Summary
Vi beskriver en dissekering teknik som bevarar arkitekturen i neuromuskulära korsningen och möjliggör en detaljerad immunocytochemical studie av motor nervceller i vuxna Drosophila ben.
Abstract
Drosophila melanogaster representerar en genetiskt dragbar modell för att studera neuronal struktur och funktion, och efterföljande förändringar i sjukdomstillstånd. Den väl karakteriserade larven neuromuskulära korsningen används ofta för sådana studier. Snabb larvutveckling följt av muskel histolys och nervsystemet ombyggnad under metamorfos gör dock denna modell problematisk för studier av långsam åldersberoende degenerativa förändringar som de som förekommer i amyotrofisk lateral skleros. Alternativt lever vuxna flugor i 90 dagar och det vuxna benet kan användas för att studera motoriska neuronförändringar under vuxenlivslängden med hjälp av in vivo fluorescerande avbildning genom nagelbandet. Här beskriver vi en ben dissekering teknik i kombination med immunocytochemistry, som möjliggör studier av molekylära förändringar vid neuromuskulära korsningen av identifierade vuxna ben motor nervceller. Dessa tekniker kan kombineras med en myriad av antikroppar som märker både pre- och postsynaptiska strukturer. Tillsammans tillåter dessa förfaranden en mer fullständig karakterisering av långsamma åldersberoende förändringar hos vuxna flugor och kan tillämpas över flera motoriska neuron sjukdomsmodeller.
Introduction
Motor neuron (MN) sjukdomar omfattar en grupp heterogena villkor som inkluderar progressiv degeneration leder till muskelförtrining och förlamning som en primär klinisk fenotyp1. Även om det är sällsynt med en global prevalens på 4,5 per 100 000, förväntas denna prevalens öka med en åldrande befolkning2. Amyotrofisk lateral skleros (ALS) är den vanligaste MN-sjukdomen (MND) och är vanligtvis dödlig inom en kort tid efter diagnos utan befintliga sjukdomsmodifierande behandlingar tillgängliga3. MNDs delar gemensamt en utdragen presymtomatisk fas med tidiga molekylära biomarkörförändringar och funktionella bildframställningsförändringar som ses hos patienter4. Tidig presymtomatisk cellulär patologi observeras också i icke-mänskliga sjukdom modeller5,6,7,8. Studien av tidiga förändringar vid den neuromuskulära korsningen är viktigt för att förstå MN sjukdom patogenes och kan bidra till att utveckla tidig diagnostik och potentiella terapier.
En mängd genetiska och molekylära verktyg finns i Drosophila för att dissekera strukturen och funktionen hos den neuromuskulära korsningen (NMJ, se9 för en översyn av den väl karakteriserade larven NMJ). Dessa verktyg i kombination med en kort livslängd gör Drosophila till en utmärkt modell för att studera neurodegenerativa förändringar vid NMJ. Specifikt är MNs innervating vuxna muskler närvarande under hela ~ 90-dagars vuxen livslängd och är föremål för normala åldrandeprocesser10,11,12,13. De vuxna MN ger därför en möjlighet att studera långsamma degenerativa förändringar i motsats till larv NMJs som bara finns under en kort ~ 1 veckas tidsperiod före metamorfos14,15.
Här beskriver vi en dissekering förfarande som gör det möjligt för oss att genomföra immunocytochemical analys av MNs i vuxna benet. Varje vuxen ben är innervated av ~ 50 MNs, som synapse på det associerade benet muskulös för att driva rörelse. Benet anatomi, mekanisk fysiologi och neurobiologi har beskrivits väl16,17,18. Axon arbors av ben-MNs har tidigare kännetecknats av avbildning genom nagelband i ryggfyllda eller genetiskt märkta cellpopulationer med hjälp av bipartite Gal4/UAS-systemet och avbildningsmetoder har publicerats tidigare19. De dissekeringsmetoder som presenteras här bevarar axon förgrening morfologi och tillåter oss att utnyttja en mängd olika antikroppar för att märka olika molekylära komponenter i NMJ. Vårt tidigare arbete har fokuserat på projektioner av en definierad MN i metathoracic (3: e) benet, som innervates tibia levator muskeln (tilm) och visar konsekventa arborization mönster och bouton nummer. Inledningsvis studerade vi åldersberoende förändringar i Drosophila superoxid dismutase 1 (dsod1) mutanter och fann förändringar som överensstämmer med demontering av NMJ20. Dessa dissekeringsmetoder ger möjlighet att bättre karakterisera långsamma degenerativa förändringar vid NMJ för andra ALS-modeller, grundläggande studier av åldrande och andra MN-associerade sjukdomar.
