Summary
Vi beskriver en disseksjonsteknikk som bevarer arkitekturen til det nevromuskulære krysset og muliggjør en detaljert immunocytokjemisk studie av motoriske nevroner i det voksne Drosophila-beinet .
Abstract
Drosophila melanogaster representerer en genetisk gjennomførbar modell for å studere nevronstruktur og funksjon, og etterfølgende endringer i sykdomstilstander. Det godt karakteriserte larval neuromuskulære krysset brukes ofte til slike studier. Imidlertid gjør rask larvalutvikling etterfulgt av muskel histolyse og nervesystem ombygging under metamorfose denne modellen problematisk for studiet av langsomme aldersavhengige degenerative endringer som de som forekommer i amyotrofisk lateral sklerose. Alternativt lever voksne fluer i 90 dager, og voksenbenet kan brukes til å studere motoriske nevronforandringer i løpet av voksen levetid ved hjelp av in vivo fluorescerende avbildning gjennom kutiklet. Her beskriver vi en ben disseksjonsteknikk kombinert med immunocytokjemi, noe som gjør det mulig å studere molekylære endringer ved det nevromuskulære krysset av identifiserte voksne benmotoriske nevroner. Disse teknikkene kan kombineres med et utall antistoffer som merker både pre- og postsynaptiske strukturer. Sammen tillater disse prosedyrene en mer fullstendig karakterisering av langsomme aldersavhengige endringer i voksne fluer og kan brukes på tvers av flere motoriske nevronsykdomsmodeller.
Introduction
Motor neuron (MN) sykdommer omfatter en gruppe heterogene forhold som inkluderer progressiv degenerasjon som fører til muskelsvømt og lammelse som en primær klinisk fenotype1. Selv om denne prevalensen er sjelden med en global prevalens på 4,5 per 100 000, forventes denne prevalensen å øke med en aldrende befolkning2. Amyotrofisk lateral sklerose (ALS) er den vanligste MN-sykdommen (MND) og er vanligvis dødelig innen kort tid etter diagnosen uten eksisterende sykdomsmodifiserende behandlinger tilgjengelig3. MND-er deler til felles en langvarig presymptomatisk fase med tidlige molekylære biomarkørendringer og funksjonelle bildeendringer sett hos pasienter4. Tidlig presymptomatisk cellulær patologi observeres også i ikke-menneskelige sykdomsmodeller5,6,7,8. Studiet av tidlige endringer ved det nevromuskulære krysset er viktig for å forstå MN sykdom patogenese og kan bidra til å utvikle tidlig diagnostikk og potensielle terapeutiske stoffer.
Et vell av genetiske og molekylære verktøy finnes i Drosophila for å dissekere strukturen og funksjonen til det nevromuskulære krysset (NMJ, se9 for en gjennomgang av den godt karakteriserte larval NMJ). Disse verktøyene kombinert med kort levetid gjør Drosophila til en utmerket modell for å studere nevrodegenerative endringer ved NMJ. Spesielt MNs innervating voksne muskler er til stede gjennom ~ 90-dagers voksen levetid og er utsatt for normale aldringsprosesser10,11,12,13. De voksne MN-ene gir derfor en mulighet til å studere langsomme degenerative endringer i motsetning til larval NMJs som eksisterer i bare en kort ~ 1 ukes tidsperiode før metamorfose14,15.
Her beskriver vi en disseksjonsprosedyre som lar oss utføre immunocytokjemisk analyse av MN-er i voksenbenet. Hvert voksenben er innervated av ~ 50 MNs, som synapse på tilhørende ben muskuløs for å drive bevegelse. Benanatomi, mekanisk fysiologi og nevrobiologi er godt beskrevet16,17,18. Axon arbors av ben MNs har tidligere vært preget av avbildning gjennom kutikal i bakfylte eller genetisk merkede cellepopulasjoner ved hjelp av bipartite Gal4 / UAS-systemet og avbildningsmetoder har blitt publisert tidligere19. Disseksjonsmetodene som presenteres her bevarer axonforgreningsmorfologi og lar oss utnytte et mangfoldig spekter av antistoffer for å merke forskjellige molekylære komponenter i NMJ. Vårt tidligere arbeid har fokusert på projeksjoner av et definert MN i metathoracic (3rd) benet, som innervates tibia levator muskel (tilm) og viser konsistente arborization mønstre og bouton tall. I utgangspunktet studerte vi aldersavhengige endringer i Drosophila superoksid dismutase 1 (dsod1) mutanter og fant endringer i samsvar med demontering av NMJ20. Disse disseksjonsmetodene gir mulighet til bedre å karakterisere langsomme degenerative endringer ved NMJ for andre ALS-modeller, grunnleggende studier av aldring og andre MN-tilknyttede sykdommer.
