Summary
تساهم الحويصلات خارج الخلية (EVs) في البيولوجيا الخلوية والاتصالات بين الخلايا. هناك حاجة إلى إجراء فحوصات عملية لتصور وقياس امتصاص المركبات الكهربائية من قبل الخلايا. يقترح البروتوكول الحالي فحص امتصاص EV من خلال استخدام التصوير الفلوري ثلاثي الأبعاد عبر المجهر الكونفوكوكال ، بعد عزل EV بواسطة جهاز microfluidic قائم على الترشيح النانوي.
Abstract
هناك حاجة إلى إجراء فحوصات عملية لتصور وقياس امتصاص الحويكل خارج الخلية (EV) للخلايا. يلعب امتصاص EV دورا في التواصل بين الخلايا في مختلف مجالات البحث؛ علم الأحياء السرطان، وعلم الأعصاب، وتسليم المخدرات. وقد تم الإبلاغ عن العديد من المقايسات EV امتصاص في الأدب; ومع ذلك، هناك نقص في المنهجية التجريبية العملية والمفصلة. يمكن تقييم امتصاص EV عن طريق وضع علامات فلورية على المركبات الكهربائية للكشف عن مواقعها داخل الخلايا. من الصعب التمييز بين المركبات الكهربائية الداخلية في الخلايا والمركبات الكهربائية السطحية على الخلايا ، ولكنها حاسمة ، لتحديد امتصاص EV بدقة. لذلك، يقترح في هذا العمل إجراء تقييم يحدد كفاءة امتصاص EV من خلال المجهر المفلور ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد). تم إعداد المركبات الكهربائية ذات العلامات الفلورية باستخدام جهاز ميكروفلويدي قائم على الترشيح النانوي ، تم تصوره بواسطة المجهر البؤري ثلاثي الأبعاد ، ثم تم تحليله من خلال برامج معالجة الصور المتقدمة. يوفر البروتوكول منهجية قوية لتحليل المركبات الكهربائية على المستوى الخلوي ونهجا عمليا للتحليل الفعال.
Introduction
الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي جزيئات ذات حجم نانوي، ومرتبطة بالغشاء الدهني يتم تصنيفها حسب أحجامها: ectosomes (100-500 نانومتر) والإكسوسومات (50-150 نانومتر)1. تحتوي المركبات الكهربائية على الجزيئات الحيوية المختلفة، مثل البروتينات والأحماض النووية والدهون. هذه الجزيئات الحيوية تنشأ من الخلايا قبل أن يتم تغليفها كشحنة والإفراج عنها في الفضاء خارج الخلية عن طريق EVs1,2,3.
نظرا لمجموعة متنوعة من حمولتها، ويعتقد أن المركبات الكهربائية تلعب دورا نشطا في الاتصالات بين الخلايا. إطلاق المركبات الكهربائية واستيعابها من قبل الخلايا تسمح بنقل الجزيئات الحيوية بين الخلايا4،5. إدخال البضائع EV إلى خلية قد يغير وظائف الخلية المتلقية وحالة الهوروستاتيكي4,5,6. يتم استيعاب المركبات الكهربائية من خلال مسارات متعددة؛ ومع ذلك، لم يتم إثبات الآليات الدقيقة بدقة.
غالبية المقايسات امتصاص EV، مثل وضع العلامات الوراثية، تسمية فلورية EVs7 الفردية. ويمكن قياس الإشارة الناتجة عن ذلك بواسطة مقياس ضوئي للصفائح الدقيقة، أو قياس التدفق الخلوي، أو المجهر، مع وجود قيود كبيرة على كل تقنية. لا يمكن أن تميز مقاييس فوتومترات الصفائح الدقيقة أو قياس التدفق الخلوي أو المجهر ثنائي الأبعاد القياسي بين EVs8,9 الداخلية والمرفقة ظاهريا. بالإضافة إلى ذلك، قد إعداد عينة اللازمة لكل من هذه التقنيات إدخال قضايا إضافية لتقييم امتصاص EV. على سبيل المثال، رفع الخلايا الملتزم بها مع تريبسين قبل تحليل امتصاص EV قد يشق بعض المركبات الكهربائية المرفقة سطحيا على سطح الخلية10،11. قد يتفاعل التريبسين أيضا مع سطح الخلية ، مما يؤثر على الخلية والنمط الظاهري EV. بالإضافة إلى ذلك، قد لا يفصل التريبسين المركبات الكهربائية السطحية تماما، مما يؤدي إلى انحراف السكان المعزولين.
لتسمية المركبات الكهربائية بدقة مع الأصباغ الفلورية، هناك حاجة إلى خطوات غسل إضافية لإزالة الصبغة المتبقية7. يمكن أن تسهم تقنيات العزل المقبولة أيضا في إشارات إيجابية خاطئة بسبب التخثر الذي يحدث أثناء عزل EV. على سبيل المثال، يستخدم الطرد الفائق المتسلسل (UC) على نطاق واسع لعزل المركبات الكهربائية وإزالة الصبغة المشلودة. ومع ذلك، قد تشارك UC في تسريع المركبات الكهربائية، وقد تؤدي الصبغة المتبقية إلى إشارة إيجابية خاطئة12,13. كما تستخدم طرق الترشيح النانوي الأخرى، مثل الترشيح القائم على العمود، على نطاق واسع لإزالة الصبغة غير المشلودة. قد تؤدي الطبيعة المعقدة للمركبات الكهربائية والصبغة التي تتفاعل داخل مصفوفة العمود إلى إزالة غير كاملة للصبغة المتبقية بسبب القطع الجزيئي للعمود الذي يتم تغييره بواسطة الإدخال المعقد14,15,16.
