Summary
Le vescicole extracellulari (EV) contribuiscono alla biologia cellulare e alle comunicazioni intercellulari. C'è bisogno di saggi pratici per visualizzare e quantificare l'assorbimento dei veicoli elettrici da parte delle cellule. L'attuale protocollo propone il test di assorbimento EV utilizzando l'imaging tridimensionale a fluorescenza tramite microscopia confocale, dopo l'isolamento EV da un dispositivo microfluidico basato su nanofiltrazione.
Abstract
C'è bisogno di saggi pratici per visualizzare e quantificare l'assorbimento delle vescicole extracellulari (EV) delle cellule. L'assorbimento di veicoli elettrici svolge un ruolo nella comunicazione intercellulare in vari campi di ricerca; biologia del cancro, neuroscienze e somministrazione di farmaci. Molti saggi di assorbimento dei veicoli elettrici sono stati riportati in letteratura; tuttavia, vi è una mancanza di metodologia sperimentale pratica e dettagliata. L'assorbimento dei veicoli elettrici può essere valutato etichettando in modo fluorescente i veicoli elettrici per rilevare la loro posizione all'interno delle cellule. Distinguere tra EV internalizzati nelle celle e EV superficiali sulle cellule è difficile, ma fondamentale, per determinare con precisione l'assorbimento ev. Pertanto, in questo lavoro viene proposto un test che quantifica in modo efficiente l'assorbimento di EV attraverso la microscopia confocale a fluorescenza tridimensionale (3D). I veicoli elettrici con etichetta fluorescente sono stati preparati utilizzando un dispositivo microfluidico basato sulla nanofiltrazione, visualizzato mediante microscopia confocale 3D e quindi analizzato attraverso un software avanzato di elaborazione delle immagini. Il protocollo fornisce una solida metodologia per l'analisi dei veicoli elettrici a livello cellulare e un approccio pratico per un'analisi efficiente.
Introduction
Le vescicole extracellulari (EV) sono particelle legate alla membrana lipidica di dimensioni nanometriche che sono classificate in base alle loro dimensioni: ectosomi (100-500 nm) ed esosomi (50-150 nm)1. Gli EV contengono varie biomolecole, come proteine, acidi nucleici e lipidi. Queste biomolecole provengono dalle cellule prima di essere incapsulate come carico e rilasciate nello spazio extracellulare tramite EV1,2,3.
A causa della varietà del loro carico, si ritiene che i veicoli elettrici svolgano un ruolo attivo nella comunicazione intercellulare. Il rilascio e l'assorbimento di VEICOLI elettrici da parte delle cellule consentono il trasferimento di biomolecole tra le cellule4,5. L'introduzione di un carico EV in una cella può alterare le funzioni della cellula ricevente e lo stato omeostatico4,5,6. I veicoli elettrici sono interiorizzati attraverso più percorsi; tuttavia, i meccanismi esatti non sono stati dimostrati con precisione.
La maggior parte dei test di assorbimento dei veicoli elettrici, come l'etichettatura genetica, etichettano fluorescentemente i singoli veicoli elettrici7. Il segnale risultante può essere misurato mediante fotometro a micropiastre, citometria a flusso o microscopia, con ogni tecnologia che presenta limitazioni sostanziali. I fotometri a micropiastre, la citometria a flusso o la microscopia bidimensionale standard (2D) non possono distinguere tra EV internalizzati e attaccati superficialmente8,9. Inoltre, la necessaria preparazione del campione per ciascuna di queste tecniche può introdurre ulteriori problemi nella valutazione dell'assorbimento dei veicoli elettrici. Ad esempio, il sollevamento di cellule aderenti con tripsina prima dell'analisi dell'assorbimento di EV può scindere alcuni EV attaccati superficialmente sulla superficie della cellula10,11. La tripsina può anche interagire con la superficie cellulare, influenzando la cellula e il fenotipo EV. Inoltre, la tripsina non può staccare completamente i veicoli elettrici superficiali, distorcendo le popolazioni isolate.
