En procedure for kapillær elektroforese elektrosprayionisering massespektrometri til absolut kvantificering af inositolpyrophosphater fra pattedyrcelleekstrakter er beskrevet.
Inositolpyrophosphater (PP-InsPs) er en vigtig gruppe af intracellulære signalmolekyler. Afledt af inositolphosphater (InsPs) har disse molekyler tilstedeværelsen af mindst en energisk pyrophosphatdel på myo-inositolringen. De eksisterer allestedsnærværende i eukaryoter og fungerer som metaboliske budbringere, der undersøger fosfathomeostase, insulinfølsomhed og cellulær energiladning. På grund af fraværet af en kromofor i disse metabolitter, en meget høj ladningstæthed og lav overflod kræver deres analyse radioaktivt sporstof, og det er derfor indviklet og dyrt. Her præsenterer undersøgelsen en detaljeret protokol til at udføre absolut og høj gennemstrømningskvantificering af inositolpyrophosphater fra pattedyrceller ved kapillær elektroforese elektrosprayioniseringsmassespektrometri (CE-ESI-MS). Denne metode muliggør følsom profilering af alle biologisk relevante PP-InsPs-arter i pattedyrceller, hvilket muliggør baseline-adskillelse af regioisomerer. Absolutte cellulære koncentrationer af PP-InsPs, herunder mindre isomerer, og overvågning af deres tidsmæssige ændringer i HCT116-celler under flere eksperimentelle betingelser præsenteres.
Siden den første opdagelse af myo-inositolpyrophosphater (PP-InsPs) i 19931,2, er der gjort betydelige fremskridt med at belyse deres biosyntese, omsætning og funktioner3. Inositolpyrophosphater forekommer allestedsnærværende i eukaryote celler4 og tjener som metaboliske signalmolekyler, der er kritisk involveret i f.eks. fosfathomeostase5,6, insulinfølsomhed7, calciumoscillationer 8,9, vesikulær handel 10, apoptose 11, DNA-reparation12, immunsignalering 13 , og andre. Overfloden af vigtige processer under kontrol af inositolpyrophosphater kræver en dybere forståelse af deres cellulære overflod, udsving og lokalisering.
Selvom InsP’er og PP-InsP’er tiltrak opmærksomhed på tværs af discipliner, udføres analysen af deres overflod rutinemæssigt ved hjælp af en metode udviklet i 80’erne, der består af mærkning af celler med tritieret inositol, der løser de ekstraherede PP-InsP’er ved stærk anionbyttekromatografi Sax-HPLC med efterfølgende scintillationstælling. Nyere metoder baseret på massespektrometri står stadig over for betydelige udfordringer: inositolpyrophosphater med op til otte fosfatenheder har fosfatestere og anhydrider, hvilket fører til en betydelig negativ ladning og potentielt fosfattab under ionisering. Der findes fire hovedtyper af PP-InsP’er hos pattedyr (figur 1): 1,5-(PP)2-InsP 4 (eller 1,5-InsP8), 5-PP-InsP 5 (eller 5-InsP 7), 1-PP-InsP 5 (eller 1-InsP7) og 5-PP-Ins(1,3,4,6)P 4 (eller5-PP-InsP 4)3,14. De fysiologiske niveauer af PP-InsP’er er typisk i nano- til lavmikromolære områder, med 5-PP-InsP 5 som den mest rigelige med cellulære koncentrationer på 0,5 – 5 μM. 1,5-(PP)2-InsP 4 og 1-PP-InsP 5 menes at være op til omkring 10% af 5-PP-InsP 5-puljen og forbliver vanskelig at spore i mange celler15. 5-PP-InsP4 med en fri OH-gruppe er endnu lavere i overflod og bliver normalt kun detekterbar, når phosphathydrolaser hæmmes med natriumfluorid (NaF)16.
