Summary
El presente protocolo describe un método para recolectar suficiente saliva de insectos perforantes-chupadores utilizando un medio artificial. Este es un método conveniente para recolectar saliva de insectos y estudiar la función salival en el comportamiento de alimentación de insectos y la transmisión de virus transmitidos por vectores.
Abstract
El virus de la franja de arroz (VRS), que causa una pérdida económica significativa de la agricultura en Asia oriental, depende completamente de los insectos vectores para su transmisión efectiva entre el arroz huésped. Laodelphax striatellus (pequeño saltamontes marrón, SBPH) es el principal vector de insectos que transmite horizontalmente el VSR mientras chupa la savia del floema. La saliva juega un papel importante en el comportamiento de alimentación de los insectos. Aquí se describe un método conveniente que será útil para la investigación de la saliva de los insectos con un comportamiento de alimentación penetrante-chupador. En este método, se permitió que los insectos se alimentaran de una dieta artificial intercalada entre dos capas de película de parafina estiradas. La dieta que contenía la saliva se recolectaba cada día, se filtraba y se concentraba para su posterior análisis. Finalmente, la calidad de la saliva recolectada se examinó mediante tinción de proteínas e inmunoblotting. Este método se ejemplificó mediante la detección de la presencia de VRS y una proteína similar a la mucina en la saliva de SBPH. Estos métodos artificiales de alimentación y recolección de saliva sentarán las bases para una mayor investigación sobre los factores en la saliva de los insectos relacionados con el comportamiento de alimentación y la transmisión del virus.
Introduction
El virus de la raya de arroz (VRS), un virus de ARN de cadena negativa en el género Tenuivirus,causa enfermedades graves en la producción de arroz en Asia oriental1,2,3. La transmisión del VSR de las plantas de arroz infectadas a las sanas depende de los insectos vectores, principalmente Laodelphax striatellus, que transmite el VSR de manera persistente-propagativa. SBPH adquiere el virus después de alimentarse de plantas infectadas por el VSR. Una vez dentro del insecto, el VSR infecta la célula epitelial del intestino medio un día después de la alimentación y luego pasa a través de la barrera del intestino medio para penetrar la hemolinfa. Posteriormente, el VSR se propaga a diferentes tejidos a través de la hemolinfa y luego se propaga. Después de un período latente de aproximadamente 10-14 días después de la adquisición, el virus dentro de la glándula salival puede transmitirse a las plantas huésped sanas a través de la saliva secretada, mientras que SBPHchupa la savia del floema4,5,6,7,8,9,10 . Un proceso de alimentación eficiente y varios factores en la saliva son esenciales para la propagación del VRS del insecto a la planta huésped.
Se cree que la saliva de insecto secretada por las glándulas salivales media insectos, virus y plantas huésped. Los insectos hemípteros suelen producir dos tipos de saliva: saliva gelificante y saliva acuosa11,12,13. La saliva gelificante se secreta principalmente en el apoplasma para mantener el movimiento del estilete entre las células huésped y también se relaciona con la superación de la resistencia de las plantas y las respuestas inmunes14,15,16,17. En la etapa de sondeo de la alimentación, los insectos secretan intermitentemente saliva gelificante que inmediatamente se oxida para formar una brida superficial. Luego, las vainas simples o ramificadas encierran el estilete para reservar un canal tubular18,19,20. Se presume que la brida superficial en la epidermis facilita la penetración del estilete al servir como punto de anclaje, mientras que las vainas alrededor del estilete pueden proporcionar estabilidad mecánica y lubricación16,21,22,23. Nlshp fue identificado como una proteína esencial para la formación de vaina salival y la alimentación exitosa desaltamontes marrones (Nilaparvata lugens,BPH). La inhibición de la expresión de la proteína de la vaina estructural (SHP) secretada por el pulgón Acyrthosiphon pisum redujo su reproducción al interrumpir la alimentación de los tubos del tamiz del huésped24. Además, en algunas especies de insectos, se supone que los factores de saliva en gel desencadenan las respuestas inmunes de las plantas al formar los llamados patrones moleculares asociados a herbívoros (HAMP). En N. lugens,NlMLP, una proteína similar a la mucina relacionada con la formación de vaina, induce las defensas de las plantas contra la alimentación, incluida la muerte celular, la expresión de genes relacionados con la defensa y la deposición de callosa 25,26. Además, se ha demostrado que algunos factores de saliva en gel en los áfidos desencadenan respuestas de defensa de las plantas a través de interacciones de gen a gen similares a los patrones moleculares asociados a patógenos12,15,27.