Figur 1. Arbetsflödessammanfattning för dissekering av ben. Se protokollet för detaljerade steg. (A,B) Flugor väljs och sövs. C) Flugor överförs till metanol och tvättas med PBS. (D) Metathoracicbenen avlägsnas vid basen av coxa medan de visualiseras med ett dissekerande mikroskop (~ 30x förstoring); skalstång = 500 μm. (E) Benen fixeras sedan i 3,7% formaldehyd/PBS (FA) lösning i 30 minuter i brunnar av 24-brunnsplattor och sedan tas FA bort genom tvättar med PBS. (F, G, H) Benen överförs till silikonelastomer dissekeringsbrickor och en bit nagelband avlägsnas från det proximala lårbenet med fasad tång medan de visualiseras under ett dissekerande mikroskop vid 80x; skalstång = 50 μm. (I) Benen är post-dissekering fixerade i FA och tvättas i PBS och sedan PBT (PBS + 0,1% icke-jonisk tensid). (J) Benen utsätts för immunocytokemisk färgning. (K,L) Benen överförs till en glasrutschbana, rensas i monteringsmedia och täcks med ett täckslip som innehåller lerutrymmen; skalstänger = 2 mm och 500 μm. (M) Benen avbildas av konfokal mikroskopi. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Protocol
Förfarandena för att förbereda arbetslösningar som används i samband med detta protokoll beskrivs i tabell 1.
| Reagens | Förberedelse | Lagring | |||
| PBS | Gör ett arbetslager på 1x PBS från en 10x PBS-buljonglösning genom att späda i destillerat vatten. PH-värdet för det arbetande PBS-beståndet bör vara 7,2- 7,4 | 4 °C i 1+ månader tills bakteriell förorening är synlig. | |||
| PBT | 1x PBS-lösning med 0,1% icke-joniskt tensid. | 4 °C i 1+ månader tills bakteriell förorening är synlig. | |||
| FA | 3,7% formaldehydlösning tillverkad av ett 37% formaldehydlager och utspädd i 1x PBS. | Rumstemperatur. Gör färsk varje dag av dissekering | |||
| VARNING: Formaldehyd som levereras som 37% lagerlösning är en potentiell cancerframkallande och bör spädas ut i en rökhuv. | |||||
| 5% NGS | 5% normalt getserum utspädd i PBT. Det serum som används ska matcha arten av den sekundära antikropp som ska användas. | 4 °C i flera veckor tills bakteriell förorening är synlig | |||
Tabell 1. Lösningar för att utföra immunocytokemi hos det vuxna Drosophila benet.
1. Initial fixering av vävnader
- Välj cirka 10 flugor för varje genotyp och ålder. Bedöva på en flugplatta under koldioxid (figur 1A, B).
OBS: Börja med fler flugor än nödvändigt för att säkerställa en tillräckligt stor provstorlek efter dissekering. - Överför flugor till kall metanol i en glasbrunn eller skål i cirka 30 sekunder till 1 minut (bild 1C). Metanolen solubiliserar de kapikulära kolväten och flugor kan nu dränkas snarare än flyta i vattenlösningar.
- Med tång överför du försiktigt flugor till PBS. Skölj 3x i iskall PBS för att avlägsna överflödig metanol och håll flugor i PBS på is tills dissekering och fixering. Vid denna tidpunkt dissekerar flugor och fixerar inom kortast möjliga tid (<30 minuter).
- För att isolera benen, överför flugor till en silikonelastomerdissektionsfat fylld med kall PBS, ta bort metathoracicbenen vid coxa med två par #5 Dumont tång eller skär benen med Vanna sax (figur 1D). Överför benen till en brunn i en plast 24 brunnsplatta fylld med 1 ml PBS och håll plattan på is tills alla ben tas bort och överförs till brunnar.
OBS: Varje brunn kan rymma minst 20 ben. - Byt ut PBS-lösningen mot 1 ml FA-lösning och rotera på en mutterator i 30 minuter (bild 1E). Nutatorinställningen ska ställas in på medelhög hastighet (17 varv/min). Se till att benen är helt nedsänkta i FA-lösningen under denna tid för adekvat fixering.
