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Biology

Zweischichtige Membran-Sandwich-Methode für Laodelphax striatellus Speichelsammlung

Published: August 27, 2021 doi: 10.3791/62831
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2
1State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2National Plant Gene Research Center, 3University of the Chinese Academy of Sciences

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode, um mit einem künstlichen Medium ausreichend Speichel von piercing-saugenden Insekten zu sammeln. Dies ist eine bequeme Methode, um Insektenspeichel zu sammeln und die Speichelfunktion auf das Fressverhalten von Insekten und die Übertragung von vektorübertragenen Viren zu untersuchen.

Abstract

Das Reisstreifenvirus (RSV), das in Ostasien zu erheblichen wirtschaftlichen Verlusten der Landwirtschaft führt, hängt für seine effektive Übertragung unter wirtseigenem Reis vollständig von Insektenvektoren ab. Laodelphax striatellus (Kleine braune Zwergzikade, SBPH) ist der primäre Insektenvektor, der RSV horizontal überträgt, während er Saft aus dem Phloem saugt. Speichel spielt eine bedeutende Rolle im Fressverhalten von Insekten. Eine praktische Methode, die für die Erforschung des Speichels von Insekten mit piercing-saugendem Fressverhalten nützlich sein wird, wird hier beschrieben. Bei dieser Methode durften sich Insekten von einer künstlichen Diät ernähren, die zwischen zwei gestreckten Paraffinfilmschichten eingeklemmt war. Die Diät, die den Speichel enthielt, wurde jeden Tag gesammelt, filtriert und für weitere Analysen konzentriert. Schließlich wurde die Qualität des gesammelten Speichels durch Proteinfärbung und Immunoblotting untersucht. Diese Methode wurde durch den Nachweis von RSV und einem Mucin-ähnlichen Protein im Speichel von SBPH veranschaulicht. Diese künstliche Fütterungs- und Speichelsammelmethode wird eine Grundlage für die weitere Erforschung von Faktoren im Speichel von Insekten im Zusammenhang mit dem Fressverhalten und der Virusübertragung bilden.

Introduction

Reisstreifenvirus (RSV), ein negativ gestrandetes RNA-Virus der Gattung Tenuivirus,verursacht schwere Erkrankungen in der Reisproduktion in Ostasien1,2,3. Die Übertragung von RSV von infizierten Reispflanzen auf gesunde pflanzen hängt von Insektenvektoren ab, hauptsächlich Laodelphax striatellus, die RSV persistent-propagierend übertragen. SBPH erwirbt das Virus nach der Fütterung von RSV-infizierten Pflanzen. Einmal im Inneren des Insekts infiziert RSV einen Tag nach der Fütterung die Mitteldarmepithelzelle und passiert dann die Mitteldarmbarriere, um die Hämolymphe zu durchdringen. Anschließend breitet sich RSV über die Hämolymphe in verschiedene Gewebe aus und vermehrt sich dann. Nach einer Latenzzeit von etwa 10-14 Tagen nach dem Erwerb kann das Virus in der Speicheldrüse über den sezernierten Speichel auf die gesunden Wirtspflanzen übertragen werden, während SBPH Saft aus dem Phloemsaugt 4,5,6,7,8,9,10 . Ein effizienter Fütterungsprozess und verschiedene Faktoren im Speichel sind für die Ausbreitung von RSV vom Insekt auf die Wirtspflanze unerlässlich.