Para estudiar los factores de saliva esenciales para la alimentación de insectos y / o la transmisión de patógenos, es necesario analizar la saliva secretada. Aquí, se describen métodos artificiales de alimentación y recolección para obtener cantidades suficientes de saliva para un análisis más detallado. Utilizando un medio que contenía un solo elemento nutricional, se recolectaron y analizaron muchas proteínas de saliva mediante tinción de plata y western blotting. Este método será útil en futuras investigaciones sobre los factores en la saliva que son esenciales para la transmisión del VSR por SBPH.
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Protocol
1. Mantenimiento SBPH
- Coloque a los individuos DE SBPH virulíferos y libres de VRS en una incubadora de vidrio (65 x 200 mm) con 5-6 plántulas de arroz(Oryza sativa cv. Nipponbare) por cámara de vidrio en el laboratorio. Cultive las plantas de arroz a 25 °C bajo un fotoperíodo de luz de 16 h / 8 h de oscuridad.
NOTA: Los individuos de SBPH virulíferos y libres de RSV fueron capturados inicialmente en la provincia de Jiangsu, China. - Detectar el VSR en sbph mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas de puntos (dot-ELISA) con un anticuerpo policlonal específico del VSR de conejo (ver Tabla de materiales)criado contra las ribonucleoproteínas (RNP) del VSR.
NOTA: Para garantizar una alta eficiencia de la infección de la descendencia, las hembras virulíferas se mantuvieron por separado, y el 15% de sus crías se sometieron a pruebas aleatorias para detectar la infección por VRS. Los detalles de dot-ELISA se describen en los pasos 1.3-1.7. - Homogeneizar SBPH simple en 20 μL de tampón de recubrimiento (0.05 M Na2CO3-NaHCO3, pH 9.5). Coloque 3 μL de cada uno en la membrana de nylon (consulte la Tabla de materiales),y luego seque la membrana a temperatura ambiente (RT).
- Incubar la membrana con 15 mL de tampón de bloqueo (PBS + 3% de leche descremada) durante 30 min a temperatura ambiente.
- Incubar la membrana con anticuerpos primarios diluidos de conejo contra el VSR (1:10000) en 15 ml de PBS durante 1 h a RT y lavar la membrana tres veces con PBS durante 5 minutos de incubación cada vez.
- Incubar la membrana con 1,5 μL de anticuerpos anti-conejo de cabra conjugados con peroxidasa de rábano picante (ver Tabla de Materiales)en 15 ml de PBS y lavar tres veces con PBS durante 5 min de incubación cada vez.
- Desarrollar los inmunoblots con Enhanced HRP-DAB Chromogenic Kit (ver Tabla de Materiales)según los protocolos proporcionados por el fabricante.
2. Preparación de la cámara de alimentación y dieta artificial
- Pesar 2 g de sacarosa en polvo y disolverlo en 40 mL de ddH2O para preparar una solución acuosa de sacarosa al 5% como dieta artificial.
- Filtre la solución a través de un filtro de 0,22 μm (ver Tabla de Materiales)para eliminar la contaminación bacteriana y las impurezas.
- Matar de hambre 2003ª-5ª larvas de SBPH durante 3-5 h antes de introducirlas en la cámara.
NOTA: Se preparan 200 SBPH para una cámara; se debe preparar más SBPH para varias cámaras. - Preparar los cilindros de vidrio como cámaras de alimentación (Figura 1A). Cubra un extremo abierto de la cámara con una membrana de parafina (ver Tabla de Materiales)antes de introducir los insectos experimentales.
NOTA: Cada cilindro tiene 15,0 cm de largo y 2,5 cm de diámetro. Estos cilindros de vidrio están hechos a medida de acuerdo con el requisito experimental. - Transfiera insectos a un cilindro de vidrio.