Per etichettare accuratamente i veicoli elettrici con coloranti fluorescenti, sono necessarie ulteriori fasi di lavaggio per rimuovere il colorante residuo7. Le tecniche di isolamento accettate possono anche contribuire a segnali falsi positivi a causa della coagulazione che si verifica durante l'isolamento EV. Ad esempio, l'ultracentrifugazione seriale (UC) è ampiamente utilizzata per isolare i veicoli elettrici e rimuovere il colorante immobilizzato. Tuttavia, UC può co-precipitare i veicoli elettrici e il colorante residuo può portare a un segnale falso positivo12,13. Altri metodi di nanofiltrazione, come la filtrazione a colonna, sono anche ampiamente utilizzati per la rimozione del colorante non immobilizzato. La natura complessa dei veicoli elettrici e del colorante che interagiscono all'interno della matrice della colonna può portare alla rimozione incompleta del colorante residuo a causa del cut-off molecolare della colonna alterato dal complesso input14,15,16.
L'attuale protocollo propone un dispositivo microfluidico basato sulla nanofiltrazione per isolare e lavare i veicoli elettrici isolati etichettati fluorescentemente. Il dispositivo microfluidico basato sulla nanofiltrazione può fornire una filtrazione efficiente tramite la tecnologia di separazione assistita da fluido (FAST)17,18. FAST riduce la caduta di pressione attraverso il filtro, riducendo così la potenziale aggregazione tra veicoli elettrici e coloranti. Rimuovendo in modo efficiente il colorante residuo, è possibile migliorare la qualità dei veicoli elettrici etichettati fluorescentemente e la specificità del test.
La microscopia confocale è in grado di distinguere tra EV internalizzati e superficialmente attaccati sulla superficie cellulare e studiare in modo completo i meccanismi cellulari di assorbimento dei veicoli elettrici in una risoluzione spaziotemporale19,20,21,22,23,24,25. Ad esempio, Sung et al. hanno descritto la visualizzazione del ciclo di vita dell'esosoma utilizzando il loro reporter di cellule vive sviluppato. La posizione dei veicoli elettrici internalizzati è stata rilevata e analizzata utilizzando un microscopio confocale in strumenti tridimensionali (3D) e di elaborazione post-immagine20. Sebbene la dimensione dei piccoli veicoli elettrici (40-200 nm) sia inferiore al limite di risoluzione del microscopio ottico, i veicoli elettrici marcati fluorescentemente possono essere rilevati al microscopio confocale poiché il fotorivelatore può rilevare l'emissione di fluorescenza potenziata. Pertanto, la localizzazione subcellulare dei veicoli elettrici marcati fluorescentemente all'interno di una cellula può essere determinata con precisione acquisendo più immagini impilate z dei veicoli elettrici e degli organelli cellulari circostanti.
Inoltre, la ricostruzione 3D e l'elaborazione post-dati possono fornire ulteriori informazioni sul posizionamento dei veicoli elettrici internalizzati, superficiali e fluttuanti. Utilizzando questi processi in combinazione con l'imaging delle cellule vive time-lapse offerto dalla microscopia confocale, il livello di assorbimento dei veicoli elettrici può essere valutato con precisione ed è anche possibile il monitoraggio in tempo reale dell'assorbimento dei veicoli elettrici. Inoltre, l'analisi del traffico di veicoli elettrici può essere eseguita utilizzando la microscopia confocale valutando la co-localizzazione dei veicoli elettrici con gli organelli, un primo passo per determinare come i veicoli elettrici internalizzati sono coinvolti nella funzione intracellulare. Questo protocollo descrive la metodologia per l'esecuzione di un test di assorbimento di EV utilizzando il dispositivo microfluidico basato su nanofiltrazione17,26, la microscopia confocale e l'analisi post-immagine.
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Protocol
1. Isolamento EV ed etichettatura EV immuno-fluorescente su chip
- Raccolta di terreni di coltura cellulare (CCM) e pre-elaborazione di CCM per l'isolamento EV
- Semina cellule PC3 al 30% di confluenza in un pallone di coltura cellulare di 75 cm2 . Consentire alle cellule di controllo di crescere fino al 90% di confluenza (~ 48 h) nei media standard e negli integratori specifici della linea cellulare.
NOTA: Per evitare che i componenti contenenti EV influenzino l'assorbimento cellulare (ad esempio, siero bovino fetale), utilizzare mezzi e integratori impoveriti di esosomi. - Raccogli il CCM.
- Centrifugare il CCM a 1000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente (RT) per pellettificare eventuali celle non attaccate e detriti di grandi dimensioni raccolti con il fluido. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo conico.