Es wird angenommen, dass Insektenspeichel, der von Speicheldrüsen abgesondert wird, Insekten, Viren und Wirtspflanzen vermittelt. Hemiptera-Insekten produzieren normalerweise zwei Arten von Speichel: gelierenden Speichel und wässrigen Speichel11,12,13. Gelierender Speichel wird hauptsächlich in das Apoplasma ausgeschieden, um die Bewegung des Stylets zwischen den Wirtszellen aufrechtzuerhalten, und ist auch mit der Überwindung der Pflanzenresistenz und der Immunantworten verbunden14,15,16,17. In der Sondierungsphase der Fütterung sezernieren Insekten intermittieren sie gelierenden Speichel, der sofort oxidiert wird, um einen Oberflächenflansch zu bilden. Dann umschließen einzelne oder verzweigte Hüllen den Stylet, um einen röhrenförmigen Kanal18,19,20zu reservieren. Es wird angenommen, dass der Oberflächenflansch an der Epidermis das Eindringen in den Stylet erleichtert, indem er als Ankerpunkt dient, während die Ummantelungen um den Stylet mechanische Stabilität und Schmierung bieten können16,21,22,23. Nlshp wurde als essentielles Protein für die Speichelscheidenbildung und die erfolgreiche Fütterung der braunen Zwergzikade(Nilaparvata lugens,BPH) identifiziert. Die Hemmung der Expression des strukturellen Mantelproteins (SHP), das von der Blattlaus Acyrthosiphon pisum sezerniert wird, reduzierte seine Fortpflanzung, indem die Fütterung aus wirtsiebröhren unterbrochen wurde24. Darüber hinaus sollen Gelspeichelfaktoren bei einigen Insektenarten pflanzliche Immunantworten auslösen, indem sie sogenannte Pflanzenfresser-assoziierte molekulare Muster (HAMPs) bilden. In N. lugensinduziert NlMLP, ein Mucin-ähnliches Protein, das mit der Scheidenbildung zusammenhängt, pflanzliche Abwehrkräfte gegen die Fütterung, einschließlich Zelltod, die Expression von verteidigungsbezogenen Genen und Kallosettenablagerung 25,26. Es wurde auch nachgewiesen, dass einige Gelspeichelfaktoren bei Blattläusen pflanzenabwehrreaktionen über Gen-zu-Gen-Interaktionen ähnlich den pathogenassoziierten molekularen Musternauslösen 12,15,27.

Für die Untersuchung der Speichelfaktoren, die für die Fütterung von Insekten und / oder die Übertragung von Krankheitserregern unerlässlich sind, ist es notwendig, den sekretierten Speichel zu analysieren. Hier werden künstliche Fütterungs- und Entnahmemethoden beschrieben, um ausreichende Mengen an Speichel für die weitere Analyse zu erhalten. Mit einem Medium, das nur ein einziges Nährstoff enthielt, wurden viele Speichelproteine gesammelt und durch Silberfärbung und Western Blotting analysiert. Diese Methode wird bei der weiteren Erforschung von Faktoren im Speichel hilfreich sein, die für die RSV-Übertragung durch SBPH unerlässlich sind.

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Protocol

1. SBPH-Wartung

  1. Aufzucht der viruliferen und RSV-freien SBPH-Individuen in einem Glasinkubator (65 x 200 mm) mit 5-6 Reissämlingen(Oryza sativa cv. Nipponbare) pro Glaskammer im Labor. Wachsen Sie die Reispflanzen bei 25 ° C unter einer 16 h hellen / 8 h dunklen Photoperiode.
    HINWEIS: Die viruliferen und RSV-freien SBPH-Individuen wurden ursprünglich in der Provinz Jiangsu, China, gefangen.
  2. Nachweis von RSV in SBPH durch dot-enzym-linked immunosorbent assay (dot-ELISA) mit einem Kaninchen-RSV-spezifischen polyklonalen Antikörper (siehe Materialtabelle), dergegen die RSV-Ribonukleoproteine (RNPs) aufgezogen wurde.
    HINWEIS: Um eine hohe Infektionseffizienz der Nachkommen zu gewährleisten, wurden virulifere Weibchen separat gehalten und 15% ihrer Nachkommen wurden nach dem Zufallsprinzip auf eine RSV-Infektion getestet. Die Einzelheiten des Punkt-ELISA sind in den Schritten 1.3-1.7 beschrieben.
  3. Homogenisieren Sie einzelne SBPH in 20 μL Beschichtungspuffer (0,05 MNa2CO3-NaHCO3, pH 9,5). Spot 3 μL von jedem auf Nylonmembran (siehe Tabelle der Materialien) und trocknen Sie dann die Membran bei Raumtemperatur (RT).
  4. Inkubieren Sie die Membran mit 15 ml Sperrpuffer (PBS + 3% Magermilch) für 30 min bei Raumtemperatur.
  5. Inkubieren Sie die Membran mit verdünnten primären Kaninchen-Antikörpern gegen RSV (1:10000) in 15 ml PBS für 1 h bei RT und waschen Sie die Membran dreimal mit PBS für jeweils 5 min Inkubation.
  6. Inkubieren Sie die Membran mit 1,5 μL Meerrettichperoxidase-konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörpern (siehe Materialtabelle) in 15 ml PBS und waschen Sie dreimal mit PBS für jeweils 5 min Inkubation.
  7. Entwickeln Sie die Immunoblots mit dem Enhanced HRP-DAB Chromogenic Kit (siehe Materialtabelle)gemäß den vom Hersteller bereitgestellten Protokollen.