- Cubra el otro extremo de la cámara con una membrana de parafina estirada (específicamente, Parafilm M). Luego, agregue 200 μL de dieta artificial. Finalmente, cubra el líquido con otra capa de membrana de parafina estirada.
NOTA: La membrana de parafina se estira hasta aproximadamente el doble de su área original. - Cubra la cámara con papel de aluminio, pero deje el extremo con el dispositivo de dieta artificial expuesto a la luz.
3. Recolección de saliva SBPH
- Recoja la dieta artificial de SBPH libre de RSV y virulífera por separado al final del período de 24 h.
- Enfríe el cilindro a 4 °C para inmovilizar los insectos.
- Destape la película exterior y recoja el líquido de dieta artificial usando una pipeta estéril en tubos estériles de 1.5 ml. Mantenga la saliva recogida a -80 °C hasta el análisis.
NOTA: La saliva recolectada podría almacenarse a -80 °C durante 1 año. - Enjuague la membrana interna con 50 μL de dieta artificial fresca tres veces pipeteando suavemente y recoja la dieta de lavado artificial como se describe en el paso 3.3. Coloque la nueva dieta artificial en la membrana interna y mantenga una membrana de parafina recién estirada en la parte superior.
- Repita los pasos 3.2 y 3.3 durante 5 días a 2 semanas.
NOTA: Cuente la tasa de supervivencia de la alimentación artificial sbPH y asegure un suplemento suficiente de SBPH fresco de acuerdo con la tasa de supervivencia. - Filtre las muestras recogidas a través de una unidad de filtro de 0,22 μm para eliminar microbios y otros contaminantes.
4. Concentración de la saliva recogida
- Transfiera las muestras de saliva recogidas en un filtro centrífugo de 0,5 ml y 10 kD (véase la Tabla de materiales)y gire a 5.500 x g a 4 °C durante 20 min. Recoge el sobrenadante y haz el volumen final a 100 μL.
- Mida la concentración de la saliva recolectada utilizando un espectrofotómetro UV-Vis apropiado siguiendo los pasos 4.3-4.6.
- Encienda el espectrofotómetro y lave los pedestales tres veces con ddH2O.
- Seleccione las siguientes opciones en la pantalla en el orden adecuado: Proteínas | Proteína A280 | Seleccione Tipo | 1 Abs = 1 mg/ml. A continuación, marque la casilla de verificación Corrección de línea base 340 nm.
- Cargue 2 μL de solución acuosa de sacarosa al 5% en blanco, toque Blanco en la parte inferior de la pantalla.
- Después de establecer los estándares, cargue 2 μL de la saliva recolectada para la medición. Lea y registre la concentración de proteínas.
NOTA: Finalmente se recolectaron 1 mg de proteínas de saliva en total al menos.
5. Tinción de plata de proteínas de saliva
- Extraiga proteínas de las muestras de saliva de insectos utilizando tampón de carga de muestras (50 mM Tris-HCl pH 6.8, 10% de glicerol, 2% de SDS, 0.1% de azul de bromofenol y 1% de β-mercaptoetanol). Luego, fraccionarlo en un 10% SDS-PAGE (ver Tabla de Materiales). Cargue la solución surosa al 5% tratada de la misma manera que un control negativo.
- Cargue una alícuota de 20 μL de la muestra en un gel SDS-PAGE junto con un marcador pretensado. Haga funcionar el gel durante 15 minutos a 90 voltios, y luego 50 minutos a 140 voltios.
- Fije el gel en etanol al 30% (vol/vol), ácido acético al 10% (vol/vol) durante al menos 30 minutos después de la electroforesis.
- Enjuague el gel dos veces con etanol al 20% (vol/vol) y agua por separado durante 10 min cada vez.
- Sensibilizar el gel en tiosulfato de sodio de 0,8 mM durante 1 min, y luego enjuagar dos veces en agua durante 1 min cada vez.
- Sumerja el gel en nitrato de plata de 12 mM durante al menos 1 h, y luego sumérjalo en agua desionizada durante 10 s antes de transferirlo a la solución reveladora.
- Cuando el fondo del gel se esté oscureciendo, sumerja el gel en una solución de parada (ácido acético al 5%) durante al menos 30 minutos para detener la reacción.
