Summary
Snelle en efficiënte kwantificering van intracellulaire M. tuberculosis-groei is cruciaal voor het nastreven van verbeterde therapieën tegen tuberculose (TB). Dit protocol beschrijft een op bouillon gebaseerde colorimetrische detectietest met behulp van een geautomatiseerd vloeistofkweeksysteem om de Mtb-groei te kwantificeren in macrofagen die worden behandeld met kandidaat-gastheergerichte therapieën.
Abstract
Mycobacterium tuberculosis (Mtb), de veroorzaker van tuberculose (tbc), was tot de komst van COVID-19 wereldwijd de belangrijkste infectieziektemoordenaar. Mtb is geëvolueerd om te blijven bestaan in zijn intracellulaire omgeving, gastheerafweer te ontwijken en heeft resistentie ontwikkeld tegen veel anti-tuberculaire geneesmiddelen. Een benadering voor het oplossen van resistentie is het identificeren van bestaande goedgekeurde geneesmiddelen die de immuunrespons van de gastheer op Mtb zullen stimuleren. Deze geneesmiddelen kunnen vervolgens worden hergebruikt als aanvullende gastheergerichte therapieën (HDT) om de behandelingstijd te verkorten en antibioticaresistentie te helpen overwinnen.
Kwantificering van intracellulaire Mtb-groei in macrofagen is een cruciaal aspect van het beoordelen van potentiële HDT. De gouden standaard voor het meten van Mtb-groei is het tellen van kolonievormende eenheden (CFU) op agarplaten. Dit is een langzame, arbeidsintensieve test die zich niet leent voor snelle screening van geneesmiddelen. In dit protocol is een geautomatiseerd, op bouillon gebaseerd kweeksysteem, dat vaker wordt gebruikt om Mtb in klinische monsters te detecteren, aangepast voor preklinische screening van gastheergerichte therapieën. De capaciteit van het vloeistofkweektestsysteem om intracellulaire Mtb-groei te onderzoeken in macrofagen behandeld met HDT werd geëvalueerd. De HDT's die werden getest op hun vermogen om mtb-groei te remmen, waren all-trans retinoïnezuur (AtRA), zowel in oplossing als ingekapseld in poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) microdeeltjes en de combinatie van interferon-gamma en linezolid. De voordelen van deze geautomatiseerde op vloeistofcultuur gebaseerde techniek ten opzichte van de CFU-methode zijn eenvoud van installatie, minder arbeidsintensieve voorbereiding en snellere tijd tot resultaten (5-12 dagen in vergelijking met 21 dagen of meer voor agarplaten).
Introduction
Mycobacterium tuberculosis (Mtb), de veroorzaker van tbc, was in 2019 wereldwijd de belangrijkste infectieziektedoder1. Om de afweer van de gastheer te ontwijken, ondermijnt Mtb de mycobactericide activiteit van aangeboren immuuncellen zoals macrofagen en dendritische cellen (DC's), waardoor het intracellulair kan blijven bestaan en2 kan repliceren. Het ontbreken van een effectief vaccin om volwassen long-tbc te voorkomen en de toenemende opkomst van resistente stammen benadrukken de dringende behoefte aan nieuwe therapieën.
Adjuvante gastheergerichte therapieën (HDT) kunnen de behandelingstijd verkorten en helpen weerstand te overwinnen3. Preklinische beoordeling van HDT-kandidaten in vitro om mycobactericide activiteit binnen macrofagen te bepalen, is vaak afhankelijk van de kwantificering van Mtb-groei door kolonievormende eenheden (CFU) op vaste agarplaten. Dit is een langzame, arbeidsintensieve test die zich niet leent voor snelle screening van geneesmiddelen. In de handel verkrijgbare geautomatiseerde, op bouillon gebaseerde microbiële detectiesystemen worden vaker gebruikt in klinische microbiologische laboratoria voor detectie en gevoeligheidstests voor geneesmiddelen van Mtb en andere mycobacteriële soorten in klinische monsters4. Deze instrumenten meten de groei indirect op basis van de bacteriële metabole activiteit die leidt tot fysieke veranderingen in de kweekmedia (verandering in CO2- of O2-niveaus of druk) die in de loop van de tijd worden gevolgd5. De uitlezing is time-to-positivity (TPP), waarvan eerder is aangetoond dat het correleert met Mtb CFU in sputummonsters van tbc-patiënten als reactie op behandeling 6,7 en in lysaten van geïnfecteerde muizenlong en milt8. Daarnaast zijn vloeistofkweekdetectiesystemen gebruikt om het effect van conventionele pathogeengerichte therapieën op de groei van mycobacteriën in axenische cultuur en gekweekte macrofagen te meten 9,10. Het instrument is ook gebruikt om het aangeboren vermogen van dendritische cellen en van alveolaire macrofagen te onderzoeken om de intracellulaire groei van Mtb 11,12 te beheersen. Dit experimentele protocol toont aan dat een vloeistofkweekdiagnostisch systeem kan worden aangepast om preklinische screening van HDT op tbc in gekweekte macrofagen uit te voeren. In vergelijking met CFU-inventarisatie is het belangrijkste voordeel van deze techniek dat het de experimentele arbeid en tijd die nodig is om intracellulaire mycobacteriële groei / overleving te kwantificeren aanzienlijk vermindert. Deze techniek is gebaseerd op toegang tot een geautomatiseerd kweekinstrument dat kan worden gebruikt om de intracellulaire mycobacteriële overleving te beoordelen in immuuncellen die worden behandeld met een breed scala aan farmacologische reagentia die gericht zijn op cellulaire functies om de immuniteit van de gastheer te vergroten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De experimenten die in dit protocol worden beschreven, zijn uitgevoerd met behulp van de verzwakte H37Ra-stam mtb, die kan worden behandeld in een laboratorium met containmentniveau 2. Alle manipulaties van levende mycobacteriën werden uitgevoerd in klasse II biologische veiligheidskast (BSC). Experimentele procedures werden ontworpen om de generatie van aerosolen te minimaliseren. Eukaryote celkweek (THP-1 cellen) werd ook uitgevoerd in een klasse II BSC. Het laboratorium voerde een risicobeoordeling uit en zorgde ervoor dat alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele en nationale biologische veiligheidsvoorschriften. De menselijke monocytische THP-1 cellijn werd gebruikt om de methode uit te voeren zoals beschreven (stap 1). Cellen worden gedifferentieerd in macrofagen na stimulatie met phorbol 12-myristate 13-acetaat (PMA) vóór infectie met mycobacteriën.