2. Vorbereitung der Futterkammer und der künstlichen Ernährung

  1. 2 g Saccharosepulver wiegen und in 40 mlddH2 O auflösen, um 5% ige wässrige Saccharoselösung als künstliche Diät herzustellen.
  2. Filtern Sie die Lösung durch einen 0,22 μm-Filter (siehe Materialtabelle),um bakterielle Verunreinigungen und Verunreinigungen zu entfernen.
  3. Verhungern Sie 2003.-5. SBPH-Larven für 3-5 h, bevor Sie sie in die Kammer einführen.
    HINWEIS: 200 SBPH sind für eine Kammer vorbereitet; mehr SBPH sollte für mehrere Kammern vorbereitet werden.
  4. Bereiten Sie die Glaszylinder als Zuführkammern vor (Abbildung 1A). Bedecken Sie ein offenes Ende der Kammer mit einer Paraffinmembran (siehe Materialtabelle),bevor Sie die experimentellen Insekten einführen.
    HINWEIS: Jeder Zylinder ist 15,0 cm lang und hat einen Durchmesser von 2,5 cm. Diese Glaszylinder werden nach der experimentellen Anforderung maßgefertigt.
  5. Übertragen Sie Insekten in einen Glaszylinder.
  6. Bedecken Sie das andere Ende der Kammer mit einer gestreckten Paraffinmembran (insbesondere Parafilm M). Dann fügen Sie 200 μL künstliche Diät hinzu. Zum Schluss bedecken Sie die Flüssigkeit mit einer weiteren Schicht gestreckter Paraffinmembran.
    HINWEIS: Die Paraffinmembran ist auf etwa das Doppelte ihrer ursprünglichen Fläche gedehnt.
  7. Decken Sie die Kammer mit Aluminiumfolie ab, aber lassen Sie das Ende mit dem künstlichen Diätgerät dem Licht ausgesetzt.

3. Sammlung von SBPH-Speichel

  1. Sammeln Sie künstliche Diät aus RSV-freier und viruliferer SBPH separat am Ende des 24-Stunden-Zeitraums.
  2. Kühlen Sie den Zylinder bei 4 ° C, um die Insekten zu immobilisieren.
  3. Decken Sie den äußeren Film auf und sammeln Sie die künstliche Diätflüssigkeit mit einer sterilen Pipette in 1,5 ml sterile röhrchen. Den gesammelten Speichel bis zur Analyse bei -80 °C aufbewahren.
    HINWEIS: Der gesammelte Speichel konnte 1 Jahr lang bei -80 °C gelagert werden.
  4. Spülen Sie die innere Membran dreimal mit 50 μL frischer künstlicher Nahrung durch sanftes Pipettieren aus und sammeln Sie die künstliche Waschdiät wie in Schritt 3.3 beschrieben ein. Legen Sie die neue künstliche Diät auf die innere Membran und halten Sie eine frisch gedehnte Paraffinmembran darauf.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 3.2 und 3.3 für 5 Tage bis 2 Wochen.
    HINWEIS: Zählen Sie die Überlebensrate der künstlichen Fütterung SBPH und stellen Sie eine ausreichende Ergänzung der frischen SBPH entsprechend der Überlebensrate sicher.
  6. Filtern Sie die gesammelten Proben durch eine 0,22 μm Filtereinheit, um Mikroben und andere Verunreinigungen zu entfernen.