- Lave el gel dos veces con agua durante 30 minutos cada vez. Desarrollar la imagen con el Sistema de Detección (ver Tabla de Materiales).
6. Detección de proteínas por western blotting
- Detectar la proteína similar a la mucina en saliva de SBPH (LssgMP) y RSV por western blots utilizando anticuerpos específicos, respectivamente.
- Trate las muestras de saliva de insectos siguiendo el paso 5.1.
- Cargue una alícuota de 20 μL de la muestra en un gel SDS-PAGE al 10% junto con un marcador pretensado y una muestra de saliva no infectada por el VSR de 20 μL como control negativo. Haga funcionar el gel durante 15 minutos a 90 voltios, y luego durante 50 minutos a 140 voltios.
- Mezcle 100 ml de tampón de transferencia de proteínas 10x (húmedo) (ver Tabla de materiales)con 900 mL de ddH2O a una solución de trabajo (1x), y luego transfiera proteínas a una membrana de difluoruro de polivinilideno utilizando tampón de transferencia de proteínas (1x).
- Bloquee la membrana en leche descremada al 5% con solución salina tamponada con Tris de 0,05 m con Tween 20 al 0,05 % (TBST) a temperatura ambiente (RT) durante 1 h.
NOTA: En este protocolo, mezcle 100 ml de 10x TBST (consulte la Tabla de materiales)con 900 ml de ddH2O en la solución de trabajo. - Incubar la membrana con anticuerpos primarios de conejo contra el VSR o LssgMP (ambos 1:10000) diluidos en TBST a RT durante al menos 2 h.
NOTA: La producción de anticuerpos primarios contra el VSR se mencionó anteriormente. Una compañía de biotecnología produjo el anticuerpo policlonal anti-LssgMP de conejo contra el péptido LssgMP GIQFDSYSASDLTRC. - Lave la membrana tres veces con TBST durante 10 minutos de incubación cada vez.
- Incubar la membrana con anticuerpos anti-conejo de cabra conjugados con peroxidasa de rábano picante diluidos en 1:10000 TBST.
- Desarrolle los inmunoblots con el sistema de detección de western blotting de quimioluminiscencia mejorada.
7. Detección del patrón de expresión LssgMP en SBPH
- Inmovilizar los insectos a 4 °C durante 5 min.
- Lave los insectos con etanol al 75% y ddH2O uno por uno, y luego diseccione los insectos en TBS preenfriados (solución salina tamponada con Tris de 0,01 M).
- Diseccionar los insectos del abdomen mientras se cortan las patas delanteras de SBPH en la articulación coxa-trocánter con fórceps; lavar el intestino medio y las glándulas salivales dos veces en TBS para eliminar cualquier contaminación de la hemolinfa.
- Coloque cinco tejidos en un tubo libre de RNasa de 1,5 ml para extraer el ARN. Considere cada tubo como una muestra.
- Realizar extracción de ARN según los protocolos del fabricante y PCR transcripcional inversa (RT-PCR) (ver Tabla de Materiales).
- Realizar PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) para investigar los niveles relativos de expresión de transcripción de LssgMP en extractos de todo el cuerpo o diversos tejidos de L. striatellus.
NOTA: Los pares de cebadores utilizados para la amplificación de genes fueron LssgMP-q-F /LssgMP-q-R, SYBR Green-based qPCR se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante. El nivel de transcripción del factor de elongación de traducción de L. striatellus 2 (ef2) se cuantificó con el par de cebadores ef2-q-F/ef2-q-R para la normalización de las plantillas de ADNc. Y las secuencias de cebador se adjuntan a continuación:LssgMP-q-F: TCCGACCTCACCAGAGTTTACAG; LssgMP-q-R: GCTTCGTCCCAGGTACTGATTCC; ef2-q-F: GTCTCCACGGATGGGCTTT; ef2-q-R: ATCTTGAATTTCTCGGCATACATTT.