Figur 1. Arbeidsflytsammendrag for dissekering av ben. Se protokoll for detaljerte trinn. (A,B) Fluer velges og bedøves. (C) Fluer overføres til metanol og vaskes med PBS. (D) Metathoracic bena fjernes ved foten av coxa mens visualisert med et dissekering mikroskop (~ 30x forstørrelse); skala bar = 500 μm. (E) Bena festes deretter i 3,7% formaldehyd/PBS (FA)-løsning i 30 minutter i brønner på 24-brønnsplater og deretter fjernes FA ved vask med PBS. (F, G, H) Ben overføres til silikon elastomer dissekering skuffer og et stykke kutikal blir fjernet fra den proksimale lårbenet ved hjelp av skrå tang mens visualisert under et dissekering mikroskop ved 80x; skala bar = 50 μm. (I) Benene er post-disseksjon fikset i FA og vasket i PBS og deretter PBT (PBS + 0,1% ikke-ionisk overflateaktivt middel). (J) Ben utsettes for immunocytokjemisk farging. (K,L) Ben overføres til en glasssklie, ryddes i monteringsmedier og dekkes med en deksler som inneholder leire avstandsstykker; skalastenger = 2 mm og 500 μm. (M) Ben er avbildet ved konfektmikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Protocol
Fremgangsmåtene for å klargjøre arbeidsløsninger som brukes sammen med denne protokollen, er beskrevet i tabell 1.
| Reagent | Forberedelse | Lagring | |||
| PBS | Lag et arbeidslager på 1x PBS fra en 10x PBS lagerløsning ved å fortynne i destillert vann. pH på den fungerende PBS-aksjen skal være 7,2-7,4 | 4 °C i 1+ måneder til bakteriell forurensning er synlig. | |||
| PBT | 1x PBS-oppløsning med 0,1 % ikke-ionisk overflateaktivt middel. | 4 °C i 1+ måneder til bakteriell forurensning er synlig. | |||
| FA | 3,7% formaldehydløsning laget av en 37% formaldehydbestand og fortynnet i 1x PBS. | Romtemperatur. Gjør fersk hver dag med disseksjon | |||
| FORSIKTIG: Formaldehyd som leveres som 37% lagerløsning er et potensielt kreftfremkallende middel og bør fortynnes i en avtrekkshette. | |||||
| 5% NGS | 5% normalt geitserum fortynnet i PBT. Serumet som brukes, bør samsvare med arten av det sekundære antistoffet som skal brukes. | 4 °C i flere uker til bakteriell forurensning er synlig | |||
Tabell 1. Løsninger for å utføre immunocytokjemi av det voksne Drosophila-beinet .
1. Innledende fiksering av vev
- Velg omtrent 10 fluer for hver genotype og alder. Bedøv på en flypute under karbondioksid (figur 1A, B).
MERK: Begynn med flere fluer enn nødvendig for å sikre en stor nok prøvestørrelse etter disseksjon. - Bruk en pensel, overfør fluer til kald metanol i en glassbrønn eller tallerken i ca. 30 sekunder til 1 minutt (figur 1C). Metanol solubiliserer cuticular hydrokarboner og fluer kan nå nedsenkes i stedet for å flyte i vandige løsninger.
- Med tang overfører du forsiktig fluer til PBS. Skyll 3x i iskald PBS for å fjerne overflødig metanol og hold fluer i PBS på is til avhandling og fiksering. På dette tidspunktet flyr dissekerer og fikser innen kortest mulig tid (<30 minutter).
- For å isolere bena, overfør fluer til en silikon elastomer disseksjonsfat fylt med kald PBS, fjern metathoracic bena på coxa ved hjelp av to par #5 Dumont tang eller kutt bena med Vanna saks (Figur 1D). Overfør bena til en brønn i en brønnplate av plast 24 fylt med 1 ml PBS og hold platen på is til alle bena er fjernet og overført til brønner.
MERK: Hver brønn kan holde minst 20 ben. - Bytt ut PBS-oppløsningen med 1 ml FA-oppløsning og roter på en mutter i 30 minutter (figur 1E). Mutterinnstilling bør stilles inn med middels hastighet (17 o/min). Forsikre deg om at bena er helt nedsenket i FA-løsning i løpet av denne tiden for tilstrekkelig fiksering.
