Summary
포유류 세포 추출물로부터 이노시톨 피로포스페이트의 절대 정량을 위한 모세관 전기영동 전기분무 이온화 질량분석법을 위한 절차가 설명된다.
Abstract
이노시톨 피로인산염(PP-InsP)은 세포 내 신호 분자의 중요한 그룹입니다. 이노시톨 포스페이트(InsPs)에서 파생된 이 분자는 미오-이노시톨 고리에 적어도 하나의 에너지 피로포스페이트 부분이 존재하는 것을 특징으로 합니다. 그들은 진핵생물에 편재하며 인산염 항상성, 인슐린 감수성 및 세포 에너지 전하를 조사하는 대사 메신저로 작동합니다. 이러한 대사 산물에 발색단이없고 전하 밀도가 매우 높으며 풍부도가 낮기 때문에 분석에는 방사성 추적자가 필요하므로 복잡하고 비용이 많이 듭니다. 여기에서 이 연구는 모세관 전기영동 전기분무 이온화 질량분석법(CE-ESI-MS)에 의해 포유류 세포에서 이노시톨 피로인산염의 절대 및 고처리량 정량을 수행하기 위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 포유류 세포에서 생물학적으로 관련된 모든 PP-InsPs 종의 민감한 프로파일링을 가능하게 하여 위치 이성질체의 기준선 분리를 가능하게 합니다. 작은 이성질체를 포함한 PP-InsP의 절대 세포 농도 및 여러 실험 조건 하에서 HCT116 세포에서의 시간적 변화의 모니터링이 제시된다.
Introduction
1993 년 myo-inositol pyrophosphates (PP-InsPs)의 초기 발견이후 1,2, 생합성, 회전율 및 기능3을 밝히기위한 상당한 진전이있었습니다. 이노시톨 피로인산염은 진핵 세포4에서 유비쿼터스로 발생하며 인산염 항상성5,6, 인슐린 감수성7, 칼슘 진동8,9, 소포 트래피킹(10), 세포자멸사11, DNA 복구(12), 면역 신호전달 13에 결정적으로 관여하는 대사 신호 분자로 작용합니다. , 그리고 다른 사람들. 이노시톨 피로인산염의 통제하에 있는 과다한 중요한 공정은 세포 풍부함, 변동 및 국소화에 대한 더 깊은 이해를 요구합니다.
InsP와 PP-InsP는 여러 분야에서 주목을 받았지만, 이들의 풍부도 분석은 80년대에 개발된 방법을 사용하여 일상적으로 수행되며, 삼중분비 이노시톨로 세포를 표지하고 강력한 음이온 교환 크로마토그래피 Sax-HPLC로 추출된 PP-InsP를 분해하고 후속 섬광 계수를 수행합니다. 질량 분석법을 기반으로 하는 새로운 방법은 여전히 중요한 문제에 직면해 있습니다: 최대 8개의 인산염 단위가 있는 이노시톨 피로인산염에는 인산염 에스테르와 무수물이 포함되어 이온화 중에 상당한 음전하와 잠재적인 인산염 손실이 발생합니다. 포유류에서 발견되는 PP-InsP에는 1,5-(PP)2-InsP 4 (또는 1,5-InsP8), 5-PP-InsP 5 (또는 5-InsP 7), 1-PP-InsP 5 (또는 1-InsP7) 및 5-PP-Ins(1,3,4,6)P 4 (또는5-PP-InsP 4)3,14의 네 가지 주요 유형이 있습니다. PP-InsPs의 생리학적 수준은 전형적으로 나노-저-마이크로몰 범위에 있으며, 5-PP-InsP5는 0.5 - 5 μM의 세포 농도로 가장 풍부하다. 1,5-(PP)2-InsP4 및 1-PP-InsP5는 5-PP-InsP5 풀의 약 10%까지인 것으로 여겨지며, 많은 세포(15)에서 추적하기 어렵다. 유리 OH 그룹을 갖는 5-PP-InsP4는 풍부도가 훨씬 낮으며 일반적으로 인산염 가수 분해 효소가 불화 나트륨 (NaF)으로 억제 될 때만 검출 될 수 있습니다.16.
PP-InsP의 높은 전하 밀도는 분리를 어렵게 만들고 PP-InsP 위치 이성질체의 발생은 이러한 노력을 더욱 복잡하게 만듭니다. 그 결과, 대부분의 실험은 매트릭스로부터의 배경이 배제되고 고감도가 달성됨에 따라 [3H]-이노시톨을 사용한 세포의 대사성 방사성 표지에 의한 정량에 의존하였다17,18. 그러나이 방법은 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리며 관련 PP-InsP 위치 이성질체를 적절하게 구별 할 수 없습니다. 또한, [3H]-이노시톨 표지는 포도당으로부터의 내인성 이노시톨 합성을 설명하지 않는다. 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 기반 방법은 널리 적용되는 저렴한 대안이지만 감도 19,20,21,22가 제한적입니다. 이온 크로마토 그래피 후 컬럼 유도체화 후 UV 검출23, 친수성 상호 작용 크로마토 그래피 (HILIC) 24 또는 질량 분석법 (MS)25과 결합 된 약한 음이온 교환 (WAX)을 포함하여 방사성 표지를 피하는 다른 접근법이 발표되었습니다. 그러나 (아직) 고전적인 [3H]-이노시톨 SAX-HPLC 프로토콜과 동등하지 않습니다.
