Summary
快速有效地定量细胞内 结核分枝杆菌 的生长对于寻求改进的结核病（TB）疗法至关重要。该协议描述了一种基于肉汤的比色检测测定，使用自动液体培养系统来量化用候选宿主定向疗法处理的巨噬细胞中的Mtb生长。
Abstract
结核分枝杆菌 （Mtb）是结核病（TB）的病原体，在COVID-19出现之前是全球最重要的传染病杀手。Mtb已经进化到在其细胞内环境中持续存在，逃避宿主防御，并且已经对许多抗结核药物产生了耐药性。解决耐药性的一种方法是确定现有的批准药物，这些药物将增强宿主对Mtb的免疫反应。然后，这些药物可以重新用作辅助宿主定向疗法（HDT），以缩短治疗时间并帮助克服抗生素耐药性。
巨噬细胞中细胞内Mtb生长的定量是评估潜在HDT的一个关键方面。测量Mtb生长的黄金标准是计数琼脂平板上的菌落形成单位（CFU）。这是一种缓慢、劳动密集型的检测方法，不适合药物的快速筛选。在该协议中，一种自动化的、基于肉汤的培养系统（更常用于检测临床标本中的 Mtb）已被适用于宿主定向疗法的临床前筛选。评估了液体培养测定系统研究用HDT处理的巨噬细胞中细胞内Mtb生长的能力。测试其抑制Mtb生长能力的HDT是全反式维甲酸（AtRA），包括溶液和封装在聚（乳酸-乙醇酸）（PLGA）微粒中以及干扰素-γ和利奈唑胺的组合。与CFU方法相比，这种基于液体培养的自动化技术的优点包括设置简单、劳动密集型制备更少以及获得结果的时间更快（5-12天，而琼脂平板为21天或更长时间）。
Introduction
结核分枝杆菌 （Mtb）是结核病的病原体，是2019年全球最重要的传染病杀手1。为了逃避宿主的防御，Mtb破坏了巨噬细胞和树突状细胞（DC）等先天免疫细胞的分枝杆菌杀活性，使其能够在细胞内持续存在并复制2。缺乏预防成人肺结核的有效疫苗以及耐药菌株的日益出现突出了对新疗法的迫切需要。
辅助宿主导向治疗（HDT）可以缩短治疗时间并帮助克服耐药性3。HDT候选药物的体外临床前评估以确定巨噬细胞内的分枝杆菌活性通常依赖于通过固体琼脂平板上的菌落形成单位（CFU）对Mtb生长的定量。这是一种缓慢、劳动密集型的检测方法，不适合药物的快速筛选。市售的基于肉汤的自动化微生物检测系统更常用于临床微生物学实验室，用于临床标本中Mtb和其他分枝杆菌物种的检测和药敏性测试4。这些仪器根据细菌代谢活性间接测量生长，导致培养基随时间监测的物理变化（CO2 或 O2 水平或压力的变化）5。读数是阳性时间 （TPP），先前已证明与 TB 患者痰标本中的 Mtb CFU 相关，以响应治疗6，7 和感染的鼠肺和脾脏8 的裂解物。此外，液体培养检测系统已被用于测量常规病原体定向疗法对轴化培养和培养巨噬细胞中分枝杆菌生长的影响9，10。该仪器还用于研究树突状细胞和肺泡巨噬细胞控制Mtb11，12细胞内生长的先天能力。该实验方案表明，液体培养诊断系统可以适用于在培养的巨噬细胞中进行HDT的临床前筛查。与CFU计数相比，该技术的主要优点是它大大减少了量化细胞内分枝杆菌生长/存活所需的实验劳动和时间。该技术依赖于对自动化培养仪器的访问，该仪器可用于评估用针对细胞功能的各种药理学试剂处理的免疫细胞中的细胞内分枝杆菌存活率，以提高宿主免疫力。
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Protocol
该协议中概述的实验是使用Mtb的减毒H37Ra菌株进行的，该菌株可以在遏制2级实验室中处理。活分枝杆菌的所有操作均在II类生物安全柜（BSC）中进行。实验程序旨在最大限度地减少气溶胶的产生。真核细胞培养（THP-1细胞）也在II类BSC中进行。实验室进行了风险评估，并确保所有程序的执行符合机构和国家生物安全条例。使用人单核细胞THP-1细胞系执行所述方法（步骤1）。在感染分枝杆菌之前，用佛波醇 12-肉豆蔻酸 13-乙酸酯 （PMA） 刺激后，细胞分化为巨噬细胞。
1. 细胞培养
- 在补充有白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶 （ADC） 富集 （10%） 和 0.05% 聚山梨酯 80 的 Middlebrook 7H9 （MB） 肉汤中将 H37Ra 种子原液传播到对数阶段。将 H37Ra 原液以 1 mL 等分试样储存在 -80 °C 冰箱中长达 1 年。
- 解冻 1 mL 小瓶 Mtb-H37Ra，并在计划实验前约 1 周将其转移到带有过滤盖的 T25 烧瓶中，该烧瓶含有 9 mL 补充 MB 的肉汤。在静态培养箱中在37°C孵育5-7天。