4. Konzentration des gesammelten Speichels

  1. Die entnommenen Speichelproben werden in einem 0,5 mL 10 kD Zentrifugalfilter (siehe Materialtabelle) überführtund bei 5.500 x g bei 4 °C für 20 min gedreht. Sammeln Sie den Überstand und machen Sie das endgültige Volumen auf 100 μL.
  2. Messen Sie die Konzentration des gesammelten Speichels mit einem geeigneten UV-Vis-Spektralphotometer gemäß den Schritten 4.3-4.6.
  3. Schalten Sie das Spektralphotometer ein und waschen Sie die Sockel dreimal mit ddH2O.
  4. Wählen Sie die folgenden Optionen auf dem Bildschirm in der richtigen Reihenfolge: Proteine | Protein A280 | Typ | auswählen 1 Abs = 1 mg/ml. Aktivieren Sie dann das Kontrollkästchen Baseline-Korrektur 340 nm.
  5. Laden Sie 2 μL 5% ige Saccharose-Wässrige Lösung als Leer, berühren Sie Blank am unteren Bildschirmrand.
  6. Nachdem Sie Standards gesetzt haben, laden Sie 2 μL des gesammelten Speichels zur Messung ein. Lesen und notieren Sie die Proteinkonzentration.
    ANMERKUNG: Insgesamt wurden schließlich mindestens 1 mg Speichelproteine gesammelt.

5. Silberfärbung von Speichelproteinen

  1. Extrahieren Sie Protein aus den Speichelproben der Insekten unter Verwendung des Probenbeladungspuffers (50 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% Glycerin, 2% SDS, 0,1% Bromphenolblau und 1% β-Mercaptoethanol). Dann fraktionieren Sie es mit 10% SDS-PAGE (siehe Tabelle der Materialien). Laden Sie die 5% ige sucroseaqueöse Lösung, die auf die gleiche Weise wie eine Negativkontrolle behandelt wird.
  2. Laden Sie ein 20 μL Aliquot der Probe neben einem vorgefärbten Marker auf ein SDS-PAGE-Gel. Lassen Sie das Gel 15 Minuten bei 90 Volt und dann 50 Minuten bei 140 Volt laufen.
  3. Fixieren Sie das Gel in 30% (vol/vol) Ethanol, 10% (vol/vol) Essigsäure für mindestens 30 min nach elektrophorese.
  4. Spülen Sie das Gel zweimal mit 20% (vol/vol) Ethanol und Wasser separat für jeweils 10 min.
  5. Sensibilisieren Sie das Gel in 0,8 mM Natriumthiosulfat für 1 min und spülen Sie es dann zweimal in Wasser für jeweils 1 min.
  6. Tauchen Sie das Gel für mindestens 1 h in 12 mM Silbernitrat und tauchen Sie es dann für 10 s in deionisiertes Wasser, bevor Sie es in die Entwicklerlösung überführen.
  7. Wenn der Hintergrund des Gels dunkel wird, tauchen Sie das Gel für mindestens 30 Minuten in eine Stopplösung (5% ige Essigsäure) ein, um die Reaktion zu stoppen.
  8. Waschen Sie das Gel zweimal mit Wasser für jeweils 30 minuten. Entwickeln Sie das Bild mit dem Detektionssystem (siehe Materialverzeichnis).

6. Proteinnachweis durch Western Blotting

  1. Nachweis des speichelmucinähnlichen Proteins von SBPH (LssgMP) und RSV durch Western Blots mit spezifischen Antikörpern.
  2. Behandeln Sie Insektenspeichelproben nach Schritt 5.1.
  3. Laden Sie ein 20 μL Aliquot der Probe auf ein 10% SDS-PAGE Gel zusammen mit einem vorgefärbten Marker und einer 20 μL RSV nicht infizierten Speichelprobe als Negativkontrolle. Lassen Sie das Gel 15 Minuten bei 90 Volt und dann 50 Minuten bei 140 Volt laufen.
  4. Mischen Sie 100 ml 10x Proteintransferpuffer (nass) (siehe Materialtabelle)mit 900 mL ddH2O zu einer Arbeitslösung (1x) und übertragen Sie dann Proteine unter Verwendung von Proteintransferpuffer (1x) auf eine Polyvinylidendifluoridmembran.
  5. Blockieren Sie die Membran in 5% Magermilch mit 0,01 M Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,05% Tween 20 (TBST) bei Raumtemperatur (RT) für 1 h.
    HINWEIS: Mischen Sie in diesem Protokoll 100 ml 10x TBST (siehe Materialtabelle)mit 900 ml ddH2O in die Arbeitslösung.
  6. Inkubieren Sie die Membran mit primären Kaninchenantikörpern gegen RSV oder LssgMP (beide 1:10000), verdünnt in TBST bei RT für mindestens 2 h.
    HINWEIS: Die Produktion von primären Antikörpern gegen RSV wurde oben erwähnt. Ein Biotechnologieunternehmen produzierte den polyklonalen Kaninchen-Anti-LssgMP-Antikörper gegen das LssgMP-Peptid GIQFDSYSASDLTRC.
  7. Waschen Sie die Membran dreimal mit TBST für jeweils 10 Minuten Inkubation.
  8. Inkubieren Sie die Membran mit Meerrettichperoxidase-konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörpern, die in 1:10000 TBST verdünnt sind.
  9. Entwickeln Sie die Immunoblots mit dem verbesserten Chemilumineszenz Western Blotting Detection System.