최근에, 모세관 전기영동 전기분무 이온화 질량분석법(CE-ESI-MS)이 InsP 및 PP-InsPs 대사 분석을 위한 변형 전략으로 도입되어 상기16에서 논의된 모든 요건을 충족하였다. CE-ESI-MS는 과염소산에 의한 현재의 최첨단 InsP 추출 후 이산화 티타늄 비드26으로 농축하여 효모에서 식물 및 포유류에 이르기까지 지금까지 테스트 된 모든 유기체에서 성공했습니다. 가능한 모든 위치 이성질체를 포함한 InsP 및 PP-InsP의 동시 프로파일링이 쉽게 달성되었습니다. 안정 동위원소 표지(SIL) 내부 표준물질은 매트릭스 효과에 관계없이 빠르고 정밀한 절대 정량을 가능하게 했습니다. MS는 동위원소 질량 차이를 포착할 수 있기 때문에 CE-ESI-MS는 예를 들어 세포에 [13C 6]-미오-이노시톨 또는 [13C6]-D-포도당을 공급하여 InsP 및 PP-InsP의 구획화된 세포 합성 경로를 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다.
여기에 설명된 것은 CE-ESI-MS에 의한 포유동물 세포로부터의 PP-InsP 및 InsP의 절대 정량을 위한 상세한 단계별 프로토콜이다. 주요 5-PP-InsP 5 이성질체 외에도 1,5- (PP) 2-InsP 4 및 1-PP-InsP5도 낮은 풍부함에도 불구하고이 연구에서 정량화됩니다. 서로 다른 실험실 (NIH, UCL)의 두 HCT116 세포주를 연구한 결과, HCT116UCL 세포는 HCT116NIH에서 발견되는 것보다 7 배 더 높은 수준의 1,5- (PP) 2-InsP4를 함유하고 5-PP-InsP5 농도는 비슷합니다. 또한, HCT116UCL에서의 1-PP-InsP5 합성은 유의적으로 증가하지 않았다. 또한, 불화 나트륨을 사용하여 탈인산화를 차단함으로써 PP-InsP 수준의 증가가 정량적으로 연구된다.
Protocol
1. CE-ESI-MS 시스템 설정
- 상용 CE 시스템과 애질런트 제트 스트림(AJS) 전기분무 이온화(ESI) 소스가 장착된 삼중 사중극자 탠덤 질량분석기로 구성된 CE-ESI-MS 시스템을 설정합니다. CE-ESI-MS 분무기 키트와 등용매 LC(액체 크로마토그래피) 펌프가 필요합니다.
- 외피 흐름 1:100 스플리터(CE-MS 분무기 키트에 포함)와 등용매 LC 펌프 배출구를 연결합니다.
- CE 시스템 주입 바이알이 질량 분석기의 분무기 팁과 동일한 높이에 있는지 확인하십시오.
- MassHunter 워크스테이션(버전 10.1) 또는 유사한 MS 소프트웨어를 활용하여 전체 시스템을 제어하고 데이터 수집 및 분석을 수행할 수 있습니다.
2. 완충액, 모세관 및 CE-MS 시스템 준비
- CE 실행 완충액 준비: 수산화암모늄으로 40mM 아세트산암모늄의 pH를 9.0으로 조정합니다. 250mL 부피 플라스크를 사용하는 것이 좋습니다. 0.2μm 공극 크기의 멤브레인 필터로 250mL의 버퍼를 여과합니다. 초순수 탈이온수와 MS 등급 시약만 사용하십시오.
알림: 이 완충액은 실온에서 2-3주 동안 또는 냉장고에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다. - 시스 액체 준비: 250mL 병에 초순수 100mL와 LC-MS 등급 이소프로판올 100mL를 섞습니다. 적어도 일주일에 한 번 외장 액체를 교체하십시오. 고분해능 질량분석기를 사용할 때 외피 액체에 질량 기준을 추가합니다.
- 외피 액체 설치: 5mL/분으로 5분 동안 퍼지하고 유속을 1mL/분(CE-MS 분무기에 10μL/분)으로 설정합니다. 펌프 압력은 약 180bar입니다. 재활용 튜브가 칼집 액체 병에 다시 연결되어 용매를 재사용하는지 확인하십시오.
- 모세관 준비: UV 감지 창이 있는 CE-MS 모세관(길이 125cm의 50μm 내경 및 365μM 외경)을 구입하십시오. 사용자는 또한 전문 유통 업체로부터 훨씬 저렴한 바 융합 실리카 모세관을 얻을 수 있습니다. 길이 100cm의 모세관을 자릅니다. 회전하는 다이아몬드 블레이드가있는 모세관 컬럼 커터로 모세관 끝을 올바르게 절단하고 라이터로 양쪽 끝의 2-3cm의 폴리이 미드 코팅을 제거합니다. 이소프로판올로 모세관 표면을 청소하십시오.
- 모세관 설치: 모세관을 CE-MS 카세트에 맞춥니다. 카세트 변경 버튼을 클릭하고 카세트를 CE 장치에 설치합니다. 모세관의 입구 끝은 전극보다 약 2mm 낮습니다. 주입 과정에서 입구 끝이 샘플 표면보다 낮은지 확인하십시오.
- 모세관 활성화: 처음 사용하기 전에 모세관을 1M NaOH로 세척한 다음 물을 10분 동안 세척하고 CE 실행 버퍼를 15분 동안 세척합니다.
- 모세관 끝을 CE-MS 분무기에 삽입: 모세관을 CE-MS 분무기에 부드럽게 넣고 모세관 끝이 분무기 끝에서 약 0.1mm 돌출되도록 합니다. 돋보기와 분무기의 조정 나사로 모세관 배출구 끝을 정밀하게 조정하십시오. 분무기를 이온 소스에 다시 삽입하고 조정 나사를 만지지 마십시오. 이 동작을 수행할 때 MS는 대기 모드에 있다.