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Representative Results
Esquemas de instalación de alimentación artificial y recolección de saliva
La Figura 1A representa el cilindro de vidrio (15 cm x 2,5 cm) utilizado como cámara de alimentación para recoger la saliva. En primer lugar, las larvas de SBPH se murieron de hambre durante varias horas para mejorar la eficiencia de la recolección y luego se inmovilizaron enfriando durante 5 minutos. Después de que los insectos fueron transferidos al cilindro de vidrio, ambos extremos abiertos de la cámara se cubrieron con una membrana de parafina estirada. En un extremo, se intercalaron 200 μL de sacarosa al 5% entre dos capas de membrana de parafina extendida a aproximadamente el doble de su área original(Figura 1B). La cámara estaba cubierta con papel de aluminio, pero el final con la dieta artificial estaba expuesto a la luz. Debido a que SBPH muestra un comportamiento fototrópico, los insectos hambrientos reunidos al final fueron expuestos a la luz y alimentados con la solución de dieta artificial a través de la membrana interna de parafina estirada. En base a ella, la saliva podría liberarse en la dieta artificial, que se recolectaba cada día. El dispositivo Parafilm-diet fue reemplazado por uno nuevo todos los días. De esta manera, se recogió la dieta artificial durante 5 días a 2 semanas, y luego se concentró toda la muestra a un volumen final de 100 μL utilizando un filtro centrífugo de 10 KD(Figura 1C). Durante la recolección de saliva, se contó la tasa de supervivencia de la alimentación con SBPH con sacarosa al 5%. En los primeros 4 días, más del 80% de SBPH sobrevivió. Sin embargo, a partir del5º día, la mortalidad aumentó rápidamente al 40%, y menos de la mitad de la HPSB sobrevivió al7º día(Figura 1D). Para recolectar suficiente saliva, se sugirió suministrar SBPH fresca en el4º día.
Verificación de las proteínas de saliva recogidas
Para evaluar la efectividad de este método de recolección, la muestra de saliva fue sometida a análisis de proteínas. En primer lugar, las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE, y luego detectadas por tinción de plata (Figura 2A). En comparación con el control negativo (5% de sacarosa), las muestras de saliva concentrada de la saliva SBPH infectada por rsV contenían muchas proteínas que podrían analizarse más a fondo, por ejemplo, mediante espectrometría de masas. Como el principal insecto vector del VSR, el SBPH transmite el virus a las plantas a través de su proceso de alimentación de succión y perforación. La liberación exitosa del VSR está relacionada con la secreción de saliva, y el VSR se considera un factor esencial en la saliva de los insectos virulíferos. Aquí, la saliva se probó después de recolectar insectos no infectados y virulíferos con un anticuerpo contra el VSR y se detectó con éxito la proteína de la capa del VSR (CP) en la muestra virulífera(Figura 2B). Otro estudio encontró que las proteínas de mucina son proteínas esenciales de saliva en gel en insectos hemípteros para meditar la formación de una vaina para la alimentación23. Para confirmar que SBPH también produce una proteína de mucina, todo el marco de lectura abierto de un supuesto gen que codifica la mucina se amplificó a partir del ARN extraído de la glándula salival de SBPH. Su secuencia fue utilizada como consulta en los análisis BLAST contra la secuencia genómica de SBPH28. Se identificó un gen que consiste en 2175 pb, llamado LssgMP. Se preparó previamente un anticuerpo contra esta proteína y se utilizó para detectar la proteína en la muestra recolectada mediante el análisis de western blot. Se detectó una proteína de 78 KD en muestras no infectadas y virulíferas, demostrando que LssgMP es una proteína de saliva(Figura 2C). A continuación, los niveles de transcripción de LssgMP en diferentes tejidos (glándula salival, intestino y cuerpo restante) se determinaron mediante qRT-PCR. Los resultados mostraron que el nivel de transcripción del gen era 20 veces mayor en la glándula salival que en el intestino y otras partes del cuerpo(Figura 2D),lo que confirma la expresión específica de LssgMP en la glándula salival.