Den høje ladningstæthed af PP-InsP’er gør deres adskillelse vanskelig, og forekomsten af PP-InsP-regioisomerer komplicerer disse bestræbelser yderligere. Som følge heraf var de fleste eksperimenter afhængige af kvantificering ved metabolisk radioaktiv mærkning af celler ved hjælp af [3H] -inositol, da baggrund fra matrixen er udelukket, og høj følsomhed opnås17,18. Denne metode er imidlertid dyr, tidskrævende og tillader ikke korrekt at skelne mellem relaterede PP-InsP-regioisomerer. Desuden, [3H]-inositol mærkning ikke redegøre for endogene inositol syntese fra glucose. En polyacrylamid gelelektroforese (PAGE) -baseret metode er et bredt anvendt billigt alternativ, men begrænset i sin følsomhed 19,20,21,22. Andre tilgange, der undgår radiomærkning, er blevet offentliggjort, herunder ionkromatografi efterfulgt af UV-detektion efter kolonneafledning23, hydrofil interaktionskromatografi (HILIC)24 eller svag anionbytning (WAX) kombineret med massespektrometri (MS)25. De er dog (endnu) ikke på niveau med den klassiske [3H]-inositol SAX-HPLC-protokol.
For nylig blev kapillær elektroforese elektrosprayioniseringsmassespektrometri (CE-ESI-MS) introduceret som en transformativ strategi til analyse af InsPs og PP-InsPs metabolisme, der opfylder alle krav diskuteret ovenfor16. Kombineret med den nuværende avancerede InsP-ekstraktion med perchlorsyre efterfulgt af berigelse med titandioxidperler26 lykkedes det CE-ESI-MS at få alle organismer, der hidtil er testet, fra gær til planter og pattedyr. Samtidig profilering af InsP’er og PP-InsP’er, herunder alle mulige regioisomerer, blev let opnået. Stabile isotopmærkede (SIL) interne standarder muliggjorde en hurtig og præcis absolut kvantificering, uanset matrixeffekter. Fordi MS kan fange isotopiske masseforskelle, kan CE-ESI-MS også anvendes til at studere opdelte cellulære synteseveje for InsPs og PP-InsPs, f.eks. ved at fodre celler med [13 C 6] -myo-inositol eller [13C6]-D-glucose.
Beskrevet her er en detaljeret trin-for-trin protokol for den absolutte kvantificering af PP-InsP’er og InsP’er fra pattedyrceller af CE-ESI-MS. Bortset fra den store 5-PP-InsP 5-isomer, 1,5-(PP)2-InsP 4 og 1-PP-InsP5 er også kvantificeret i denne undersøgelse, på trods af deres lavere forekomst. To HCT116-cellelinjer fra forskellige laboratorier (NIH, UCL) undersøges, og det valideres, at HCT116UCL-celler indeholder 7 gange højere niveauer af 1,5-(PP)2-InsP 4 end fundet i HCT116NIH, mens 5-PP-InsP5-koncentrationer er sammenlignelige. Derudover øges 1-PP-InsP5-syntese i HCT116UCL ikke signifikant. Stigningen i PP-InsP-niveauer ved at blokere deres dephosphorylering ved anvendelse af natriumfluorid undersøges kvantitativt.
Præsenteret her er en praktisk og følsom metode til kvantificering af højt ladede inositolpyrophosphater i pattedyrceller. Ved at kombinere denne analysemetode med den nuværende avancerede InsP-ekstraktion med perchlorsyre efterfulgt af berigelse med TiO2 har CE-ESI-MS-analyse hidtil usete fordele. Med hensyn til dens gennemstrømning, følsomhed, stabilitet, absolut kvantificering, isomeridentifikation og matrixafhængighed skiller denne metode sig ud sammenlignet med andre tilgange. Denne protokol gælder for pattedyrceller, men faktisk lykkes denne strategi i mange forskellige prøver (f.eks. Gær, planter, parasitter, musevæv osv.).