- För att ta bort FA-lösningen, tvätta i 1 ml PBS 3x snabbt följt av ytterligare 3 tvättar i 5 minuter vardera i 1 ml PBS. Håll vävnader i 1 ml PBS på is före och under de dissekeringssteg som beskrivs nedan.
2. Ta bort ben nagelband och antikroppsfärgning
- Ta bort nagelbandet i benet
- De dissekerande tångarna är avgörande för framgång. Inför små parallella böjningar i båda spetsarna i slutet av #5 superfina tångar för att ge en avfasning som gör att nagelbandet kan tas tag i ytligt snarare än att petas, vilket kan förstöra vävnaden (figur 1F, G).
OBS: Spetsar böjda parallellt bör fortfarande komma i kontakt med varandra under hela spetsen när de är stängda (figur 2). - Överför benen till en silikonelastomer skål i PBS för dissekering. Rikta ett ben så att den främre sidan är vänd uppåt (se figur 3 för benanatomi och orienteringsinformation). Håll skenbenet mot silikonelastomerskålen med ett par tångar. Använd de andra tångarna som hålls avfasningssidan nedåt, ta en bit nagelband på lårbenets distala ände och dra i den proximala riktningen mot trochantern.
- Fortsätt metodiskt att ta bort nagelband tills den nakna muskeln är synlig i lårbenets proximala ände (figur 1F, G, H).
OBS: Ta endast ytlig kontakt med benen med hjälp av tångens fasade sida för att undvika att dra i musklerna. - När alla ben har dissekerats, byt ut PBS med FA för att efterfixa benen i 30 minuter med skakning på en mutterator med medelhastighet (bild 1I). Tvätta proverna i 1 ml PBS 3 gånger snabbt och sedan 3 gånger i 5 minuter vardera i PBT (figur 1J).
OBS: Om färgning med monoklonal antikropp NC82 (anti-bruchpilot) för att märka aktiva zoner, efterfixera i 20 minuter eftersom detta antigen är känsligt för längre fixeringar.
- De dissekerande tångarna är avgörande för framgång. Inför små parallella böjningar i båda spetsarna i slutet av #5 superfina tångar för att ge en avfasning som gör att nagelbandet kan tas tag i ytligt snarare än att petas, vilket kan förstöra vävnaden (figur 1F, G).
Figur 2. Modifierade tångar som används för dissekering av vuxna ben. (A) Tångens ändar böjs och plattas sedan nedtill (pil) vilket skapar en avfasning genom att fila på en slipsten. B) Däremot är spetsarna av oförändrade tångar inte böjda. Skalningslist = 1 mm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Färgning av antikroppar
- För att blockera vävnader för antikroppsfärgning, ersätt 1 ml PBT med blockerande lösning bestående av 1 ml 5% NGS utspädd i PBT. Inkubera dissekerade ben i 4 timmar vid rumstemperatur eller över natten vid 4 °C medan du gungar på en mutterator vid medelhastighet (17 varv/min). Täck brunnar med tätningstejp utöver plasthöljet (figur 1J) under alla inkubationer.
OBS: 24 brunnsplattor används för immunocytokemi snarare än 1,5 ml eller 2 mL mikrocentrifuge eftersom tidigare försök att använda mikrocentrifugerör resulterade i brutna ben och skadad vävnad. - Ta bort blockeringslösningen och tillsätt 300 ml primära antikroppar utspädda i färsk blockeringslösning. Den lilla mängd antikroppar som används bör vara tillräcklig för att täcka vävnaderna. Försegla brunnar med laboratorietätningstejp och plastlock och inkubera över natten vid 4 °C med skakning på en mutterator med medelhastighet (figur 1J). Informationen om reagens och koncentrationer av arbetsantikroppsreagens som används i dessa studier beskrivs i tabell 2.
- Tvätta primära antikroppar i 1 ml PBT i 3 gånger kort och sedan 3 gånger i 15 minuter vardera (figur 1J).
OBS: Utspädda primära antikroppar kan sparas och återanvändas om de förvaras vid 4 °C i upp till 2 veckor. - Blockera vävnader igen i 1 ml 5% NGS i minst 2 timmar vid rumstemperatur eller över natten vid 4 C (figur 1J).
- Ta bort 5% NGS-blockeringslösningen och tillsätt 300 μL av lämpliga utspädda fluorescerande konjugerade sekundära antikroppar. Tillsätt dessutom 1:2000 utspädning av fluorescenskonjugerat falloidin för att märka muskeln (figur 1J).