1. Celkweek
- Vermeerdering van H37Ra-zaadvoorraad tot logfase in Middlebrook 7H9 (MB) bouillon aangevuld met albumine-dextrose-catalase (ADC) verrijking (10%) en 0,05% polysorbaat 80. Bewaar H37Ra voorraad in 1 ml aliquots in een -80 °C vriezer voor maximaal 1 jaar.
- Ontdooi een injectieflacon mtb-H37ra van 1 ml en breng deze ongeveer 1 week voor het geplande experiment over in een T25-kolf met een filterdop met 9 ml MB aangevulde bouillon. Incubeer bij 37 °C gedurende 5-7 dagen in een statische incubator.
- Kweek THP-1 cellen in RPMI-1640 aangevuld met niet-warmtedodend 10% foetaal kalfsserum (compleet (c)RPMI) in een T75 kolf in een CO2 bevochtigde incubator bij 5% CO2/37 °C en subcultuur tweemaal per week om een dichtheid van minder dan 1 x 106 cellen/ml te behouden.
- Differentieer THP-1-cellen in macrofagen 3 dagen voor infectie door cellen meerdere keren voorzichtig te pipetteren met behulp van een serologische pipet in T75-kolven om eventuele klonten te verspreiden en in een conische buis van 50 ml te plaatsen.
- Centrifugeer cellen bij 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, decanteer het supernatant en resuspenseer de pellet voorzichtig in 2 ml RPMI. Voer het aantal cellen uit om cellen/ml te schatten.
- Zaad 2 ml THP-1 macrofagen in 12-well weefselkweekplaten met een dichtheid van 100.000 cellen / ml in cRPMI met 100 ng / ml PMA gedurende 72 uur. Verwijder PMA-bevattend medium uit cellen en vul aan met verse cRPMI vóór Mtb-infectie.
- Stel afzonderlijke platen in voor elk vereist tijdstip.
- Zaadcellen met dezelfde dichtheid (100.000 cellen / ml) in 2-well glazen kamerglaasjes om de multipliciteit van infectie (MOI) te bepalen.
- Plaats in een 5% CO2 bevochtigde incubator gedurende 3 dagen bij 37 °C.
2. Kwantificering van mtb-opname
- Bepaling van mtb-opname door macrofagen (MOI)
- Stel de biologische veiligheidskast klasse II (BSC) op de dag van infectie in en werk aan twee lagen tissuepapier om eventuele morsen op te vangen. Stel afvalcontainers in volgens de lokale regelgeving.
- Verwijder 6-8 ml mycobacteriële cultuur uit de T25-kolf en breng deze over in een polypropyleenbuis van 15 ml.
OPMERKING: Buizen met een kleiner volume kunnen worden gebruikt voor kleinere experimenten. - Centrifugeer de buis in een benchtopcentrifuge bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten bij 2890 x g.
- Verwijder de buis voorzichtig uit de centrifuge en breng deze over naar de biologische veiligheidskast. Wacht 1 minuut om de bacteriën te laten bezinken.
- Giet het supernatant af in de desinfecterende weggooicontainer, recap-buis en resuspenseer de bacteriën in het resterende medium door op de zijkant van de buis te tikken. Wacht 1 minuut om de bacteriën te laten bezinken.
- Voeg 2 ml voorverwarmd cRPMI toe, meng voorzichtig en breng over in een conische buis van 50 ml.
- Resuspendeer de mycobacteriën zeer voorzichtig met behulp van een naald van 25 G en een spuit van 5 ml. Om te resuspenderen, trekt u de mycobacteriënsuspensie in de spuit en werpt u heel voorzichtig de zijwand van de buis uit om de aerosolproductie te minimaliseren. Herhaal dit 6-8 keer.
OPMERKING: Wees uiterst voorzichtig, want dit is een cultuur van mycobacteriën met een hoge dichtheid. Om het risico op prikaccidenten te voorkomen, gebruikt u waar mogelijk stompe naalden en Luer-slotspuiten. - Gooi de naald en spuit weg in een naaldencontainer in de BSC.