- 在补充有非热杀死的10%胎牛血清（完全（c）RPMI）的RPMI-1640中生长THP-1细胞，在CO 2加湿培养箱中的T75 烧瓶中以5%CO2 / 37°C进行传代培养，每周传代培养两次以保持密度小于1 x 106 细胞/ mL。
- 在感染前 3 天，使用 T75 烧瓶中的血清移液管轻轻移液细胞数次，分散任何团块并将其放入 50 mL 锥形管中，从而将 THP-1 细胞分化为巨噬细胞。
- 在室温下以300× g 离心细胞10分钟，倒出上清液，然后将沉淀轻轻重悬于2mL RPMI中。进行细胞计数以估计细胞/mL。
- 在 12 孔组织培养板中以 100，000 个细胞/mL 的密度在 cRPMI 中接种 2 mL THP-1 巨噬细胞，用 100 ng/mL PMA 接种 72 小时。从细胞中取出含PMA的培养基，并在Mtb感染前补充新鲜的cRPMI。
- 为所需的每个时间点设置单独的板。
- 在 2 孔玻璃室载玻片中以相同密度 （100，000 个细胞/mL） 接种细胞，以确定感染的多重性 （MOI）。
- 置于37°C的5%CO2 加湿培养箱中3天。
2. Mtb吸收量的量化
- 巨噬细胞（MOI）对Mtb摄取的测定
- 在感染当天设置II类生物安全柜（BSC），并在两层薄纸上工作以捕捉任何溢出物。根据当地法规设置废物丢弃容器。
- 从 T25 烧瓶中取出 6-8 mL 分枝杆菌培养物，并将其转移到 15 mL 聚丙烯管中。
注意：较小体积的试管可用于较小的实验。 - 将管在室温下在台式离心机中以2890× g离心10分钟。
- 小心地从离心机中取出试管并将其转移到生物安全柜中。等待1分钟，让细菌沉淀。
- 将上清液倒入消毒剂丢弃容器中，重新盖管，并通过敲击管的侧面将细菌重悬于剩余培养基中。等待1分钟，让细菌沉淀。
- 加入 2 mL 预热的 cRPMI，轻轻混合，然后转移到 50 mL 锥形管中。
- 使用 25 G 针头和 5 mL 注射器非常小心地重悬分枝杆菌。要重新悬浮，请将分枝杆菌悬浮液吸入注射器中，然后非常轻柔地沿着管子的侧壁喷射，以尽量减少气溶胶的产生。重复6-8次。
注意：请格外小心，因为这是分枝杆菌的高密度培养。为避免针刺伤的风险，请尽可能使用钝针和鲁尔锁注射器。 - 将针头和注射器丢弃在平衡计分卡的锐器容器中。
- 将悬浮液转移到 2 mL 微量离心管（带旋入式盖）中，并在室温下以 100 x g 离心 3 分钟以沉淀任何剩余的团块。将管子放回安全柜并等待 1 分钟以使细菌沉淀。
- 将顶部 1-1.5 mL 的上清液转移到新管中。将原始管丢弃在装有消毒剂的废物桶中。充分混合并将各种量的分枝杆菌悬浮液（例如，5，25，50，150μL）添加到2孔玻璃室载玻片中，并在37°C的CO2 培养箱中孵育3小时。
- 抗酸细菌染色 （AFB）
注意：孵育3小时后，洗涤巨噬细胞并用多聚甲醛固定以灭活分枝杆菌。然后使用改良的Auramine O试剂盒（参见 材料表）对载玻片进行染色，以估计每个细胞吞噬的分枝杆菌。由于其蜡质细胞壁，分枝杆菌在酸醇洗涤后保留了金胺染料。然后用Hoechst对巨噬细胞核进行复染。该方法允许对每个细胞的吞噬细菌数量进行计数，并用于确定巨噬细胞的感染多样性（MOI）。- 上下移液三次后，从玻璃室载玻片中取出培养基，以去除未被吞噬的细菌。
- 用 2 mL 室温 PBS 洗涤一次。
- 储存4%多聚甲醛的库存，在-20°C下等分溶解在PBS中长达6个月。使用前立即解冻4%多聚甲醛的等分试样。用PBS稀释至2%多聚甲醛，每孔加入2 mL。
- 在室温下孵育10分钟。在此阶段，可以从安全柜中取出玻璃室载玻片进行染色。
- 在温和的自来水下清洗滑梯。
- 将足够的金胺分配到载玻片上，使用塑料移液管覆盖细胞，并在室温下在黑暗中孵育1分钟（用铝箔覆盖）。
- 用自来水洗掉载玻片上多余的染料，并在黑暗中加入脱色剂/淬火剂1分钟。
- 用自来水洗掉多余的，并在室温下用Hoechst 33342（PBS中的10μg/ mL）在黑暗中孵育15分钟。
- 用自来水洗掉Hoechst污渍，取出腔室，从载玻片中排出多余的水，加入一滴防淬灭剂和盖玻片，然后风干。
- 使用100倍油物镜在荧光显微镜下检查载玻片。分枝杆菌在FITC过滤器下会发出绿色荧光。细胞核在DAPI过滤器下发出蓝色荧光（图1C）。
- 通过计算每个细胞吞噬的分枝杆菌数量和感染细胞的百分比来确定MOI。