- ESI 스프레이 확인: 전체 스캔 모드에서 ESI 분무기의 안정성을 확인합니다. 총 이온 전기 페로 그램의 변동은 5 % 이내 여야합니다.
- InsP 표준물질로 테스트 실행 수행: 50mbar에서 10초(10nL) 동안 주입하여 테스트 실행을 위해 2μM InsP3-InsP 8 표준물질(정량적 31PNMR15,27로 조정)의 혼합물을 사용합니다. 표 1과 같이 자세한 ESI 및 MS 파라미터를 설정합니다. CE 전류는 약 26μA입니다. 피크 폭은 약 0.4-0.5 분입니다. 신호 대 잡음비가 400 이상에 도달하는지 확인합니다.
3. 포유류 세포에서 가용성 이노시톨 인산염 추출
참고 : HCT116NIH 세포는 Stephen Shears28의 친절한 선물이었습니다. HCT116UCL 세포는 사이아르디의 실험실26으로부터 나왔다.
- 세포 파종
- 10% 태아 소 혈청(FBS)이 보충된 둘베코의 변형된 독수리 배지(DMEM) 중 5% 고습도CO2 분위기(표준 조건으로 추가로 지칭됨)에서 37°C의 T75 플라스크에서 HCT116NIH 또는 HCT116UCL 세포를 배양한다.
- HCT116NIH 및 HCT116UCL 스톡 배양물을 인산완충식염수(PBS)(5mL)로 세척하고, 세포가 완전히 분리될 때까지 표준 조건에서 트립신-에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)(3mL, 0.25%)으로 세포를 배양한다. 배지(7 mL)를 첨가하여 트립신 활성을 켄칭하고, 세포를 원심분리 튜브 및 원심분리기(200 x g, 3분)에 수집한다.
- 상청액을 제거하고 세포를 배지(10 mL)에 재현탁시킨다. 세포를 세고 트리판 블루 배제를 통해 생존력을 결정합니다.
- 세포(분석당 600만 HCT116 세포)를 150mm 접시에 넣고 총 20mL의 세포 배양 배지를 조정합니다. 파종하기 전에 원심분리 튜브에서 배지와 세포를 미리 혼합하여 접시에 세포를 균등하게 분배합니다. 셀 번호에 의한 정규화가 필요한 경우 병렬 접시를 준비하십시오.
- 72 시간 동안 표준 조건에서 세포를 배양하십시오. 세포는 약 80%-90% 합류에 도달합니다.
- NaF 및 세포 수확을 통한 이노시톨 인산염 수준의 조절
- NaF 처리 : 배지에 수확하기 1 시간 전에 NaF (10mM)를 첨가하십시오. 플레이트/피펫팅을 소용돌이치며 배지를 혼합하고 표준 조건에서 60분 동안 세포를 배양합니다.
- NaF 처리 후 세포에서 배지를 제거하고 세포를 얼음 위에 놓습니다.
- 세포를 PBS(5 mL, 4°C)로 2회 세척하고 PBS를 접시로부터 완전히 제거한다.
- 과염소산 (PA) (1 mL, 1 M, 4 ° C)을 첨가하십시오. 전체 표면을 PA로 덮으십시오 (단백질이 침전됨에 따라 세포가 흰색으로 변합니다). 세포를 4°C의 틸트 테이블 상에서 10분 동안 인큐베이션한다.
- PA를 원심분리 튜브에 모으고 원심분리(17,000 x g, 5분, 4°C)로 오염 부스러기를 제거합니다. InsPs의 풀다운을 위해 준비된TiO2 비드에 상청액을 첨가한다.
- 탈산화를 위해 추출 후 접시를 PBS(5mL, r.t.)로 두 번 세척합니다. 접시에서 PBS를 완전히 제거하십시오.
- 세포 용해 완충액(1.5 mL, r.t.; 0.1 M NaOH 중 0.1% 나트륨 도데실 설페이트[SDS])의 첨가를 통해 플레이트 상에 단백질을 가용화시킨다. r.t.의 틸트 테이블에서 접시를 15분 동안 배양합니다. 세포 용해물을 원심분리 튜브와 원심분리기(17,000 x g, 5분, 4°C)로 옮깁니다. 소 혈청 알부민을 보정 표준으로 사용하여 DC 단백질 분석을 통해 단백질 농도가 결정될 때까지 상청액을 -80°C에서 보관하십시오(일반적으로 150mm 접시 1개에는 약 10mg의 단백질이 들어 있음).
- 평행 접시에서 세포 수 결정: 단계 3.1.2에 설명된 대로 트립신을 통해 평행 접시의 세포를 수확하고(150mm 접시에 5mL 트립신-EDTA 사용) 배지를 제거합니다. 세포 펠릿을 PBS(5mL)에 재현탁하고 적절하게 혼합한 다음 세포를 세십시오. 직접 퀀칭을 통해 수확 직전에 이 단계를 수행하여 대표적인 세포 수를 얻으십시오. 또한 적절한 방법(예: 멀티사이저 기계 사용)으로 셀의 부피를 측정합니다.
- 이노시톨 포스페이트의TiO2 농축
참고: 인산화 화합물의 산성 분해를 방지하려면 얼음에서 용리될 때까지 모든 농축 단계를 수행하고 모든 시약을 4°C로 냉각하십시오. 추출 시간을 최소 (1.5-2 시간)로 유지하십시오. 1 M PA로 모든 추출 단계를 수행하십시오.- 비드의 제조:TiO2 비드(샘플당 5mg)를ddH2O(1mL) 및 원심분리기(3,500 x g, 1분, 4°C)로 세척합니다. ddH2O를 제거하고 비드를 PA(1 mL)로 세척한다. 원심분리(3,500 x g, 1분, 4°C)로 PA를 제거합니다. 비드를 PA(샘플당 50μL)에 재현탁합니다.