- Breng de suspensie over in een microfugebuis van 2 ml (met schroefdop) en centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten bij 100 x g om eventuele resterende klonten te pelleteren. Breng de buis terug naar de veiligheidskast en wacht 1 minuut om de bacteriën te laten bezinken.
- Breng de bovenste 1-1,5 ml van het supernatant over in een nieuwe buis. Gooi de originele buis weg in de afvalemmer met ontsmettingsmiddel. Meng goed en voeg verschillende hoeveelheden van de mycobacteriële suspensie (bijv. 5, 25, 50, 150 μL) toe aan de 2-well glazen kamerglaasjes en incubeer gedurende 3 uur in een CO2-incubator bij 37 °C.
- Kleuring voor zuurvaste bacteriën (AFB)
OPMERKING: Na 3 uur incubatie worden de macrofagen gewassen en gefixeerd met paraformaldehyde om mycobacteriën te inactiveren. De dia's worden vervolgens gekleurd met behulp van een modified Auramine O-kit (zie tabel met materialen) om mycobacteriën fagocytosed per cel te schatten. Door hun wasachtige celwand behouden mycobacteriën de Auramine-kleurstof na een zuur-alcoholwasbeurt. De macrofaagkernen worden dan tegengesteld met Hoechst. Deze methode maakt het mogelijk om het aantal fagocytose bacteriën per cel te tellen en wordt gebruikt om de multipliciteit van infectie (MOI) van de macrofagen te bepalen.- Verwijder het medium uit de glazen kamerschuif nadat u drie keer op en neer hebt gepipetteerd om bacteriën te verdrijven die niet zijn gefagocyteerd.
- Eenmaal wassen met 2 ml PBS op kamertemperatuur.
- Bewaar voorraden van 4% paraformaldehyde, opgelost in PBS in aliquots bij -20 °C gedurende maximaal 6 maanden. Ontdooi een aliquot van 4% paraformaldehyde vlak voor gebruik. Verdun tot 2% paraformaldehyde met PBS en voeg 2 ml per put toe.
- Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. De glaskamerschuif kan in dit stadium uit de veiligheidskast worden verwijderd voor vlekken.
- Was de glijbaan onder een zachte stroom kraanwater.
- Doseer voldoende Auramine op de dia om de cellen te bedekken met een plastic transferpipet en incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur in het donker (afdekken met aluminiumfolie).
- Was overtollige kleurstof van de glijbaan met kraanwater en voeg de ontkleurer/blusser gedurende 1 minuut toe in het donker.
- Was het teveel af met leidingwater en incubeer gedurende 15 minuten op kamertemperatuur met Hoechst 33342 (10 μg/ml in PBS) in het donker.
- Was de Hoechst-vlek af met kraanwater, verwijder de kamers, giet overtollig water af van de glijbaan, voeg een druppel antifade en coverslip toe en droog aan de lucht.
- Bekijk de dia onder de fluorescerende microscoop met behulp van het 100x olieobjectief. Mycobacteriën fluoresceren groen onder het FITC-filter. De kernen fluoresceren blauw onder het DAPI-filter (figuur 1C).
- Bepaal de MOI door het aantal mycobacteriën fagocytosed per cel en het percentage geïnfecteerde cellen te tellen.
- Bereken het volume mycobacteriële suspensie dat nodig is om de vereiste MOI te bereiken op basis van het oppervlak van een put in de plaat; het oppervlak van de glazen kamerdia's die in dit experiment worden gebruikt, is bijvoorbeeld 4 cm2. Lage MOI (ongeveer 1-2 bacillen/cellen) is wenselijk voor experimenten die gedurende meerdere dagen (bijv. 5 dagen) worden uitgevoerd.
- Infectie van macrofagen
- Meng de mycobacteriën suspensie goed en voeg de hoeveelheid die nodig is toe aan de cellen op 12-well platen zodra het volume dat nodig is om de gewenste MOI te bereiken is bepaald.
- Incubeer bij 37 °C gedurende 3 uur om mycobacteriën te laten fagocyteren.
- Verwijder extracellulaire bacteriën door de putjes meerdere keren te wassen met warme RPMI of HBSS.
- Laat de macrofagen in één putje (3 uur monster) lyseren om het percentage tijd tot positiviteit (TTP) van het initiële entmateriaal (3 h monster) te bepalen, zoals beschreven in stap 3 hieronder.
- Voeg verse cRPMI en de vereiste geneesmiddeldoses of voertuigcontrole toe aan de resterende putten, incubeer de platen in de CO2-incubator bij 37 °C gedurende de benodigde tijd (afhankelijk van het experimentele ontwerp, maar meestal met verschillende tussenpozen tussen 1 en 8 dagen).
3. Monsters oogsten voor het vloeistofkweekdetectiesysteem
OPMERKING: Op de dag van infectie worden extracellulaire mycobacteriën verwijderd door wassen en intracellulaire mycobacteriën worden geoogst door lysis van één put van macrofagen (3 uur monster) om de initiële hoeveelheid fagocytosed te bepalen als een basislijncontrole voor infectie. Op latere tijdstippen worden zowel het medium, cellysaat als wasbeurten gecombineerd om de totale mycobacteriële groei te meten. Extracellulaire en intracellulaire groei kunnen indien gewenst ook afzonderlijk worden beoordeeld.