- 根据板中孔的表面积计算达到所需MOI所需的分枝杆菌悬浮液体积;例如，本实验中使用的玻璃室载玻片的表面积为4cm2。低MOI（约1-2杆菌/细胞）对于在几天（例如5天）进行的实验是理想的。
- 巨噬细胞感染
- 充分混合分枝杆菌悬浮液，并在确定达到所需MOI所需的体积后，将所需的量添加到12孔板上的细胞中。
- 在37°C孵育3小时以使分枝杆菌被吞噬。
- 通过用温热的RPMI或HBSS洗涤孔几次来去除细胞外细菌。
- 在一个孔（3小时样品）中裂解巨噬细胞，以确定初始接种物（3小时样品）的阳性时间百分比（TTP），如下步骤3所述。
- 向剩余孔中加入新鲜的cRPMI和所需的药物剂量或载体对照，将板在CO2 培养箱中于37°C孵育所需的时间（取决于实验设计，但通常在1至8天之间的几个间隔）。
3. 液体培养物检测系统的采集样品
注意：在感染当天，通过洗涤去除细胞外分枝杆菌，并通过裂解一个巨噬细胞孔（3小时样品）收获细胞内分枝杆菌，以确定吞噬作为感染基线对照的初始量。在随后的时间，将培养基、细胞裂解物和洗涤液结合起来以测量分枝杆菌的总生长。如果需要，也可以单独评估细胞外和细胞内生长。
- 收获3小时样品以确定TTP
- 如步骤2.3.3所述，在感染的初始3小时后从所有孔中洗去细胞外分枝杆菌。向3小时对照孔中加入1 mL新鲜培养基，以使裂解物体积与以后时间点的体积相等。
注意：如果要从分析中排除细胞外分枝杆菌，请参阅步骤3.2.7。
- 如步骤2.3.3所述，在感染的初始3小时后从所有孔中洗去细胞外分枝杆菌。向3小时对照孔中加入1 mL新鲜培养基，以使裂解物体积与以后时间点的体积相等。
- 样品采集
- 加热MB肉汤和仪器培养瓶，使其达到室温。
- 将培养基从 12 孔板转移到相应的标记锥形管中。
- 向每个孔中加入 500 μL 无菌裂解缓冲液（通过无菌 0.2 μm 过滤器过滤的 PBS 中的 0.1% Triton x-100）10 分钟。
- 用无菌刮刀轻轻地从孔中刮出细胞，并在适当的锥形管中与培养基结合。
- 用 0.5 mL 无菌 PBS 洗涤孔并转移到适当的管中。
- 轻轻地将每个样品通过针头和注射器（25 G）6-8次以分解团块。将样品在MB肉汤中以1：10的比例稀释;100 μL 样品 + 900 μL MB 培养基。
- 在所需的时间/天（通常在1至8天之间），按照上述步骤3.2.1-3.2.6收获剩余的样品。
注意：研究人员可能更愿意从他们的分析中排除细胞外分枝杆菌，在这种情况下，在上面的步骤3.2.2中，丢弃每个孔的培养基，并在加入裂解缓冲液之前洗涤巨噬细胞几次。
- 接种和装载仪器培养瓶
注意： 材料表中提供了液体培养仪器和相关耗材的详细信息。- 用浸泡在70%酒精中的薄纸对仪器培养瓶的橡胶盖进行消毒，并使其风干。
注意：此步骤需要在平衡计分卡中执行。 - 将所有样品的营养补充剂转移到锥形管（0.5 mL/瓶）中来制备瓶子。使用针头和注射器将 0.5 mL 营养补充剂注入器械培养瓶中。
- 将 500 μL 稀释样品 （1：10） 移液到 1 mL V 底管中。
- 使用针头和注射器将 500 μL 样品注入指定的仪器培养瓶中。
- 用浸泡在70%酒精中的薄纸对仪器培养瓶的橡胶盖进行消毒，并使其风干。从平衡计分卡中取出之前，用浸有 70% 酒精的薄纸擦拭瓶子。
- 小心地将瓶子从生物安全柜运送到仪器进行装载。
- 按下自动微生物检测系统上的加载按钮。
- 扫描仪器培养瓶上的条形码，并将瓶子放入37°C的检测系统培养箱中长达42天。从仪器屏幕上读取并记录达到阳性所需的时间。
注意： 条形码允许仪器识别瓶子并将反射率读数与特定瓶子联系起来。 - 通过将初始细胞内接种物（第 0 天）的 TTP 与在指定时间内培养的巨噬细胞的 TTP 进行比较，计算阳性百分比时间 （TTP）。TTP百分比的积极变化意味着分枝杆菌生长13。
例如，对于第 3 天：
阳性时间变化百分比 =
- 用浸泡在70%酒精中的薄纸对仪器培养瓶的橡胶盖进行消毒，并使其风干。
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Representative Results