- Nel nuovo tubo, centrifugare il surnatante a 10.000 x g per 20 minuti a 4 °C per pellettizzare detriti più piccoli e corpi apoptotici rimasti nel mezzo. Alcuni veicoli elettrici più grandi saranno pellet. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo.
- Filtrare il surnatante attraverso un filtro a membrana in polivinilidenfluoruro idrofilo (PVDF) da 0,45 μm.
NOTA: se non si elabora immediatamente il CCM per l'isolamento EV, conservare il CCM pre-elaborato a -80 °C fino all'esecuzione dell'isolamento. Se congelato, limitare i cicli di congelamento-disgelo a uno.
- Semina cellule PC3 al 30% di confluenza in un pallone di coltura cellulare di 75 cm2 . Consentire alle cellule di controllo di crescere fino al 90% di confluenza (~ 48 h) nei media standard e negli integratori specifici della linea cellulare.
- Isolamento EV da CCM utilizzando un dispositivo microfluidico basato su nanofiltrazione
- Se congelato, scongelare completamente CCM e vortice per 30 s prima del punto 1.2.2.
- Iniettare 1 mL di CCM pre-elaborato (fase 1.1) nella camera del campione del dispositivo microfluidico basato sulla nanofiltrazione (vedi Tabella dei materiali)17,26.
NOTA: Seguire la procedura operativa standard per il dispositivo microfluidico basato sulla nanofiltrazione17,26. - Girare a 3000 giri / min per 10 minuti nella filatura da banco (vedi Tabella dei materiali) per far funzionare il dispositivo microfluidico.
NOTA: se CCM rimane sulla camera del campione dopo l'esecuzione iniziale, eseguire giri aggiuntivi fino a quando tutto il CCM non si è svuotato dalla camera del campione. - Rimuovere il fluido dalla camera di scarico mediante pipettaggio e ripetere due volte i passaggi 1.2.1, 1.2.2 e 1.2.3.
NOTA: in totale, 3 ml di CCM saranno elaborati per l'isolamento EV. - Iniettare 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) nella camera del campione per lavare i veicoli elettrici isolati. Girare nella filatrice da banco per il funzionamento del dispositivo microfluidico come indicato al punto 1.2.3. Individuare i veicoli elettrici puri sulla membrana del dispositivo.
NOTA: La qualità dei veicoli elettrici isolati dal dispositivo microfluidico basato sulla nanofiltrazione, in particolare, è stata confermata e confrontata con il metodo UC convenzionale mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM), microscopio elettronico a scansione (SEM), analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA), microscopia a illuminazione strutturata, saggio immunoassorbente enzimatico e PCR in tempo reale nella ricerca precedente17,26.
- Etichettatura immunofluorescente di veicoli elettrici mediante dispositivo microfluidico basato sulla nanofiltrazione (Figura 1)
- Selezionare un anticorpo EV-specifico in base allo scopo del test (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: Alcuni anticorpi possono interferire con i siti di legame del ligando specifici delle vie di assorbimento dell'EV (ad esempio, endocitosi). - Iniettare 1 μg/mL dell'anticorpo EV-specifico nel foro di eluizione del dispositivo contenente 100 μL di veicoli elettrici isolati.
- Incubare per 1 ora al buio a RT su uno shaker a piastre per garantire la distribuzione uniforme dell'anticorpo attraverso il campione.
- Attaccare un nastro adesivo al foro di eluizione. Iniettare 1 mL di PBS nella camera del campione per eliminare eventuali anticorpi residui.
- Ruotare il dispositivo a 3000 giri/min fino a quando la camera del campione non è vuota. Rimuovere qualsiasi fluido dalla camera di scarico mediante pipettaggio. Iniettare 1 mL di PBS nella camera del campione.
NOTA: i veicoli elettrici etichettati con fluorescenza si troveranno nella camera a membrana. - Pipettare i veicoli elettrici etichettati fluorescentemente (Figura 2) dalla camera a membrana a un tubo ambrato. Bloccare dalla luce fino all'uso.
- Selezionare un anticorpo EV-specifico in base allo scopo del test (vedere Tabella dei materiali).
2. Incubazione delle cellule con EV marcati fluorescentemente per il test di assorbimento EV
- Semina cellulare target e coltura sui piatti compatibili con la coltura cellulare.