- Monster van 3 uur om TTP te bepalen
- Spoel extracellulaire mycobacteriën uit alle putjes na de eerste 3 uur infectie zoals beschreven in stap 2.3.3. Voeg 1 ml verse media toe aan de 3-uursregeling om het lysaatvolume gelijk te maken met dat van latere tijdstippen.
OPMERKING: Zie stap 3.2.7 als extracellulaire mycobacteriën van de analyse moeten worden uitgesloten.
- Spoel extracellulaire mycobacteriën uit alle putjes na de eerste 3 uur infectie zoals beschreven in stap 2.3.3. Voeg 1 ml verse media toe aan de 3-uursregeling om het lysaatvolume gelijk te maken met dat van latere tijdstippen.
- Monsterverzameling
- Warme MB bouillon en instrument cultuur flessen om ze op kamertemperatuur te brengen.
- Breng het medium over van de 12-wells plaat naar de overeenkomstige gelabelde conische buizen.
- Voeg 500 μL steriele lysisbuffer (0,1% Triton x-100 in PBS gefilterd door een steriel filter van 0,2 μm) toe aan elk putje gedurende 10 minuten.
- Schraap de cellen voorzichtig uit de put met een steriele schraper en combineer met het medium in de juiste conische buis.
- Was de put met 0,5 ml steriel PBS en breng over in de juiste buis.
- Laat elk monster voorzichtig 6-8 keer door een naald en spuit (25 G) gaan om de klonten te breken. Verdun monsters 1:10 in MB bouillon; 100 μL monster + 900 μL MB medium.
- Oogst de resterende monsters op de vereiste tijden/dagen (meestal tussen 1 en 8 dagen) door de stappen 3.2.1-3.2.6 hierboven te volgen.
OPMERKING: Onderzoekers kunnen er de voorkeur aan geven om extracellulaire mycobacteriën uit te sluiten van hun analyse, in welk geval, in stap 3.2.2 hierboven, het medium uit elke put wordt weggegooid en macrofagen meerdere keren worden gewassen voordat lysisbuffer wordt toegevoegd.
- Inenten en laden van instrumentkweekflessen
OPMERKING: Details van het vloeistofkweekinstrument en de bijbehorende verbruiksartikelen zijn te vinden in de materiaaltabel.- Steriliseer de rubberen dop van de instrumentkweekfles met tissuepapier gedrenkt in 70% alcohol en laat het aan de lucht drogen.
OPMERKING: Deze stap moet worden uitgevoerd in het BSC. - Bereid flessen voor door voldoende voedingssupplementen voor alle monsters over te brengen in een conische buis (0,5 ml / fles). Gebruik een naald en spuit om 0,5 ml voedingssupplement in de instrumentcultuurfles te injecteren.
- Pipetteer 500 μL van het verdunde monster (1:10) in een buis met 1 ml V-bodem.
- Gebruik een naald en spuit om de 500 μL monster in de toegewezen instrumentkweekfles te injecteren.
- Steriliseer de rubberen dop van de instrumentkweekfles met tissuepapier gedrenkt in 70% alcohol en laat het aan de lucht drogen. Veeg de flessen af met vloeipapier gedrenkt in 70% alcohol voordat u ze uit de BSC verwijdert.
- Transporteer flessen zorgvuldig van de bioveiligheidskast naar het instrument om te laden.
- Druk op de laadknop op het geautomatiseerde microbiële detectiesysteem.
- Scan de barcodes op instrumentkweekflessen en plaats de flessen in de incubator van het detectiesysteem bij 37 °C gedurende maximaal 42 dagen. Lees en noteer de tijd die nodig is om positiviteit te bereiken vanaf het instrumentenscherm.
OPMERKING: Met de streepjescode kan het instrument de fles identificeren en reflectiemetingen koppelen aan een bepaalde fles. - Bereken de procentuele tijd tot positiviteit (TTP) door de TTP van het initiële intracellulaire entmateriaal (dag 0) te vergelijken met die van macrofagen gekweekt voor de aangegeven tijden. Een positieve verandering in percentage TTP betekent mycobacteriële groei13.
Bijvoorbeeld voor dag 3:
Procentuele verandering in tijd naar positiviteit =
- Steriliseer de rubberen dop van de instrumentkweekfles met tissuepapier gedrenkt in 70% alcohol en laat het aan de lucht drogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het geautomatiseerde vloeistofkweekinstrument dat in deze studie wordt gebruikt, bewaakt elke 10 minuten de CO2-niveaus . Een kleurverandering in de sensor aan de onderkant van de instrumentfles wordt colorimetrisch gemeten en uitgedrukt als reflectie-eenheden. De instrumentsoftware past vervolgens detectiealgoritmen toe om de tijd tot positiviteit (TTP) te berekenen, d.w.z. het aantal dagen vanaf inenting totdat culturen als positief worden gemarkeerd (figuur 1A). Een omgekeerde relatie tussen TTP en log10CFU (bepaald volgens de agarplaatmethode)12 in het initiële entmateriaal wordt geïllustreerd in figuur 1B. Wanneer mtb-groei binnen macrofagen-geïnfecteerde bij MOI variërend van 1-2 tot 5-10 in de aan- of afwezigheid van farmacologische remmers (figuur 1C) werd vergeleken met de beschreven geautomatiseerde kweekmethode of door inventarisatie van kolonies op vaste agar, was er een significante correlatie tussen de resultaten verkregen door beide methoden (figuur 1D). Om de Mtb-groei grafisch weer te geven, werd de procentuele verandering in TTP berekend volgens de bovenstaande vergelijking door de TTP-waarden tot 8 dagen na infectie van macrofagen te vergelijken met de initiële TTP-waarde12. De resultaten toonden een vergelijkbare trend tussen vloeistofkweek en CFU, met een significante remming van mtb-groei in macrofagen in aanwezigheid van AtRA in oplossing of de equivalente dosis AtRA ingekapseld in PLGA-microdeeltjes (MP) (figuur 2A, B).
