Summary
Ekstracellulære vesikler (elbiler) bidrager til cellulær biologi og intercellulær kommunikation. Der er behov for praktiske analyser til at visualisere og kvantificere elbiler optagelse af cellerne. Den nuværende protokol foreslår EV optagelse assay ved hjælp af tre-dimensionelle fluorescens billeddannelse via konfokal mikroskopi, efter EV isolation af en nano-filtrering-baseret mikrofluidisk enhed.
Abstract
Der er behov for praktiske analyser til at visualisere og kvantificere cellernes ekstracellulære vesikel (EV) optagelse. Udbredelsen af el-og el-eks. kræftbiologi, neurovidenskab og lægemiddellevering. Mange EV optagelse assays er blevet rapporteret i litteraturen; Der mangler imidlertid en praktisk og detaljeret eksperimentel metode. EV optagelse kan vurderes ved fluorescerende mærkning elbiler til at opdage deres placering i celler. Det er vanskeligt, men kritisk at skelne mellem internaliserede elbiler i celler og de overfladiske elbiler på celler, men det er vigtigt at bestemme EV-optagelsen nøjagtigt. Derfor foreslås en analyse, der effektivt kvantificerer EV-optagelse gennem tredimensionel (3D) fluorescenskonfokal mikroskopi i dette arbejde. Fluorescerende mærket elbiler blev udarbejdet ved hjælp af en nano-filtrering-baseret mikrofluidisk enhed, visualiseret af 3D konfokal mikroskopi, og derefter analyseret gennem avanceret billedbehandling software. Protokollen giver en robust metode til analyse af elbiler på celleniveau og en praktisk tilgang til effektiv analyse.
Introduction
Ekstracellulære vesikler (elbiler) er nano-størrelse, lipidmembran-bundet partikler, der er kategoriseret efter deres størrelser: ectosomes (100-500 nm) og exosomer (50-150 nm)1. Elbiler indeholder forskellige biomolekyler, såsom proteiner, nukleinsyrer og lipider. Disse biomolekyler stammer fra cellerne, før de indkapsles som last og frigives i det ekstracellulære rum via elbiler1,2,3.
På grund af de mange forskellige deres last, elbiler menes at spille en aktiv rolle i intercellulær kommunikation. Frigivelse og optagelse af elbiler af celler gør det muligt at overføre biomolekyler mellem cellerne4,5. Indførelsen af EV-last til en celle kan ændre modtagercellens funktioner og homøostatisk tilstand4,5,6. Elbiler internaliseres gennem flere veje; De nøjagtige mekanismer er dog ikke blevet nøjagtigt påvist.
De fleste af ev optagelse assays, såsom genetisk mærkning, fluorescerende mærke individuelle elbiler7. Det resulterende signal kan måles ved mikropladefotometer, flowcytometri eller mikroskopi, hvor hver teknologi har betydelige begrænsninger. Mikropladefotometre, flowcytometri eller standard todimensionel (2D) mikroskopi kan ikke skelne mellem internaliserede og overfladisk vedhæftede elbiler8,9. Desuden kan den nødvendige prøveforberedelse for hver af disse teknikker medføre yderligere problemer i forbindelse med evaluering af ev-optagelse. For eksempel, løfte klæbede celler med trypsin før EV optagelse analyse kan kløve nogle overfladisk vedhæftede elbiler på cellens overflade10,11. Trypsin kan også interagere med celleoverfladen, påvirker celle og EV fænotype. Derudover kan trypsin ikke løsne overfladiske elbiler helt, skævvridning isolerede populationer.
For nøjagtigt at mærke elbiler med fluorescerende farvestoffer kræves der yderligere vasketrin for at fjerne restfarvet7. Accepterede isolationsteknikker kan også bidrage til falsk-positive signaler på grund af koagulation, der opstår under EV-isolation. For eksempel er seriel ultracentrifugering (UC) meget udbredt til at isolere elbiler og fjerne det immobiliserede farvestof. UC kan dog være med til at udfælde elbiler, og restfarvestoffet kan føre til et falsk-positivt signal12,13. Andre nanofiltreringsmetoder, såsom kolonnebaseret filtrering, anvendes også i vid udstrækning til ikke-immobiliseret farvefjernelse. Den komplekse karakter af elbiler og farvestof, der interagerer inden for kolonnematrixen, kan føre til ufuldstændig fjernelse af restfarvestof, fordi søjlens molekylære afskæring ændres af den komplekse indgang14,15,16.