- För sekundära antikroppskubationer, försegla brunnar med laboratorietätningstejp och lock. Också linda plattor i aluminiumfolie för att skydda fluoroforer från ljus. Inkubera i 6-8 timmar vid rumstemperatur eller över natten vid 4 °C.
- Tvätta sekundära antikroppar och falloidin enligt beskrivningen i steg 2.2.3 ovan. Täckplattor med aluminiumfolie mellan tvättar för att skydda fluoroforer från ljus.
- För att blockera vävnader för antikroppsfärgning, ersätt 1 ml PBT med blockerande lösning bestående av 1 ml 5% NGS utspädd i PBT. Inkubera dissekerade ben i 4 timmar vid rumstemperatur eller över natten vid 4 °C medan du gungar på en mutterator vid medelhastighet (17 varv/min). Täck brunnar med tätningstejp utöver plasthöljet (figur 1J) under alla inkubationer.
3. Monteringsben
- Överför benen till en glidbild med tång och orientera främre sidan uppåt. Täck benen med monteringsmedium (bild 1K, L).
OBS: De dissekerade benen kan aspireras med en P1000 pipettspets om bottenhålet breddas genom skärning med ett rakblad. - Tillsätt lerdelar till ett 22x22 mm2 täckslip (#1,5 tjocklek) genom att skrapa täckhörnen över en liten boll av modelleringslera. Varje hörn ska ha en liten mängd lera 1-2 mm tjock (figur 1K).
- För att täcka glidningen, lägg till täckslipet med lerutrymmena vända mot glidningen och tryck försiktigt på hörnen tills täckslipet bara berör lårbenets yta.
- För att förhindra avdunstning, försegla kanterna på täcket med nagellack och låt torka på en mörk plats (ca 10 minuter) innan du förvarar vid 4 °C tills avbildningen.
4. Bildbehandling
- Bild med konfokalmikroskop (bild 1M). Inkludera en överförd ljuskanal för att bättre bedöma kvaliteten på dissekeringen och prover med synligt störda muskelfibrer i intresseområdet bör kasseras.
- Börja avbilda z-staplar med 20x förstoring med 2x zoom och ett totalt bilddjup på ~ 40 mm motsvarande lårbenets tjocklek. För fluorescerande signaldetektering, ta bilder med upplösningar som överensstämmer med Nyquist-sampling (vi använder 1024 x 1024 pixlar med en uppehållsinställning på 8-10 μs/pixel). Signalintensiteten bör ligga i det linjära intervall som uppnås genom att justera högspänningsvinstinställningarna. När förstärkningsinställningarna har ställts in för en serie prover i ett experiment bör de inte ändras så att signalintensiteterna kan jämföras mellan proverna.
- För bildsyn synaptiska boutoner och annan subcellulär struktur, fånga konfokala bilder vid ≥60x förstoring. Detektorinställningarna ska ligga i det linjära intervallet, medan pixeltätheten, uppehållsinställningarna och z-djupet ska vara likartade för bilder som tas vid lägre förstoring (steg 4.1).
Representative Results
Figur 4 visar ett representativt exempel på ett metathoracic ben färgade med anti-hrp, anti-dlg och falloidin. För dissektioner som tar bort nagelband från lårbenets proximala del kommer stereotypa arbors att vara uppenbara nära senan som lätt detekteras av autofluorescens. Observera att antikroppsinträngning i benet sker en kort bit utanför den region där nagelband har avlägsnats (figur 4A). Dessa regioner kan avbildas effektivt när stark fluorescenssignal är närvarande. Avbildning vid låg förstoring (20x med en 2x zoom) möjliggör en enkel bestämning av 1) hur mycket nagelband som tas bort och 2) om skador uppstod under dissekering. Ökad förstoring (60x) visar stereotypa projektioner på tilm (figur 4B). Vårt arbete har fokuserat på en MN, troligen härledd från I- MN-härstamningen som innervate tilm i det proximala lårbenet (låda, figur 4B och figur 4C). Ökad förstoring ytterligare (100x med 2x zoom) möjliggör effektiv visualisering av synaptiska batonger (figur 4D).