- For å fjerne FA-oppløsningen, vask i 1 ml PBS 3x raskt etterfulgt av ytterligere 3 vasker i 5 minutter hver i 1 ml PBS. Hold vev i 1 ml PBS på is før, og under disseksjonstrinnene beskrevet nedenfor.
2. Fjerne ben cuticle og antistoff farging
- Fjerne benet kutikalle
- Dissekerings tang er avgjørende for å lykkes. Introduser små parallelle bøyninger i begge pinnene på slutten av #5 super fine tang for å gi en skråkant som gjør at kutiklet kan gripes overfladisk i stedet for å bli stikket, noe som kan ødelegge vevet (figur 1F, G).
MERK: Pinnene som bøyes parallelt, bør fortsatt komme i kontakt med hverandre gjennom hele lengden på stiften når de er lukket (figur 2). - Overfør bena til en silikonelastomerfat i PBS for disseksjon. Plasser et ben slik at den fremre siden vender opp (se figur 3 for informasjon om benanatomi og orientering). Bruk ett par tang, hold tibiasegmentet mot silikonelastomerfatet. Bruk de andre tangene holdt skråsiden ned, ta et stykke kutikal på den distale enden av lårbenet og trekk i den proksimale retningen mot trochanteren.
- Hold metodisk fjerne kutikal til den nakne muskelen er synlig gjennom den proksimale enden av lårbenet (figur 1F, G, H).
MERK: Ta kun overfladisk kontakt med bena ved hjelp av den skrå sidene av tangene for å unngå å trekke muskler. - Når alle bena er dissekert, erstatt PBS med FA for å etterfikse bena i 30 minutter med risting på en mutter på middels hastighet (figur 1I). Vask prøver i 1 ml PBS i 3 ganger raskt og deretter 3 ganger i 5 minutter hver i PBT (figur 1J).
MERK: Hvis farging med monoklonalt antistoff NC82 (anti-bruchpilot) for å merke aktive soner, etterretting i 20 minutter, da dette antigenet er følsomt for lengre fikseringer.
- Dissekerings tang er avgjørende for å lykkes. Introduser små parallelle bøyninger i begge pinnene på slutten av #5 super fine tang for å gi en skråkant som gjør at kutiklet kan gripes overfladisk i stedet for å bli stikket, noe som kan ødelegge vevet (figur 1F, G).
Figur 2. Modifiserte tang som brukes til dissekering av voksne ben. (A) Endene på tangene er bøyd og deretter flatt i bunnen (pilen) og skaper en skråkant ved å arkivere på en skarp stein. (B) Derimot er pinnene av umodifiserte tang ikke bøyd. Skalastang = 1 mm Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Antistofffarging
- For å blokkere vev for antistofffarging, erstatt 1 ml PBT med blokkeringsløsning som består av 1 ml 5% NGS fortynnet i PBT. Inkuber dissekerte ben i 4 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 °C mens du gynger på en mutter ved middels hastighet (17 o/min). Under alle inkubasjoner dekker du brønner med tetningstape i tillegg til plastdekselet (figur 1J).
MERK: 24 brønnplater brukes til immuncytokjemi i stedet for 1,5 ml eller 2 ml mikrosenter fordi tidligere forsøk på å bruke mikrocentrifugerør resulterte i brukne ben og skadet vev. - Fjern blokkeringsløsningen og tilsett 300 ml primære antistoffer fortynnet i fersk blokkeringsløsning. Det lille volumet av antistoff som brukes bør være tilstrekkelig til å dekke vevet. Forsegle brønner på nytt med laboratorieforseglingstape og plastlokk og inkuber over natten ved 4 °C med risting på en mutter ved middels hastighet (figur 1J). Informasjonen og konsentrasjonen av virkestoffreagens som brukes i disse studiene er beskrevet i tabell 2.
- Vask primære antistoffer i 1 ml PBT i 3 ganger kort og deretter 3 ganger i 15 minutter hver (figur 1J).
MERK: Fortynnede primære antistoffer kan lagres og gjenbrukes hvis de oppbevares ved 4 °C i opptil 2 uker. - Blokker vev igjen i 1 ml 5 % NGS i minst 2 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 C (figur 1J).
- Fjern den 5% NGS-blokkeringsløsningen og tilsett 300 μL av de aktuelle fortynnede fluorescerende konjugiserte sekundære antistoffene. I tillegg legger du til 1:2000 fortynning av fluorescenskonjugert falloidin for å merke muskler (figur 1J).