Den nuværende protokol foreslår en nanofiltreringsbaseret mikrofluidisk enhed til at isolere og vaske fluorescerende mærket isolerede elbiler. Den nanofiltreringsbaserede mikrofluidiske enhed kan give effektiv filtrering via væskeassisteret separationsteknologi (FAST)17,18. FAST reducerer trykfaldet på tværs af filteret, hvilket reducerer den potentielle sammenlægning mellem elbiler og farvestoffer. Ved effektivt at fjerne restfarve, er det muligt at forbedre kvaliteten af fluorescerende mærket elbiler og analysens specificitet.
Konfokal mikroskopi kan skelne mellem internaliserede og overfladisk vedhæftede elbiler på celleoverfladen og grundigt undersøge de cellulære mekanismer af EV optagelse i en spatiotemporal opløsning19,20,21,22,23,24,25. For eksempel beskrev Sung et al. visualiseringen af den exosome livscyklus ved hjælp af deres udviklede live-celle reporter. Placeringen af de internaliserede elbiler blev opdaget og analyseret ved hjælp af et konfokalt mikroskop i 3D-værktøjer (three-dimension) og post-image processing20. Selv om størrelsen af små elbiler (40-200 nm) er under opløsningsgrænsen for det optiske mikroskop, kan de fluorescerende mærkede elbiler detekteres ved konfokal mikroskopi, da fotodetektoren kan detektere den forbedrede fluorescensemission. Derfor kan den subcellulære lokalisering af de fluorescerende mærkede elbiler i en celle bestemmes præcist ved at erhverve flere z-stablede billeder af elbilerne og de omkringliggende cellulære organeller.
Derudover kan 3D-rekonstruktion og post-databehandling give yderligere indsigt i placeringen af de internaliserede, overfladiske og fritflydende elbiler. Ved at udnytte disse processer i forbindelse med time-lapse live-celle billeddannelse, der tilbydes af konfokal mikroskopi, kan niveauet af EV optagelse vurderes præcist, og real-time tracking af EV optagelse er også muligt. Endvidere kan ev trafficking analyse udføres ved hjælp af konfokal mikroskopi ved at vurdere co-lokalisering af elbiler med organeller, et første skridt til at bestemme, hvordan internaliserede elbiler er involveret i den intracellulære funktion. Denne protokol beskriver metoden til udførelse af en EV-optagelsesanalyse ved hjælp af den nanofiltreringsbaserede mikrofluidiske enhed17,26, konfokal mikroskopi og analyse efter billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. EV isolation og on-chip immun-fluorescerende EV mærkning
- Indsamling af cellekulturmedier (CCM) og forbehandling af CCM til EV-isolering
- Seed PC3 celler ved 30% sammenløb i en 75 cm2 celle kultur kolbe. Tillad kontrolceller at vokse til 90% sammenløb (~48 h) i standard medier og celle-line-specifikke kosttilskud.
BEMÆRK: For at forhindre, at EV-holdige komponenter påvirker cellulær optagelse (dvs. fosterkvægsserum), skal du bruge exosome-udtømte medier og kosttilskud. - Høst CCM' en.
- Centrifuge CCM ved 1000 x g i 10 min ved stuetemperatur (RT) for at pellet eventuelle uopnåede celler og store snavs høstet med medierne. Overfør supernatanten til et nyt konisk rør.
- I det nye rør centrifugere supernatanten ved 10.000 x g i 20 min ved 4 °C for at pille mindre snavs og apoptotiske kroppe tilbage i medierne. Nogle større elbiler vil pellet. Overfør supernatanten til et nyt rør.
- Supernatanten filtreres gennem et 0,45 μm hydrofil polyvinylidenfluorid (PVDF) membransprøjtefilter.
BEMÆRK: Hvis CCM ikke straks forarbejdes til EV-isolering, skal den forbehandlede CCM opbevares ved -80 °C, indtil isolationen er udført. Hvis fryse-optøningscyklusser fryses ned, begrænses de til én.
- Seed PC3 celler ved 30% sammenløb i en 75 cm2 celle kultur kolbe. Tillad kontrolceller at vokse til 90% sammenløb (~48 h) i standard medier og celle-line-specifikke kosttilskud.