För att studera morfologiska förändringar hos vuxna NMJ över tid har vi tidigare använt dsod1 mutanter som modell för ALS. Bouton svullnad förekommer i åldrade dsod1H71Y mutanter i förhållande till dsod1null och dsod1+ (figur 5A, B). Vid larven NMJ används monoklonal antikropp NC82 ofta för att märka aktiva zoner och dessa strukturer kan enkelt visualiseras vid den vuxna NMJ (figur 5C). Svagt positiva HRP axon grenar är rikligt i dsod1H71Y mutanter och dessa grenar visar ofta svag och diffus BRP lokalisering (pilar).
Viktigt för neurodegeneration, kommersiellt tillgängliga antikroppar kan upptäcka allestädes närvarande proteiner som ofta finns i aggregat, och vi har upptäckt allestädes närvarande aggregat inom terminala axoner av MNs i åldrade mutanta dsod1 flugor samt inom muskler (figur 6A). Antikroppar som märker mitokondrier kan också upptäcka morfologiska förändringar med åldern (figur 6B).
För vissa preparat gör muskelskador under dissekeringen provet oanvändbart. Först kan sådana skador vara vanliga, men förbättring sker med övning. Exempel på bra dissekeringar är figur 7A, C medan dåliga dissektioner visas i figur 7B, D. Dåliga dissekeringar orsakar oorganisering av muskelfibrer som detekteras av faskontrastmikroskopi (figur 7B) eller saknade muskelfibrer visualiserade av fluorescerande konjugerat falloidin (figur 7D, pil). Kombinationen av att använda falloidin för att märka muskler och överförda ljusbilder kan hjälpa till att upptäcka sådana muskelskador som kanske inte är uppenbara när man tittar under ett dissekerande mikroskop.
Figur 3. Anatomi av Drosophila benet. (A) Diagram över den främre sidan av ett metathoracic ben, kännetecknas av förekomsten av borst i motsats till den framträdande nakna nagelband som finns på den bakre sidan. Det segmenterade benet består av coxa (Cx), trochanter (Tr), lårben (Fe), skenbenet (Ti), 5 tarsala segment (Ta1-5) och klo (Cl) för att från proximal (Pr) till distala (Di). Dorsala (D) och ventrala (V) sidor av lårbenet anges också. Skalstreck =100 μm. B) Diagram över lårbenet som innehåller tibia levator (tilm), skenbensdepressor (tidm), lång sena muskel 2 (ltm2) och skenbensreducator (tirm) muskler och axonprojektioner i det proximala lårbenet innervating tilm. Dessa stereotypa axonal projektioner antas härledas från I-lineage neuroblaster16, och den andra arborization är den enklaste att komma åt genom dissekering (boxas). Skalstång = 100 μm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4. Dissekerade metathoracic lårbenet visade stereotypa MN arkitektur innervating tilm. Immunocytokemi användes för att markera nervceller (HRP), skivor-stora (DLG) och muskler (falloidin). Z-staplar fångades av confocal mikroskopi imaging genom hela lårbenet och visas som en maximal serie projektion. (A) En överförd ljuskanal inkluderades också för att illustrera att inga påvisbara muskelskador inträffade under dissekering. Bilden togs vid 20x förstoring, skalstreck =50 μm. B) Identifierade arbors associerade med tilm (boxat område, centrum), skalstång =20 μm; och (C) vid 60x förstoring, skalstång = 20 μm. (D) DLG omgivande boutons var uppenbart i vilda typ djur när bilden vid 100x förstoring med 2x zoom; skalstreck = 2 μm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Exempel på åldersberoende förändringar i bouton morfologi som kan detekteras med hjälp av benet dissekering teknik. Bouton svullnad ses i åldrade dsod1H71Y mutanter. (A) Representativa bilder av HRP färgade bouton från unga (nyemitterade, dag 0 vuxna) och gamla (dag 10) flugor, skalstång = 1 μm. (B) Boutonstorlekar kvantifierades från respektive genotyper med hjälp av måttfunktionen inom ImageJ. p<0.0001 (2-vägs ANOVA med tukeytest efter hoc). C) Aktiva zoner inom synaptiska batonger märkta med monoklonal antikropp NC82 (anti-bruchpilot). skalstång = 1 μm. Figur ändrad från 20Please klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 6. Vanliga markörer associerade med neurodegenerativa sjukdomar som används i Drosophila benpreparat. A) Subcellulära polyubiquitinerade