Figura 1: Diagrama de la cámara de alimentación con sándwich de membrana de parafina para permitir la alimentación de SBPH en la dieta artificial. (A) Ilustración de la cámara de alimentación artificial. El cilindro tiene una longitud de 15,0 cm y un diámetro de 2,5 cm. En un extremo de la cámara está el sándwich de membrana de parafina; el otro extremo y la pared del cilindro cubierta con papel de aluminio de estaño (líneas inclinadas) representan el dispositivo cubierto con papel de aluminio de estaño. La fuente de luz se estableció para atraer a SBPH para alimentarse de la dieta artificial. (B) Diagrama del sándwich de parafina que contiene dieta artificial. Se intercalaron 200 μL de solución acuosa de sacarosa al 5% entre dos capas de membranas de parafina estiradas hasta aproximadamente el doble de su área original. (C) La concentración de saliva recogida mediante un filtro centrífugo de 10 KD. (D) La tasa de supervivencia de SBPH que se alimenta de sacarosa al 5%. La media y el SEM se calcularon a partir de cuatro réplicas biológicas con tres réplicas técnicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Verificación de las proteínas de saliva recogidas. ( A )Detecciónde proteínas de saliva por tinción de plata. La sacarosa al 5% es un control negativo. (B) Detección de la proteína de la capa del virus de la raya de arroz (CP) en la saliva recolectada mediante análisis de western blot. (C) Western blotting para confirmar la presencia de LssgMP en la saliva recolectada. (D) Expresión específica de LssgMP en la glándula salival de L. striatellus. ef2: factor de elongación de la traducción 2 de SBPH. La media y el SEM se calcularon a partir de cuatro réplicas biológicas con tres réplicas técnicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La cría exitosa de insectos en dietas artificiales se informó por primera vez en 1962 cuando Mittler y Dadd describieron la técnica de membrana de parafina para mantener una dieta artificial29,30. Y este método se ha explorado en muchos aspectos de la biología y el comportamiento de los insectos, por ejemplo, suplementos nutricionales, alimentación con dsRNA y adquisición de virus. Según los requisitos del análisis de saliva, la sacarosa al 5% se utiliza como la dieta artificial general para recolectar saliva de SBPH en este estudio. Para una recolección de saliva exitosa, vale la pena señalar varios pasos críticos aquí. En primer lugar, es necesario matar de hambre a los insectos experimentales antes de introducirlos en la cámara para garantizar la eficiencia de la recolección de saliva. En segundo lugar, para imitar el ambiente estilizado, se hace un sándwich de parafina de dos capas. Cuando SBPH se alimenta de la dieta artificial, la vaina salival se forma en el extremo interior frente a la dieta, y la saliva acuosa se secreta posteriormente. En tercer lugar, se debe recolectar e intercambiar un medio artificial a tiempo para reducir la contaminación microbiana en la muestra recolectada. Por último, anestesiar a los insectos a 4 °C durante 5 min es fundamental para evitar la pérdida de insectos mientras se cambia la dieta artificial.
En contraste con la mayoría de las dietas artificiales que contienen aminoácidos, vitaminas y carbohidratos, las ventajas del medio de sacarosa al 5% son notables. Primero, es fácil de preparar. En segundo lugar, la composición simple de la dieta significa pocas sustancias para interferir con un análisis adicional de los diversos factores en la saliva. Sin embargo, la relación de supervivencia de la SBPH disminuyó en los últimos días del período de alimentación utilizando sacarosa al 5% como dieta artificial general (Figura 1D). Para superar este defecto, se debe suministrar SBPH fresco a tiempo para obtener suficiente saliva. Y para una mayor investigación de la función salival en el comportamiento de alimentación o la transmisión del virus, la duración de la recolección de saliva debe limitarse al tiempo preciso antes de que la mortalidad de los insectos aumente debido a la desnutrición. Parece ser una limitación común del medio artificial. Algunos otros estudios encontraron que la supervivencia de N. lugens criados en la dieta químicamente definida D-97 era inferior a la de los criados en la variedad de arroz susceptible TN1, lo que implica que el huésped original suministra más que solo insectos vectores de alimentos. Y varios estudios se han centrado en optimizar las dietas definidas químicamente para la alimentación continua de insectos para mejorar la eficiencia de la cría.
El análisis del transcriptoma de la glándula salival es un método tradicional para la identificación de proteínas salivales. Y se han detectado diferentes proteínas salivales en las mismas especies de A. pisum y M. persicae14,31,y la abundancia de proteínas salivales determina la frecuencia de su detección32. Sin embargo, faltaba un método válido para investigar la proteína sospechosa en la saliva. Este método sándwich de membrana de parafina proporciona una manera innovadora de confirmar una sospecha de proteína de saliva identificada por análisis de transcriptoma, que se demuestra aún más mediante la detección de LssgMP(Figura 2C). Además, el análisis de proteínas confirmó que abundantes proteínas están presentes en la saliva recolectada(Figura 2A),que es una cantidad suficiente para un análisis posterior, por ejemplo, mediante espectrometría de masas. El análisis proteómico de la saliva recolectada será un método directo y efectivo para identificar los factores secretados involucrados en la etapa de alimentación de SBPH, minimizando el riesgo de detectar proteínas redundantes falsos positivos.