- EV isolation fra CCM ved hjælp af en nano-filtrering baseret mikrofluidisk enhed
- Hvis den er frosset, optøs CCM og hvirvlen i 30 s før trin 1.2.2.
- 1 mL forarbejdet CCM (trin 1.1) indsprøjtes i prøvekammeret i den nanofiltreringsbaserede mikrofluidiske anordning (se Materialetabel)17,26.
BEMÆRK: Følg standarddriftsproceduren for den nanofiltreringsbaserede mikrofluidiske enhed17,26. - Drej ved 3000 omdr./min i bænken-top spinning maskine (se Tabel af materialer) til at betjene den mikrofluidiske enhed.
BEMÆRK: Hvis CCM forbliver på prøvekammeret efter den første kørsel, skal du udføre yderligere spins, indtil alle CCM'er er tømt fra prøvekammeret. - Væsken fjernes fra affaldskammeret ved at pipettere og gentage trin 1.2.1, 1.2.2 og 1.2.3 to gange.
BEMÆRK: I alt vil 3 mL CCM blive behandlet til EV-isolering. - 1 mL fosfatbufferet saltvand (PBS) i prøvekammeret for at vaske de isolerede elbiler. Spin i bænken-top spindemaskine til betjening af mikrofluidiske enhed som nævnt i trin 1.2.3. Find de rene elbiler på enhedens membran.
BEMÆRK: Kvaliteten af elbiler isoleret fra den nanofiltreringsbaserede mikrofluidiske enhed blev specifikt bekræftet og sammenlignet med den konventionelle UC-metode ved transmissionselektronmikroskopi (TEM), scanningselektronmikroskop (SEM), nanopartiklersporingsanalyse (NTA), struktureret belysningsmikroskopi, enzymbundet immunosorbentanalyse og realtids-PCR i den tidligere forskning17,26.
- Immunfluorescent mærkning af EV ved hjælp af nanofiltreringsbaseret mikrofluidisk enhed (figur 1)
- Vælg et EV-specifikt antistof i henhold til formålet med analysen (se Materialetabel).
BEMÆRK: Visse antistoffer kan forstyrre ligandbindingssteder, der er specifikke for EV-optagelsesveje (dvs. endokytose). - Ansprøjt 1 μg/mL af det EV-specifikke antistof i elutionshullet på den anordning, der indeholder 100 μL isolerede elbiler.
- Inkuber i 1 time i mørket ved RT på en plade shaker for at sikre jævn fordeling af antistoffet på tværs af prøven.
- Fastgør et klæbebånd til fortyndingshullet. Indsprøjt 1 mL PBS i prøvekammeret for at vaske eventuelle resterende antistoffer ud.
- Drej enheden ved 3000 omdr./min., indtil prøvekammeret er tomt. Fjern eventuel væske fra affaldskammeret ved at pipettere. 1 mL PBS ind i prøvekammeret.
BEMÆRK: Fluorescerende mærkede elbiler vil blive placeret i membrankammeret. - Pipette fluorescerende mærket elbiler (figur 2) fra membrankammeret til et ravrør. Bloker fra lyset, indtil det er i brug.
- Vælg et EV-specifikt antistof i henhold til formålet med analysen (se Materialetabel).
2. Inkubation af cellerne med fluorescerende mærkede elbiler til EV-optagelsesanalysen
- Mål celle såning og kultur på celle-kultur kompatible retter.
- Seed 1 x 104 PC3-celler i mikroslidten 8-brøndspladen (9,4 x 10,7 mm for hver brønd) med 0,2 mL medier eller 4 x 104 PC3-celler i en 35 mm skål med 1 mm medie. Pladen cellerne i en celle-kultur kompatibel skål bestående af en tynd coverlip (tykkelse: 0,18 mm).
BEMÆRK: Den tynde coverlip minimerer den negative spredning af lys. - Lad cellerne klæbe natten over under optimale cellekulturforhold (37 °C, 5% CO2-koncentration , 90% fugtighed).
- Vask klæbede celler to gange med exosome-udtømte medier (beskrevet i trin 1.1.1).
- Seed 1 x 104 PC3-celler i mikroslidten 8-brøndspladen (9,4 x 10,7 mm for hver brønd) med 0,2 mL medier eller 4 x 104 PC3-celler i en 35 mm skål med 1 mm medie. Pladen cellerne i en celle-kultur kompatibel skål bestående af en tynd coverlip (tykkelse: 0,18 mm).