aggregat detekteras i terminala axoner och muskler hos aged1H71Y-flugor. Immunocytokemi med anti-polyubiquitin (FK2) detekterar punkta (pilar) i åldern dsod1H71Y/H71Y, skalstång = 20 μm (vänster) och 5 μm (höger). (B) Svullna mitokondrier kan detekteras med anti-ATP5A, skalstång = 1 μm. Figur ändrad från 20Please klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 7. Exempel på goda och dåliga dissekeringar. (A) Dissekering som inte störde den underliggande muskelarkitekturen. (B) Ett exempel på en dålig dissekering som visade slitna muskelfibrer (pil) och inte kunde användas för analys. Båda proverna avbildades av faskontrastmikroskopi. Skalstång = 50 μm. (C) Exempel på en bra dissekering avbildad av konfokal mikroskopi med HRP (grön) och falloidin (blå). (D) En dålig dissekering saknar dorsala muskelfibrer i TILM saknas (pil). Skalningslist = 50 μm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Antikropp/Fläck | Utspädning* |
| Anti-ATP5A | 1:500 |
| Anti-bruchpilot (nc82) | 1:20 |
| Anti-cysteinsträngprotein (ab49) | 1:50 |
| Antiskivor stora (4F3) | 1:200 |
| Anti-hrp | 1:550 |
| Anti-polyubiquitin (FK2) | 1:1000 |
| Anti-repo (8D12) | 1:5 |
| Get antimus sekundär antikropp | 1:800 |
| Falloidin | 1:2000 |
| *Späd i 5% NGS |
Tabell 2. Antikroppar och utspädningar. De kommersiella leverantörerna av de antikroppar som används i dessa studier finns upptagna i materialförteckningen.
Discussion
Drosophila vuxna ben är en idealisk modell för att studera neurodegeneration givet relativ enkelhet med väl karakteriserade MNs mappade från neuroblast härstamningar och stereotypa arborization mönster. Flera rapporter har tidigare använt ben-MNs för studier av neurodegenerativa sjukdomar21,22. Dessa studier använde GFP-uttryckande linjer i kombination med mosaik analys med en repressible cellmarkör (MARCM) att avbilda genom nagelband och dokumenterade en serie morfologiska förändringar. Imaging vuxna NMJs av immunocytochemistry med resected nagelband möjliggör ytterligare karakterisering med förmågan att spåra komplexa molekylära förändringar med hjälp av en verktygslåda av antikroppar tillgängliga.
Immunocytokemi delen av detta protokoll är relativt standard och kan genomföras oberoende av genotyp (se23 för en utmärkt beskrivning av allmänna antikropp färgningsmetoder för användning med Drosophila). Dessutom kan parametrar som fluorescensintensitet, axongrenlängd och boutonnummer och -storlek bestämmas med hjälp av en mängd tillgängliga ImageJ-makron när bilder har tagits och detaljerade metoder för kvantitativ analys har publicerats (till exempel se24,25,26). Dissekeringstekniken är således den viktigaste innovationen som beskrivs här. Före dissekering är flugor nedsänkta i en alkohol för att strippa cuticular kolväten. Både etanol och metanol används ofta för detta ändamål; emellertid, vi har bara använt metanol. Avgörande för dissekeringsframgång är flera faktorer: För det första möjliggör användning av modifierade tångar med avfasning mycket ytlig kontakt med nagelbandet. För det andra, med hjälp av ett dissekerande mikroskop som kan 60-100x total förstoring så att nagelbandets yta är tydligt synlig. För mikroskop med lägre maximal förstoring finns 2x-mål tillgängliga för de vanligaste märkena och bör vara tillräckliga i kombination med befintliga linser. För det tredje gör det första fixeringssteget nagelbandet sprött och lättare att dra bort utan att skada muskeln under. Överfixering i detta steg gör hela benet för styvt för effektiv dissekering. Därför bör den ursprungliga fixeringen begränsas till 30 minuter. Formaldehydfixativet kommer inte att tränga tillräckligt för att effektivt korsa den underliggande vävnaden under denna korta period och därför är ett andra fixeringssteg nödvändigt. Före den andra fixeringen bör vävnader hållas på is för att förhindra nedbrytning och förändringar i morfologin. För det fjärde har vi funnit dissekerande prover medan kyla också är viktigt, sannolikt av liknande skäl i att nagelband är sprött och en liten bit lättare kan avlägsnas.