- Seminare 1 x 104 celle PC3 nella piastra microslide a 8 pozzetti (9,4 x 10,7 mm per ciascun pozzetto) con 0,2 mL di supporto o 4 x 104 celle PC3 in un piatto da 35 mm con 1 mL di supporto. Placcare le cellule in un piatto compatibile con la coltura cellulare costituito da un sottile coverslip (spessore: 0,18 mm).
NOTA: il coperchio sottile riduce al minimo la dispersione avversa della luce. - Consentire alle cellule di aderire durante la notte in condizioni ottimali di coltura cellulare (37 °C, 5% di concentrazione di CO2 , 90% di umidità).
- Lavare due volte le cellule aderenti con mezzi impoveriti di esosomi (descritti nel passaggio 1.1.1).
- Seminare 1 x 104 celle PC3 nella piastra microslide a 8 pozzetti (9,4 x 10,7 mm per ciascun pozzetto) con 0,2 mL di supporto o 4 x 104 celle PC3 in un piatto da 35 mm con 1 mL di supporto. Placcare le cellule in un piatto compatibile con la coltura cellulare costituito da un sottile coverslip (spessore: 0,18 mm).
- Incubazione cellulare con veicoli elettrici etichettati in modo fluorescente.
- Misurare la concentrazione di veicoli elettrici marcati fluorescentemente (fase 1.3.5) mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA, Figura supplementare 1). Determinare la concentrazione ottimale di veicoli elettrici marcati con fluorescenza da aggiungere alle cellule coltivate (fase 2.1.2.).
- Diluire i veicoli elettrici marcati fluorescentemente con mezzi impoveriti di esosomi per corrispondere alla concentrazione desiderata misurata nel passaggio 2.2.1. (cioè, 7,80 x 109 EV (in valore NTA) in 200 μL di mezzi impoveriti di esosomi.)
- Aggiungere i veicoli elettrici diluiti (fase 2.2.2) alle cellule bersaglio aderenti preparate al punto 2.1.2. Incubare per il tempo sperimentale (cioè 4, 8 o 12 ore).
- Lavare le cellule tre volte con supporti privi di esosomi per rimuovere eventuali veicoli elettrici non internalizzati.
NOTA: Opzionale: le celle possono essere fissate dopo il lavaggio. - Etichettare il citoplasma delle cellule aderenti con 1 μg/mL di CMTMR ((5-(e-6)-(((4-clorometil)benzoil)ammino) tetrametilrodramina) (vedi Tabella dei materiali) e incubare in condizioni ottimali di coltura cellulare (37 °C, concentrazione di CO2 al 5%, umidità del 90%).
NOTA: i coloranti dell'area cellulare devono fluorescere separatamente dai veicoli elettrici etichettati per aiutare a determinare la posizione spaziale (internalizzata o superficiale) dei veicoli elettrici a spillo durante il test di assorbimento dei veicoli elettrici. - Lavare due volte le cellule etichettate con mezzi impoveriti di esosomi per rimuovere il colorante residuo. Aggiungere nuovi mezzi impoveriti di esosomi alle cellule in preparazione per l'imaging confocale a cellule vive.
3. Microscopia confocale
- Per eseguire l'imaging di cellule vive, utilizzare un incubatore sul palco per mantenere condizioni ottimali di coltura cellulare (37 °C, concentrazione di CO2 al 5%, umidità del 90%).
- Posizionare le cellule preparate nell'incubatrice sul palco.
- Impostare i parametri di imaging in base ai campioni di controllo.
NOTA: i campioni di controllo suggeriti includono: solo veicoli elettrici con etichetta fluorescente, celle etichettate fluorescenti, veicoli elettrici senza etichetta e celle senza etichetta. - Determinare la profondità delle celle di destinazione e l'intervallo di dimensioni di impilamento nella direzione z per acquisire immagini confocali 3D.
NOTA: lo spessore di uno Z-stack è di 1 μm. L'acquisizione di immagini 3D confocali è durata 2 min 34 s (ogni acquisizione di immagini del piano Z ha richiesto circa 8 s; un totale di venti immagini Z-stack). - Impostare l'acquisizione dell'immagine su più immagini impilate z di entrambi i coloranti specifici della cellula (cioè rosso) e coloranti specifici ev (cioè verde) contemporaneamente (Figura 3 e Figura 4A).