- Celleinkubation med fluorescerende mærkede elbiler.
- Måle koncentrationen af fluorescerende mærkede elbiler (trin 1.3.5) ved nanopartiklersporingsanalyse (NTA, supplerende figur 1). Den optimale koncentration af fluorescerende mærkede elbiler, der skal tilsættes de dyrkede celler (trin 2.1.2.).
- Fluorescerende mærkede elbiler fortyndes med exosome-udtømte medier, så de svarer til den ønskede koncentration målt i trin 2.2.1. (dvs. 7,80 x 109 elbiler (i NTA-værdi) i 200 μL exosome-udtømte medier.)
- De fortyndede elbiler (trin 2.2.2) til de tilsatte målceller, der er fremstillet ved 2.1.2, tilføjes. Inkuber til forsøgstid (dvs. 4, 8 eller 12 timer).
- Vask celler tre gange med exosome-fri medier for at fjerne eventuelle ikke-internaliserede elbiler.
BEMÆRK: Valgfrit: Celler kan fikseres efter vask. - Mærk cytoplasmaet i de klæbede celler med 1 μg/mL CMTMR ((5-(og-6)-(((4-chloromethyl)benzoyl)amino) tetramethylrhodamin) (se Materialetabel) og inkuber under optimale cellekulturforhold (37 °C, 5% CO2-koncentration , 90% fugtighed).
BEMÆRK: Celleområdefarvestoffer bør fluoresce adskilt fra mærkede elbiler for at hjælpe med at bestemme den rumlige placering (internaliseret eller overfladisk) af de spidse elbiler under EV-optagelsesanalysen. - Vask mærkede celler to gange med exosome-udtømte medier for at fjerne det resterende farvestof. Tilføj friske exosome-udtømte medier til cellerne som forberedelse til live-celle confocal billeddannelse.
3. Konfokal mikroskopi
- For at udføre live-cellebilleddannelse skal du bruge en inkubator på scenen til at opretholde optimale cellekulturforhold (37 °C, 5% CO2-koncentration , 90% fugtighed).
- Placer de forberedte celler i inkubatoren på scenen.
- Angiv billedparametrene baseret på kontroleksempler.
BEMÆRK: Foreslåede kontrolprøver omfatter: Kun fluorescerende mærkede elbiler, fluorescerende mærkede celler, umærkede elbiler og umærkede celler. - Bestem dybden af målcellerne og stablingsstørrelsen i z-retningen for at hente 3D-konfokale billeder.
BEMÆRK: Tykkelsen af en Z-stak er 1 μm. Den confocal 3D-billede erhvervelse varede 2 min 34 s (hver Z-plane billede erhvervelse tog ca 8 s; i alt tyve Z-stack billeder). - Indstil billedopsamling til flere z-stablede billeder af både cellespecifikt farvestof (dvs. rød) og EV-specifikt farvestof (dvs. grønt) samtidigt (figur 3 og figur 4A).
4. Billedbehandling
- Brug automatisk billedbehandlingssoftware til at analysere de rå z-stablede konfokale billeder og bestemme EV-optagelsen af celler (se Materialetabel).
- Angiv fortærseringsparametre til cellernes fluorescerende signal og EV-specifikke farvestoffer. Byg cellernes virtuelle overflader (Figur 4A,B).
- Hvis du vil opbygge cellernes virtuelle overflader, skal du klikke på knappen Tilføj nye overflader.
- Vælg Korteste afstandsberegning som "Algoritmeindstillinger" for at bruge den angivne algoritme af softwaren, og klik derefter på Næste: Kildekanal.
- Vælg Kanal 2 - CMTMR som "Kildekanal" i dette eksperiment.
- Vælg Glat og læg den relevante værdi i "Overflader Detalje" for overflade udjævning.
BEMÆRK: 0,57 μm i dette eksperiment, da 1 pixel repræsenterer 0,57 μm i rå billeddata. - Vælg Absolut intensitet som "Tærskeling".
- Hvis du automatisk vil tærskel det fluorescerende billede med den angivne algoritme, skal du klikke på Tærskel (absolut intensitet): Værdien angives automatisk.
- Vælg Aktivér som "Opdel berøringsobjekter (områdedyrkning)", og læg værdien af den anslåede cellestørrelse i "Frøpointdiameter", 10,0 μm i dette eksperiment. Klik derefter på Næste: Filtrer frøpunkter.