De werkzaamheid van een andere HDT, IFNγ, die is gebruikt voor de behandeling van multiresistente TB14, in combinatie met het tweedelijns antibioticum linezolid, werd ook onderzocht. Een dosis-responsexperiment werd eerst uitgevoerd in geïnfecteerde THP-1-cellen om de werkzaamheid van linezolid alleen te bepalen bij concentraties variërend van 0,6-5,0 μg/ml (figuur 2C) voordat de combinatie van linezolid bij een suboptimale dosis (1,25 μg/ml) en IFNγ werd getest: er was geen significante interactie tussen de geneesmiddelen (figuur 2D).
Figuur 1: Kwantificering van mtb-groei door geautomatiseerde vloeistofcultuur en op vast medium. Mtb H37Ra werd verdund in Middlebrook-bouillon over een reeks verdunningen (1:2 tot 1:100.000). Een aliquot van 300 μL van elke verdunning werd geïnjecteerd in dubbele instrumentkweekflessen, geïncubeerd op het vloeistofkweekinstrument, en hun groei werd gecontroleerd. Tegelijkertijd werd een aliquot (10 μL) verspreid over MB-agarplaten met 0,5% glycerol en 10% OADC (oliezuur, albumine, dextrose, catalasesupplement) in drievoud, voor CFU-inventarisatie zoals eerder gepubliceerd12. (A) Gegevenspunten van het vloeistofkweeksysteem van elke verdunning worden uitgezet als reflectie-eenheden versus tijd15. Om vergelijkingen tussen monsters mogelijk te maken, werd de achtergrond genormaliseerd naar de 9 uur reflectiemeting voor elk monster. De groei werd in totaal 42 dagen gevolgd (de eerste 21 dagen zijn weergegeven op grafiek), de tijd tot positiviteit (TTP) varieerde van 3,83 tot 11,1 dagen. B) TTP van verdunde monsters werd uitgezet tegen log10 CFU-schatting; elk gegevenspunt vertegenwoordigt de waarden voor twee replicaties van één experiment en beschrijft twee afzonderlijke experimenten. De lijn van de beste pasvorm en regressiecoëfficiënt (r2) worden weergegeven. (C) Voorbeeld van AFB-kleuring van intracellulaire Mtb H37Ra in THP-1 macrofagen met auramine (groen) die wordt gebruikt om de veelheid van infectie te berekenen, kernen worden tegengekleurd met Hoechst 333258 (blauw). Beelden werden gegenereerd met behulp van een epifluorescente microscoop met een olieobjectief van 100x (numeriek diafragma [NA], 1,3). Schaalbalk vertegenwoordigt 2 μm. (D) Correlatieanalyse (Pearson) van gepaarde TTP (vloeistofkweek) en CFU-schatting van Mtb H37Ra-groei in THP-1-macrofaaglysaten uit meerdere experimenten (n = 23), behandeld met / zonder farmacologische reagentia en geïnfecteerd bij MOI variërend van 1-2 tot 5-10 bacillen / geïnfecteerde macrofaag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Evaluatie van gastheergerichte therapieën voor tbc met behulp van een geautomatiseerd vloeistofkweeksysteem. THP-1 macrofagen werden gedurende 3 uur geïnfecteerd met Mtb H37Ra, extracellulaire bacteriën werden verwijderd en cellen werden behandeld met kandidaat-gastheergerichte therapieën gedurende maximaal 192 h. (A) CFU-schatting van Mtb-groei in macrofagen behandeld met AtRA-oplossing (Sol) of 2 μM AtRA-microdeeltjes (MP) (10-20 μg / ml). B) % verandering in (tijd tot positiviteit TTP) in macrofagen behandeld met AtRA-oplossing of AtRA PLGA MP. Geïnfecteerde THP1-cellen gekweekt in 0,1% DMSO in cRPMI werden aangewezen als onbehandelde controles. (C) Macrofagen werden behandeld met toenemende concentraties van linezolidoplossing (0,6 μg/ml tot 5 μg/ml), % verandering in TTP werd 24 en 72 uur na infectie bepaald met behulp van een geautomatiseerd vloeistofkweeksysteem. (D) Macrofagen geïnfecteerd met Mtb H37Ra werden behandeld met linezolid alleen (1,25 μg/ml) of linezolid + IFNγ (5 ng/ml) tot 72 uur, % verandering in TTP werd berekend. Onbehandelde controles bestonden uit geïnfecteerde THP1-cellen die alleen in cRPMI werden gekweekt voor de aangegeven tijden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De auteurs hebben de in dit protocol beschreven vloeistofkweekmethode gebruikt om de Mtb-groei te volgen in van monocyten afgeleide macrofagen en alveolaire macrofagen en THP-1-cellen gedifferentieerd met PMA 11,16,17. Deze techniek kan ook worden aangepast voor gebruik met niet-adherente cellen12. Meer recent werd het instrument ook gebruikt in preklinische studies om geïnhaleerd all-trans retinoïnezuur (AtRA) te evalueren als een HDT voor TB17. Kritieke stappen in het protocol omvatten (1) controle op opname van Mtb door AFB-kleuring om factoren zoals differentiële fagocytose als gevolg van medicamenteuze voorbehandeling te verminderen en celdood te minimaliseren die minder waarschijnlijk is bij lagere MOI, (2) afhankelijk van de MOI, cellysaten moeten mogelijk worden verdund om het dynamische bereik van de test te maximaliseren. Het streven naar een TTP van ongeveer 5-12 dagen heeft reproduceerbare resultaten opgeleverd.