本研究中使用的自动液体培养仪器每10分钟监测一次CO2水平。仪器瓶底部传感器的颜色变化以比色法测量，并以反射率单位表示。然后，仪器软件应用检测算法来计算阳性时间（TTP），即从接种到培养物被标记为阳性的天数（图1A）。TTP与初始接种物中log 10 CFU（通过琼脂平板法确定）12之间的反比关系如图1B所示。当通过描述的自动培养方法或通过固体琼脂上的菌落计数来比较在MOI感染的巨噬细胞内的Mtb生长范围为1-2至5-10（图1C）时，两种方法获得的结果之间存在显着相关性（图1D）。为了以图形方式显示Mtb生长，根据上述公式计算TTP的百分比变化，方法是将巨噬细胞感染后长达8天的TTP值与初始TTP值12进行比较。结果表明，液体培养和CFU之间存在类似的趋势，显示当溶液中存在AtRA或包封在PLGA微粒（MP）中的等效剂量的AtRA时，巨噬细胞中的Mtb生长受到显着抑制（图2A，B）。
还研究了另一种HDT的IFNγ与二线抗生素利奈唑胺联合治疗耐多药结核病14的疗效。首先在受感染的THP-1细胞中进行剂量反应实验，以确定单独使用利奈唑胺在浓度范围为0.6-5.0μg/ mL（图2C）的功效，然后测试次优剂量（1.25μg/ mL）和IFNγ的组合：药物之间没有显着的相互作用（图2D）。
图 1：通过自动液体培养和固体培养基定量 Mtb 生长。Mtb H37Ra在米德尔布鲁克肉汤中以一系列稀释度（1：2至1：100，000）稀释。将每种稀释液的300 μL等分试样注入重复的仪器培养瓶中，在液体培养仪器上孵育，并监测其生长情况。同时，将等分试样（10μL）一式三份涂抹在含有0.5%甘油和10%OADC（油酸，白蛋白，葡萄糖，过氧化氢酶补充剂）的MB琼脂平板上，用于先前发表的CFU计数12。（A）每次稀释液培养系统的数据点绘制为反射单位与时间15的关系。为了便于样品之间的比较，将背景归一化为每个样品的9小时反射率读数。总共监测了42天的生长（前21天如图所示），阳性时间（TTP）范围为3.83至11.1天。（B）将稀释样品的TTP与log10 CFU估计值作图;每个数据点代表一个实验的两个重复值，并描述两个单独的实验。显示了最佳拟合线和回归系数 （r2）。（C）用金胺（绿色）对THP-1巨噬细胞中的细胞内Mtb H37Ra进行AFB染色的示例，用于计算感染的多重性，用Hoechst 333258（蓝色）对细胞核进行复染。使用具有100倍（数值孔径[NA]，1.3）油物镜的落射荧光显微镜生成图像。比例尺代表 2 μm。 （D） 配对 TTP（液体培养）的相关分析（皮尔逊）和 CFU 估计来自多个实验 （n = 23） 的 THP-1 巨噬细胞裂解物中 Mtb H37Ra 生长，用/不使用药理试剂处理并在 MOI 下感染，范围为 1-2 至 5-10 杆菌/感染巨噬细胞。请点击此处查看此图的大图。
图2：使用自动液体培养系统评估宿主导向的结核病疗法。 THP-1巨噬细胞感染Mtb H37Ra3小时，去除细胞外细菌，并用候选宿主定向疗法处理细胞长达192小时。 （A）CFU估计用AtRA溶液（Sol）或2μM AtRA微粒（MP）（10-20μg/ mL）处理的巨噬细胞中的Mtb生长。（B）用AtRA溶液或AtRA PLGA MP处理的巨噬细胞（阳性TTP时间）的百分比变化。在cRPMI中用0.1%DMSO培养的感染THP1细胞被指定为未处理的对照。（C）用增加浓度的利奈唑胺溶液（0.6μg/ mL至5μg/ mL）处理巨噬细胞，使用自动液体培养系统在感染后24和72小时测定TTP的变化百分比。（D）感染Mtb H37Ra的巨噬细胞单独用利奈唑胺（1.25μg/mL）或利奈唑胺+ IFNγ（5ng/mL）处理长达72小时，计算TTP变化百分比。未经处理的对照包括仅在cRPMI中培养的受感染的THP1细胞，所述时间。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
作者使用本协议中描述的液体培养方法来监测单核细胞来源的巨噬细胞和肺泡巨噬细胞以及用PMA11，16，17分化的THP-1细胞中的Mtb生长。该技术也可以修改以用于非贴壁细胞12。最近，该仪器还用于临床前研究，以评估吸入全反式维甲酸（AtRA）作为结核病17的HDT。协议中的关键步骤包括（1）通过AFB染色控制Mtb的摄取，以减轻药物预处理引起的差异吞噬作用等因素，并最大限度地减少细胞死亡，这在较低MOI下不太可能发生，（2）根据MOI，可能需要稀释细胞裂解物以最大化测定的动态范围。目标是大约 5-12 天的 TTP 已经产生了可重复的结果。