- For sekundære antistoffinkubasjoner, tetningsbrønner med laboratorieforseglingstape og lokk. Vikle også plater i aluminiumsfolie for å beskytte fluoroforer mot lys. Inkuber i 6-8 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 °C.
- Vask sekundære antistoffer og falloidin som beskrevet i trinn 2.2.3 ovenfor. Dekkplater med aluminiumsfolie mellom vasker for å beskytte fluoroforer mot lys.
- For å blokkere vev for antistofffarging, erstatt 1 ml PBT med blokkeringsløsning som består av 1 ml 5% NGS fortynnet i PBT. Inkuber dissekerte ben i 4 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 °C mens du gynger på en mutter ved middels hastighet (17 o/min). Under alle inkubasjoner dekker du brønner med tetningstape i tillegg til plastdekselet (figur 1J).
3. Montering av ben
- Overfør bena til et lysbilde ved hjelp av tang og orienter fremre side opp. Dekk bena med monteringsmedier (figur 1K, L).
MERK: De dissekerte beina kan aspireres med en P1000 pipettespiss hvis bunnboret utvides ved å kutte med et barberblad. - Tilsett leire avstandsstykker til en 22x22 mm2 coverlip (#1,5 tykkelse) ved å skrape dekslene over en liten ball av modellering leire. Hvert hjørne skal ha en liten mengde leire 1-2 mm tykk (figur 1K).
- For å dekke lysbildet, legg til dekslene med leire avstandsstykkene vendt mot lysbildet og skyv forsiktig på hjørnene til dekslene bare berører overflaten av lårbenet.
- For å forhindre fordampning, forsegle kantene på dekslene med neglelakk og la tørke på et mørkt sted (ca. 10 minutter) før du lagrer ved 4 °C til avbildning.
4. Bildebehandling
- Bilde av konfokalt mikroskop (figur 1M). Inkluder en overført lyskanal for bedre å vurdere kvaliteten på disseksjonen og prøver med synlig forstyrrede muskelfibre i interesseområdet bør kastes.
- Begynn å bilde z-stabler med 20x forstørrelse med 2x zoom og en total bildedybde på ~ 40 mm tilsvarende tykkelsen på lårbenet. For fluorescerende signaldeteksjon, ta bilder med oppløsninger som samsvarer med Nyquist-sampling (vi bruker 1024 x 1024 piksler med en dvelende innstilling på 8-10 μs / piksel). Signalintensiteten skal være i det lineære området som oppnås ved å justere innstillingene for høyspenningsforsterkning. Når forsterkningsinnstillingene er angitt for en serie prøver i et eksperiment, bør de ikke endres slik at signalintensiteter kan sammenlignes mellom prøver.
- For synaptiske kamper og annen subcellulær struktur kan du ta konfiskeringsbilder ved ≥60x forstørrelse. Detektorinnstillingene skal være i det lineære området, mens pikseltettheten, oppholdsinnstillingene og z-dybden skal være like for bilder som er tatt med lavere forstørrelse (trinn 4.1).
Representative Results
Figur 4 viser et representativt eksempel på et metathoracic ben farget med anti-hrp, anti-dlg og falloidin. For disseksjoner som fjerner kutikol fra den proksimale delen av lårbenet, vil stereotype arbors være tydelige nær senen som oppdages lett ved autofluorescence. Vær oppmerksom på at antistoffinntrengning i beinet oppstår i kort avstand utenfor regionen der kutiklet er fjernet (figur 4A). Disse regionene kan forbildes effektivt når sterkt fluorescenssignal er til stede. Bildebehandling ved lav forstørrelse (20x med 2x zoom) gir en enkel bestemmelse på 1) hvor mye kutiklet som fjernes, og 2) om skaden oppstod under disseksjonen. Økt forstørrelse (60x) viser stereotype projeksjoner på tilm (figur 4B). Vårt arbeid har fokusert på en MN, sannsynligvis avledet fra I- MN-avstammingen som innervate tilm i proksimal femur (boks, figur 4B og figur 4C). Hvis du øker forstørrelsen ytterligere (100x med 2x zoom), muliggjør effektiv visualisering av synaptiske boutons (figur 4D).