ويقترح البروتوكول الحالي جهازا ميكروفلويديا قائما على الترشيح النانوي لعزل وغسل المركبات الكهربائية المعزولة المسماة بالفلورسنت. يمكن لجهاز microfluidic القائم على الترشيح النانوي توفير ترشيح فعال عبر تقنية الفصل بمساعدة السوائل (FAST)17,18. يقلل FAST من انخفاض الضغط عبر الفلتر، مما يقلل من التجميع المحتمل بين المركبات الكهربائية والأصباغ. من خلال إزالة الصبغة المتبقية بكفاءة ، من الممكن تعزيز جودة المركبات الكهربائية ذات العلامات الفلورية وخصوصية المقايسة.
يمكن أن يميز المجهر البؤري بين المركبات الكهربائية الداخلية والمرفقة سطحيا على سطح الخلية والتحقيق الشامل في الآليات الخلوية لامتصاص EV في قرار ندواتي 19,20,21,22,23,24,25. على سبيل المثال، وصف سونغ وآخرون تصور دورة حياة إكسوسوم باستخدام مراسلهم المتطور للخلايا الحية. تم الكشف عن موقع المركبات الكهربائية الداخلية وتحليلها باستخدام المجهر confocal في ثلاثة أبعاد (3D) وأدوات معالجة ما بعد الصورة20. على الرغم من أن حجم المركبات الكهربائية الصغيرة (40-200 نانومتر) هو أقل من الحد الأقصى دقة المجهر البصري، يمكن الكشف عن المركبات الكهربائية المسمى الفلورسنت عن طريق المجهر البؤري منذ يمكن الكشف عن الالتقاف الضوئي انبعاثات الفلورية المحسنة. لذلك ، يمكن تحديد توطين الخلايا الفرعية للمركبات الكهربائية المسماة بالفلورسنت داخل الخلية بدقة من خلال الحصول على صور متعددة مكدسة ب z للمركبات الكهربائية والأعضاء الخلوية المحيطة بها.
بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن توفر إعادة البناء ثلاثية الأبعاد ومعالجة ما بعد البيانات المزيد من التبصر في وضع المركبات الكهربائية الداخلية والسطحية والحرة العائمة. من خلال الاستفادة من هذه العمليات بالتزامن مع التصوير بالخلايا الحية الفاصل الزمني الذي يقدمه المجهر الكونفوجال ، يمكن تقييم مستوى امتصاص EV بدقة ، ويمكن أيضا تتبع امتصاص EV في الوقت الفعلي. وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء تحليل الاتجار بالمركبات الكهربائية باستخدام المجهر البؤري عن طريق تقييم التوطين المشترك للمركبات الكهربائية مع العضيات، وهي خطوة أولى لتحديد كيفية مشاركة المركبات الكهربائية الداخلية في الوظيفة داخل الخلايا. يصف هذا البروتوكول منهجية إجراء فحص امتصاص EV باستخدام جهاز microfluidic القائم على الترشيح النانوي17,26 ، والتنظير المجهري البؤري ، وتحليل ما بعد الصورة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. EV العزلة وعلى رقاقة المناعة الفلورسنت EV وضع العلامات
- مجموعة من وسائط ثقافة الخلية (CCM) والمعالجة المسبقة ل CCM لعزل EV
- خلايا البذور PC3 في التقاء 30٪ في قارورة ثقافة الخلية 75 سم2 . السماح للخلايا التحكم في النمو إلى التقاء 90٪ (~ 48 ساعة) في وسائل الإعلام القياسية والمكملات الخاصة بخط الخلية.
ملاحظة: لمنع المكونات المحتوية على EV من التأثير على امتصاص الخلوية (أي مصل الأبقار الجنين)، استخدم الوسائط والمكملات الغذائية المنضبة. - حصاد CCM.
- الطرد المركزي CCM في 1000 × ز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) بيليه أي خلايا غير مرتبطة والحطام الكبير حصادها مع وسائل الإعلام. نقل supernatant إلى أنبوب مخروطي جديد.
- في الأنبوب الجديد، طارد مركزي للناطق الفائق عند 10,000 × غرام لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية ل بيليه الحطام الأصغر والأجسام المبرمج المتبقية في وسائل الإعلام. بعض المركبات الكهربائية الكبيرة سوف بيليه. نقل supernatant إلى أنبوب جديد.
- تصفية supernatant من خلال 0.45 ميكرومتر هيدروفيلي Polyvinylidene فلوريد (PVDF) مرشح حقنة غشاء.
ملاحظة: إذا لم يتم معالجة CCM لعزل EV فورا، قم بتخزين CCM المعالج مسبقا عند -80 درجة مئوية حتى يتم إجراء العزل. إذا تم تجميدها، قم بالحد من دورات التجميد والذوبان إلى دورة واحدة.