在该协议中，减毒Mtb H37Ra已被用作毒力Mtb的替代物，但该方法也可以用于研究在遏制3级设施中对毒性实验室和临床菌株的药物疗效，并进行适当的修改。在毒性结核的小鼠模型中证实了这些结果，其中吸入AtRA，无论是在溶液中还是包封在聚（乳酸-乙醇酸（PLGA）微粒（MP）中，显着改善了Mtb-H37Rv从肺部的清除率，同时减少了病理，表明在这些研究中，H37Ra是毒性Mtb的有用替代品17。
由于HDT被设计为用作常规疗法的辅助药物，因此必须评估其与抗结核抗生素联合使用的体外疗效，以分析潜在的药物相互作用18。为了获得可测量的TTP，在评估巨噬细胞中的HDT/抗生素组合之前，必须首先将抗生素（尤其是具有高细胞内功效的抗生素）滴定至次优浓度（低于最低抑制浓度）。在该方案所示的示例中（图2C，D），在与IFN-γ组合评估之前，首先单独滴定利奈唑胺。在另一个例子中，用利福平处理的H37Ra感染的THP-1巨噬细胞的裂解物在液体培养系统中不能可靠地变成阳性17。因此，需要较低浓度的利福平来评估巨噬细胞中任何HDT与这种抗生素的组合。
由于Mtb有形成聚集体的趋势，因此有必要分解团块以提供单细胞悬液，以便在每次实验中将分枝杆菌均匀地等分到培养的巨噬细胞的多个孔中。同样，在巨噬细胞裂解后重复该解聚步骤，以提供准确的生长估计。在本协议中，使用注射器将分枝杆菌通过25G针头以产生单细胞悬液。其他扩散方法包括在超声水浴中超声处理分枝杆菌悬浮液或用玻璃珠涡旋19。然而，这两种技术都可以改变Mtb20，21外囊的组成，并可能影响与巨噬细胞21的结合和吞噬作用。
如果药理化合物在感染前或感染期间与巨噬细胞一起孵育，则可影响分枝杆菌的摄取。此外，当用原代人巨噬细胞进行实验时，供体之间分枝杆菌的吞噬作用可能存在差异。在这些情况下，使用固定比例的分枝杆菌：巨噬细胞将导致3小时感染期间摄取的差异。这可能会导致对化合物功效的错误假设。这可以通过在存在每个HDT的情况下使用此处描述的金胺方法（或另一种AFB染色）对抗酸杆菌（AFB）进行染色并相应地调整初始接种物来避免22。虽然由于难以区分细胞外和细胞内分枝杆菌19 以及仍然存在小团块的可能性，容易出现一定程度的错误，但 AFB 染色程序有助于平衡每种治疗的细胞内感染的初始水平。
在该协议中，对于在初始3小时感染样品以外的时间收集的样品，将裂解物和上清液结合以收集细胞内分枝杆菌和细胞外释放的分枝杆菌。原因是，由于巨噬细胞在与Mtb孵育最初3小时后已洗涤，因此存在的细胞外分枝杆菌很可能已被坏死巨噬细胞释放。另一方面，如果研究人员更喜欢收获剩余的细胞内分枝杆菌并排除细胞外分枝杆菌，则这种方法很容易适应这样做。
与固体培养基相比，基于液体培养的自动化仪器的优点是设置简单，无需分析连续稀释液，因此实验工作流程更有效，与更主观的菌落手动计数相比，可以获得准确的读数，获得结果的时间更快（大约5-12天，而琼脂平板为21天或更长时间）， 和更高的灵敏度5.缺点包括（1）依赖研究人员获得合适的仪器，（2）购买仪器瓶会大大增加每个样品的成本。此外，（3）生长的检测取决于杆菌复制：非复制休眠分枝杆菌的亚群不会发出信号23，24。然而，这一缺点也适用于固体培养基上的生长，并且在液体培养基中长时间孵育可能会恢复这些亚群的生长25，26。此外，（4）使用这种液体肉汤培养方法需要手动收获裂解物，并且不适合筛选化合物库所需的中高通量工作流程。在这种情况下，自动成像系统是更实用的选择27。然而，即使在高通量实验中，也必须使用直接测量生长的方法确认命中的抗菌活性28。未来，作者计划使用这种方法来评估自噬诱导药物与常规抗结核药物联合使用对巨噬细胞Mtb存活的杀菌作用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作由爱尔兰科学基金会（SFI 08 / RFP / BMT1689），爱尔兰健康研究委员会[HRA-POR/2012 / 4和HRA-POR-2015-1145]和都柏林皇家医院信托基金资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IX51 Fluorescent Microscope | Olympus, Japan | N/A | AFB detection and imaging |
| 2 mL microtube, flat bottom, screw cap, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 72.694.006 | Mtb infection of macropahges |
