supelco | 47861 | |
| Scalpel blades NO. 11 | OdontoMed2011 | S2771 | |
| Sodium chloride | Merck | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S8045 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Merck | S9640 | |
| VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP) | Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021 | ||
| WT | Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149 | ||
| Yeast Extract | Millipore | 70161 | |
| ZnSO4 |
References
- Kumar, A. Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications. International Journal of Microbiology. 2020, 8894215 (2020).
- Kück, U., Bloemendal, S., Teichert, I. Putting Fungi to Work: Harvesting a Cornucopia of Drugs, Toxins, and Antibiotics. PLoS Pathogens. 10 (3), (2014).
- Paterson, R. R. M., Lima, N. Filamentous Fungal Human Pathogens from Food Emphasising Aspergillus, Fusarium and Mucor. Microoraganism. 5 (3), (2017).
- Wang, C., Wang, S. Insect Pathogenic Fungi: Genomics, Molecular Interactions, and Genetic Improvements. Annual Review of Entomology. 62, 73-90 (2017).
- Etxebeste, O., Espeso, E. A. Aspergillus nidulans in the post-genomic era: a top-model filamentous fungus for the study of signaling and homeostasis mechanisms. International Microbiology. 23 (1), 5-22 (2020).
- Riquelme, M., et al. Fungal Morphogenesis, from the Polarized Growth of Hyphae to Complex Reproduction and Infection Structures. Microbiology and Molecular Biology Reviews MMBR. 82 (2), (2018).
- Athanasopoulos, A., André, B., Sophianopoulou, V., Gournas, C.
- Pantazopoulou, A., Peñalva, M. A. Organization and Dynamics of the Aspergillus nidulans Golgi during Apical Extension and Mitosis. Molecular Biology of the Cell. 20 (20), 4335-4347 (2009).
- Bayram, Ö, Feussner, K., Dumkow, M., Herrfurth, C., Feussner, I., Braus, G. H. Changes of global gene expression and secondary metabolite accumulation during light-dependent Aspergillus nidulans development. Fungal Genetics and Biology. 87, 30-53 (2016).
- Yu, J. -H. Regulation of Development in Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus. Mycobiology. 38 (4), 229-237 (2010).
- Tomkins, R. G. Measuring growth: The petri dish method. Transactions of the British Mycological Society. 17 (1-2), 150-153 (1932).
- Gifford, D. R., Schoustra, S. E. Modelling colony population growth in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Journal of Theoretical Biology. 320, 124-130 (2013).
- Kasprowicz, R., Suman, R., O'Toole, P. Characterising live cell behaviour: Traditional label-free and quantitative phase imaging approaches. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 89-95 (2017).
- Aknoun, S., et al. Quantitative phase microscopy for non-invasive live cell population monitoring. Scientific Reports. 11, (2021).
- Chessel, A., Carazo Salas, R. E. From observing to predicting single-cell structure and function with high-throughput/high-content microscopy. Essays in Biochemistry. 63 (2), 197-208 (2019).
- Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).
- Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. Live-cell Imaging of Filamentous Fungi Using Vital Fluorescent Dyes and Confocal Microscopy. Methods in Microbiology. 34, 63-87 (2004).
- Trinci, A. P. J. A Kinetic Study of the Growth of Aspergillus nidulans and Other Fungi. Journal of General Microbiology. 57 (1), 11-24 (1969).
- Lichius, A., Zeilinger, S. Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi. Journal of Visualized Experiments. (153), e60613 (2019).
- Oomen, L. C. J. M., Sacher, R., Brocks, H. H. J., Zwier, J. M., Brakenhoff, G. J., Jalink, K. Immersion oil for high-resolution live-cell imaging at 37°C: optical and physical characteristics. Journal of Microscopy. 232 (2), 353-361 (2008).
- Distel, M., Köster, R. In Vivo Time-Lapse Imaging of Zebrafish Embryonic Development. CSH protocols. 2007, (2007).
- Walzik, M., et al. A portable low-cost long-term live-cell imaging platform for biomedical research and education. Biosensors and Bioelectronics. 64, (2014).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. The Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Miura, K. Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences. F1000Research. 1000, 1494 (2020).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for Cell and Particle Tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Strovas, T. J., Lidstrom, M. E. Population heterogeneity in Methylobacterium extorquens AM1. Microbiology. 155, Pt 6 2040-2048 (2009).
- Biratsi, A., Athanasopoulos, A., Kouvelis, V. N., Gournas, C., Sophianopoulou, V. A highly conserved mechanism for the detoxification and assimilation of the toxic phytoproduct L-azetidine-2-carboxylic acid in Aspergillus nidulans. Scientific Reports. 11 (1), 7391 (2021).
- Athanasopoulos, A., Boleti, H., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome distribution and localization in the meiotic progeny of Aspergillus nidulans. Fungal Genetics and Biology. 53, 84-96 (2013).
- Vangelatos, I., Roumelioti, K., Gournas, C., Suarez, T., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome Organization in the Filamentous AscomyceteAspergillus nidulans. Eukaryotic Cell. 9 (10), 1441-1454 (2010).
- Athanasopoulos, A., Gournas, C., Amillis, S., Sophianopoulou, V. Characterization of AnNce102 and its role in eisosome stability and sphingolipid biosynthesis. Scientific Reports. 5 (1), (2015).
- Peñalva, M. A. Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64. Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).
- Versari, C., et al. Long-term tracking of budding yeast cells in brightfield microscopy: CellStar and the Evaluation Platform. Journal of The Royal Society Interface. 14 (127), 20160705 (2017).
- Adams, T. H., Wieser, J. K., Yu, J. -H.
- Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F.
- Brunk, M., Sputh, S., Doose, S., van de Linde, S., Terpitz, U. HyphaTracker: An ImageJ toolbox for time-resolved analysis of spore germination in filamentous fungi. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Baum, T., Navarro-Quezada, A., Knogge, W., Douchkov, D., Schweizer, P., Seiffert, U. HyphArea-Automated analysis of spatiotemporal fungal patterns. Journal of Plant Physiology. 168 (1), 72-78 (2011).
- Barry, D. J., Williams, G. A., Chan, C. Automated analysis of filamentous microbial morphology with AnaMorf. Biotechnology Progress. 31 (3), 849-852 (2015).