- خلايا البذور PC3 في التقاء 30٪ في قارورة ثقافة الخلية 75 سم2 . السماح للخلايا التحكم في النمو إلى التقاء 90٪ (~ 48 ساعة) في وسائل الإعلام القياسية والمكملات الخاصة بخط الخلية.
- عزل EV من CCM باستخدام جهاز microfluidic القائم على الترشيح النانوي
- إذا المجمدة، ذوبان CCM تماما ودوامة لمدة 30 ق قبل الخطوة 1.2.2.
- حقن 1 مل من CCM المعالجة مسبقا (الخطوة 1.1) في غرفة عينة من جهاز microfluidic المستندة إلى الترشيح نانو (انظر جدول المواد)17,26.
ملاحظة: اتبع إجراء التشغيل القياسي لجهاز microfluidic المستندة إلى الترشيح نانو17,26. - تدور في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة في آلة الغزل مقاعد البدلاء الأعلى (انظر جدول المواد) لتشغيل الجهاز microfluidic.
ملاحظة: إذا كان CCM يبقى على غرفة العينة بعد التشغيل الأولي، قم بإجراء دورات إضافية حتى يتم إفراغ كافة CCM من غرفة العينة. - إزالة السائل من غرفة النفايات عن طريق pipetting وتكرار الخطوات 1.2.1، 1.2.2، و 1.2.3 مرتين.
ملاحظة: في المجموع، ستتم معالجة 3 مل من CCM لعزل EV. - حقن 1 مل فوسفات عازلة المالحة (PBS) في غرفة العينة لغسل المركبات الكهربائية المعزولة. تدور في آلة الغزل مقاعد البدلاء أعلى لتشغيل الجهاز microfluidic كما ذكر في الخطوة 1.2.3. حدد موقع المركبات الكهربائية النقية على غشاء الجهاز.
ملاحظة: تم تأكيد جودة المركبات الكهربائية المعزولة عن جهاز microfluidic القائم على الترشيح النانوي ، على وجه التحديد ، ومقارنتها بطريقة UC التقليدية عن طريق المجهر الإلكتروني الإرسال (TEM) ، المجهر الإلكتروني المسح الضوئي (SEM) ، تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) ، المجهر الإضاءة المنظمة ، المقايسة المناعية المرتبطة بالإنزيم وPCR في الوقت الحقيقي في البحث السابق17،26.
- وضع العلامات المناعية للمركبات الكهربائية باستخدام جهاز ميكروفلويديك قائم على الترشيح النانوي (الشكل 1)
- حدد الأجسام المضادة EV محددة وفقا لغرض الفحص (انظر جدول المواد).
ملاحظة: قد تتداخل بعض الأجسام المضادة مع مواقع الربط ليغاند محددة لمسارات امتصاص EV (أي، بطانة الرحم). - حقن 1 ميكروغرام / مل من الأجسام المضادة EV محددة في ثقب elution من الجهاز الذي يحتوي على 100 ميكرولتر من المركبات الكهربائية المعزولة.
- احتضان لمدة 1 ساعة في الظلام في RT على شاكر لوحة لضمان التوزيع حتى من الأجسام المضادة عبر العينة.
- إرفاق شريط لاصق إلى ثقب elution. حقن 1 مل برنامج تلفزيوني في غرفة العينة لغسل أي أجسام مضادة المتبقية.
- قم بتدير الجهاز عند 3000 دورة في الدقيقة حتى تصبح غرفة العينة فارغة. إزالة أي سائل من غرفة النفايات عن طريق pipetting. حقن 1 مل برنامج تلفزيوني في غرفة العينة.
ملاحظة: سيتم وضع المركبات الكهربائية ذات العلامات الفلورية في غرفة الغشاء. - ماصة المركبات الكهربائية المسمى fluorescently (الشكل 2) من غرفة الغشاء إلى أنبوب العنبر. منع من الضوء حتى الاستخدام.
- حدد الأجسام المضادة EV محددة وفقا لغرض الفحص (انظر جدول المواد).
2. احتضان الخلايا مع المركبات الكهربائية المسمى فلوريا لEV امتصاص المقايسة
- استهداف بذر الخلايا والثقافة على الأطباق المتوافقة مع ثقافة الخلية.
- البذور 1 × 104 PC3 الخلايا في لوحة microslide 8 جيدا (9.4 × 10.7 ملم لكل بئر) مع 0.2 مل من وسائل الإعلام أو 4 × 104 خلايا PC3 في طبق 35 ملم مع 1 مل من وسائل الإعلام. صفيحة الخلايا في طبق متوافق مع ثقافة الخلية يتكون من غطاء رقيق (سمك: 0.18 مم).
ملاحظة: يقلل غطاء الأغطية الرقيق من التشتت السلبي للضوء. - السماح للخلايا بالالتصاق بين عشية وضحاها في ظروف مثالية زراعة الخلايا (37 درجة مئوية، تركيز 5٪ CO2 ، 90٪ رطوبة).
- غسل الخلايا المرتبطة مرتين مع وسائل الإعلام exosome المنضب (وصفها في الخطوة 1.1.1).
