Summary
Een procedure voor capillaire elektroforese elektrospray ionisatie massaspectrometrie voor de absolute kwantificering van inositolpyrosfaten uit zoogdiercelextracten wordt beschreven.
Abstract
Inositol pyrofosfaten (PP-InsPs) zijn een belangrijke groep van intracellulaire signaalmoleculen. Afgeleid van inositolfosfaten (InsP's), deze moleculen kenmerken de aanwezigheid van ten minste één energetisch pyrofosfaat deel op de myo-inositol ring. Ze bestaan alomtegenwoordig in eukaryoten en werken als metabole boodschappers die fosfaathomeostase, insulinegevoeligheid en cellulaire energielading onderzoeken. Vanwege de afwezigheid van een chromofoor in deze metabolieten, een zeer hoge ladingsdichtheid en een lage abundantie, vereist hun analyse radioactieve tracer, en dus is het ingewikkeld en duur. Hier presenteert de studie een gedetailleerd protocol om absolute en hoge doorvoerkwantificering van inositolpyrofosfaten uit zoogdiercellen uit te voeren door capillaire elektroforese elektrospray ionisatie massaspectrometrie (CE-ESI-MS). Deze methode maakt de gevoelige profilering van alle biologisch relevante PP-InsPs-soorten in zoogdiercellen mogelijk, waardoor basisscheiding van regio-isomeren mogelijk wordt. Absolute cellulaire concentraties van PP-Insp's, inclusief kleine isomeren, en monitoring van hun temporele veranderingen in HCT116-cellen onder verschillende experimentele omstandigheden worden gepresenteerd.
Introduction
Sinds de eerste ontdekking van myo-inositol pyrofosfaten (PP-Insp's) in 1993 1,2, is aanzienlijke vooruitgang geboekt om hun biosynthese, omzet en functies op te helderen3. Inositolpyrosfaten komen alomtegenwoordig voor in eukaryote cellen4 en dienen als metabole signaalmoleculen die kritisch betrokken zijn bij bijvoorbeeld fosfaathomeostase 5,6, insulinegevoeligheid7, calciumoscillaties 8,9, vesiculaire handel10, apoptose11, DNA-reparatie12, immuunsignalering13 , en anderen. De overvloed aan belangrijke processen onder de controle van inositol pyrofosfaten vraagt om een dieper begrip van hun cellulaire overvloed, fluctuatie, en lokalisatie.
Hoewel Insp's en PP-Insp's de aandacht trokken in verschillende disciplines, wordt de analyse van hun abundantie routinematig uitgevoerd met behulp van een methode die in de jaren '80 is ontwikkeld, bestaande uit het labelen van cellen met tritiated inositol, waarbij de geëxtraheerde PP-InsP's worden opgelost door sterke anionenuitwisselingschromatografie Sax-HPLC met daaropvolgende scintillatietelling. Nieuwere methoden op basis van massaspectrometrie worden nog steeds geconfronteerd met aanzienlijke uitdagingen: inositolpyrofosfaat met maximaal acht fosfaateenheden herbergen fosfaatesters en anhydriden, wat leidt tot een aanzienlijke negatieve lading en potentieel fosfaatverlies tijdens ionisatie. Er zijn vier belangrijke soorten PP-Insp's gevonden bij zoogdieren (figuur 1): 1,5-(PP)2-InsP4 (of 1,5-InsP8), 5-PP-InsP5 (of 5-InsP7), 1-PP-InsP5 (of 1-InsP7) en 5-PP-Ins(1,3,4,6)P4 (of 5-PP-InsP4)3,14. De fysiologische niveaus van PP-Insp's liggen meestal in het nano- tot lage micromolaire bereik, met 5-PP-InsP5 als de meest voorkomende met cellulaire concentraties van 0,5 - 5 μM. 1,5-(PP)2-InsP4 en 1-PP-InsP5 worden verondersteld tot ongeveer 10% van de 5-PP-InsP5-pool te zijn en blijven moeilijk te traceren in veel cellen15. 5-PP-InsP4 met een vrije OH-groep is nog lager in overvloed en wordt meestal alleen detecteerbaar wanneer fosfaathydrolasen worden geremd met natriumfluoride (NaF)16.
De hoge ladingsdichtheid van PP-Insp's maakt hun scheiding moeilijk, en het optreden van PP-InsP-regio-isomeren bemoeilijkt deze inspanningen verder. Als gevolg hiervan vertrouwden de meeste experimenten op kwantificering door metabole radioactieve etikettering van cellen met behulp van [3H] -inositol, omdat achtergrond uit de matrix is uitgesloten en hoge gevoeligheid wordt bereikt17,18. Deze methode is echter kostbaar, tijdrovend en maakt het niet mogelijk om gerelateerde PP-InsP-regio-isomeren goed te onderscheiden. Bovendien, [3H] -inositol etikettering is niet verantwoordelijk voor endogene inositol synthese uit glucose. Een op polyacrylamide gel-elektroforese (PAGE) gebaseerde methode is een veel toegepast goedkoop alternatief, maar beperkt in zijn gevoeligheid 19,20,21,22. Andere benaderingen die radiolabeling vermijden, zijn gepubliceerd, waaronder ionchromatografie gevolgd door postkolomderivatisatie UV-detectie23, hydrofiele interactiechromatografie (HILIC)24 of zwakke anionenuitwisseling (WAX) in combinatie met massaspectrometrie (MS)25. Ze zijn echter (nog) niet op gelijke voet met het klassieke [3H]-inositol SAX-HPLC protocol.