7. Erkennung des LssgMP-Expressionsmusters in SBPH

  1. Immobilisieren Sie die Insekten bei 4 ° C für 5 min.
  2. Waschen Sie die Insekten nacheinander mit 75% Ethanol undddH2Ound sezieren Sie die Insekten dann in vorgekühlter TBS (0,01 M Tris-gepufferte Kochsalzlösung).
  3. Sezieren Sie die Insekten aus dem Bauch, während Sie die Vorderbeine von SBPH am Coxa-Trochanter-Gelenk mit einer Pinzette abtrennen; Waschen Sie den Mitteldarm und die Speicheldrüsen zweimal in TBS, um jegliche Kontamination von der Hämolymphe zu entfernen.
  4. Legen Sie fünf Gewebe in ein 1,5 ml RNase-freies Röhrchen, um RNA zu extrahieren. Betrachten Sie jedes Röhrchen als eine Probe.
  5. Führen Sie RNA-Extraktion gemäß den Protokollen des Herstellers und Reverse-Transkriptional PCR (RT-PCR) durch (siehe Materialtabelle).
  6. Durchführung einer quantitativen Real-Time-PCR (qRT-PCR), um die relativen Transkriptexpressionsniveaus von LssgMP in Extrakten des ganzen Körpers oder verschiedener Gewebe von L. striatelluszu untersuchen.
    HINWEIS: Die Primerpaare, die für die Genamplifikation verwendet wurden, waren LssgMP-q-F /LssgMP-q-R, SYBR Green-basierte qPCR wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Das Transkriptniveau des L. striatellus Translationsdehnungsfaktors 2 (ef2) wurde mit dem Primerpaar ef2-q-F/ef2-q-R für die Normalisierung der cDNA-Templates quantifiziert. Und die Primersequenzen sind unten angehängt:LssgMP-q-F: TCCGACCTCACCAGAGTTTACAG; LssgMP-q-R: GCTTCGTCCCAGGTACTGATTCC; ef2-q-F: AGBTCCACGGATGGGCTTT; ef2-q-R: ATCTTGAATTTCTCGGCATACATTT.

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Representative Results

Schematische Darstellung der künstlichen Fütterungsanlage und Speichelsammlung
Abbildung 1A zeigt den Glaszylinder (15 cm x 2,5 cm), der als Futterkammer zum Sammeln des Speichels verwendet wird. Zuerst wurden die SBPH-Larven für mehrere Stunden ausgehungert, um die Sammeleffizienz zu verbessern, und dann durch Abkühlen für 5 Minuten immobilisiert. Nachdem die Insekten in den Glaszylinder überführt wurden, wurden beide offenen Enden der Kammer mit gestreckter Paraffinmembran bedeckt. An einem Ende wurden 200 μL 5% Saccharose zwischen zwei Schichten Paraffinmembran eingeklemmt, die auf etwa das Doppelte ihrer ursprünglichen Fläche ausgedehnt wurden (Abbildung 1B). Die Kammer war mit Folie bedeckt, aber das Ende mit der künstlichen Diät wurde Licht ausgesetzt. Da SBPH phototropes Verhalten zeigt, wurden die am Ende gesammelten ausgehungerten Insekten Licht ausgesetzt und durch die gestreckte innere Paraffinmembran mit der künstlichen Diätlösung gefüttert. Darauf aufbauend konnte Speichel in die künstliche Ernährung freigesetzt werden, die jeden Tag gesammelt wurde. Das Parafilm-Diät-Gerät wurde jeden Tag durch ein neues ersetzt. Auf diese Weise wurde die künstliche Diät für 5 Tage bis 2 Wochen gesammelt, und dann wurde die gesamte Probe mit einem 10 KD-Zentrifugalfilter auf ein Endvolumen von 100 μL konzentriert (Abbildung 1C). Während der Speichelentnahme wurde die Überlebensrate von SBPH, die die 5% Saccharose fütterte, gezählt. In den ersten 4 Tagen überlebten mehr als 80% SBPH. Ab dem5. Tag stieg die Mortalität jedoch schnell auf 40% an, und weniger als die Hälfte der SBPH überlebte am7. Tag (Abbildung 1D). Um genügend Speichel zu sammeln, wurde vorgeschlagen, frische SBPH am4. Tag zu liefern.