- البذور 1 × 104 PC3 الخلايا في لوحة microslide 8 جيدا (9.4 × 10.7 ملم لكل بئر) مع 0.2 مل من وسائل الإعلام أو 4 × 104 خلايا PC3 في طبق 35 ملم مع 1 مل من وسائل الإعلام. صفيحة الخلايا في طبق متوافق مع ثقافة الخلية يتكون من غطاء رقيق (سمك: 0.18 مم).
- حضانة الخلايا مع المركبات الكهربائية المسماة بالفلورسنت.
- قياس تركيز المركبات الكهربائية ذات العلامات الفلورية (الخطوة 1.3.5) بواسطة تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA، الشكل التكميلي 1). تحديد التركيز الأمثل للمركبات الكهربائية المسماة بالفلورسنت التي يمكن إضافتها إلى الخلايا المستزرعة (الخطوة 2.1.2).
- تمييع المركبات الكهربائية المسماة بالفلورسنت مع الوسائط المستنفدة للاكسوسوم لتتناسب مع التركيز المطلوب الذي يقاس في الخطوة 2.2.1. (أي 7.80 × 109 مركبات كهربائية (بقيمة NTA) في 200 ميكرولتر من الوسائط المستنفدة للاكسوسوم).)
- إضافة EVs المخفف (الخطوة 2.2.2) إلى الخلايا المستهدفة التي تم الالتزام بها التي أعدت في 2.1.2. حضانة الوقت التجريبي (أي 4 أو 8 أو 12 ساعة).
- اغسل الخلايا ثلاث مرات مع وسائط خالية من الإكسوسوم لإزالة أي مركبات كهربائية غير داخلية.
ملاحظة: اختياري: يمكن تثبيت الخلايا بعد الغسل. - تسمية السيتوبلازم من الخلايا الملتزم بها مع 1 ميكروغرام / مل من CMTMR ((5-(و-6)-(((4-chloromethyl)benzoyl)أمينية) رباعي ميثيل الهرهودامين) (انظر جدول المواد) واحتضان في ظروف مثالية زراعة الخلايا (37 درجة مئوية، تركيز ثاني أكسيد الكربون 5٪، 90٪ الرطوبة).
ملاحظة: يجب أن تفلور صبغات منطقة الخلية بشكل منفصل عن المركبات الكهربائية المسماة للمساعدة في تحديد الموقع المكاني (الداخلي أو السطحي) للمركبات الكهربائية المقوى أثناء فحص امتصاص EV. - غسل الخلايا المسماة مرتين مع وسائل الإعلام exosome المنضب لإزالة الصبغة المتبقية. إضافة وسائط جديدة مستنزفة exosome إلى الخلايا استعدادا للتصوير confocal الخلية الحية.
3. المجهر كونفوجال
- لإجراء التصوير بالخلايا الحية، استخدم حاضنة على خشبة المسرح للحفاظ على الظروف المثلى زراعة الخلايا (37 درجة مئوية، تركيز ثاني أكسيد الكربون 5٪، 90٪ رطوبة).
- ضع الخلايا المعدة في حاضنة على خشبة المسرح.
- تعيين معلمات التصوير استنادا إلى عينات التحكم.
ملاحظة: تتضمن عينات التحكم المقترحة: المركبات الكهربائية ذات العلامات الفلورية فقط، والخلايا المسماة بالفلورسنت، والمركبات الكهربائية غير المسماة، والخلايا غير المسماة. - تحديد عمق الخلايا المستهدفة ونطاق حجم التراص في الاتجاه z للحصول على صور confocal 3D.
ملاحظة: سمك مكدس Z هو 1 ميكرومتر. استمر اكتساب الصورة ثلاثية الأبعاد confocal 2 دقيقة و 34 s (استغرق كل اكتساب صورة Z-plane حوالي 8 ق ؛ ما مجموعه عشرين صورة Z-stack). - تعيين الحصول على صورة لعدة صور z مكدسة من كل من صبغة الخلية محددة (أي الأحمر) وصبغ EV محددة (أي الأخضر) في وقت واحد (الشكل 3 والشكل 4A).
4. معالجة الصور
- استخدام برنامج معالجة الصور التلقائي لتحليل الصور الخام z مكدسة confocal وتحديد امتصاص EV من قبل الخلايا (انظر جدول المواد).
- تعيين معلمات العتبة إلى إشارة الفلورسنت من الخلايا والأصباغ EV محددة. بناء السطوح الظاهرية للخلايا (الشكل 4A، B).
- لإنشاء الأسطح الظاهرية للخلايا، انقر فوق الزر إضافة أسطح جديدة.
- حدد أقصر حساب المسافة باسم "إعدادات الخوارزمية" لاستخدام الخوارزمية المقدمة من قبل البرنامج، ثم انقر فوق التالي: قناة المصدر.
- حدد القناة 2 - CMTMR ك "قناة المصدر" في هذه التجربة.
- حدد ناعم ووضع القيمة المناسبة في "تفاصيل السطوح" لتجانس السطح.
ملاحظة: 0.57 ميكرومتر في هذه التجربة منذ 1 بكسل يمثل 0.57 ميكرومتر في بيانات التصوير الخام. - حدد الكثافة المطلقة ك "عتبة".