In dit protocol is verzwakte Mtb H37Ra gebruikt als surrogaat voor virulente Mtb, maar de methode kan ook worden toegepast om de werkzaamheid van geneesmiddelen tegen virulente laboratorium- en klinische stammen in een containmentniveau 3-faciliteit met de juiste modificatie te bestuderen. Bevestiging van deze resultaten in een muismodel van virulente TB waarbij geïnhaleerde AtRA, zowel in oplossing als ingekapseld in poly (melkzuur-co-glycolzuur (PLGA) microdeeltjes (MP), de klaring van Mtb-H37Rv uit de long aanzienlijk verbeterde en tegelijkertijd de pathologie verminderde, geeft aan dat H37Ra een nuttig surrogaat is voor virulente Mtb in deze studies17.
Aangezien HDT's zijn ontworpen om te worden gebruikt als aanvulling op conventionele therapieën, is het essentieel om hun werkzaamheid in vitro te evalueren in combinatie met anti-tuberculaire antibiotica om potentiële geneesmiddelinteracties te analyseren18. Om een meetbare TTP te verkrijgen, moeten antibiotica - met name die met een hoge intracellulaire werkzaamheid - eerst worden getitreerd tot suboptimale concentraties (onder de minimale remmende concentratie) voordat HDT / antibioticacombinaties in macrofagen worden geëvalueerd. In het voorbeeld in dit protocol (figuur 2C,D) werd alleen linezolid eerst getitreerd voordat het werd geëvalueerd in combinatie met IFN-γ. In een ander voorbeeld worden lysaten van H37Ra-geïnfecteerde THP-1-macrofagen behandeld met rifampicine op of boven 0,6 μg/ml niet betrouwbaar positief in het vloeistofkweeksysteem17. Daarom is een lagere concentratie rifampicine nodig om een HDT in combinatie met dit antibioticum in macrofagen te evalueren.
Vanwege de neiging van Mtb om aggregaten te vormen, is het noodzakelijk om klonten op te breken om een enkele celsuspensie te bieden om uniforme aliquoting van mycobacteriën in meerdere putten van gekweekte macrofagen in elk experiment te bereiken. Evenzo wordt deze uitsplitsingsstap herhaald nadat macrofagen zijn gelyseerd om een nauwkeurige schatting van de groei te geven. In het huidige protocol worden de mycobacteriën door een naald van 25 G geleid met behulp van een spuit om een eencellige suspensie te genereren. Andere verspreidingsmethoden omvatten ultrasoonapparaat van de mycobacteriële suspensie in een sonicerend waterbad of vortexing met glazen kralen19. Beide technieken kunnen echter de samenstelling van de buitenste capsule van Mtb20,21 veranderen en kunnen de binding aan en fagocytose door macrofagen beïnvloeden21.
Farmacologische verbindingen kunnen de opname van mycobacteriën beïnvloeden als ze voor of tijdens de infectie worden geïncubeerd met macrofagen. Bovendien kan er bij het uitvoeren van experimenten met primaire menselijke macrofagen variatie zijn in fagocytose van mycobacteriën tussen donoren. In deze omstandigheden, met behulp van een vaste verhouding van mycobacteriën: macrofagen zou leiden tot verschillen in opname tijdens de 3 h infectieperiode. Dit kan leiden tot onjuiste aannames over de werkzaamheid van verbindingen. Dit kan worden voorkomen door kleuring voor zure snelle bacillen (AFB) uit te voeren met behulp van de hier beschreven auramine-methode (of een andere AFB-vlek) in aanwezigheid van elke HDT en het initiële entmateriaal dienovereenkomstig aan te passen22. Hoewel gevoelig voor een bepaalde hoeveelheid fouten als gevolg van moeite met het onderscheiden van extracellulaire van intracellulaire mycobacteriën19 en de waarschijnlijkheid dat er nog steeds kleine klonten aanwezig zijn, helpt de AFB-kleuringsprocedure om het initiële niveau van intracellulaire infectie voor elke behandeling gelijk te trekken.
In dit protocol worden voor monsters die zijn verzameld op andere tijdstippen dan het initiële 3 uur infectiemonster, het lysaat en supernatant gecombineerd om intracellulaire mycobacteriën en die welke extracellulair zijn vrijgegeven te verzamelen. De reden hiervoor is dat, aangezien de macrofagen zijn gewassen na de eerste 3 uur incubatie met Mtb, extracellulaire mycobacteriën waarschijnlijk zijn vrijgegeven door necrotische macrofagen. Aan de andere kant, als onderzoekers er de voorkeur aan geven om de resterende intracellulaire mycobacteriën te oogsten en extracellulaire mycobacteriën uit te sluiten, is deze methode gemakkelijk aan te passen om dit te doen.