- Hvis du vil konfigurere de virtuelle celleoverflader, skal du klikke på knappen + Tilføj og derefter vælge Kvalitet som "Filtertype". Tærskel den relevante værdi (210 i dette eksperiment) for den lave grænse ved en visuel inspektion og maksimumværdien (1485) for den øvre grænse, og klik derefter på knappen Udfør .
BEMÆRK: En visuel inspektion betyder, at en forsker kan diskriminere celleområdet fra et råt fluorescerende billede. - Klik derefter på knappen Tilføj nye pletter for at opbygge de virtuelle prikker af elbiler.
- Vælg Forskellige staffagestørrelser (områdedyrkning) og korteste afstandsberegning som "Algoritmeindstillinger", og klik derefter på Næste: Kildekanal.
- Vælg Kanal 1 - Alexa Fluor 488 som "Kildekanal" i dette eksperiment.
- Sæt den relevante værdi i "Anslået XY Diameter" til spotdetektering, 1 μm i dette eksperiment. Klik derefter på Næste: Filtrer pletter.
- Hvis du vil konfigurere de virtuelle EV-prikker, skal du klikke på + Knappen Tilføj , vælge Kvalitet som "Filtertype" og angive "Nedre tærskel" ved en visuel inspektion , 100 i dette eksperiment. Klik derefter på knappen Næste: Staffageområdetype .
- Vælg Absolut intensitet som "Staffageområdertype", og klik derefter på Næste: Staffageområder.
- Til tærskel, regionen EV prikker, sætte den relevante værdi i "Region Threshold" ved en visuel inspektion, 100 som "Region Threshold" i dette eksperiment.
BEMÆRK: En visuel inspektion betyder, at en forsker kan diskriminere elbilområdet fra et råt fluorescerende billede. - Vælg Områdevolumen som "Diameter fra", og klik derefter på Udfør.
- Brug softwarens medfølgende algoritmer til at opdele de grupperede pletter inde i den byggede overflade ved trin 4.2 (Figur 4C, i-iv).
- Klik på de indbyggede pletter, og gå derefter ind i Filtre.
- Klik på knappen + Tilføj , og vælg derefter Korteste afstand til overflader = Surface 1 som filtertype, og klik derefter på Dubletmarkering til knappen Pletter . Den laveste tærskel (-7,0 i dette eksperiment) for den lave grænse og den relevante værdi (-0,5) for den øvre grænse.
BEMÆRK: Indstil den øvre grænse med den anslåede radius af pletter. I dette forsøg blev den anslåede diameter af pletter, dvs. EV-prikker, sat til 1 μm i trin 4.2.11. således kan den øvre grænse være 0,5.
- Automatisk antal elbiler inde i cellerne
BEMÆRK: Softwaren tæller automatisk antallet af elbiler inde i cellerne, hvilket angiver det antal, der internaliseres af målcellerne.- Klik på det byggede spots 1-valg [Korteste afstand til overflader = Overflader 1 mellem -7,00 og -0,500].
- Gå til Statistik, og eksporter værdien fra "Samlet antal pletter"
BEMÆRK: Softwarens medfølgende algoritmer beregner automatisk antallet og mængden af celler.
- Bestem udbyttet af EV-optagelse pr. inkubationsperiode baseret på de ovenfor beregnede værdier (figur 5).
- Hvis du vil have fat i antallet af celler, skal du klikke på de byggede overflader 1 og derefter gå til Statistikken og eksportere værdien af "Samlet antal overflader" fra Overall.