La saliva funciona como portador del virus de las plantas huésped a las plantas huésped y es un componente esencial de la interacción vector-virus-planta14,33,34. El título de virus liberado por los insectos vectores es un factor crucial para la infección al huésped. En comparación con los métodos indirectos que prueban el título viral en plantas infectadas, este protocolo puede detectar directamente el VSR liberado por el SBPH virulífero(Figura 2B). Con el apoyo de este método sándwich de membrana de parafina, los análisis comparativos adicionales de las proteínas de saliva recolectadas de insectos libres de RSV e infectados por RSV también pueden revelar posibles candidatos involucrados en la interacción virus-planta-vector.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (No. 2019YFC1200503), por la Fundación Nacional de Ciencias de China (No. 32072385) y por la Asociación de Promoción de la Innovación Juvenil CAS (2021084).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-KD centrifugal filter | Merck Millipore | R5PA83496 | For concentration |
| 10x Protein Transfer Buffer(wet) | macGENE | MP008 | Transfer buffer for western blotting |
| 10x TBST buffer | Coolaber | SL1328-500mL×10 | Wash buffer for western blotting |
| Azure c600 biosystems | Azure Biosystems | Azure c600 | Imaging system for western blotting and silver staining |
| Color Prestained protein ladder | GenStar | M221-01 | Protein marker for western blotting |
| ECL western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | Western blotting detection |
| Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit | TIANGEN | #PA110 | Chromogenic reaction |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies | Sigma | 401393-2ML | Polyclonal secondary antibody for western blotting |
| Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane | Merck Millipore | IPVH00010 | Transfer membrane for western blotting |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | For quantitative real-time PCR (qRT-PCR) |
| KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES | Bio-Rad | 1708891 | For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR) |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RB | For filtration |
| Mini-PROTEAB TGX Gels | Bio-Rad | 4561043 | For SDS-PAGE |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | Detection of protein concentration |
| Nylon membrane | PALL | T42754 | Membrane for dot-ELISA |
| Parafilm M Membrane | Sigma | P7793-1EA | Making artifical diet sandwichs |
| Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides | Genstript | Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting | |
| Rabbit anti-RSV polyclonal antibody | Genstript | Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA | |
| RNAprep pure Micro Kit | TIANGEN | DP420 | For RNA Extraction |
References
- Cheng, X., Zhu, L., He, G. Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper. Molecular Plant. 6 (3), 621-634 (2013).
- Cho, W. K., Lian, S., Kim, S. M., Park, S. H., Kim, K. H. Current insights into research on Rice Stripe Virus. The Plant Pathology Journal. 29 (3), 223-233 (2013).
- He, M., Guan, S. Y., He, C. Q.
- Wu, W., et al. Nonstructural protein NS4 of Rice Stripe Virus plays a critical role in viral spread in the body of vector insects. PLoS One. 9 (2), 88636 (2014).
- Huo, Y., et al. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector. PLoS Pathogens. 10 (3), 1003949 (2014).
- Taning, C. N., Andrade, E. C., Hunter, W. B., Christiaens, O., Smagghe, G. Asian citrus psyllid RNAi pathway-RNAi evidence. Scientific Reports. 6, 38082 (2016).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
- Huo, Y., et al. Artificial feeding Rice Stripe Virus enables efficient virus infection of Laodelphax striatellus. Journal of Virological Methods. 235, 139-143 (2016).
- Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).
- Huo, Y., et al. Rice Stripe Virus hitchhikes the vector insect vitellogenin ligand-receptor pathway for ovary entry. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374, 20180312 (2019).
- Bao, Y. Y., et al. De novo intestine-specific transcriptome of the brown planthopper Nilaparvata lugens revealed potential functions in digestion, detoxification and immune response. Genomics. 99 (4), 256-264 (2012).