- 인산화 화합물을 함유하는 상청액(비교 섹션 3.2, 단계 3.2.5)을 비드 현탁액, 와류에 첨가한 다음, 샘플을 4°C에서 20분 동안 회전시킨다.
- 샘플을 원심분리(3,500 x g, 1분, 4°C)하고 상청액을 버린다. 비드를 PA(500μL)와 원심분리기(3,500 x g, 1분, 4°C)로 세척합니다. 상청액을 버리고 세척 단계를 반복한다.
- NH4OH(200μL, 3%)를 비드에 첨가하고 재현탁시킨다. r.t.에서 샘플을 5분 동안 회전합니다.
- 샘플을 원심분리하고(3,500 x g, 1분) 상청액을 새 원심분리 튜브로 옮깁니다.
- 용리 단계 3.3.4 및 3.3.5를 반복하고 용리액을 결합합니다. 구슬을 버리십시오.
- 혼합된 용리액(17,000 x g, 1분, 4°C)을 원심분리하여 불용성 잔류물을 제거합니다.
- 상청액을 진공 증발 하에서 완전히 건조시킨다(70분, 60°C, V-AQ). InsPs를 함유하는 건조 추출물에 ddH2O (50 μL)를 첨가한다. 와동시켜 완전히 용해될 때까지 샘플을 혼합한다. 샘플을 CE-ESI-MS 분석이 될 때까지 -20°C에서 보관한다.
4. CE-ESI-MS 실행 수행
- 40 μM [13 C 6] 1,5- (PP) 2-InsP 4, 80 μM [13 C 6] 5-PP-InsP 5, 80 μM [13 C 6] 1-PP-InsP 5, 400 μM [13 C 6] InsP 6 및 400 μM [13C 6] Ins(1,3,4,5,6) P 5를 포함하는 내부 표준물질의 혼합물을 준비합니다. SIL IS 용액의 농도는 인증된 참조 표준물질(예: 포스포아세트산)의 도움을 받아 정량적 31P및 1HNMR로 측정합니다.
참고: 순도가 96%보다 높은 위의 모든 SIL 내부 표준(IS)은 Fiedler 그룹15,27에서 합성 및 제공했습니다. 뉴클레오티드와 마찬가지로 이러한 IS는 많은 결정 물 분자와 다양한 반대 이온을 운반 할 수 있습니다. 물질을 칭량하고 농도를 계산하는 대신 정량적 31PNMR에 의한 13C6표준 용액의 농도 측정이 권장됩니다. - CE 샘플 바이알에서 10 μL의 샘플을 0.5 μL의 내부 표준물질 혼합물과 혼합합니다. 2 μM [13 C 6]1,5- (PP) 2-InsP 4, 4 μM [13 C 6] 5-PP-InsP 5, 4 μM [13 C 6] 1-PP-InsP 5, 20 μM [13 C 6] InsP 6 및 20 μM [13C 6] Ins (1,3,4,5,6) P 5는 샘플 내부의 최종 농도입니다.
- 보충 시스템을 사용할 때 병 교체 버튼을 클릭하고 준비된 250mL의 CE 실행 버퍼를 전해질 병에 넣은 다음 클린 튜브를 클릭합니다. 보충 바늘을 물병에 보관하십시오.
- 표 1과 같이 ESI 및 MS 파라미터를 설정합니다. 이노시톨 폴리포스페이트 표준물질이 혼합된 Source Optimizer를 사용하여 소스 파라미터를 최적화합니다. 모든 표준물질과 함께 매스헌터 옵티마이저를 사용하여 다중 반응 모니터링(MRM) 설정을 얻습니다. 다른 계측에 대한 ESI 및 MS/MS 설정을 조정합니다.
- InsP 추출에 대한 실행을 수행하고 결과를 확인합니다(그림 2). 샘플이 더 많은 경우 시퀀스를 설정합니다.
- 측정 후 MS를 대기 모드로 설정하십시오. LC 펌프를 끄지 마십시오. 외피 액체의 흐름은 분무기 바늘을 보호합니다. 외피 액체 공급이 없을 때 CE-ESI-MS 분무기를 LC-ESI-MS 분무기로 교체하십시오.
5. 데이터 분석
- 정량 분석(QQQ용) 소프트웨어를 열고 모든 샘플에 대한 배치를 생성합니다.
- 수집된 MRM 데이터에서 새 메서드를 만듭니다. [13C6]InsP를 내부 표준으로 설정합니다 - (ISTD). MRM 화합물 설정, 머무름 시간 설정, ISTD 설정, 농도 설정 및 한정자 설정을 확인합니다. 유효성 검사를 통과하고 종료하여 현재 일괄 처리에 메서드를 적용합니다. 메서드를 저장합니다.
- 배치의 각 피크가 제대로 통합되었는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 피크를 수동으로 통합합니다.
- 결과를 스프레드시트로 내보냅니다. 분석물 피크 반응과 SIL IS의 각 피크 반응을 알려진 농도와 비교하여 이노시톨(파이로)포스페이트의 정량을 수행합니다. 선형 범위의 5-PP-InsP5,InsP6 및 Ins(1,3,4,5,6)P5에 대한 이론 및 실험 교정 곡선은 표 2에 나와 있습니다.