| 5 mL syringe, Luer lock | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | SZR-150-031K | Mtb infection of macropahges/CFU |
| 50 mL tube, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 62.547.254 | Mtb infection of macropahges |
| all-trans-Retinoic Acid (ATRA) ≥98% (HPLC) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | R2625 | Host directed therapy candidate |
| BacT/ALERT 3D Microbial Detection System | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 247001 | Broth-based colormetric detection system |
| BACT/ALERT MP BACT/ALERT MP Nutrient Supplement | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 414997 | Broth-based colormetric detection assay |
| BACT/ALERT MP culture bottles | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 419744 | Broth-based colormetric detection assay |
| BD BBL Middlebrook ADC Enrichment, 20 mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0553 | Mycobacterium liquid culture |
| BD BBL Middlebrook OADC Enrichment, 20mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0678 | Colony Forming Units |
| Cell scraper, 25 cm | Sarstedt, North Carolina, USA | 83.1830 | Harvest of lmacrophage lysates |
| Corning Syringe Filter, 0.2 µm | Corning Incorporated, Germany | 431219 | Sterilization of lysis buffer |
| Cover glass (borosilicate), 24 x 50 mm, #1.5 thickness | VWR International Limited | 631 - 0147 | |
| Cycloheximide, from microbial | Sigma Aldrich, Missouri, USA | C7698 | Colony Forming Units |
| Dako Fluorescent Mounting Medium | Agilent Technologies Ireland Limited | S3023 | Antifade mounting medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich, Missouri, USA | D8537 | Mtb infection of macropahges |
| Fetal Bovine Serum, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 10270106 | Macrophage cell culture |
| Glycerol, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 228220 | Colony Forming Units |