4. Elaborazione delle immagini
- Utilizzare un software di elaborazione automatica delle immagini per analizzare le immagini confocali grezze impilate con z e determinare l'assorbimento EV da parte delle celle (vedere Tabella dei materiali).
- Impostare i parametri di soglia per il segnale fluorescente delle cellule e dei coloranti specifici per EV. Costruire le superfici virtuali delle celle (Figura 4A,B).
- Per creare le superfici virtuali delle celle, fare clic sul pulsante Aggiungi nuove superfici.
- Selezionare Calcolo della distanza più breve come "Impostazioni algoritmo" per utilizzare l'algoritmo fornito dal software, quindi fare clic su Avanti: Canale sorgente.
- Selezionare canale 2 - CMTMR come "canale sorgente" in questo esperimento.
- Selezionate Liscia (Smooth) e inserite il valore appropriato in "Dettagli superfici" per la levigatura delle superfici.
NOTA: 0,57 μm in questo esperimento poiché 1 pixel rappresenta 0,57 μm nei dati di imaging grezzi. - Seleziona Intensità assoluta come "Soglia".
- Per sogliere automaticamente l'immagine fluorescente in base all'algoritmo fornito, fare clic su Soglia (intensità assoluta): il valore viene impostato automaticamente.
- Seleziona Abilita come "Dividi oggetti di tocco (regione in crescita)" e inserisci il valore della dimensione stimata della cella in "Diametro punti di partenza", 10,0 μm in questo esperimento. Quindi fare clic su Avanti: filtra i punti di inizializzazione.
- Per configurare le superfici delle celle virtuali, fai clic sul pulsante + Aggiungi , quindi seleziona Qualità come "Tipo di filtro". Soglie il valore appropriato (210 in questo esperimento) per il limite basso mediante un'ispezione visiva e il valore massimo (1485) per il limite superiore, quindi fare clic sul pulsante Fine .
NOTA: un'ispezione visiva significa che un ricercatore può discriminare l'area cellulare da un'immagine fluorescente grezza. - Successivamente, per creare i punti virtuali dei veicoli elettrici, fai clic sul pulsante Aggiungi nuovi spot.
- Seleziona Diverse dimensioni spot (Regione in crescita) e Calcolo della distanza più breve come "Impostazioni algoritmo", quindi fai clic su Avanti: Canale sorgente.
- Seleziona il canale 1 - Alexa Fluor 488 come "Canale sorgente" in questo esperimento.
- Inserire il valore appropriato in "Diametro XY stimato" per il rilevamento spot, 1 μm in questo esperimento. Quindi, fai clic su Avanti: Filtra punti.
- Per configurare i punti EV virtuali, fare clic su + pulsante Aggiungi , selezionare Qualità come "Tipo di filtro" e impostare "Soglia inferiore" mediante un'ispezione visiva, 100 in questo esperimento. Quindi, fai clic sul pulsante Avanti: Tipo di regione spot .
- Seleziona Intensità assoluta come "Tipo di regioni spot", quindi fai clic su Avanti: Regioni spot.
- Per soglia, la regione dei punti EV, inserire il valore appropriato in "Soglia regione" mediante un'ispezione visiva, 100 come "Soglia regione" in questo esperimento.
NOTA: un'ispezione visiva significa che un ricercatore può discriminare l'area dei veicoli elettrici da un'immagine fluorescente grezza. - Seleziona Volume regione come "Diametro da", quindi fai clic su Fine.
- Utilizzare gli algoritmi forniti dal software per dividere i punti raggruppati all'interno della superficie costruita al passaggio 4.2 (Figura 4C, i-iv).
- Fai clic sugli Spot costruiti, quindi vai in Filtri.
- Fate clic sul pulsante + Aggiungi (Add), quindi selezionate Distanza più breve dalle superfici Superfici = Superficie 1 come Tipo filtro (Filter Type), quindi fate clic sul pulsante Duplica selezione per nuovi spot . La soglia più bassa (-7,0 in questo esperimento) per il limite basso e il valore appropriato (-0,5) per il limite superiore.
NOTA: impostate il limite superiore con il raggio stimato di Spot. In questo esperimento, il diametro stimato degli Spot, cioè dei punti EV, è stato impostato su 1 μm nel passaggio 4.2.11.; quindi, il limite superiore può essere 0,5.