참고: 이론적 교정 곡선을 적용하는 전제 조건은 표적화된 분석물의 고품질 동위원소 패턴과 신뢰할 수 있는 농도의 사용입니다. 선형 범위를 평가합니다. 검량선은 위에서 언급한 동위원소 표준물질의 완전한 획득이 비현실적인 경우 절대 정량에 필수적입니다. - InsP 추출 용액의 측정 된 농도와 부피로 절대량을 계산하십시오. 또한, 세포 수 또는 단백질 함량에 따라 양을 정상화하십시오. HCT116 (1.68 fL)의 세포 수 및 평균 세포 부피를 기준으로 세포 농도를 계산하십시오.
Representative Results
여기에 표시된 결과는 CE-ESI-MS 분석의 잠재력을 설명하는 것을 목표로합니다. 보고된 수치는 기술적으로 완벽한 CE-ESI-MS 실행을 설명합니다. 먼저, 이노시톨 피로인산 표준물질(그림 1)과 포유류 세포 추출물(그림 2)의 혼합물이 제시됩니다. 둘째, 두 개의 HCT116 세포주 (그림 3)와 NaF 처리 HCT116 (그림 4) 세포의 비교가 제공됩니다.
2μM 농도에서 이노시톨(파이로)인산염 표준물질의 추출된 이온 전기페로그램(EIE)이 그림 1에 나와 있습니다. 단순화 된 구조를 가진 포유류에서 이노시톨 피로 포스페이트의 대사가 삽입됩니다. 포유류의 4 가지 이노시톨 피로 포스페이트 인 1,5- (PP) 2-InsP 4, 5-PP-InsP 5, 1-PP-InsP 5 및5-PP-Ins(1,3,4,6) P 4는 설명 된 방법을 사용하여 잘 구별됩니다. HCT116UCL의 CE-ESI-MS 실행은 그림 2에 나와 있습니다. 안정 동위원소 표지(SIL) 내부 표준물질의 도움으로 신호 반응을 알려진 농도의 스파이크된 SIL과 비교하여 절대적인 정량을 쉽게 달성할 수 있습니다. InsP5에서 (PP) 2-InsP4까지의 이노시톨 포스페이트의 통합 EIE와 동위 원소 패턴의 통합되지 않은 EIE가 표시됩니다. 6 개의 기술 반복에서 나온 모든 분석 물의 RSD는 4 % 이내입니다. 측정된 농도와 추출물의 부피로 분석물의 양을 계산할 수 있습니다. 세포 수와 세포 부피 또는 단백질 함량을 사용하면 절대 세포 농도 (μM) 또는 단백질 함량 (pmol / mg 단백질)으로 정규화 된 양이 일반적으로 이러한 분석의 최종 결과입니다.
이전 연구에 따르면, 발산된 HCT116 세포의 2개의 배치는 InsP8 수준의 변이를 갖고, HCT116UCL 세포는 HCT116NIH 세포보다 6배 더 높은 수준의InsP8을 함유한다(29). CE-MS 방법을 사용하면 HCT116 NIH에서 1,5- (PP)2-InsP 4를 쉽게 정량화 할 수 있으며 (그림 3) HCT116UCL 세포는 HCT116 NIH보다 7 배 더 높은 수준의 InsP8을 포함합니다. 또한, HCT116UCL 세포에서 1,5-(PP)2-InsP4의 상당한 축적은 유의하게 증가된 1-PP-InsP5와 병행하며, 이는 이제 도 3에 정량적으로 도시되어 있다.
PP-InsP 수준은 불화 나트륨을 사용하여 탈인산화를 억제함으로써 증가합니다. NaF 처리 HCT116NIH 세포의 CE-ESI-MS 분석은 InsP 6의 감소 및 5-PP-Ins (1,3,4,6) P 4의 출현과 함께 -5-PP-InsP5 상승을 입증했습니다 (그림 4). 게다가, InsP8 수준의 상승은 눈에 띄는 반면, 1-PP-InsP5 는 어느 정도 감소합니다. 1-PP-InsP5는 NaF 처리 HCT116NIH에 완전히 존재하지 않지만 대부분 검출 또는 정량의 한계 미만입니다.
그림 1: 설명된 프로토콜을 사용한 CE-ESI-MS 분석에서 이노시톨(파이로)인산염 표준물질의 일반적인 추출 이온 전기페로그램(EIE). 각 분석물의 농도는 2μM입니다. 주입된 시료량은 약 10nL이며 50mbar에서 10초 동안 주입합니다. 삽입물은 포유류에서 이노시톨 피로 인산염의 신진 대사를 보여줍니다. IPPK: 이노시톨 펜타키스포스페이트 2-키나제, IP6K: 이노시톨 헥사키스포스페이트 키나아제, PPIP5K: 디포스포이노시톨 펜타키스포스페이트 키나제, DIPP1: 디포스포이노시톨폴리포스페이트 포스포하이드롤라제 1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: HCT116 UCL 세포의 대표적인 InsP 프로파일. (A) HCT116 NIH 및 스파이크 된 SIL IS의 주요 이노시톨 (파이로) 포스페이트의 EIEs 2 μM [13 C 6] 1,5- (PP) 2-InsP 4 (1), 4 μM [13 C 6] 5-PP-InsP 5 (2), 4 μM [13 C 6] 1-PP-InsP 5 (3), 20 μM [13C 6] InsP 6 (4), 및 20 μM [13C 6] Ins (1,3,4,5,6) P 5 (5). 삽입물은 CE-ESI-MS에 의한 InsP 분석의 6 가지 기술적 반복을 보여 주며, 데이터는 SD± 수단으로 제시됩니다. (B) 인간 세포주 HCT116UCL에서 PP-InsP 및 InsP의 세포 농도 및 (C) 단백질 함량에 의해 정규화 된 PP-InsP 및 InsP 양. 