Nachweis der gesammelten Speichelproteine
Zur Beurteilung der Wirksamkeit dieser Entnahmemethode wurde die Speichelprobe einer Proteinanalyse unterzogen. Zunächst wurden Proteine durch SDS-PAGE getrennt und dann durch Silberfärbung nachgewiesen (Abbildung 2A). Im Vergleich zur Negativkontrolle (5% Saccharose) enthielten die konzentrierten Speichelproben aus RSV-infiziertem SBPH-Speichel viele Proteine, die beispielsweise massenspektrometrisch weiter analysiert werden konnten. Als primärer Insektenvektor von RSV überträgt SBPH das Virus über seinen saugenden und durchdringenden Fütterungsprozess auf Pflanzen. Die erfolgreiche Freisetzung von RSV hängt mit der Speicheelsekretion zusammen, und RSV gilt als wesentlicher Faktor im Speichel viruliferer Insekten. Hier wurde Speichel nach Entnahme von nicht infizierten und viruliferen Insekten mit einem Antikörper gegen RSV getestet und das RSV-Mantelprotein (CP) in der viruliferen Probe erfolgreich nachgewiesen (Abbildung 2B). Eine andere Studie ergab, dass Mucinproteine essentielle Gelspeichelproteine in hemipteranen Insekten sind, um die Bildung einer Hülle für die Fütterung zu meditieren23. Um zu bestätigen, dass SBPH auch ein Mucin-Protein produziert, wurde der gesamte offene Leserahmen eines mutmaßlichen Mucin-kodierenden Gens aus RNA amplifiziert, die aus der Speicheldrüse von SBPH extrahiert wurde. Seine Sequenz wurde als Abfrage in BLAST-Analysen gegen die Genomsequenz von SBPH28verwendet. Ein Gen bestehend aus 2175 bp, genannt LssgMP, wurde identifiziert. Ein Antikörper gegen dieses Protein wurde zuvor hergestellt und verwendet, um das Protein in der gesammelten Probe durch Western-Blot-Analyse nachzuweisen. Ein 78 KD-Protein wurde in nicht infizierten und viruliferen Proben nachgewiesen, was zeigt, dass LssgMP ein Speichelprotein ist (Abbildung 2C). Als nächstes wurden die Transkriptspiegel von LssgMP in verschiedenen Geweben (Speicheldrüse, Darm und verbleibender Körper) durch qRT-PCR bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass der Gentranskriptspiegel in der Speicheldrüse 20-mal höher war als im Darm und anderen Körperteilen (Abbildung 2D), was die spezifische Expression von LssgMP in der Speicheldrüse bestätigt.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Futterkammer mit Paraffinmembransandwich, um die Fütterung von SBPH auf künstlicher Nahrung zu ermöglichen. (A) Abbildung der künstlichen Futterkammer. Der Zylinder ist 15,0 cm lang und 2,5 cm im Durchmesser. An einem Ende der Kammer befindet sich das Paraffinmembran-Sandwich; das andere Ende und die mit Alufolienpapier (schräge Linien) bedeckte Zylinderwand stellen das mit Alufolienpapier überzogene Gerät dar. Die Lichtquelle sollte SBPH anziehen, um sich von der künstlichen Ernährung zu ernähren. (B) Schematisches Paraffinsandwich mit künstlicher Ernährung. 200 μL 5% ige wässrige Saccharoselösung wurden zwischen zwei Schichten von Paraffinmembranen eingeklemmt, die etwa doppelt so groß waren wie ihre ursprüngliche Fläche. (C) Die Konzentration des gesammelten Speichels unter Verwendung eines 10 KD-Zentrifugalfilters. (D) Die Überlebensrate von SBPH, die sich mit 5% Saccharose ernährt. Mittelwert und REM wurden aus vier biologischen Replikaten mit drei technischen Replikaten berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Überprüfung der gesammelten Speichelproteine. (A) Speichelproteinnachweis durch Silberfärbung. Die 5% Saccharose ist Negativkontrolle. (B) Nachweis von Reisstreifenvirus-Mantelprotein (CP) im gesammelten Speichel durch Western-Blot-Analyse. ( C) Western Blotting zur Bestätigung des Vorhandenseins von LssgMP im gesammelten Speichel. (D) Spezifische Expression von LssgMP in der Speicheldrüse von L. striatellus. ef2: Translationsdehnungsfaktor 2 der SBPH. Mittelwert und REM wurden aus vier biologischen Replikaten mit drei technischen Replikaten berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Die erfolgreiche Aufzucht von Insekten auf künstlicher Diät wurde erstmals 1962 berichtet, als Mittler und Dadd die Paraffinmembrantechnik zur Durchführung einer künstlichen Diät beschrieben29,30. Und diese Methode wurde in vielen Aspekten der Insektenbiologie und des Verhaltens erforscht, zum Beispiel in den Bereichen Nahrungsergänzungsmittel, dsRNA-Fütterung und Virusakquisition. Basierend auf den Anforderungen der Speichelanalyse wird in dieser Studie 5% Saccharose als allgemeine künstliche Diät verwendet, um Speichel von SBPH zu sammeln. Für eine erfolgreiche Speichelsammlung sind hier mehrere kritische Schritte erwähnenswert. Erstens ist es notwendig, die experimentellen Insekten zu verhungern, bevor sie in die Kammer eingeführt werden, um die Effizienz der Speichelsammlung zu gewährleisten. Zweitens, um die Stylet-Umgebung zu imitieren, wird ein zweischichtiges Paraffin-Sandwich hergestellt. Wenn sich SBPH von der künstlichen Diät ernährt, bildet sich die Speichelscheide am inneren Ende, das der Diät zugewandt ist, und der wässrige Speichel wird anschließend abgesondert. Drittens sollte ein künstliches Medium rechtzeitig gesammelt und ausgetauscht werden, um die mikrobielle Kontamination in der entnommenen Probe zu reduzieren. Schließlich ist die Betäubung der Insekten bei 4 ° C für 5 Minuten unerlässlich, um den Verlust von Insekten bei der Umstellung der künstlichen Ernährung zu vermeiden.