Med övning finner vi ~ 50% av dissekeringarna kommer att kunna användas inom ingen märkbar vävnadsskada. Även om denna procentandel kan tyckas låg i förhållande till vissa andra vävnader, är dissekeringsproceduren snabb och många ben kan bearbetas på 30-60 minuter. Därför, även om framgångsgraden är låg inledningsvis, är det möjligt att få 4-5 bra prover för varje experimentell grupp. En begränsning kan dock vara antalet tillgängliga flugor vid en given tidpunkt om genotyper och/eller ålder leder till betydande dödlighet.
En annan begränsning är att vi inte har kunnat dissekera andra delar av benet bortom lårbenets proximala region på grund av storlek. Således kan vi studera identifierade MN arbors innervating TILM på ett tillförlitligt sätt och det är möjligt att dissekera nagelband ovanför skenbenet depressor muskeln med små förändringar i hur benet är orienterad vid dissekering. Att komma åt andra regioner i benet har dock visat sig svårare utan att störa axonal arkitektur under dissekering.
Här presenterar vi dissekeringsmetoder för att upptäcka förändringar vid vuxna NMJ för definierade MNs innervating tilm med immunocytochemistry. Benet är användbart som ett enkelt system, innervated av endast ~ 50 MN och innehåller 14 muskler med väl beskriven anatomi. Den dissekerade benberedningen kan användas över genotyper och en serie antikroppar finns tillgängliga för NMJ-visualisering utan behov av att bygga genotypiskt komplexa lager av reportergenkonstruktioner i mutanta bakgrunder. Detta tillvägagångssätt kommer att möjliggöra en mer detaljerad karakterisering av förändringar vid NMJ för MN-sjukdomar och andra åldersrelaterade tillstånd.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar Eric Roberts för råd om bildbehandling. Vi vill också tacka informationstekniktjänster vid Rhode Island College och i synnerhet Michael Caine och Jake Douglas för videografi. Monoklonala antikroppar anti-dlg och anti-brp utvecklades av UC-Berkeley respektive Universitaetsklinikim Wuerzburg, och erhölls från Developmental Studies Hybridoma Bank, skapad av NICHD av NIH och underhålls vid University of Iowa, Department of Biology, Iowa City, IA 52242, USA. Forskningen som rapporterades här stöddes fullt ut av Rhode Island Institutional Development Award (IDeA) Network of Biomedical Research Excellence från National Institute of General Medical Sciences vid National Institutes of Health under bidragsnummer [P20GM103430].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP3991 | |
| 24 well plates | Corning | 3473 | Hydrophobic, ultra-low attachment surface |
| 2x objective accessory | Olympus | 110AL2X | Screw-on attachment |
| Anti-ATP5A primary antibody | Abcam | ab14748 | Mouse monoclonal |
| Anti-bruchpilot primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Mouse monoclonal |
| Anti-discs large primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | Mouse monoclonal |
| Anti-hrp primary antibody | Jackson Immuno Research | 123-605-021 | Alexa Fluor 647 conjugated polyclonal |
| Anti-polyubiquitin (FK2) primary antibody | Millipore Sigma | 04-263 | Mouse monoclonal |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Objectives (NA): 10x (0.4), 20x (0.85), 40x (1.20), 60x (1.42), 100x (1.40) |
| Coverslips | Corning | 285022 | 160-190 mm thickness |
| Dissecting forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Dumont #5SF |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | 37% stock stabilized with methanol |
| Goat anti-mouse secondary antibody | Jackson Immuno Research | 115-545-146 | Alexa Fluor 488 conjugated |
| Goat Serum | Novus Biologicals | NB036768 | 0.2 mm filtered |
| Laboratory sealing tape | Fisher Scientific | 03-448-254 | Parafilm M |
| Methanol | Fisher Scientific | A413 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | 76mm x 25mm |
| Mounting media | Molecular Probes | S36972 | Slowfade Diamond mounting media |
| Nonionic surfactant | Acros Organics | 215680010 | Triton-X 100 |
| Nutator | Fisher Scientific | S06622 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A34055 | Alexa Fluor 555- conjugated |
| Sharpening stone | Fine Science Tools | 29008-01 | |
| Silicone elastomer | Electron Microscopy Sciences | 2423610 | Sylgard 184 |
References
- McDermott, C. J., Shaw, P. J. Diagnosis and management of motor neurone disease. BMJ. 336 (7645), 658-662 (2008).
- Global Collaborators, G. B. D. M. N. D. Global, regional, and national burden of motor neuron diseases 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 17 (12), 1083-1097 (2018).