데이터는 3개의 독립적인 실험에서 SEM± 평균입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 두 개의 분기된 HCT116 세포 간의 InsP8 수준의 변화. (ᅡ) HCT116 UCL 및 HCT116 NIH에서 이노시톨 피로 포스페이트의 EIE. HCT116UCL의 InsP8은 HCT116NIH에서보다 현저하게 더 풍부합니다. (B) 두HCT116 세포에서 InsP6에 대한 이노시톨 피로포스페이트의 비율(%). HCT116UCL 세포는 HCT116NIH에 비해 7배 더 높은 수준의 InsP8을 포함하는 반면 5-PP-InsP5 수준은 동일합니다. 데이터는 3개의 독립적인 실험에서 SEM± 평균입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: NaF 처리를 한 HCT116NIH 세포의 이노시톨(파이로)인산염 수치. (A) 불화 나트륨 처리 (NaF, 10 mM)를 사용한 HCT116NIH에서 이노시톨 (파이로) 포스페이트의 EIE. 1,5- (PP) 2-InsP 4, 5-PP-InsP 5 및 5-PP-Ins(1,3,4,6) P4를 포함한 이노시톨 피로 포스페이트의 수준은 NaF를 사용하여 탈인산화를 차단함으로써 증가합니다. (B) 미처리 및 NaF 처리된 HCT116NIH 세포에서 이노시톨(파이로)포스페이트 수준(양은 단백질 함량에 의해 표준화됨). 데이터는 3개의 독립적인 실험에서 SEM± 평균입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: CE-ESI-MS 매개변수 설정. 소스 매개변수 및 iFunnel 매개변수는 Source 및 iFunnel 최적화 도구에 의해 최적화됩니다. 이노시톨(파이로)포스페이트에 대한 MSM 파라미터 설정은 매스헌터 옵티마이저에 의해 최적화됩니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2 : 이론 및 실험 회귀 방정식. [13C 6] 5-PP-InsP 5 [13 C 6] InsP 6 및 [13C 6] Ins (1, 3, 4, 5,6) P5의 농도는 각각 4 μM, 20 μM 및 20 μM입니다. 회귀 방정식의 경우, 5-PP-InsP5 농도는 0.04 μM, 0.1 μM, 0.2 μM, 0.4 μM, 1 μM, 2 μM, 4 μM, 8 μM, 16 μM, 24 μM이다. InsP 6 및 Ins (1, 3, 4, 5,6)P5 농도는 0.2 μM, 0.5 μM, 1 μM, 2 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM이고, 40 μM, 80 μM, 120 μM. x는 농도, y는 (면적 InsP)12C/(면적 InsP)13C입니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기에 제시된 것은 포유류 세포에서 고도로 하전 된 이노시톨 피로 포스페이트의 정량을위한 실용적이고 민감한 방법입니다. 이 분석 접근법을 과염소산을 사용한 현재의 최첨단 InsP 추출 후 TiO2로 농축하는 것과 결합하면 CE-ESI-MS 분석은 전례없는 이점을 제공합니다. 처리량, 감도, 안정성, 절대 정량, 이성질체 식별 및 매트릭스 내 의존성과 관련하여 이 방법은 다른 접근 방식에 비해 두드러집니다. 이 프로토콜은 포유동물 세포에 적용가능하지만, 실제로 이 전략은 많은 상이한 샘플(예를 들어, 효모, 식물, 기생충, 마우스 조직 등)에서 성공한다.
적용된 추출 프로토콜은 포유류 세포 추출물16,19로부터 PP-InsP 및 InsP6를 완전히 회수합니다. 또한 많은 다른 음이온 대사 산물, 특히 인산염 함유 종, 예를 들어 당 인산염 및 뉴클레오티드를 추출합니다. 이 프로토콜을 사용한 사용자의 분석물에 대한 회수 및 분해 평가가 필요합니다.
일반적으로 CE-ESI-MS 시스템은 원활하게 실행되며 이 프로토콜을 사용하여 매주 약 200개의 샘플을 수용할 수 있습니다. 그러나 HPLC와 달리 CE는 오랫동안 전문가 및 전문인을위한 방법으로 간주되어 시장을 제한하고 적용을 제한했습니다. 따라서 CE-ESI-MS 장치는 일반적으로 분석 학부에 없습니다. CE-ESI-MS 분석을 수행하려는 사람들은 CE 경험이 부족하고 문제 해결에 더 많은 시간을 할애할 것입니다. 여기에서 중요한 단계가 강조 표시됩니다. 가장 중요한 것은 모세관 절단의 품질입니다. ESI 스프레이의 감도와 안정성은 대부분 일류 모세관 절단에 의존합니다. 둘째, 모세관 출구 끝은 분무기 팁에서 정확히 0.1mm 떨어져 있어야합니다. 분무기 바늘과 CE 모세관은 축 방향이어야합니다. ESI 스프레이의 품질은 정량에 매우 중요합니다. 반복성을 평가하기 위해 기술적 실행을 수행해야 합니다.