- Elzinga, D. A., Jander, G. The role of protein effectors in plant-aphid interactions. Current Opinion In Plant Biology. 16 (4), 451-456 (2013).
- Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15728-15733 (2013).
- Bos, J. I., et al. A functional genomics approach identifies candidate effectors from the aphid species Myzus persicae (green peach aphid). PLoS Genetics. 6 (11), 1001216 (2010).
- Liu, X., Zhou, H., Zhao, J., Hua, H., He, Y. Identification of the secreted watery saliva proteins of the rice brown planthopper, Nilaparvata lugens (Stål) by transcriptome and Shotgun LC-MS/MS approach. Journal of Insect Physiology. 89, 60-69 (2016).
- Cao, T. T., Lü, J., Lou, Y. G., Cheng, J. A. Feeding-induced interactions between two rice planthoppers, Nilaparvata lugens and Sogatella furcifera (Hemiptera: Delphacidae): effects on feeding and honeydew excretion. Environmental Entomology. 42 (6), 1281-1291 (2013).
- De Vos, M., Jander, G. Myzus persicae (green peach aphid) salivary components induce defence responses in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell & Environment. 32 (11), 1548-1560 (2009).
- Wang, L., et al. Understanding the immune system architecture and transcriptome responses to southern rice black-streaked dwarf virus in Sogatella furcifera. Scientific Reports. 6, 36254 (2016).
- Wang, Y., et al. Penetration into rice tissues by brown planthopper and fine structure of the salivary sheaths. Entomologia Experimentalis et Applicata. 129 (3), 295-307 (2008).
- Wang, W., et al. Armet is an effector protein mediating aphid-plant interactions. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (5), 2032-2045 (2015).
- Chaudhary, R., Atamian, H. S., Shen, Z., Briggs, S. P., Kaloshian, I. GroEL from the endosymbiont Buchnera aphidicola betrays the aphid by triggering plant defense. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 8919-8924 (2014).
- Ma, R., Chen, J. L., Cheng, D. F., Sun, J. R. Activation of defense mechanism in wheat by polyphenol oxidase from aphid saliva. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (4), 2410-2418 (2010).
- Zheng, L., Seon, Y. J., McHugh, J., Papagerakis, S., Papagerakis, P. Clock genes show circadian rhythms in salivary glands. Journal of Dental Research. 91 (8), 783-788 (2012).
- Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species. Journal of Proteomics. 172, 25-35 (2018).
- Huang, H. J., Liu, C. W., Xu, H. J., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Mucin-like protein, a saliva component involved in brown planthopper virulence and host adaptation. Journal of Insect Physiology. 98, 223-230 (2017).
- Shangguan, X., et al. A mucin-like protein of planthopper is required for feeding and induces immunity response in plants. Plant Physiology. 176 (1), 552-565 (2018).
- Petrova, A., Smith, C. M. Immunodetection of a brown planthopper (Nilaparvata lugens Stål) salivary catalase-like protein into tissues of rice, Oryza sativa. Insect Molecular Biology. 23 (1), 13-25 (2014).
- Zhu, J., et al. Genome sequence of the small brown planthopper, Laodelphax striatellus. GigaScience. 6 (12), 1-12 (2017).
- Van Bel, A. J., Will, T. Functional evaluation of proteins in watery and gel saliva of aphids. Frontiers In Plant Science. 7, 1840 (2016).
- Perez-Vilar, J., Hill, R. L. The structure and assembly of secreted mucins. The Journal of Biological Chemistry. 274 (45), 31751-31754 (1999).
- Pitino, M., Hogenhout, S. A. Aphid protein effectors promote aphid colonization in a plant species-specific manner. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (1), 130-139 (2013).
- Zhang, F., Zhu, L., He, G. Differential gene expression in response to brown planthopper feeding in rice. Journal of Plant Physiology. 161 (1), 53-62 (2004).
- Hogenhout, S. A., Ammar, E. -D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Boissot, N., Schoeny, A., Vanlerberghe-Masutti, F. Vat, an amazing gene conferring resistance to aphids and viruses they carry: from molecular structure to field effects. Frontiers In Plant Science. 7, 1420 (2016).