Im Gegensatz zu den meisten künstlichen Diäten, die Aminosäuren, Vitamine und Kohlenhydrate enthalten, sind die Vorteile von 5% Saccharosemedium bemerkenswert. Erstens ist es einfach vorzubereiten. Zweitens bedeutet die einfache Zusammensetzung der Diät, dass nur wenige Substanzen die weitere Analyse der verschiedenen Faktoren im Speichel beeinträchtigen. Dennoch sank das Überlebensverhältnis der SBPH in den letzten Tagen der Fütterungsperiode unter Verwendung von 5% Saccharose als allgemeine künstliche Ernährung (Abbildung 1D). Um diesen Mangel zu überwinden, sollte frisches SBPH rechtzeitig für genügend Speichel zugeführt werden. Und für die weitere Erforschung der Speichelfunktion auf das Fressverhalten oder die Virusübertragung sollte die Speichelsammeldauer auf den genauen Zeitpunkt begrenzt werden, bevor die Sterblichkeit von Insekten aufgrund von Innutung zunahm. Es scheint eine häufige Einschränkung des künstlichen Mediums zu sein. Einige andere Studien fanden heraus, dass das Überleben von N. lugens, die auf der chemisch definierten Diät D-97 aufgezogen wurden, niedriger war als das von denen, die auf der anfälligen Reissorte TN1 aufgezogen wurden, was bedeutet, dass der ursprüngliche Wirt mehr als nur Nahrungsvektorinsekten liefert. Und mehrere Studien haben sich auf die Optimierung chemisch definierter Diäten für die kontinuierliche Fütterung von Insekten konzentriert, um die Aufzuchteffizienz zu verbessern.