Onlangs werd capillaire elektroforese elektrospray ionisatie massaspectrometrie (CE-ESI-MS) geïntroduceerd als een transformatieve strategie voor de analyse van Insp's en PP-InsPs metabolisme, die voldoen aan alle vereisten die hierboven16 zijn besproken. In combinatie met de huidige state-of-the-art InsP-extractie door perchloorzuur gevolgd door verrijking met titaandioxidekorrels26, slaagde CE-ESI-MS in elk tot nu toe getest organisme, van gist tot planten en zoogdieren. Gelijktijdige profilering van Insp's en PP-Insp's, inclusief alle mogelijke regio-isomeren, was gemakkelijk te bereiken. Stabiele interne standaarden (SIL) met isotooplabel maakten een snelle en nauwkeurige absolute kwantificering mogelijk, ongeacht matrixeffecten. Omdat MS isotopische massaverschillen kan opvangen, kan CE-ESI-MS ook worden toegepast om gecompartimenteerde cellulaire syntheseroutes van InsP's en PP-Insp's te bestuderen, bijvoorbeeld door cellen te voeden met [13C6]-myo-inositol of [13C6]-D-glucose.
Hier wordt een gedetailleerd stapsgewijs protocol beschreven voor de absolute kwantificering van PP-Insp's en Insp's uit zoogdiercellen door CE-ESI-MS. Naast het belangrijkste 5-PP-InsP5 isomeer, worden ook 1,5-(PP)2-InsP4 en 1-PP-InsP5 gekwantificeerd in deze studie, ondanks hun lagere abundantie. Twee HCT116-cellijnen van verschillende laboratoria (NIH, UCL) worden bestudeerd en er is gevalideerd dat HCT116UCL-cellen 7-voudig hogere niveaus van 1,5-(PP)2-InsP4 bevatten dan gevonden in HCT116NIH, terwijl 5-PP-InsP5-concentraties vergelijkbaar zijn. Bovendien is de 1-PP-InsP5-synthese in HCT116UCL niet significant verhoogd. Ook wordt de toename van PP-InsP-niveaus door hun defosforylering met natriumfluoride kwantitatief bestudeerd.
Protocol
1. Opzetten van het CE-ESI-MS-systeem
- Zet een CE-ESI-MS-systeem op dat bestaat uit een commercieel CE-systeem - en een drievoudige quadrupole tandem massaspectrometer, uitgerust met een Agilent Jet Stream (AJS) elektrospray ionisatie (ESI) bron. Een CE-ESI-MS spuitset en een isocratische LC (Liquid Chromatography) pomp zijn vereist.
- Sluit de manteldebiet 1:100 splitter (meegeleverd in de CE-MS spuitset) en de isocratische LC pompuitlaat aan.
- Zorg ervoor dat de injectieflacon van het CE-systeem zich op dezelfde hoogte bevindt als de sproeipunt van de massaanalysator.
- Gebruik het MassHunter Workstation (versie 10.1) of vergelijkbare MS-software om het hele systeem te besturen en voor gegevensverzameling en -analyse.
2. Buffer-, capillair- en CE-MS-systeem voorbereiden
- Ce-loopbuffer voorbereiden: Stel de pH van 40 mM ammoniumacetaat in op 9,0 met ammoniumhydroxide. Een maatkolf van 250 ml wordt aanbevolen. Filtreer de buffer van 250 ml met membraanfilters ter grootte van 0,2 μm. Zorg ervoor dat u alleen ultrazuiver gedeïoniseerd water en REAGENTIA van MS-kwaliteit gebruikt.
OPMERKING: Deze buffer kan 2-3 weken of enkele maanden in een koelkast op kamertemperatuur worden bewaard. - Bereid mantelvloeistof: Meng 100 ml ultrazuiver water en 100 ml isopropanol van LC-MS-kwaliteit in een fles van 250 ml. Vervang de mantelvloeistof minstens één keer per week. Voeg massareferentie toe aan de mantelvloeistof bij gebruik van een massaspectrometer met hoge resolutie.
- Mantelvloeistof installeren: spoel gedurende 5 minuten op 5 ml/min en stel het debiet in op 1 ml/min (10 μl/min in de CE-MS-sproeier). De pompdruk zal op ca. 180 bar liggen. Zorg ervoor dat de recyclebuis weer aansluit op de vloeibare fles om het oplosmiddel opnieuw te gebruiken.