Voordelen van geautomatiseerde op vloeistofcultuur gebaseerde instrumenten in vergelijking met het vaste medium zijn eenvoud van opstelling, een efficiëntere experimentele workflow omdat analyse van seriële verdunningen niet nodig is, een nauwkeurige uitlezing wordt verkregen in vergelijking met de meer subjectieve handmatige telling van kolonies, snellere tijd tot resultaten (ongeveer 5-12 dagen in vergelijking met 21 of meer voor agarplaten), en hogere gevoeligheid5. Nadelen zijn onder meer (1) afhankelijkheid van onderzoekers die toegang hebben tot een geschikt instrument, (2) de aankoop van instrumentflessen kan aanzienlijk bijdragen aan de kosten per monster. Bovendien hangt (3) detectie van groei af van bacillaire replicatie: subpopulaties van niet-replicerende slapende mycobacteriën geven geen signaal23,24. Dit nadeel geldt echter ook voor groei op vaste media en langdurige incubatie in vloeibare media kan de groei van deze subpopulaties herstellen25,26. Bovendien (4) vereist het gebruik van deze vloeibare bouillonkweekmethode het handmatig oogsten van lysaten en zou het niet geschikt zijn voor workflows met een gemiddelde tot hoge doorvoer die nodig zijn om samengestelde bibliotheken te screenen. In dergelijke gevallen zijn geautomatiseerde beeldvormingssystemen een praktischere optie27. Zelfs in experimenten met een hoge doorvoer is het echter essentieel om de antimicrobiële activiteit van treffers te bevestigen met behulp van een methode die de groei direct meet28. In de toekomst zijn de auteurs van plan deze methode te gebruiken om de bacteriedodende effecten van autofagie-inducerende geneesmiddelen in combinatie met conventionele anti-tuberculaire geneesmiddelen op mtb-overleving in macrofagen te beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door Science Foundation Ireland (SFI 08/RFP/BMT1689), de Health Research Board in Ierland [HRA-POR/2012/4 en HRA-POR-2015-1145] en Royal City of Dublin Hospital Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IX51 Fluorescent Microscope | Olympus, Japan | N/A | AFB detection and imaging |
| 2 mL microtube, flat bottom, screw cap, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 72.694.006 | Mtb infection of macropahges |
| 5 mL syringe, Luer lock | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | SZR-150-031K | Mtb infection of macropahges/CFU |
| 50 mL tube, sterile | Sarstedt, North Carolina, USA | 62.547.254 | Mtb infection of macropahges |
| all-trans-Retinoic Acid (ATRA) ≥98% (HPLC) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | R2625 | Host directed therapy candidate |
| BacT/ALERT 3D Microbial Detection System | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 247001 | Broth-based colormetric detection system |
| BACT/ALERT MP BACT/ALERT MP Nutrient Supplement | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 414997 | Broth-based colormetric detection assay |
| BACT/ALERT MP culture bottles | Biomerieux ( Hampshire, UK) | 419744 | Broth-based colormetric detection assay |
| BD BBL Middlebrook ADC Enrichment, 20 mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0553 | Mycobacterium liquid culture |
| BD BBL Middlebrook OADC Enrichment, 20mL | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0678 | Colony Forming Units |
| Cell scraper, 25 cm | Sarstedt, North Carolina, USA | 83.1830 | Harvest of lmacrophage lysates |
| Corning Syringe Filter, 0.2 µm | Corning Incorporated, Germany | 431219 | Sterilization of lysis buffer |
| Cover glass (borosilicate), 24 x 50 mm, #1.5 thickness | VWR International Limited | 631 - 0147 | |
| Cycloheximide, from microbial | Sigma Aldrich, Missouri, USA | C7698 | Colony Forming Units |
| Dako Fluorescent Mounting Medium | Agilent Technologies Ireland Limited | S3023 | Antifade mounting medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich, Missouri, USA | D8537 | Mtb infection of macropahges |
| Fetal Bovine Serum, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 10270106 | Macrophage cell culture |
| Glycerol, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 228220 | Colony Forming Units |
| Hoescht 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | B2261 | Nuclear stain |
| IFNγ, recombinant human | R&D Systems Inc, Minnesota, USA | 285-IF | Host directed therapy candidate |
| Labtek 2-well chamber slide, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | TKT-210-150R | Mtb infection of macropahges |
| L-Asparagine, anhydrous | Sigma Aldrich, Missouri, USA | A4159 | Colony Forming Units |
| Linezolid | Sigma Aldrich, Missouri, USA | PZ0014 | Antibiotic |
| Microlance Hypodermic Needle 25 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 300400 | Mtb infection of macropahges/CFU |
| Middlebrook 7H10 Agar Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0303 | Colony Forming Units |
| Middlebrook 7H9 Broth Base | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | M0178 | Mycobacterium liquid culture |
| Modified Auramine O Stain and Decolourizer | Scientific Device Laboratory, IL, USA | 345-250 | AFB stain |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich, Missouri, USA | 158127 | Mtb infection of macropahges |
| Petri dishes, 92 x 16mm (20/bag) | Sarstedt, North Carolina, USA | 82.1473.001 | Colony Forming Units |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich, Missouri, USA | P8139 | Macrophage cell culture |
| Polysorbate 80, Difco | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 231181 | Mycobacterium liquid culture |
| RPMI-1640, Gibco | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 52400025 | Macrophage cell culture |
| Sterile Cell Spreader, L-Shaped | Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, USA | RB-44103 | Colony Forming Units |
| T25 TC flask, angled neck, filter cap, sterile, Nunc | Thermo Fisher, Massachusetts, USA | 156367 | Mycobacterium liquid culture |
| THP-1 cell line | ATCC, Virginia, USA | ATCC TIB-202 | Macrophage cell culture |
References
- WHO.