For å studere morfologiske endringer ved den voksne NMJ over tid, har vi tidligere brukt dsod1 mutanter som modell av ALS. Bouton hevelse forekommer hos alderen dsod1H71Y mutanter i forhold til dsod1nullog dsod1+ (Figur 5A, B). Ved larval NMJ brukes monoklonalt antistoff NC82 ofte til å merke aktive soner, og disse strukturene kan lett visualiseres ved den voksne NMJ (figur 5C). Svakt positive HRP axon grener er rikelig i dsod1H71Y mutanter og disse grenene viser ofte svak og diffus BRP lokalisering (piler).
Viktig for nevrodegenerasjon, kommersielt tilgjengelige antistoffer kan oppdage allestedsnærværende proteiner som ofte finnes i aggregater, og vi har oppdaget allestedsnærværende aggregater innen terminale axoner av MNer i alderen mutant dsod1 fluer så vel som innenfor muskel (Figur 6A). Antistoffer som merker mitokondrier kan også oppdage morfologiske endringer med alderen (figur 6B).
For noen preparater gjør muskelskader under disseksjonen prøven ubrukelig. I begynnelsen kan slik skade være en vanlig forekomst, men forbedring skjer med praksis. Eksempler på gode disseksjoner er figur 7A, C , mens dårlige disseksjoner er vist i figur 7B, D. Dårlige disseksjoner forårsaker uorganisering av muskelfibre som påvises ved fasekontrastmikroskopi (figur 7B) eller manglende muskelfibre visualisert av fluorescerende konjugert falloidin (figur 7D, pil). Kombinasjonen av å bruke falloidin til å merke muskler, og overførte lysbilder kan bidra til å oppdage slike muskelskader som kanskje ikke er tydelige når du ser under et dissekerende mikroskop.
Figur 3. Anatomien til Drosophila-beinet . (A) Diagram over den fremre siden av et metathoracic ben, preget av tilstedeværelsen av børster i motsetning til den fremtredende nakne kutikulære tilstede på bakre side. Det segmenterte benet består av coxa (Cx), trochanter (Tr), lårben (Fe), tibia (Ti), 5 tarsale segmenter (Ta1-5) og klo (Cl) i rekkefølge fra proksimal (Pr) til distal (Di). Dorsale (D) og ventrale (V) sider av lårbenet er også indikert. Skalalinje =100 μm. (B) Diagram over lårbenet som inneholder tibia levator (tilm), tibia depressor (tidm), lang sene muskel 2 (ltm2) og tibia reductor (tirm) muskler og axon projeksjoner i proksimal femur innervering tilm. Disse stereotype axonale projeksjonene antas å være avledet fra I-lineage neuroblaster16, og den andre arboriseringen er den enkleste å få tilgang til ved disseksjon (bokset). Skalastang = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Dissekert metathoracic femur avslørte stereotyp mn arkitektur innervering tilm. Immunocytokjemi ble brukt til å markere nevroner (HRP), plater-store (DLG) og muskel (falloidin). Z-stabler ble fanget opp av konfokal mikroskopiavbildning gjennom hele lårbenet og vist som en maksimal serieprojeksjon. (A) En overført lyskanal ble også inkludert for å illustrere at det ikke oppstod noen påviselig muskelskade under disseksjonen. Bildet ble tatt med 20x forstørrelse, skalalinje = 50 μm. (B) Identifiserte arbors knyttet til tilm (boxed area, center), skala bar = 20 μm; og (C) ved 60x forstørrelse, skala bar = 20 μm. (D) DLG omkringliggende boutons var tydelig i vill type dyr når avbildet ved 100x forstørrelse med 2x zoom; skala bar = 2 μm Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5. Eksempel på aldersavhengige endringer i boutonmorfologi som kan oppdages ved hjelp av ben disseksjonsteknikken. Bouton hevelse er sett i alderen dsod1H71Y mutanter. (A) Representative bilder av HRP fargede boutons fra unge (nylig eclosed, dag 0 voksne) og gamle (dag 10) fluer, skala bar = 1 μm. (B) Bouton-størrelser ble kvantifisert fra respektive genotyper ved hjelp av målefunksjonen i ImageJ. p<0.0001 (2-veis ANOVA med post-hoc Tukey-test). (C) Aktive soner innen synaptiske boutons merket med monoklonalt antistoff NC82 (anti-bruchpilot); skala bar = 1 μm. Figur endret fra20Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6. Vanlige markører forbundet med nevrodegenerativ sykdom som brukes i Drosophila benpreparater. (A) Subcellulære polyubiquitinerte