- لتحديد عتبة الصورة الفلورية تلقائيا بواسطة الخوارزمية المتوفرة، انقر فوق Threshold (Intensity المطلق): يتم تعيين القيمة تلقائيا.
- حدد تمكين ك "تقسيم لمس الكائنات (المنطقة المتنامية)" ووضع قيمة حجم الخلية المقدر في "قطر نقاط البذور"، 10.0 ميكرومتر في هذه التجربة. ثم انقر فوق التالي: تصفية نقاط البذور.
- لتكوين أسطح الخلايا الظاهرية، انقر فوق + إضافة زر، ثم حدد الجودة ك "نوع عامل تصفية". عتبة القيمة المناسبة (210 في هذه التجربة) للحد الأدنى بواسطة فحص مرئي والقيمة القصوى (1485) للحد الأعلى، ثم انقر فوق الزر إنهاء .
ملاحظة: الفحص البصري يعني أن الباحث يمكنه تمييز المنطقة الخلوية من صورة فلورية خام. - بعد ذلك، لإنشاء النقاط الظاهرية للمركبات الكهربائية، انقر فوق الزر إضافة بقع جديدة.
- حدد أحجام مختلفة (زراعة المنطقة) وأقصر حساب المسافة ك "إعدادات الخوارزمية"، ثم انقر فوق التالي: قناة المصدر.
- حدد القناة 1 - أليكسا فلور 488 باسم "قناة المصدر" في هذه التجربة.
- وضع القيمة المناسبة في "تقدير قطر XY" للكشف عن بقعة، 1 ميكرومتر في هذه التجربة. ثم انقر فوق التالي: تصفية البقع.
- لتكوين نقاط EV الظاهرية، انقر فوق + زر إضافة ، وحدد الجودة ك "نوع التصفية"، وتعيين "العتبة السفلى" من خلال فحص مرئي، 100 في هذه التجربة. ثم انقر فوق الزر التالي: نوع المنطقة الفورية .
- حدد Intensity المطلقة ك "نوع المناطق الموضعية"، ثم انقر فوق التالي: مناطق موضعية.
- إلى عتبة، المنطقة من النقاط EV، وضع القيمة المناسبة في "عتبة المنطقة" عن طريق الفحص البصري، 100 باسم "عتبة المنطقة" في هذه التجربة.
ملاحظة: الفحص المرئي يعني أن الباحث يمكنه تمييز منطقة المركبات الكهربائية من صورة فلورية خام. - حدد حجم المنطقة ك "قطر من"، ثم انقر فوق إنهاء.
- استخدم الخوارزميات المقدمة من البرنامج لتقسيم البقع المجمعة داخل السطح المبني في الخطوة 4.2 (الشكل 4C، i-iv).
- انقر فوق البقع المضمنة، ثم انتقل إلى عوامل التصفية.
- انقر فوق + إضافة زر، ثم حدد أقصر مسافة إلى Surfaces Surfaces = Surface 1 كنوع تصفية، ثم انقر فوق تحديد مكرر إلى زر نقاط جديدة . أدنى عتبة (-7.0 في هذه التجربة) للحد الأدنى والقيمة المناسبة (-0.5) للحد الأعلى.
ملاحظة: تعيين الحد الأعلى مع نصف قطرها المقدر من البقع. في هذه التجربة، تم تعيين القطر المقدر للبقع،أي النقاط EV، إلى 1 ميكرومتر في الخطوة 4.2.11.; وبالتالي، يمكن أن يكون الحد الأعلى 0.5.
- العد التلقائي للمركبات الكهربائية داخل الخلايا
ملاحظة: سيقوم البرنامج تلقائيا بحساب عدد المركبات الكهربائية داخل الخلايا، مما يشير إلى العدد الذي تم استيعابه من قبل الخلايا المستهدفة.- انقر فوق تحديد البقع 1 المبنية [أقصر مسافة إلى أسطح السطح = السطوح 1 بين -7.00 و-0.500].
- انتقل إلى الإحصاءات، وتصدير القيمة من "إجمالي عدد المواقع"
ملاحظة: سيتم حساب الخوارزميات المتوفرة للبرنامج تلقائيا عدد وحجم الخلايا.
- تحديد عائد امتصاص EV لكل فترة حضانة استنادا إلى القيم المحسوبة أعلاه (الشكل 5).
- للحصول على عدد الخلايا، انقر فوق Surfaces 1 المبنية، ثم انتقل إلى الإحصائيات، ثم قم بتصدير قيمة "إجمالي عدد الأسطح" من إجمالي.