설명된 프로토콜에서 PP-InsP에 대한 정량 한계(LOQ)는 50mbar에서 10초(10nL) 동안 주입한 경우 40nM입니다. 분석법 감도를 더욱 높이기 위한 몇 가지 방법이 있습니다. 첫째, 100 mbar에서 20 초 (40 nL) 동안 주입하면 위치 이성질체 5-PP-InsP 5 및 1-PP-InsP5에 대해 여전히 양호한 피크 모양과 충분한 분해능을 얻을 수 있습니다. 둘째, InsP 추출물은 더 적은 양의 물에 용해 될 수 있습니다. 셋째, 정량 분석에 MRM 전이를 덜 사용할 때 체류 시간이 늘어날 수 있습니다. 또한 초저 외피 액체 흐름을 사용하는 CE-MS 이온 소스는 감도를 크게 증가시킵니다.
pH 9의 CE 실행 버퍼는 InsP6-InsP 8 사이에서 최상의 분해능을 제공합니다. pH를 9.7로 높이면 InsP 3-InsP 6 사이의 분리능이 크게 향상됩니다. 우수한 분해능으로 인해 처리량을 더욱 늘리기 위해 72cm의 더 짧은 모세관 길이가 권장됩니다. 또한 40 ° C에서 CE 카세트 온도가 높을수록 수성 전기 영동 버퍼의 점도가 감소하고 EOF에서의 이동이 가속화됩니다. 다양한 연구 요구에 따라 이 방법을 수정하면 InsP 및 PP-InsPs 분석을 더욱 용이하게 할 수 있습니다. 따라서 설명된 CE-ESI-MS 프로토콜은 이 다면적인 신호 분자 제품군에 대한 새로운 연구 길을 열 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.
Disclosures
저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램(HJJ에 대한 보조금 계약 번호 864246)에 따라 유럽 연구 위원회(ERC)로부터 자금을 지원받았습니다. DQ는 Brigitte-Schlieben-Lange-Programm의 재정 지원을 인정합니다. AS는 MRC 프로그램 보조금 MR/T028904/1에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Greiner Bio-One | 616201 | - |
| 15 cm tissue culture dishes | Thermo Fisher | 168381 | - |
| 2.0 mL microcentrifuge tubes | Greiner Bio-One | 623201 | - |
| 50 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 227261 | - |
| 96-well plates | Thermo Fisher | 260836 | for the DC protein assay |
| CE fused silica capillary | CS Chromatographie | 105180 | 50 µM i.d. 360 µM o.d. |
| Pipette tips | Starlab | I1054-0001, S1111-6701, S1113-1700, S1111-3700 | 10 mL, 1000 µL, 200 µL, 10 µL pipette tips |
| Serological pipets | TPP | 94550, 94525, 94010, 94005 | 50 mL, 25, mL, 10 mL, 5 mL serological pipettes |
| T75 flasks | TPP | 90076 | - |
| Chemicals and Reagents | |||
| NaOH | AppliChem | A6829,0500 | sodium hydroxide pellets for molecular biology, for preparation of cell lysis buffer |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | - |
| Ammonium acetate | Thermo Fisher | 1677373 | HPLC grade |
| BSA | Thermo Fisher | 23209 | albumin standard (2.0 mg/mL) for standard curve preparation |
| DC protein assay | Biorad | 5000116 | DC protein assay reagents package |
| DMEM | Gibco | 41966029 | high glucose, pyruvate |
| FBS | Gibco | 10270106, 10500064 (heat inactivated) | 10270106 for HCT116UCL, 10500064 for HCT116NIH |
| Isopropanol | Carl Roth | AE73.2 | 99.95% LC-MS grade |
| NH4OH, 10% | Carl Roth | 6756.1 | for preparation of 3% NH4OH |
| PBS | Gibco | 10010015 | - |
| Perchloric acid, 70% | Carl Roth | 9216.1 | for preparation of 1 M perchloric acid |
| SDS | SERVA | 20760.02 | for preparation of cell lysis buffer |
| Sodium fluoride | Sigma Aldrich | S7920 | - |
| TiO2 beads | GL Sciences | 5020-75000 | 5 µm particle size |
| Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | trypan blue stain (0.4%) |
| Ultrapure (Type 1) water | Milli-Q | ZRQSVP3WW | model: Direct-Q 3 UV Water Purification System |
| Equipment | |||
| Analytical balance | Mettler Toledo | 30105893 | model: XPE26; for weighing of beads (5-6 mg per sample) |
| Automated cell counter | Logos Biosystems | L40002 | model: LUNA-II Automated Cell Counter |
| Benchtop centrifuge | Hettich | 1401 | model: UNIVERSAL 320 |
| Benchtop centrifuge with cooling | VWR | 521-1647P | model: Microstar 17R |
| CE system | Agilent | G7100A | - |
| CE/MS Adapter Kit | Agilent | G1603A | - |
| CE/MS Sprayer Kit | Agilent | G1607A | - |
| Cell counting slides | Logos Biosystems | L12001 | LUNA Cell Counting Slides |
| Centrifugal evaporator | Eppendorf | 5305000304 | model: Concentrator plus complete system |
| ESI source | Agilent | AJS ESI | - |
| Super Support Film | Nisshin EM Co. Ltd, Tokyo | 647 | |
| Humidified incubator | Binder | 9040-0088 | model: CB E6.1, for cultivation of mammalian cells |
| Ice box | - | - | should provide enough space for samples, dishes, etc. |
| Isocratic LC system | Agilent | G7110B 1260 Iso Pump | model: Infinity II Quaternary system |
| MSD | Agilent | G6495C | triple quadrupole |
| Multiplate reader | Tecan | 30086375 | model: SPARK 10 M |
| Pipette filler | Thermo Fisher | 10072332 | for serological pipettes |
| Pipettes | Brand | 705884, 705880, 705878, 705872, 705870 | various pipettes |
| Rotator | Labnet | H5500 | model: Mini LabRoller Rotator |
| Shortix capillary column cutter | SGT | S0020 | - |
| Test tube shaker (vortex mixer) | Carl Roth | HXH6.1 | model: Rotilabo-Mini Vortex |
| Tilt table | Labnet | S0600 | model: EDURO MiniMix Nutating Mixer |
| Water bath | Thermo Fisher | FSGPD05 | model: Isotemp GPD 05 |
| Software | |||
| MassHunter Workstation | Agilent | Version 10.1 | - |
| MassHunter Workstation LC/MS Data Acquisition | Agilent | Version 10.1 | - |
| MassHunter Workstation Optimizer | Agilent | Version 10.1 | - |
| MassHunter Workstation Qualitative Analysis | Agilent | Version 10.0 | - |
| QQQ Quantitaion Analysis | Agilent | Version 10.1 | - |
References
- Stephens, L., et al. The detection, purification, structural characterization, and metabolism of diphosphoinositol pentakisphosphate(s) and bisdiphosphoinositol tetrakisphosphate(s). The Journal of Biological Chemistry. 268 (6), 4009-4015 (1993).