aggregater oppdages i terminalaksoner og muskler i alderen dsod1H71Y fluer. Immunocytokjemi ved bruk av antipolyubiquitin (FK2) oppdager puncta (piler) i alderen dsod1H71Y/H71Y, skalastang = 20 μm (venstre) og 5 μm (høyre). (B) Hovne mitokondrier kan påvises ved hjelp av anti-ATP5A, skala bar = 1 μm. Figur endret fra20Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7. Eksempler på gode og dårlige disseksjoner. (A) Disseksjon som ikke forstyrret den underliggende muskelarkitekturen. (B) Et eksempel på en dårlig disseksjon som viste frynsete muskelfibre (pil) og ikke kunne brukes til analyse. Begge prøvene ble avbildet ved fasekontrastmikroskopi. Skalastang = 50 μm. (C) Eksempel på en god disseksjon avbildet ved konfektmikroskopi med HRP (grønn) og falloidin (blå). (D) En dårlig disseksjon mangler dorsale muskelfibre av TILM mangler (pil). Skalalinje = 50 μm Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Antistoff/flekk | Fortynning* |
| Anti-ATP5A | 1:500 |
| Anti-bruchpilot (nc82) | 1:20 |
| Anti-cystein streng protein (ab49) | 1:50 |
| Anti-plater store (4F3) | 1:200 |
| Anti-hrp | 1:550 |
| Anti-polyubiquitin (FK2) | 1:1000 |
| Anti-repo (8D12) | 1:5 |
| Geit anti-mus sekundær antistoff | 1:800 |
| Falloidin | 1:2000 |
| * Fortynn i 5% NGS |
Tabell 2. Antistoffer og fortynning. De kommersielle leverandørene av antistoffene som brukes i disse studiene er oppført i materiallisten.
Discussion
Drosophila voksenben er en ideell modell for å studere nevrodegenerasjon gitt relativ enkelhet med godt karakteriserte MNer kartlagt fra nevroblastomavledninger og stereotype arboriseringsmønstre. Flere rapporter har tidligere brukt ben-MN-er til studiet av nevrodegenerativ sykdom21,22. Disse studiene benyttet GFP-uttrykkende linjer kombinert med mosaikkanalyse med en trykkbar cellemarkør (MARCM) for å bilde gjennom kutiklet og dokumenterte en rekke morfologiske endringer. Avbildning av voksne NMJs ved immunocytokjemi med resected kutikol muliggjør ytterligere karakterisering med evnen til å spore komplekse molekylære endringer ved hjelp av en verktøykasse med antistoffer tilgjengelig.
Immunocytokjemidelen av denne protokollen er relativt standard og kan implementeres uavhengig av genotype (se23 for en utmerket beskrivelse av generelle antistofffargingsmetoder for bruk med Drosophila). Videre kan parametere som fluorescensintensitet, axongrenslengde og boutontall og -størrelse bestemmes ved hjelp av en rekke tilgjengelige ImageJ-makroer når bilder er tatt og detaljerte metoder for kvantitativ analyse er publisert (for eksempel se24,25,26). Dermed er disseksjonsteknikken den viktigste innovasjonen som er beskrevet her. Før disseksjonen nedsenkes fluer i en alkohol for å fjerne kuperte hydrokarboner. Både etanol og metanol brukes ofte til dette formålet; Vi har imidlertid bare brukt metanol. Kritisk for disseksjonssuksess er flere faktorer: For det første gir bruk av modifiserte tang med skråkant svært overfladisk kontakt med kutiklet. For det andre, ved hjelp av et dissekerende mikroskop som er i stand til 60-100x total forstørrelse slik at overflaten av kutiklet er tydelig synlig. For mikroskoper med lavere maksimal forstørrelse er 2x mål tilgjengelige for de fleste vanlige merker og bør være tilstrekkelig når de kombineres med eksisterende linser. For det tredje gjør det første fikseringstrinnet kutikal sprø og lettere å trekke seg bort uten å skade muskelen under. Overfiksering på dette trinnet gjør hele benet for stivt for effektiv avhandling. Derfor bør den første fikseringen begrenses til 30 minutter. Formaldehydfiksiven vil ikke trenge inn i nok til effektivt å krysskoble det underliggende vevet i løpet av denne korte perioden, og dermed er det nødvendig med et nytt fikseringstrinn. Før den andre fikseringen bør vev holdes på is for å forhindre nedbrytning og endringer i morfologi. For det fjerde har vi funnet dissekeringsprøver mens kulde også er viktig, sannsynligvis av lignende grunner ved at kutiklet er sprøtt og et lite stykke lettere kan fjernes.