Den anvendte ekstraktionsprotokol genvinder PP-InsPs og InsP6 fuldstændigt fra pattedyrcelleekstrakter16,19. Det vil også ekstrahere mange andre anioniske metabolitter, især fosfatholdige arter, f.eks. sukkerphosphater og nukleotider. Evaluering af gendannelse og nedbrydning for brugerens analytter med denne protokol ville være nødvendig.
Generelt kører CE-ESI-MS-systemet problemfrit og kan rumme omkring 200 prøver hver uge ved hjælp af denne protokol. I modsætning til HPLC er CE imidlertid blevet betragtet som en metode for eksperter og specialiserede personer i lang tid, hvilket begrænsede dets marked og begrænsede dets anvendelse. Således er en CE-ESI-MS-enhed normalt fraværende i analytiske fakulteter. Folk, der ønsker at udføre CE-ESI-MS-analyse, mangler sandsynligvis CE-erfaring og vil bruge mere tid på fejlfinding. Her fremhæves de kritiske trin. Først og fremmest er kvaliteten af kapillærsnittet. Følsomheden og stabiliteten af ESI-spray er for det meste afhængig af et førsteklasses kapillærsnit. For det andet skal kapillærudløbets ende være nøjagtigt 0,1 mm ud af sprøjtespidsen. Sprøjtenålen og CE-kapillæren skal være i aksial retning. Kvaliteten af ESI-sprayen er afgørende for kvantificeringen; Tekniske kørsler skal udføres for at evaluere repeterbarheden.
Med den beskrevne protokol er kvantificeringsgrænsen (LOQ) for PP-InsPs 40 nM med en injektion ved 50 mbar i 10 s (10 nL). Der er flere tilgange til yderligere at øge metodefølsomheden. For det første vil en injektion ved 100 mbar i 20 s (40 nL) stadig resultere i en god topform og tilstrækkelig opløsning til regioisomerer 5-PP-InsP 5 og 1-PP-InsP5. For det andet kan InsP-ekstrakter opløses i en mindre mængde vand. For det tredje kan opholdstiden øges, når der anvendes færre MRM-overgange til kvantificering. Derudover vil en CE-MS-ionkilde, der bruger ultra-lav kappevæskestrøm, øge følsomheden betydeligt.
CE-løbebufferen med pH 9 giver den bedste opløsning mellem InsP6-InsP 8. Når pH øges til 9,7, forbedres opløsningen blandt InsP3-InsP 6 betydeligt. På grund af den fremragende opløsning anbefales en kortere kapillærlængde på 72 cm for yderligere at øge gennemstrømningen. Desuden nedsætter en højere CE-kassettetemperatur ved 40 °C viskositeten af den vandige elektroforetiske buffer og fremskynder deres bevægelse under EOF. I henhold til forskellige forskningskrav kan ændringer af denne metode yderligere lette InsPs og PP-InsPs analyse. Derfor har de beskrevne CE-ESI-MS-protokoller potentialet til at åbne nye forskningsveje i denne mangesidede familie af signalmolekyler.
The authors have nothing to disclose.
Dette projekt har modtaget støtte fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under EU’s Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram (tilskudsaftale nr. 864246 til HJJ). DQ anerkender den økonomiske støtte fra Brigitte-Schlieben-Lange-Programm. AS er støttet af MRC-programtilskuddet MR/T028904/1.