| Hoescht 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | B2261 | Nuclear stain |
| IFNγ, recombinant human | R&D Systems Inc, Minnesota, USA | 285-IF | Host directed therapy candidate |
| Labtek 2-well chamber slide, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | TKT-210-150R | Mtb infection of macropahges |
| L-Asparagine, anhydrous | Sigma Aldrich, Missouri, USA | A4159 | Colony Forming Units |
| Linezolid | Sigma Aldrich, Missouri, USA | PZ0014 | Antibiotic |
| Microlance Hypodermic Needle 25 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 300400 | Mtb infection of macropahges/CFU |
| Middlebrook 7H10 Agar Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0303 | Colony Forming Units |
| Middlebrook 7H9 Broth Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0178 | Mycobacterium liquid culture |
| Modified Auramine O Stain and Decolourizer | Scientific Device Laboratory, IL, USA | 345-250 | AFB stain |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich, Missouri, USA | 158127 | Mtb infection of macropahges |
| Petri dishes, 92 x 16mm (20/bag) | Sarstedt, North Carolina, USA | 82.1473.001 | Colony Forming Units |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | P8139 | Macrophage cell culture |
| Polysorbate 80, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 231181 | Mycobacterium liquid culture |
| RPMI-1640, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 52400025 | Macrophage cell culture |
| Sterile Cell Spreader, L-Shaped | Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, USA | RB-44103 | Colony Forming Units |
| T25 TC flask, angled neck, filter cap, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 156367 | Mycobacterium liquid culture |
| THP-1 cell line | ATCC, Virginia, USA | ATCC TIB-202 | Macrophage cell culture |
References
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