Med praksis finner vi at ~ 50% av disseksjonene vil være brukbare uten merkbar vevsskade. Selv om denne prosentandelen kan virke lav i forhold til noen andre vev, er disseksjonsprosedyren rask, og mange ben kan behandles på 30-60 minutter. Derfor, selv om suksessratene er lave i utgangspunktet, er det mulig å få 4-5 gode prøver for hver eksperimentell gruppe. En begrensning kan imidlertid være antall fluer som er tilgjengelige til enhver tid hvis genotyper og/eller alder resulterer i betydelig dødelighet.
En annen begrensning er at vi ikke har vært i stand til å dissekere andre områder av beinet utover den proksimale regionen av lårbenet på grunn av størrelse. Dermed kan vi studere identifiserte MN arbors innervating TILM pålitelig, og det er mulig å dissekere kutikalle over tibia depressor muskel med små endringer i måten beinet er orientert når dissekering. Tilgang til andre regioner i beinet har imidlertid vist seg vanskeligere uten å forstyrre axonal arkitektur under disseksjon.
Her presenterer vi disseksjonsmetoder for å oppdage endringer ved den voksne NMJ for definerte MN-er som innerverer tilm ved hjelp av immunocytokjemi. Benet er nyttig som et enkelt system, innervated av bare ~ 50 MNs og inneholder 14 muskler med godt beskrevet anatomi. Dissekert benforberedelse kan brukes på tvers av genotyper, og en rekke antistoffer er tilgjengelige for NMJ-visualisering uten behov for å bygge genotypisk komplekse lagre av reportergenkonstruksjoner i mutantbakgrunn. Denne tilnærmingen vil muliggjøre en mer detaljert karakterisering av endringer ved NMJ for MN-sykdommer og andre aldersrelaterte tilstander.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Eric Roberts for råd om bildebehandling. Vi ønsker også å takke Information Technology Services på Rhode Island College og spesielt Michael Caine og Jake Douglas for videografi. Monoklonale antistoffer anti-dlg og anti-brp ble utviklet av henholdsvis UC-Berkeley og Universitaetsklinikim Wuerzburg, og ble hentet fra Developmental Studies Hybridoma Bank, opprettet av NICHD av NIH og vedlikeholdt ved University of Iowa, Department of Biology, Iowa City, IA 52242, USA. Forskningen som ble rapportert her ble støttet fullt ut av Rhode Island Institutional Development Award (IDeA) Network of Biomedical Research Excellence fra National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under tilskuddsnummer [P20GM103430].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP3991 | |
| 24 well plates | Corning | 3473 | Hydrophobic, ultra-low attachment surface |
| 2x objective accessory | Olympus | 110AL2X | Screw-on attachment |
| Anti-ATP5A primary antibody | Abcam | ab14748 | Mouse monoclonal |
| Anti-bruchpilot primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Mouse monoclonal |
| Anti-discs large primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | Mouse monoclonal |
| Anti-hrp primary antibody | Jackson Immuno Research | 123-605-021 | Alexa Fluor 647 conjugated polyclonal |
| Anti-polyubiquitin (FK2) primary antibody | Millipore Sigma | 04-263 | Mouse monoclonal |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Objectives (NA): 10x (0.4), 20x (0.85), 40x (1.20), 60x (1.42), 100x (1.40) |
| Coverslips | Corning | 285022 | 160-190 mm thickness |
| Dissecting forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Dumont #5SF |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | 37% stock stabilized with methanol |
| Goat anti-mouse secondary antibody | Jackson Immuno Research | 115-545-146 | Alexa Fluor 488 conjugated |
| Goat Serum | Novus Biologicals | NB036768 | 0.2 mm filtered |
| Laboratory sealing tape | Fisher Scientific | 03-448-254 | Parafilm M |
| Methanol | Fisher Scientific | A413 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | 76mm x 25mm |
| Mounting media | Molecular Probes | S36972 | Slowfade Diamond mounting media |
| Nonionic surfactant | Acros Organics | 215680010 | Triton-X 100 |
| Nutator | Fisher Scientific | S06622 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A34055 | Alexa Fluor 555- conjugated |
| Sharpening stone | Fine Science Tools | 29008-01 | |
| Silicone elastomer | Electron Microscopy Sciences | 2423610 | Sylgard 184 |
References
- McDermott, C. J., Shaw, P. J. Diagnosis and management of motor neurone disease. BMJ. 336 (7645), 658-662 (2008).