- Gå til Detaljeret statistik for at eksportere diskenheden fra Detaljeret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af en nanofiltreringsbaseret mikrofluidisk enhed blev elbiler isoleret fra PC3 CCM og mærket med et fluorophore-konjugeret EV-specifikt (CD63) antistof (figur 1). De mærkede elbiler blev med succes visualiseret af 3D-konfokal mikroskopi (figur 2). De mærkede elbiler blev inkuberet med celler i flere timer i exosome-udtømte medier. Efter inkubation blev celler vasket med exosome udtømte medier. De resterende elbiler blev internaliseret eller klæbet til celler under inkubation. Celleområdet var mærket. Internaliserede elbiler blev visualiseret som punktta19,20,24,27 og en individuel EV (figur 3 og figur 4A). Efterbehandling af disse billeder gør det muligt at visualisere og kvantificere EV internalisering i cellerne (Figur 4). Trinene i forbindelse tillader præcis EV optagelse assay udføres effektivt. Figur 5 viser de repræsentative resultater af EV-optagelsesanalysen. Analysen viser, at ev-optagelsen er afhængig af inkubationsperiodens længde. Proceduren giver mulighed for systematisk udelukkelse af ikke-internaliserede elbiler (figur 4C) for præcist at sikre antallet af internaliserede elbiler. Størrelsen fordeling af internaliserede EV prikker blev beregnet (Figur 6). Desuden kan antallet af internaliserede elbiler normaliseres til modtagercellernes volumen for at bestemme den faktiske hastighed af EV-optagelse for den specifikke celle. Normalisering tegner sig for den heterogene cellestørrelse og repræsenterer antallet af internaliserede elbiler vedrørende det cellulære overfladeareal. Cellulært overfladeareal defineres som det celleområde, der er i kontakt med EV-spiked, exosome-udtømte kulturmedier under inkubation.
Figur 1: Skematisk illustration af EV-isolering og on-chip-mærkning ved hjælp af en nanofiltreringsbaseret mikrofluidisk enhed. (A) Elbiler isolation fra CCM. (B) Immunfluorescent-mærkning af elbiler på chippen. (C) Fjernelse af ubundne antistoffer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Billedbehandling af fluorescerende mærkede elbiler. De fluorescerende mærket (anti-CD63-Alexa Fluor 488) elbiler blev opdaget ved hjælp af det konfokale mikroskop (40x mål). (A) Positiv prøve (anti-CD63-Alexa Fluor 488 mærket elbiler). (B) Negativ kontrol 1 for EV-mærkningen (kun elbiler med 2. antistof (Alexa Fluor 488) uden 1. antistof). (C) Negativ kontrol 2 (elbiler med musen (MS) IgG antistof og 2. antistof (Alexa Fluor 488)). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Billeddannelse af de internaliserede elbiler i celler i et 2D-billede. (A) Det fluorescerende mærkede (anti-CD63-Alexa Fluor 488, grønne) elbiler og cellerne (CMTMR, rød) blev detekteret ved hjælp af det konfokale mikroskop (20x mål) efter inkubationen. (B) Et separat billede af de fluorescerende mærkede elbiler. (C) Kun et separat billede af de fluorescerende mærkede celler. Excitation / emission laser bølgelængder til CMTMR og Alexa Fluor 488 er 560.6/595 (±50) nm og 487.8/525 (±50) nm. Lasereffektindstillingerne er 3,0 % for CMTMR og 10,0 % for Alexa Fluor 488. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Kvantificering af de internaliserede elbiler efter billeddannelsesprocessen. (B) Virtuel gengivelse af elbilerne som pr- prik (grøn) og cellerne som overflade (rød) ved hjælp af billedbehandlingssoftwaren. (C, i-iv) Forskelsbehandling af de internaliserede elbiler (gule prikker) og ikke-internaliserede elbiler (grønne prikker, hvid pil) ved hjælp af den leverede softwarealgoritme. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Mængden af EV-optagelse som funktion af inkubationstiden. (A) Antallet af internaliserede elbiler pr. celle. (B) Antallet af internaliserede elbiler pr. cellevolumen. Antallet af internaliserede elbiler blev øget afhængigt af inkubationstiden. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Størrelsesfordelingen af internaliserede EV-prikker. Størrelsen af EV prikker blev målt og afbildet til en fordeling. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: NTA måling af anti-CD63-Alex Fluor 488 mærket elbiler. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Mængden af co-lokaliserede elbiler med lysosomer som funktion af inkubationstid. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 3: Mængden af ev optagelse som funktion af inkubationstid. (A) Antallet af internaliserede elbiler pr. celle. (B) Antallet af internaliserede elbiler pr. cellevolumen. Antallet af internaliserede elbiler blev øget afhængigt af inkubationstiden. EV-prøven blev mærket af RNA-farvningsfarve (se Materialetabel). Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En EV optagelse assay baseret på 3D fluorescens billeddannelse via konfokal mikroskopi giver en effektiv metode og følsom analyse. Denne fluorescerende EV mærkning letter visualisering af elbiler og med succes udfører en præcis EV optagelse assay. Tidligere metoder til mærkning af elbiler og fjernelse af restfarvestof er blevet rapporteret ved at fjerne nedbør ved hjælp af ultracentrifugering (UC); UC kan dog være med til at udfælde elbiler, og det immobiliserede farvestof kan føre til et falsk-positivt signal12,13. Nanofiltreringsbaserede mikrofluidiske anordninger eliminerer denne co-nedbør af elbiler og farvestof, hvilket forbedrer kvaliteten af de fluorescerende mærkede elbiler og analysens specificitet. EV-optagelse blev målt ved volumetrisk analyse for at skelne og kvantificere de internaliserede elbiler adskilt fra overfladiske elbiler på celleoverfladen. Den volumetriske analyse af EV optagelse giver mulighed for normalisering af EV optagelse af cellestørrelse. Den levende celle EV optagelse assay blev opnået ved hjælp af på scenen konfokale mikroskop inkubator. Protokollen gælder for undersøgelser, der kræver levende cellekulturer og elbiler. Intracellulær EV-sporing i realtid kan udføres på tværs af et 3D-vindue. Derudover kan der opnås analyse af handel med elbiler af rumlig-tidsmæssig opløsning sammen med samdealisering af elbiler med subcellulære organeller gennem protokollen (supplerende figur 2). Protokollen beskrevet her er et kraftfuldt værktøj til cellulær analyse af elbiler.