- Foster, L. A., Salajegheh, M. K. Motor Neuron Disease: Pathophysiology, Diagnosis, and Management. American Journal of Medicine. 132 (1), 32-37 (2019).
- Bede, P., Pradat, P. F. Editorial: Biomarkers and Clinical Indicators in Motor Neuron Disease. Frontiers in Neurology. 10, 1318 (2019).
- Clark, J. A., Southam, K. A., Blizzard, C. A., King, A. E., Dickson, T. C. Axonal degeneration, distal collateral branching and neuromuscular junction architecture alterations occur prior to symptom onset in the SOD1(G93A) mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Chemical Neuroanatomy. 76, 35-47 (2016).
- Martineau, E., Di Polo, A., Van de Velde, C., Robitaille, R. Dynamic neuromuscular remodeling precedes motor-unit loss in a mouse model of ALS. Elife. 7, (2018).
- Shahidullah, M., et al. Defects in synapse structure and function precede motor neuron degeneration in Drosophila models of FUS-related ALS. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19590-19598 (2013).
- Tremblay, E., Martineau, E., Robitaille, R. Opposite Synaptic Alterations at the Neuromuscular Junction in an ALS Mouse Model: When Motor Units Matter. Journal of Neuroscience. 37 (37), 8901-8918 (2017).
- Harris, K. P., Littleton, J. T. Transmission, Development, and Plasticity of Synapses. Genetics. 201 (2), 345-375 (2015).
- Beramendi, A., Peron, S., Casanova, G., Reggiani, C., Cantera, R. Neuromuscular junction in abdominal muscles of Drosophila melanogaster during adulthood and aging. Journal of Comparative Neurology. 501 (4), 498-508 (2007).
- Banerjee, S., et al. Miniature neurotransmission is required to maintain Drosophila synaptic structures during ageing. Nature Communications. 12 (1), 4399 (2021).
- Liao, S., Broughton, S., Nassel, D. R. Behavioral Senescence and Aging-Related Changes in Motor Neurons and Brain Neuromodulator Levels Are Ameliorated by Lifespan-Extending Reproductive Dormancy in Drosophila. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 111 (2017).
- Mahoney, R. E., Rawson, J. M., Eaton, B. A. An age-dependent change in the set point of synaptic homeostasis. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2111-2119 (2014).
- Fernandes, J. J., Keshishian, H.
- Truman, J. W. Metamorphosis of the central nervous system of Drosophila. Journal of Neurobiology. 21 (7), 1072-1084 (1990).
- Baek, M., Mann, R. S. Lineage and birth date specify motor neuron targeting and dendritic architecture in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 29 (21), 6904-6916 (2009).
- Enriquez, J., et al. Specification of individual adult motor neuron morphologies by combinatorial transcription factor codes. Neuron. 86 (4), 955-970 (2015).
- Soler, C., Daczewska, M., Da Ponte, J. P., Dastugue, B., Jagla, K. Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg. Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).
- Guan, W., Venkatasubramanian, L., Baek, M., Mann, R. S., Enriquez, J. Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle. Journal of Visualized Experiments. (140), e58365 (2018).
- Agudelo, A., et al. Age-dependent degeneration of an identified adult leg motor neuron in a Drosophila SOD1 model of ALS. Biology Open. 9 (10), (2020).
- Fernius, J., Starkenberg, A., Thor, S. Bar-coding neurodegeneration: identifying subcellular effects of human neurodegenerative disease proteins using Drosophila leg neurons. Disease Models & Mechanisms. 10 (8), 1027-1038 (2017).
- Sreedharan, J., Neukomm, L. J., Brown, R. H., Freeman, M. R. Age-Dependent TDP-43-Mediated Motor Neuron Degeneration Requires GSK3, hat-trick, and xmas-2. Current Biology. 25 (16), 2130-2136 (2015).
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods in Cell Biology. 44, 445-487 (1994).
- Guirado, R., Carceller, H., Castillo-Gomez, E., Castren, E., Nacher, J. Automated analysis of images for molecular quantification in immunohistochemistry. Heliyon. 4 (6), 00669 (2018).
- Castells-Nobau, A., et al. Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology. Journal of Visualized Experiments. (123), e55395 (2017).
- Brown, J. R., Phongthachit, C., Sulkowski, M. J. Immunofluorescence and image analysis pipeline for Drosophila motor neurons. Biology Methods and Protocols. 4 (1), (2019).