- انتقل إلى مفصلة في الإحصاءات لتصدير حجم من مفصل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وباستخدام جهاز ميكروفلويدي قائم على الترشيح النانوي، تم عزل المركبات الكهربائية من PC3 CCM وسمت بأجسام مضادة خاصة ب EV (CD63) مرتبطة بالفلوروفوري (الشكل 1). تم تصور المركبات الكهربائية المسماة بنجاح من خلال المجهر البؤري ثلاثي الأبعاد (الشكل 2). تم احتضان المركبات الكهربائية المسماة بخلايا لعدة ساعات في الوسائط المستنفدة للاكسوسوم. بعد الحضانة، تم غسل الخلايا مع وسائل الإعلام المنضب exosome. تم استيعاب المركبات الكهربائية المتبقية أو الالتزام بها في الخلايا أثناء الحضانة. تم تسمية منطقة الخلية. تم تصور المركبات الكهربائية الداخلية على أنها puncta19,20,24,27 وEV فردي (الشكل 3 والشكل 4A). بعد معالجة هذه الصور يسمح التصور والتحديد الكمي لل EV استيعاب في الخلايا (الشكل 4). تسمح الخطوات بالاقتران بإجراء فحص امتصاص EV بدقة. ويبين الشكل 5 النتائج التمثيلية لمقاايسة امتصاص EV. يشير المقايسة إلى أن مستوى امتصاص EV يعتمد على طول فترة الحضانة. يسمح الإجراء بالاستبعاد المنهجي للمركبات الكهربائية غير الداخلية (الشكل 4C) للتأكد بدقة من عدد المركبات الكهربائية الداخلية. تم حساب توزيع حجم نقاط EV الداخلية (الشكل 6). علاوة على ذلك، يمكن تسوية عدد المركبات الكهربائية الداخلية إلى حجم الخلايا المتلقية لتحديد المعدل الفعلي لامتصاص EV للخلية المحددة. التطبيع حسابات لحجم الخلية غير متجانسة ويمثل عدد من المركبات الكهربائية استيعابها فيما يتعلق مساحة السطح الخلوي. تعرف مساحة السطح الخلوي بأنها منطقة الخلية التي تتلامس مع وسائط الثقافة المستنفدة للمركبات الكهربائية أثناء الحضانة.
الشكل 1: رسم تخطيطي لعزلة EV ووضع العلامات على الشريحة باستخدام جهاز ميكروفلويديك قائم على الترشيح النانوي. (أ) عزل المركبات الكهربائية عن CCM. (ب) وضع العلامات المناعية على رقاقة من المركبات الكهربائية. (ج) إزالة الأجسام المضادة غير المقيدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تصوير المركبات الكهربائية ذات العلامات الفلورية. تم الكشف عن المركبات الكهربائية ذات العلامات الفلورية (ANTI-CD63-Alexa Fluor 488) باستخدام المجهر البؤري (هدف 40x). (أ) عينة إيجابية (مضادة للCD63- اليكسا فلور 488 المسمى EVs). (ب) التحكم السلبي 1 لعلامات EV (EVs مع الأجسام المضادة الثانية (Alexa Fluor 488) فقط ، بدون الأجسام المضادة الأولى ). (ج) التحكم السلبي 2 (EVs مع الماوس (MS) IgG الأجسام المضادة والأجسام المضادة 2 (اليكسا فلور 488)). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تم الكشف عن تصوير المركبات الكهربائية المستوعبة في خلايا في صورة 2D. (أ) الفلورسنت المسمى (المضادة CD63-Alexa فلور 488، الأخضر) EVs والخلايا (CMTMR، الأحمر) باستخدام المجهر confocal (20x الهدف) بعد الحضانة. (ب) صورة منفصلة للمركبات الكهربائية المسماة بالفلورسنت فقط. (ج) صورة منفصلة للخلايا المسماة بالفلورسنت فقط. أطوال الليزر الإثارة / الانبعاثات لCMTMR واليكسا فلور 488 هي 560.6/595 (±50) نانومتر و 487.8/525 (±50) نانومتر. إعدادات الطاقة بالليزر هي 3.0 ٪ لCMTMR و 10.0 ٪ لاليكسا فلور 488. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحديد كمي للمركبات الكهربائية الداخلية من خلال عملية ما بعد التصوير. (أ) صورة كونفوجال الخام التي تم الحصول عليها من المقايسة EV-امتصاص. (ب) تقديم الظاهري من المركبات الكهربائية كنقطة (الأخضر) والخلايا كسطح (أحمر) باستخدام برنامج معالجة الصور. (ج، i-iv) التمييز بين المركبات الكهربائية الداخلية (النقاط الصفراء) والمركبات الكهربائية غير الداخلية (النقاط الخضراء، السهم الأبيض) باستخدام البرنامج المقدم خوارزمية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مقدار امتصاص EV كدالة لوقت الحضانة. (أ) عدد المركبات الكهربائية الداخلية لكل خلية. (ب) عدد المركبات الكهربائية الداخلية لكل وحدة تخزين الخلية. وقد زاد عدد المركبات الكهربائية الداخلية تبعا لوقت الحضانة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: توزيع حجم نقاط EV الداخلية. تم قياس حجم نقاط EV ورسمها إلى توزيع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: قياس NTA للمركبات الكهربائية المضادة للCD63-Alex فلور 488. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: مقدار المركبات الكهربائية المترجمة مع الليسوسومات كدالة لوقت الحضانة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الشكل التكميلي 3: مقدار امتصاص EV كدالة لوقت الحضانة. (أ) عدد المركبات الكهربائية الداخلية لكل خلية. (ب) عدد المركبات الكهربائية الداخلية لكل وحدة تخزين الخلية. وقد زاد عدد المركبات الكهربائية الداخلية تبعا لوقت الحضانة. تم تسمية عينة EV بواسطة صبغة تلطيخ الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد). الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر فحص امتصاص EV استنادا إلى التصوير الفلوري ثلاثي الأبعاد عبر المجهر البؤري منهجية فعالة وتحليلا حساسا. يسهل وضع العلامات الفلورية EV هذا تصور المركبات الكهربائية ويؤدي بنجاح فحص امتصاص EV دقيق. تم الإبلاغ عن الطرق السابقة لتسمية المركبات الكهربائية وإزالة الصبغة المتبقية عن طريق إزالة هطول الأمطار باستخدام الطرد الفائق (UC)؛ ومع ذلك، قد تشارك UC في تسريع المركبات الكهربائية، وقد تؤدي الصبغة المشلودة إلى إشارة إيجابية خاطئة12,13. أجهزة microfluidic المستندة إلى الترشيح النانوي تقضي على هذا التهطال المشترك للمركبات الكهربائية والصبغة ، وبالتالي تعزيز جودة المركبات الكهربائية المسماة بالفلورسنت وخصوصية المقايسة. تم قياس امتصاص EV من خلال التحليل الحجمي لتمييز وقياس المركبات الكهربائية الداخلية المنفصلة عن المركبات الكهربائية السطحية على سطح الخلية. يسمح التحليل الحجمي لامتصاص EV بتطبيع امتصاص EV حسب حجم الخلية. تم تحقيق فحص امتصاص EV للخلية الحية من خلال استخدام حاضنة المجهر الكونفوجال على خشبة المسرح. ينطبق البروتوكول على الدراسات التي تتطلب ثقافات الخلايا الحية ومركبات EVs. يمكن إجراء تتبع EV داخل الخلايا في الوقت الحقيقي عبر نافذة ثلاثية الأبعاد. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تحقيق تحليل الاتجار بالمركبات الكهربائية للدقة المكانية - الزمنية إلى جانب التوطين المشترك للمركبات الكهربائية ذات العضيات دون الخلوية من خلال البروتوكول (الشكل التكميلي 2). البروتوكول الموصوف هنا هو أداة قوية للتحليل الخلوي للمركبات الكهربائية.
على الرغم من كل مزايا البروتوكول، هناك قيود محتملة. قد يشارك جهاز الترشيح النانوي الدقيق المستخدمة في هذه الدراسة في عزل الملوثات الأخرى أثناء عزل EV. البروتينات الدهنية منخفضة الكثافة مماثلة في الحجم للمركبات الكهربائية ويمكن أن تكون عالقة في الغشاء أثناء العزل28. على الرغم من أن العلامات الخاصة ب EV يمكن أن تحدد المركبات الكهربائية، إلا أن الملوثات المعزولة المشتركة قد تؤثر على تحليل المصب. في هذه المخطوطة، وصفت المركبات الكهربائية بصبغة اليكسا فلور 488 المقترنة ب CD63. هذا وضع العلامات يزيد من خصوصية الكشف عن EV; ومع ذلك، فإنه يربط أيضا جزيء سطح EV ويزيد من الربط التنافسي. بالإضافة إلى ذلك، قد يعتمد مستوى امتصاص EV على خط الخلية و CCM. يمكن تكييف طرق وضع العلامات المفصلة في هذا البروتوكول مع الأصباغ الأخرى مثل الأصباغ الدهنية والأصباغ الخلوية وأصباغ الحمض النووي الريبي (الشكل التكميلي 3). يستخدم البروتوكول مجهر ا ضوئيا ضوئيا (LSCM) للكشف عن الإشارة الصغيرة للمركبات الكهربائية. يعتمد LSCM على أشعة الليزر المكثفة ، ونتيجة لذلك ، قد تتضرر الخلايا الحية أو تتغير بسبب إثارة الليزر على المدى الطويل. يمكن أن تقلل سرعة الاستحواذ السريعة من photodamage باستخدام مجهر كونفوجكال قرص الغزل (SDCM). يمكن أيضا استخدام SDCM في تتبع EV الذي يتطلب تصويرا قصيرا بفارق زمني لتصور حركات المسافات القصيرة.