På trods af alle fordelene ved protokollen er der potentielle begrænsninger. Den mikrofluidiske nanofiltreringsanordning, der anvendes i denne undersøgelse, kan være med til at isolere andre forurenende stoffer under EV-isolation. Lipoproteiner med lav densitet har samme størrelse som elbiler og kan fanges i membranen under isolation28. Selvom EV-specifikke markører kan angive elbiler, kan de samisolerede forurenende stoffer påvirke downstream-analysen. I dette manuskript blev elbiler mærket med en CD63 konjugeret Alexa Fluor 488 farvestof. Denne mærkning øger specificiteten for registrering af ev. Det binder dog også EV-overflademolekylet og øger konkurrencebindingen. Derudover kan niveauet af EV optagelse være afhængig af cellelinjen og CCM. De mærkningsmetoder, der er beskrevet i denne protokol, kan tilpasses andre farvningsfarvestoffer såsom lipofile farvestoffer, cytosolic farvestoffer og RNA-farvestoffer (supplerende figur 3). Protokollen bruger et let scanning konfokalt mikroskop (LSCM) til at registrere det lille signal af elbiler. LSCM er afhængig af intense lasere, og som følge heraf kan levende celler blive beskadiget eller ændret af langvarig laser excitation. Den hurtige anskaffelseshastighed kan reducere fotodamage ved at bruge et roterende skivekonfokalt mikroskop (SDCM). SDCM kan også bruges i EV tracking, der kræver kort tid-lapse billeddannelse til at visualisere kortdistance bevægelser.
På trods af disse potentielle begrænsninger giver den foreslåede protokol en effektiv metode til vurdering af ev-optagelse og har potentiale til yderligere analyse af mobilappehjul i liveceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Y.-K. Cho er en opfinder af patenter på nano-filtrering-baserede mikrofluidiske enhed, Exodisc, som er licenseret til Labspinner (Ulsan, Korea). Alle andre forfattere har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIC-tilskudsnr. U54CA143803, CA163124, CA093900 og CA143055 til K.J.P. Denne forskning blev støttet af en bevilling fra Korea Health Technology R &D Project gennem Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finansieret af Ministeriet for Sundhed og Velfærd, Republikken Korea (tilskudsnummer: HI19C1122). Arbejde af J. Kim og Y.-K. Cho blev støttet af Institute for Basic Science (IBS-R020-D1), finansieret af den koreanske regering. Forfatterne takker de nuværende og tidligere medlemmer af Brady Urological Institute, især medlemmer af Pienta-Amend laboratoriet, for den kritiske læsning af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353038 | Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent |
| CFI Apo Lambda S 40XC WI | Nikon | MRD77400 | Objective for confocal imaging, NA=1.25 |
| CFI Plan Apo VC 20X | Nikon | MRD70200 | Objective for confocal imaging, NA=0.75 |
| Exodisc | Labspinner Inc. | EX-D1001 | A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation |
| ExoDiscovery | Labspinner Inc. | EX-R1001 | Operation device for Exodisc |
| Exosome-depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection |
| Fetal bovine serum (FBS) | VWR | 1500-500 | Nutrient for cell cultivation |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed | abcam | ab7063 | Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling |
| Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm | Ibidi | 81156 | Culture dish for confocal imaging |
| Imaris 9.7.1 | Oxford Instruments | 9.7.1 | Post-image processing software |
| Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer | Live Cell Instrument | TU-O-20 | Incubator system for live cell imaging |
| Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera | Nikon | NA | Camera for confocal imaging |
| Nikon Eclipse Ti microscope | Nikon | NA | Inverted microscope for confocal imaging |
| NIS-Elements AR 4.50.00 | Nikon | 4.50.00 | Image processing software for Nikon microscope |
| NTA, NanoSight NS500 | Malvern Panalytical | NS500 | Measurement device for EV concentration |
| OriginPro 2020 | OriginLab | 9.7.0.185 | Graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotics for cell cultivation |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | Cell culture media for PC3 cell line cultivation |
| SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S32703 | RNA staining fluorescent dye for the EV labeling |
References
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Sunkara, V., Woo, H. -K., Cho, Y. -K. Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular vesicles and their roles in cancer diagnostics and prognostics. The Analyst. 141 (2), 371-381 (2016).