Materials | |||
1.5 mL microcentrifuge tubes | Greiner Bio-One | 616201 | – |
15 cm tissue culture dishes | Thermo Fisher | 168381 | – |
2.0 mL microcentrifuge tubes | Greiner Bio-One | 623201 | – |
50 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 227261 | – |
96-well plates | Thermo Fisher | 260836 | for the DC protein assay |
CE fused silica capillary | CS Chromatographie | 105180 | 50 µM i.d. 360 µM o.d. |
Pipette tips | Starlab | I1054-0001, S1111-6701, S1113-1700, S1111-3700 | 10 mL, 1000 µL, 200 µL, 10 µL pipette tips |
Serological pipets | TPP | 94550, 94525, 94010, 94005 | 50 mL, 25, mL, 10 mL, 5 mL serological pipettes |
T75 flasks | TPP | 90076 | – |
Chemicals and Reagents | |||
NaOH | AppliChem | A6829,0500 | sodium hydroxide pellets for molecular biology, for preparation of cell lysis buffer |
0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | – |
Ammonium acetate | Thermo Fisher | 1677373 | HPLC grade |
BSA | Thermo Fisher | 23209 | albumin standard (2.0 mg/mL) for standard curve preparation |
DC protein assay | Biorad | 5000116 | DC protein assay reagents package |
DMEM | Gibco | 41966029 | high glucose, pyruvate |
FBS | Gibco | 10270106, 10500064 (heat inactivated) | 10270106 for HCT116UCL, 10500064 for HCT116NIH |
Isopropanol | Carl Roth | AE73.2 | 99.95% LC-MS grade |
NH4OH, 10% | Carl Roth | 6756.1 | for preparation of 3% NH4OH |
PBS | Gibco | 10010015 | – |
Perchloric acid, 70% | Carl Roth | 9216.1 | for preparation of 1 M perchloric acid |
SDS | SERVA | 20760.02 | for preparation of cell lysis buffer |
Sodium fluoride | Sigma Aldrich | S7920 | – |
TiO2 beads | GL Sciences | 5020-75000 | 5 µm particle size |
Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | trypan blue stain (0.4%) |
Ultrapure (Type 1) water | Milli-Q | ZRQSVP3WW | model: Direct-Q 3 UV Water Purification System |
Equipment | |||
Analytical balance | Mettler Toledo | 30105893 | model: XPE26; for weighing of beads (5-6 mg per sample) |
Automated cell counter | Logos Biosystems | L40002 | model: LUNA-II Automated Cell Counter |
Benchtop centrifuge | Hettich | 1401 | model: UNIVERSAL 320 |
Benchtop centrifuge with cooling | VWR | 521-1647P | model: Microstar 17R |
CE system | Agilent | G7100A | – |
CE/MS Adapter Kit | Agilent | G1603A | – |
CE/MS Sprayer Kit | Agilent | G1607A | – |
Cell counting slides | Logos Biosystems | L12001 | LUNA Cell Counting Slides |
Centrifugal evaporator | Eppendorf | 5305000304 | model: Concentrator plus complete system |
ESI source | Agilent | AJS ESI | – |
Humidified incubator | Binder | 9040-0088 | model: CB E6.1, for cultivation of mammalian cells |
Ice box | – | – | should provide enough space for samples, dishes, etc. |
Isocratic LC system | Agilent | G7110B 1260 Iso Pump | model: Infinity II Quaternary system |
MSD | Agilent | G6495C | triple quadrupole |
Multiplate reader | Tecan | 30086375 | model: SPARK 10 M |
Pipette filler | Thermo Fisher | 10072332 | for serological pipettes |
Pipettes | Brand | 705884, 705880, 705878, 705872, 705870 | various pipettes |
Rotator | Labnet | H5500 | model: Mini LabRoller Rotator |
Shortix capillary column cutter | SGT | S0020 | – |
Test tube shaker (vortex mixer) | Carl Roth | HXH6.1 | model: Rotilabo-Mini Vortex |
Tilt table | Labnet | S0600 | model: EDURO MiniMix Nutating Mixer |
Water bath | Thermo Fisher | FSGPD05 | model: Isotemp GPD 05 |
Software | |||
MassHunter Workstation | Agilent | Version 10.1 | – |
MassHunter Workstation LC/MS Data Acquisition | Agilent | Version 10.1 | – |
MassHunter Workstation Optimizer | Agilent | Version 10.1 | – |
MassHunter Workstation Qualitative Analysis | Agilent | Version 10.0 | – |
QQQ Quantitaion Analysis | Agilent | Version 10.1 | – |