وعلى الرغم من هذه القيود المحتملة، يوفر البروتوكول المقترح طريقة فعالة لتقييم امتصاص EV ولديه القدرة على إجراء مزيد من التحليل لتتبع EV للخلايا الحية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Y.-K. تشو هو مخترع براءات الاختراع على جهاز microfluidic القائم على الترشيح النانوي ، Exodisc ، المرخصة ل Labspinner (أولسان ، كوريا). جميع المؤلفين الآخرين ليس لديهم ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من قبل NCI منحة لا. U54CA143803، CA163124، CA093900، وCA143055 إلى K. J. P. وقد تم دعم هذا البحث بمنحة من مشروع البحث والتطوير في مجال التكنولوجيا الصحية الكورية من خلال المعهد الكوري لتنمية الصناعة الصحية (KHIDI)، بتمويل من وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية، جمهورية كوريا (رقم المنحة: HI19C1122). عمل ج. كيم وY.-K. وتحظى تشو بدعم معهد العلوم الأساسية (IBS-R020-D1)، الذي تموله الحكومة الكورية. يشكر المؤلفون الأعضاء الحاليين والماضيين في معهد برادي للمسالك البولية، ولا سيما أعضاء مختبر بينتا-Amend، على القراءة النقدية للمخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353038 | Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent |
| CFI Apo Lambda S 40XC WI | Nikon | MRD77400 | Objective for confocal imaging, NA=1.25 |
| CFI Plan Apo VC 20X | Nikon | MRD70200 | Objective for confocal imaging, NA=0.75 |
| Exodisc | Labspinner Inc. | EX-D1001 | A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation |
| ExoDiscovery | Labspinner Inc. | EX-R1001 | Operation device for Exodisc |
| Exosome-depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection |
| Fetal bovine serum (FBS) | VWR | 1500-500 | Nutrient for cell cultivation |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed | abcam | ab7063 | Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling |
| Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm | Ibidi | 81156 | Culture dish for confocal imaging |
| Imaris 9.7.1 | Oxford Instruments | 9.7.1 | Post-image processing software |
| Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer | Live Cell Instrument | TU-O-20 | Incubator system for live cell imaging |
| Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera | Nikon | NA | Camera for confocal imaging |
| Nikon Eclipse Ti microscope | Nikon | NA | Inverted microscope for confocal imaging |
| NIS-Elements AR 4.50.00 | Nikon | 4.50.00 | Image processing software for Nikon microscope |
| NTA, NanoSight NS500 | Malvern Panalytical | NS500 | Measurement device for EV concentration |
| OriginPro 2020 | OriginLab | 9.7.0.185 | Graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotics for cell cultivation |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | Cell culture media for PC3 cell line cultivation |
| SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S32703 | RNA staining fluorescent dye for the EV labeling |
References
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Sunkara, V., Woo, H. -K., Cho, Y. -K. Emerging techniques in the isolation and characterization of extracellular vesicles and their roles in cancer diagnostics and prognostics. The Analyst. 141 (2), 371-381 (2016).
- Kalluri, R., Lebleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Bonsergent, E., et al. Quantitative characterization of extracellular vesicle uptake and content delivery within mammalian cells. Nature Communications. 12, 1864 (2021).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
- Dehghani, M., Gaborski, T. R.
- Ragni, E., et al. Innovative Visualization and Quantification of Extracellular Vesicles Interaction with and Incorporation in Target Cells in 3D Microenvironments. Cells. 9 (5), 1180 (2020).
- Saari, H., et al. FLIM reveals alternative EV-mediated cellular up-take pathways of paclitaxel. Journal of Controlled Release. 284, 133-143 (2018).
- Franzen, C. A., et al. Characterization of Uptake and Internalization of Exosomes by Bladder Cancer Cells. BioMed Research International. 2014, 619829 (2014).
- Feng, D., et al. Cellular Internalization of Exosomes Occurs Through Phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
- Hoen, E. N. M. N. -T., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Van Der Vlist, E. J., Nolte-'T Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z.
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Singh, K., et al. Separation of distinct exosome subpopulations: isolation and characterization approaches and their associated challenges. The Analyst. 146 (12), 3731-3749 (2021).
- Woo, H. -K., et al. Exodisc for Rapid, Size-Selective, and Efficient Isolation and Analysis of Nanoscale Extracellular Vesicles from Biological Samples. ACS Nano. 11 (2), 1360-1370 (2017).
- Kim, T. -H., et al. FAST: Size-Selective, Clog-Free Isolation of Rare Cancer Cells from Whole Blood at a Liquid-Liquid Interface. Analytical Chemistry. 89 (2), 1155-1162 (2017).
- Joshi, B. S., De Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. Endocytosis of Extracellular Vesicles and Release of Their Cargo from Endosomes. ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).
- Sung, B. H., et al. A live cell reporter of exosome secretion and uptake reveals pathfinding behavior of migrating cells. Nature Communications. 11, 2092 (2020).
- Heusermann, W., et al. Exosomes surf on filopodia to enter cells at endocytic hot spots, traffic within endosomes, and are targeted to the ER. Journal of Cell Biology. 213 (2), 173-184 (2016).
- Reclusa, P., et al. Improving extracellular vesicles visualization: From static to motion. Scientific Reports. 10, 6494 (2020).
- Verweij, F. J., et al. Live Tracking of Inter-organ Communication by Endogenous Exosomes In Vivo. Developmental Cell. 48 (4), 573-589 (2019).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029 (2015).
- Durak-Kozica, M., Baster, Z., Kubat, K., Stępień, E. 3D visualization of extracellular vesicle uptake by endothelial cells. Cellular & Molecular Biology Letters. 23, 57 (2018).
- Sunkara, V., et al. Fully Automated, Label-Free Isolation of Extracellular Vesicles from Whole Blood for Cancer Diagnosis and Monitoring. Theranostics. 9 (7), 1851-1863 (2019).
- Li, H., et al. Internalization of trophoblastic small extracellular vesicles and detection of their miRNA cargo in P-bodies. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1812261 (2020).
- Dong, L., et al. Comprehensive evaluation of methods for small extracellular vesicles separation from human plasma, urine and cell culture medium. Journal of Extracellular Vesicles. 10, 12044 (2020).