- Global Collaborators, G. B. D. M. N. D. Global, regional, and national burden of motor neuron diseases 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 17 (12), 1083-1097 (2018).
- Foster, L. A., Salajegheh, M. K. Motor Neuron Disease: Pathophysiology, Diagnosis, and Management. American Journal of Medicine. 132 (1), 32-37 (2019).
- Bede, P., Pradat, P. F. Editorial: Biomarkers and Clinical Indicators in Motor Neuron Disease. Frontiers in Neurology. 10, 1318 (2019).
- Clark, J. A., Southam, K. A., Blizzard, C. A., King, A. E., Dickson, T. C. Axonal degeneration, distal collateral branching and neuromuscular junction architecture alterations occur prior to symptom onset in the SOD1(G93A) mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Chemical Neuroanatomy. 76, 35-47 (2016).
- Martineau, E., Di Polo, A., Van de Velde, C., Robitaille, R. Dynamic neuromuscular remodeling precedes motor-unit loss in a mouse model of ALS. Elife. 7, (2018).
- Shahidullah, M., et al. Defects in synapse structure and function precede motor neuron degeneration in Drosophila models of FUS-related ALS. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19590-19598 (2013).
- Tremblay, E., Martineau, E., Robitaille, R. Opposite Synaptic Alterations at the Neuromuscular Junction in an ALS Mouse Model: When Motor Units Matter. Journal of Neuroscience. 37 (37), 8901-8918 (2017).
- Harris, K. P., Littleton, J. T. Transmission, Development, and Plasticity of Synapses. Genetics. 201 (2), 345-375 (2015).
- Beramendi, A., Peron, S., Casanova, G., Reggiani, C., Cantera, R. Neuromuscular junction in abdominal muscles of Drosophila melanogaster during adulthood and aging. Journal of Comparative Neurology. 501 (4), 498-508 (2007).
- Banerjee, S., et al. Miniature neurotransmission is required to maintain Drosophila synaptic structures during ageing. Nature Communications. 12 (1), 4399 (2021).
- Liao, S., Broughton, S., Nassel, D. R. Behavioral Senescence and Aging-Related Changes in Motor Neurons and Brain Neuromodulator Levels Are Ameliorated by Lifespan-Extending Reproductive Dormancy in Drosophila. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 111 (2017).
- Mahoney, R. E., Rawson, J. M., Eaton, B. A. An age-dependent change in the set point of synaptic homeostasis. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2111-2119 (2014).
- Fernandes, J. J., Keshishian, H.
- Truman, J. W. Metamorphosis of the central nervous system of Drosophila. Journal of Neurobiology. 21 (7), 1072-1084 (1990).
- Baek, M., Mann, R. S. Lineage and birth date specify motor neuron targeting and dendritic architecture in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 29 (21), 6904-6916 (2009).
- Enriquez, J., et al. Specification of individual adult motor neuron morphologies by combinatorial transcription factor codes. Neuron. 86 (4), 955-970 (2015).
- Soler, C., Daczewska, M., Da Ponte, J. P., Dastugue, B., Jagla, K. Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg. Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).
- Guan, W., Venkatasubramanian, L., Baek, M., Mann, R. S., Enriquez, J. Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle. Journal of Visualized Experiments. (140), e58365 (2018).
- Agudelo, A., et al. Age-dependent degeneration of an identified adult leg motor neuron in a Drosophila SOD1 model of ALS. Biology Open. 9 (10), (2020).
- Fernius, J., Starkenberg, A., Thor, S. Bar-coding neurodegeneration: identifying subcellular effects of human neurodegenerative disease proteins using Drosophila leg neurons. Disease Models & Mechanisms. 10 (8), 1027-1038 (2017).
- Sreedharan, J., Neukomm, L. J., Brown, R. H., Freeman, M. R. Age-Dependent TDP-43-Mediated Motor Neuron Degeneration Requires GSK3, hat-trick, and xmas-2. Current Biology. 25 (16), 2130-2136 (2015).
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods in Cell Biology. 44, 445-487 (1994).
- Guirado, R., Carceller, H., Castillo-Gomez, E., Castren, E., Nacher, J. Automated analysis of images for molecular quantification in immunohistochemistry. Heliyon. 4 (6), 00669 (2018).
- Castells-Nobau, A., et al. Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology. Journal of Visualized Experiments. (123), e55395 (2017).
- Brown, J. R., Phongthachit, C., Sulkowski, M. J. Immunofluorescence and image analysis pipeline for Drosophila motor neurons. Biology Methods and Protocols. 4 (1), (2019).