- Kalluri, R., Lebleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Bonsergent, E., et al. Quantitative characterization of extracellular vesicle uptake and content delivery within mammalian cells. Nature Communications. 12, 1864 (2021).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
- Dehghani, M., Gaborski, T. R.
- Ragni, E., et al. Innovative Visualization and Quantification of Extracellular Vesicles Interaction with and Incorporation in Target Cells in 3D Microenvironments. Cells. 9 (5), 1180 (2020).
- Saari, H., et al. FLIM reveals alternative EV-mediated cellular up-take pathways of paclitaxel. Journal of Controlled Release. 284, 133-143 (2018).
- Franzen, C. A., et al. Characterization of Uptake and Internalization of Exosomes by Bladder Cancer Cells. BioMed Research International. 2014, 619829 (2014).
- Feng, D., et al. Cellular Internalization of Exosomes Occurs Through Phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
- Hoen, E. N. M. N. -T., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Van Der Vlist, E. J., Nolte-'T Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z.
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Singh, K., et al. Separation of distinct exosome subpopulations: isolation and characterization approaches and their associated challenges. The Analyst. 146 (12), 3731-3749 (2021).
- Woo, H. -K., et al. Exodisc for Rapid, Size-Selective, and Efficient Isolation and Analysis of Nanoscale Extracellular Vesicles from Biological Samples. ACS Nano. 11 (2), 1360-1370 (2017).
- Kim, T. -H., et al. FAST: Size-Selective, Clog-Free Isolation of Rare Cancer Cells from Whole Blood at a Liquid-Liquid Interface. Analytical Chemistry. 89 (2), 1155-1162 (2017).
- Joshi, B. S., De Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. Endocytosis of Extracellular Vesicles and Release of Their Cargo from Endosomes. ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).
- Sung, B. H., et al. A live cell reporter of exosome secretion and uptake reveals pathfinding behavior of migrating cells. Nature Communications. 11, 2092 (2020).
- Heusermann, W., et al. Exosomes surf on filopodia to enter cells at endocytic hot spots, traffic within endosomes, and are targeted to the ER. Journal of Cell Biology. 213 (2), 173-184 (2016).
- Reclusa, P., et al. Improving extracellular vesicles visualization: From static to motion. Scientific Reports. 10, 6494 (2020).
- Verweij, F. J., et al. Live Tracking of Inter-organ Communication by Endogenous Exosomes In Vivo. Developmental Cell. 48 (4), 573-589 (2019).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029 (2015).
- Durak-Kozica, M., Baster, Z., Kubat, K., Stępień, E. 3D visualization of extracellular vesicle uptake by endothelial cells. Cellular & Molecular Biology Letters. 23, 57 (2018).
- Sunkara, V., et al. Fully Automated, Label-Free Isolation of Extracellular Vesicles from Whole Blood for Cancer Diagnosis and Monitoring. Theranostics. 9 (7), 1851-1863 (2019).
- Li, H., et al. Internalization of trophoblastic small extracellular vesicles and detection of their miRNA cargo in P-bodies. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1812261 (2020).
- Dong, L., et al. Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium. Journal of Extracellular Vesicles. 10, 12044 (2020).