- Menniti, F. S., Miller, R. N., Putney, J. W. Jr, Shears, S. B. Turnover of inositol polyphosphate pyrophosphates in pancreatoma cells. The Journal of Biological Chemistry. 268 (6), 3850-3856 (1993).
- Shears, S. B. Inositol pyrophosphates: Why so many phosphates. Advances in Biological Regulation. 57, 203-216 (2015).
- Irvine, R. F., Schell, M. J. Back in the water: the return of the inositol phosphates. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (5), 327-338 (2001).
- Szijgyarto, Z., Garedew, A., Azevedo, C., Saiardi, A. Influence of inositol pyrophosphates on cellular energy dynamics. Science. 334 (6057), 802-805 (2011).
- Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
- Chakraborty, A., et al. Inositol pyrophosphates inhibit Akt signaling, thereby regulating insulin sensitivity and weight gain. Cell. 143 (6), 897-910 (2010).
- Bittner, T., et al. Photolysis of caged inositol pyrophosphate InsP8 directly modulates intracellular Ca2+ oscillations and controls C2AB domain localization. Journal of the American Chemical Society. 142 (24), (2020).
- Hauke, S., et al. Photolysis of cell-permeant caged inositol pyrophosphates controls oscillations of cytosolic calcium in a β-cell line. Chemical Science. 10 (9), 2687-2692 (2019).
- Saiardi, A., Sciambi, C., McCaffery, J. M., Wendland, B., Snyder, S. H. Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14206-14211 (2002).
- Koldobskiy, M. A., et al. p53-mediated apoptosis requires inositol hexakisphosphate kinase-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (49), 20947 (2010).
- Rao, F., et al. Inositol hexakisphosphate kinase-1 mediates assembly/disassembly of the CRL4-signalosome complex to regulate DNA repair and cell death. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16005 (2014).
- Williams, S. P., Gillaspy, G. E., Perera, I. Y. Biosynthesis and possible functions of inositol pyrophosphates in plants. Frontiers in Plant Science. 6, 67 (2015).
- Wilson, M. S. C., Livermore, T. M., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates: between signalling and metabolism. The Biochemical Journal. 452 (3), 369-379 (2013).
- Harmel, R. K., et al. Harnessing 13C-labeled myo-inositol to interrogate inositol phosphate messengers by NMR. Chemical Science. 10 (20), 5267-5274 (2019).
- Qiu, D., et al. Analysis of inositol phosphate metabolism by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nature Communications. 11 (1), 6035 (2020).
- Azevedo, C., Saiardi, A. Extraction and analysis of soluble inositol polyphosphates from yeast. Nature Protocols. 1 (5), 2416-2422 (2006).
- Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of radioactive labelling to elucidate inositol polyphosphate signalling. Phosphate Labeling and Sensing in Chemical Biology. , 67-87 (2017).
- Wilson, M. S. C., Bulley, S. J., Pisani, F., Irvine, R. F., Saiardi, A. A novel method for the purification of inositol phosphates from biological samples reveals that no phytate is present in human plasma or urine. Open Biology. 5 (3), 150014 (2015).
- Losito, O., Szijgyarto, Z., Resnick, A. C., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates and their unique metabolic complexity: analysis by gel electrophoresis. PloS One. 4 (5), 5580 (2009).
- Dong, J., et al. Inositol pyrophosphate InsP8 acts as an intracellular phosphate signal in arabidopsis. Molecular Plant. 12 (11), 1463-1473 (2019).
- Riemer, E., et al. ITPK1 is an InsP6/ADP phosphotransferase that controls systemic phosphate homeostasis in Arabidopsis. bioRxiv. , (2020).
- Whitfield, H., et al. An ATP-responsive metabolic cassette comprised of inositol tris/tetrakisphosphate kinase 1 (ITPK1) and inositol pentakisphosphate 2-kinase (IPK1) buffers diphosphosphoinositol phosphate levels. The Biochemical Journal. 477 (14), 2621-2638 (2020).
- Ito, M., et al. Hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantitative analysis of mammalian-derived inositol poly/pyrophosphates. Journal of chromatography. A. 1573, 87-97 (2018).
- Mantilla, B. S., Amaral, L. D. D., Jessen, H. J., Docampo, R. the inositol pyrophosphate biosynthetic pathway of Trypanosoma cruzi. ACS Chemical Biology. 16 (2), 283-292 (2021).
- Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Inositol phosphates purification using titanium dioxide beads. Bio-Protocol. 8 (15), 2959 (2018).
- Puschmann, R., Harmel, R. K., Fiedler, D. Scalable chemoenzymatic synthesis of inositol pyrophosphates. Biochemistry. 58 (38), 3927-3932 (2019).
- Gu, C., et al. KO of 5-InsP7 kinase activity transforms the HCT116 colon cancer cell line into a hypermetabolic, growth-inhibited phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 11968-11973 (2017).
- Gu, C., Wilson, M. S. C., Jessen, H. J., Saiardi, A., Shears, S. B. Inositol Pyrophosphate Profiling of Two HCT116 Cell Lines Uncovers Variation in InsP8 Levels. PloS One. 11 (10), 0165286 (2016).