- Conteggio automatico dei veicoli elettrici all'interno delle celle
NOTA: il software conterà automaticamente il numero di veicoli elettrici all'interno delle celle, indicando il numero internalizzato dalle celle di destinazione.- Fate clic sulla selezione Spot 1 costruita [Distanza più breve dalle superfici = Superfici 1 comprese tra -7.00 e -0.500].
- Vai alle Statistiche ed esporta il valore da "Numero totale di spot"
NOTA: gli algoritmi forniti dal software calcoleranno automaticamente il numero e il volume delle celle.
- Determinare la resa di assorbimento di EV per periodo di incubazione in base ai valori sopra calcolati (Figura 5).
- Per ottenere il numero di celle, fare clic sulle superfici 1 predefinite, quindi passare a Statistiche ed esportare il valore di "Numero totale di superfici" da Complessivo.
- Vai a Dettagliato in Statistiche per esportare il Volume da Dettagliato.
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Representative Results
Utilizzando un dispositivo microfluidico basato sulla nanofiltrazione, i veicoli elettrici sono stati isolati dal PC3 CCM ed etichettati con un anticorpo EV-specifico (CD63) coniugato con fluoroforo (Figura 1). I veicoli elettrici etichettati sono stati visualizzati con successo dalla microscopia confocale 3D (Figura 2). I veicoli elettrici etichettati sono stati incubati con cellule per diverse ore in mezzi impoveriti di esosomi. Dopo l'incubazione, le cellule sono state lavate con mezzi impoveriti di esosomi. I restanti veicoli elettrici sono stati interiorizzati o aderiti alle cellule durante l'incubazione. L'area della cella è stata etichettata. I veicoli elettrici internalizzati sono stati visualizzati come puncta19,20,24,27 e un singolo EV (Figura 3 e Figura 4A). La post-elaborazione di queste immagini consente la visualizzazione e la quantificazione dell'internalizzazione EV nelle celle (Figura 4). I passaggi in combinazione consentono un accurato test di assorbimento dei veicoli elettrici eseguito in modo efficiente. La Figura 5 mostra i risultati rappresentativi del test di assorbimento dei veicoli elettrici. Il test indica che il livello di assorbimento di EV dipende dalla durata del periodo di incubazione. La procedura consente l'esclusione sistematica dei veicoli elettrici non internalizzati (Figura 4C) per misurare con precisione il numero di veicoli elettrici internalizzati. È stata calcolata la distribuzione dimensionale dei punti EV internalizzati (Figura 6). Inoltre, il numero di veicoli elettrici internalizzati può essere normalizzato al volume delle cellule riceventi per determinare il tasso effettivo di assorbimento dei veicoli elettrici per la cella specifica. La normalizzazione tiene conto delle dimensioni eterogenee delle cellule e rappresenta il numero di EV internalizzati per quanto riguarda l'area della superficie cellulare. L'area della superficie cellulare è definita come l'area cellulare a contatto con terreni di coltura con esosoma a spillo EV, impoveriti di esosomi durante l'incubazione.
Figura 1: Illustrazione schematica dell'isolamento EV e dell'etichettatura su chip utilizzando un dispositivo microfluidico basato sulla nanofiltrazione. (A) Isolamento dei veicoli elettrici dal CCM. (B) Etichettatura immunofluorescente su chip dei veicoli elettrici. (C) Rimozione di anticorpi non legati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Imaging di veicoli elettrici con etichetta fluorescente. I veicoli elettrici marcati fluorescentemente (anti-CD63-Alexa Fluor 488) sono stati rilevati utilizzando il microscopio confocale (obiettivo 40x). (A) Campione positivo (EV etichettati anti-CD63-Alexa Fluor 488). (B) Controllo negativo 1 per l'etichettatura EV (solo EV con 2° anticorpo (Alexa Fluor 488), senza 1° anticorpo). (C) Controllo negativo 2 (EV con l'anticorpo IgG del topo (MS) e il secondo anticorpo (Alexa Fluor 488)). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Imaging dei veicoli elettrici internalizzati in cellule in un'immagine 2D. (A) I veicoli elettrici marcati fluorescenti (anti-CD63-Alexa Fluor 488, verde) e le cellule (CMTMR, rosso) sono stati rilevati utilizzando il microscopio confocale (obiettivo 20x) dopo l'incubazione. (B) Un'immagine separata dei soli veicoli elettrici etichettati in modo fluorescente. (C) Un'immagine separata solo delle cellule marcate in modo fluorescente. Le lunghezze d'onda laser di eccitazione/emissione per CMTMR e Alexa Fluor 488 sono 560,6/595 (±50) nm e 487,8/525 (±50) nm. Le impostazioni di potenza del laser sono del 3,0% per CMTMR e del 10,0% per Alexa Fluor 488. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Quantificazione dei veicoli elettrici internalizzati mediante il processo di post-imaging. (A) Immagine confocale grezza ottenuta dal test di assorbimento ev. (B) Rendering virtuale dei veicoli elettrici come punto (verde) e delle celle come superficie (rosso) utilizzando il software di elaborazione delle immagini. (C, i-iv) Discriminazione dei veicoli elettrici internalizzati (punti gialli) e dei veicoli elettrici non internalizzati (punti verdi, freccia bianca) utilizzando l'algoritmo fornito dal software. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: La quantità di assorbimento di EV in funzione del tempo di incubazione. (A) Il numero di veicoli elettrici internalizzati per cella. (B) Il numero di veicoli elettrici internalizzati per volume di cella. Il numero di veicoli elettrici internalizzati è stato aumentato a seconda del tempo di incubazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: La distribuzione dimensionale dei punti EV internalizzati. La dimensione dei punti EV è stata misurata e tracciata su una distribuzione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 1: Misurazione NTA di veicoli elettrici marcati anti-CD63-Alex Fluor 488. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 2: La quantità di veicoli elettrici co-localizzati con lisosomi in funzione del tempo di incubazione. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 3: La quantità di assorbimento di EV in funzione del tempo di incubazione. (A) Il numero di veicoli elettrici internalizzati per cella. (B) Il numero di veicoli elettrici internalizzati per volume di cella. Il numero di veicoli elettrici internalizzati è stato aumentato a seconda del tempo di incubazione. Il campione EV è stato etichettato con colorante colorante colorante RNA (vedi Tabella dei materiali). Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Un test di assorbimento EV basato sull'imaging a fluorescenza 3D tramite microscopia confocale fornisce una metodologia efficiente e un'analisi sensibile. Questa etichettatura fluorescente dei veicoli elettrici facilita la visualizzazione dei veicoli elettrici ed esegue con successo un preciso test di assorbimento dei veicoli elettrici. I metodi precedenti per l'etichettatura dei veicoli elettrici e la rimozione del colorante residuo sono stati segnalati rimuovendo la precipitazione utilizzando l'ultracentrifugazione (UC); tuttavia, UC può co-precipitare i veicoli elettrici e il colorante immobilizzato può portare a un segnale falso positivo12,13. I dispositivi microfluidici basati sulla nanofiltrazione eliminano questa co-precipitazione di veicoli elettrici e coloranti, migliorando così la qualità dei veicoli elettrici etichettati fluorescentemente e la specificità del test. L'assorbimento di veicoli elettrici è stato misurato mediante analisi volumetrica per distinguere e quantificare i veicoli elettrici internalizzati separati dai veicoli elettrici superficiali sulla superficie cellulare. L'analisi volumetrica dell'assorbimento di EV consente la normalizzazione dell'assorbimento di EV in base alle dimensioni delle cellule. Il test di assorbimento EV a cellule vive è stato ottenuto utilizzando l'incubatore per microscopio confocale sul palco. Il protocollo si applica agli studi che richiedono colture cellulari vive e veicoli elettrici. Il monitoraggio intracellulare dei veicoli elettrici in tempo reale può essere eseguito attraverso una finestra 3D. Inoltre, l'analisi del traffico EV della risoluzione spazio-temporale insieme alla co-localizzazione di veicoli elettrici con organelli subcellulari può essere ottenuta attraverso il protocollo (Figura supplementare 2). Il protocollo qui descritto è un potente strumento per l'analisi cellulare dei veicoli elettrici.