- Russell, D. G. Mycobacterium tuberculosis and the intimate discourse of a chronic infection. Immunological Reviews. 240 (1), 252-268 (2011).
- Young, C., Walzl, G., Du Plessis, N. Therapeutic host-directed strategies to improve outcome in tuberculosis. Mucosal Immunology. 13 (2), 190-204 (2020).
- Angeby, K. A., et al. Evaluation of the BacT/ALERT 3D system for recovery and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. Clinical Microbiology and Infection. 9 (11), 1148-1152 (2003).
- Asmar, S., Drancourt, M. Rapid culture-based diagnosis of pulmonary tuberculosis in developed and developing countries. Frontiers in Microbiology. 6, 1184 (2015).
- Diacon, A. H., et al. Time to liquid culture positivity can substitute for colony counting on agar plates in early bactericidal activity studies of antituberculosis agents. Clinical Microbiology and Infection. 18 (7), 711-717 (2012).
- Diacon, A. H., et al. Time to positivity in liquid culture predicts colony forming unit counts of Mycobacterium tuberculosis in sputum specimens. Tuberculosis. 94 (2), Edinburgh. 148-151 (2014).
- O'Sullivan, D. M., et al. Evaluation of liquid culture for quantitation of Mycobacterium tuberculosis in murine models. Vaccine. 25 (49), 8203-8205 (2007).
- Heinrichs, M., et al. Mycobacterium tuberculosis Strains H37ra and H37rv have equivalent minimum inhibitory concentrations to most antituberculosis drugs. International Journal of Mycobacteriology. 7 (2), 156-161 (2018).
- Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (1), 640-645 (2016).
- O'Leary, S. M., et al. Cigarette smoking impairs human pulmonary immunity to Mycobacterium tuberculosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (12), 1430-1436 (2014).
- Ryan, R. C., O'Sullivan, M. P., Keane, J. Mycobacterium tuberculosis infection induces non-apoptotic cell death of human dendritic cells. BMC Microbiology. 11, 237 (2011).
- Keane, J., Remold, H. G., Kornfeld, H. Virulent mycobacterium tuberculosis strains evade apoptosis of infected alveolar macrophages. The Journal of Immunology. 164 (4), 2016-2020 (2000).
- Gao, X. F., Yang, Z. W., Li, J. Adjunctive therapy with interferon-gamma for the treatment of pulmonary tuberculosis: a systematic review. International Journal of Infectious Diseases. 15 (9), 594-600 (2011).
- Thorpe, T. C., et al. BacT/Alert: an automated colorimetric microbial detection system. Journal of Clinical Microbiology. 28 (7), 1608-1612 (1990).
- Gleeson, L. E., et al. Cutting edge: Mycobacterium tuberculosis induces aerobic glycolysis in human alveolar macrophages that is required for control of intracellular bacillary replication. The Journal of Immunology. 196 (6), 2444-2449 (2016).
- O'Connor, G., et al. Inhalable poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles encapsulating all-trans-Retinoic acid (ATRA) as a host-directed, adjunctive treatment for Mycobacterium tuberculosis infection. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 134, 153-165 (2019).
- O'Connor, G., et al. Sharpening nature's tools for efficient tuberculosis control: A review of the potential role and development of host-directed therapies and strategies for targeted respiratory delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 102, 33-54 (2016).
- Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).
- Ortalo-Magne, A., et al. Molecular composition of the outermost capsular material of the tubercle bacillus. Microbiology. 141, Reading. Pt 7 1609-1620 (1995).
- Stokes, R. W., et al. The glycan-rich outer layer of the cell wall of Mycobacterium tuberculosis acts as an antiphagocytic capsule limiting the association of the bacterium with macrophages. Infection and Immunity. 72 (10), 5676-5686 (2004).
- O'Sullivan, M. P., O'Leary, S., Kelly, D. M., Keane, J. A caspase-independent pathway mediates macrophage cell death in response to Mycobacterium tuberculosis infection. Infection and Immunity. 75 (4), 1984-1993 (2007).
- Cheon, S. H., et al. Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 901-907 (2002).
- Nathan, C., Barry, C. E. TB drug development: immunology at the table. Immunological Reviews. 264 (1), 308-318 (2015).
- Bowness, R., et al. The relationship between Mycobacterium tuberculosis MGIT time to positivity and cfu in sputum samples demonstrates changing bacterial phenotypes potentially reflecting the impact of chemotherapy on critical sub-populations. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (2), 448-455 (2015).
- Basu Roy, R., et al. An auto-luminescent fluorescent BCG whole blood assay to enable evaluation of paediatric mycobacterial responses using minimal blood volumes. Frontiers in Pediatrics. 7, 151 (2019).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000645 (2009).
- Franzblau, S. G., et al. Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis. 92 (6), Edinburgh. 453-488 (2012).