Die Transkriptomanalyse der Speicheldrüse ist eine traditionelle Methode zur Identifizierung von Speichelproteinen. Und verschiedene Speichelproteine wurden in der gleichen Spezies von A. pisum und M. persicae14,31nachgewiesen, und die Häufigkeit von Speichelproteinen bestimmt die Häufigkeit ihres Nachweises32. Es fehlte jedoch eine valide Methode, um das vermutete Protein im Speichel zu untersuchen. Diese Paraffinmembran-Sandwich-Methode bietet eine innovative Methode zur Bestätigung eines vermuteten Speichelproteins, das durch Transkriptomanalyse identifiziert wurde, was durch den Nachweis von LssgMP weiter bewiesen wird (Abbildung 2C). Darüber hinaus bestätigte die Proteinanalyse, dass im gesammelten Speichel reichlich Proteine vorhanden sind (Abbildung 2A), was eine ausreichende Menge für die weitere Analyse beispielsweise durch Massenspektrometrie darstellt. Die Proteomik-Analyse des gesammelten Speichels wird eine direkte und wirksame Methode zur Identifizierung sezernierter Faktoren sein, die an der Fütterungsphase von SBPH beteiligt sind, wodurch das Risiko des Nachweises falsch-positiver redundanter Proteine minimiert wird.

Speichel wirkt als Virusträger vom Insekt zur Wirtspflanze und ist ein wesentlicher Bestandteil der Vektor-Virus-Pflanze-Interaktion14,33,34. Der Titer des von Insektenvektoren freigesetzten Virus ist ein entscheidender Faktor für die Infektion des Wirts. Im Vergleich zu indirekten Methoden, die den Virustiter in infizierten Pflanzen testen, kann dieses Protokoll RSV, das durch viruliferes SBPH freigesetzt wird, direkt nachweisen (Abbildung 2B). Unterstützt durch diese Paraffinmembran-Sandwich-Methode können weitere vergleichende Analysen von Speichelproteinen, die von RSV-freien und RSV-infizierten Insekten gesammelt wurden, auch potenzielle Kandidaten aufdecken, die an der Virus-Pflanze-Vektor-Interaktion beteiligt sind.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde vom National Key Research and Development Program of China (Nr. 2019YFC1200503), von der National Science Foundation of China (Nr. 32072385) und von der Youth Innovation Promotion Association CAS (2021084) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10-KD centrifugal filter Merck Millipore R5PA83496 For concentration
10x Protein Transfer Buffer(wet) macGENE MP008 Transfer buffer for western blotting
10x TBST buffer Coolaber SL1328-500mL×10 Wash buffer for western blotting
Azure c600 biosystems Azure Biosystems Azure c600 Imaging system for western blotting and silver staining
Color Prestained protein ladder GenStar M221-01 Protein marker for western blotting
ECL western blotting detection reagents GE Healthcare RPN2209 Western blotting detection
Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit TIANGEN #PA110 Chromogenic reaction
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies Sigma 401393-2ML Polyclonal secondary antibody for western blotting
Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane Merck Millipore IPVH00010 Transfer membrane for western blotting
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 1725125 For quantitative real-time PCR (qRT-PCR)
KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES Bio-Rad 1708891 For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR)
Millex-GP Filter, 0.22 µm Merck Millipore SLGP033RB For filtration
Mini-PROTEAB TGX Gels Bio-Rad 4561043 For SDS-PAGE
NanoDrop One Thermo Scientific ND-ONEC-W Detection of protein concentration
Nylon membrane PALL T42754 Membrane for dot-ELISA
Parafilm M Membrane Sigma P7793-1EA Making artifical diet sandwichs
Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides Genstript Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting
Rabbit anti-RSV polyclonal antibody Genstript Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA
RNAprep pure Micro Kit TIANGEN DP420 For RNA Extraction

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cheng, X., Zhu, L., He, G. Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper. Molecular Plant. 6 (3), 621-634 (2013).
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Biologie Heft 174
Zweischichtige Membran-Sandwich-Methode für <em>Laodelphax striatellus</em> Speichelsammlung
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Zhao, J., Yang, J., Zhang, L., Fang, … More

Zhao, J., Yang, J., Zhang, L., Fang, R., Huo, Y. Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection. J. Vis. Exp. (174), e62831, doi:10.3791/62831 (2021).

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