Nonostante tutti i vantaggi del protocollo, ci sono potenziali limitazioni. Il dispositivo microfluidico di nanofiltrazione utilizzato in questo studio può co-isolare altri contaminanti durante l'isolamento EV. Le lipoproteine a bassa densità hanno dimensioni simili a quelle dei veicoli elettrici e possono essere catturate nella membrana durante l'isolamento28. Sebbene i marcatori specifici per i veicoli elettrici possano specificare i veicoli elettrici, i contaminanti co-isolati possono influenzare l'analisi a valle. In questo manoscritto, i veicoli elettrici sono stati etichettati con un colorante Alexa Fluor 488 coniugato CD63. Questa etichettatura aumenta la specificità per il rilevamento dei veicoli elettrici; tuttavia, lega anche la molecola di superficie EV e aumenta il legame competitivo. Inoltre, il livello di assorbimento dei veicoli elettrici può dipendere dalla linea cellulare e dal CCM. I metodi di etichettatura descritti in questo protocollo possono essere adattati ad altri coloranti coloranti come coloranti lipofili, coloranti citosolici e coloranti a RNA (Figura supplementare 3). Il protocollo utilizza un microscopio confocale a scansione luminosa (LSCM) per rilevare il piccolo segnale dei veicoli elettrici. LSCM si basa su laser intensi e, di conseguenza, le cellule viventi possono essere danneggiate o alterate dall'eccitazione laser a lungo termine. L'elevata velocità di acquisizione può ridurre il fotodanno utilizzando un microscopio confocale a disco rotante (SDCM). SDCM può essere utilizzato anche nel tracciamento EV che richiede immagini time-lapse brevi per visualizzare i movimenti a breve distanza.
Nonostante queste potenziali limitazioni, il protocollo proposto fornisce un metodo efficiente per la valutazione dell'assorbimento dei veicoli elettrici e ha il potenziale per ulteriori analisi di tracciamento dei veicoli elettrici a cellule vive.
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Disclosures
Y.-K. Cho è un inventore dei brevetti sul dispositivo microfluidico basato sulla nanofiltrazione, Exodisc, che sono concessi in licenza a Labspinner (Ulsan, Corea). Tutti gli altri autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da n. di sovvenzione NCI. U54CA143803, CA163124, CA093900 e CA143055 a K. J. P. Questa ricerca è stata supportata da una sovvenzione del Korea Health Technology R&D Project attraverso il Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finanziato dal Ministero della Salute e del Welfare, Repubblica di Corea (numero di sovvenzione: HI19C1122). Opera di J. Kim e Y.-K. Cho è stato sostenuto dall'Institute for Basic Science (IBS-R020-D1), finanziato dal governo coreano. Gli autori ringraziano i membri attuali e passati del Brady Urological Institute, in particolare i membri del laboratorio Pienta-Amend, per la lettura critica del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353038 | Fluorescent dye conjugated EV-specific antibody |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Live cell (cytoplasm) fluoresent labeling reagent |
| CFI Apo Lambda S 40XC WI | Nikon | MRD77400 | Objective for confocal imaging, NA=1.25 |
| CFI Plan Apo VC 20X | Nikon | MRD70200 | Objective for confocal imaging, NA=0.75 |
| Exodisc | Labspinner Inc. | EX-D1001 | A nano-filtration based microfluidic device for EV isolation |
| ExoDiscovery | Labspinner Inc. | EX-R1001 | Operation device for Exodisc |
| Exosome-depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | Nutrient of cell culture media for PC3 cell line derived EV collection |
| Fetal bovine serum (FBS) | VWR | 1500-500 | Nutrient for cell cultivation |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed | abcam | ab7063 | Mouse IgG antibody for negatvie control of EV labeling |
| Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm | Ibidi | 81156 | Culture dish for confocal imaging |
| Imaris 9.7.1 | Oxford Instruments | 9.7.1 | Post-image processing software |
| Incubator System+ CO2/O2/N2 gas mixer | Live Cell Instrument | TU-O-20 | Incubator system for live cell imaging |
| Nikon A1 HD25 / A1R HD25 camera | Nikon | NA | Camera for confocal imaging |
| Nikon Eclipse Ti microscope | Nikon | NA | Inverted microscope for confocal imaging |
| NIS-Elements AR 4.50.00 | Nikon | 4.50.00 | Image processing software for Nikon microscope |
| NTA, NanoSight NS500 | Malvern Panalytical | NS500 | Measurement device for EV concentration |
| OriginPro 2020 | OriginLab | 9.7.0.185 | Graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotics for cell cultivation |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | Cell culture media for PC3 cell line cultivation |
| SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S32703 | RNA staining fluorescent dye for the EV labeling |
References
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