- Capillair bereiden: Koop een CE-MS capillair (50 μm i.d. en 365 μM o.d. met een lengte van 125 cm) met een UV-detectievenster. De gebruiker kan ook veel goedkopere staafgesmolten silicacapillairen verkrijgen bij gespecialiseerde distributeurs. Snijd een capillair met een lengte van 100 cm. Snijd beide capillaire uiteinden goed met een capillaire kolomsnijder met een roterend diamantblad en verwijder 2-3 cm polyimidecoating aan beide uiteinden met een aansteker. Reinig het capillaire oppervlak met isopropanol.
- Capillair installeren: Giet het capillair in de CE-MS-cassette. Klik op de knop Cassette wijzigen en installeer de cassette in het CE-apparaat. Het inlaatuiteinde van het capillair is ongeveer 2 mm lager dan de elektrode. Zorg ervoor dat het inlaatuiteinde tijdens het injectieproces lager is dan het oppervlak van het monster.
- Activeer capillair: Spoel het capillair voor het eerste gebruik door met 1 M NaOH, gevolgd door water gedurende 10 minuten en CE-loopbuffer gedurende 15 minuten.
- Steek het capillaire uiteinde in de CE-MS-sproeier: plaats het capillair voorzichtig in de CE-MS-sproeier en zorg ervoor dat het capillaire uiteinde ongeveer 0,1 mm uit de spuitpunt steekt. Zorg ervoor dat u het capillaire uitlaateinde nauwkeurig afstelt met een vergrootglas en de stelschroef in de sproeier. Steek de sproeier terug in de ionenbron en raak de stelschroef niet aan. De MS staat in de stand-bymodus wanneer u deze bewerking uitvoert.
- ESI-spray controleren: Controleer de stabiliteit van de ESI-sproeier in de volledige scanmodus. De fluctuatie van totale ionenelektroferogrammen moet binnen 5% liggen.
- Voer een testrun uit met InsP-normen: gebruik een mengsel van 2 μM InsP 3-InsP8-normen (aangepast door kwantitatieve 31P NMR15,27) voor testruns met een injectie op 50 mbar gedurende 10 s (10 nL). Stel de gedetailleerde ESI- en MS-parameters in zoals weergegeven in tabel 1. De CE-stroom is ca. 26 μA. De piekbreedte is ongeveer 0,4-0,5 min. Zorg ervoor dat de signaal-ruisverhouding ten minste 400 bereikt.
3. Extractie van oplosbare inositolfosfaten uit zoogdiercellen
OPMERKING: HCT116NIH-cellen waren een vriendelijk geschenk van Stephen Shears28. HCT116UCL-cellen waren afkomstig uit Saiardi's Lab26.
- Zaaicellen
- Kweek HCT116NIH - of HCT116UCL-cellen in T75-kolven bij 37 °C in een CO2-atmosfeer met een hoge luchtvochtigheid van 5% (verder aangeduid als standaardomstandigheden) in Dulbecco's gemodificeerde adelaarsmedium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS).
- Was de HCT116NIH - en HCT116UCL-stamculturen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (5 ml) en incubeer de cellen met trypsine-ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) (3 ml, 0,25%) onder standaardomstandigheden totdat ze volledig zijn losgemaakt. Doof trypsine-activiteit door medium (7 ml) toe te voegen, verzamel de cellen in een centrifugebuis en centrifugeer (200 x g, 3 min).
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in medium (10 ml). Tel de cellen en bepaal de levensvatbaarheid via trypan blue exclusion.
- Zaai de cellen (6 miljoen HCT116-cellen per test) in een schaal van 150 mm en pas in totaal 20 ml celkweekmedium aan. Meng het medium en de cellen in een centrifugebuis voordat u gaat zaaien om een gelijke verdeling van de cellen in de schotel te bereiken. Bereid een parallelle schotel wanneer normalisatie op celnummer vereist is.
- Kweek de cellen onder standaardomstandigheden gedurende 72 uur. De cellen bereiken ongeveer 80% -90% samenvloeiing.
- Modulatie van inositolfosfaat niveaus met NaF en cel oogsten
- NaF-behandeling: Voeg NaF (10 mM) 1 uur toe voordat u het in het medium oogst. Meng het medium door de plaat/pipettering te draaien en incubeer de cellen gedurende 60 minuten onder standaardomstandigheden.
- Verwijder na de NaF-behandeling het medium uit de cellen en plaats de cellen op ijs.
- Was de cellen twee keer met PBS (5 ml, 4 °C) en verwijder de PBS volledig uit de schaal.
- Voeg perchloorzuur (PA) (1 ml, 1 M, 4 °C) toe. Zorg ervoor dat u het hele oppervlak bedekt met PA (de cellen worden wit als eiwitten neerslaan). Incubeer de cellen gedurende 10 minuten op een kanteltafel bij 4 °C.
- Verzamel PA in een centrifugebuis en verwijder het verontreinigende vuil door centrifugering (17.000 x g, 5 min, 4 °C). Voeg het supernatant toe aan de voorbereide TiO2-kralen voor het afzetten van Insp's.
- Was de naextractieschaal tweemaal met PBS (5 ml, r.t.) voor ontzuring; verwijder PBS volledig uit de schaal.
- Verzacht de eiwitten op de plaat via de toevoeging van cellysisbuffer (1,5 ml, r.t.; 0,1% natriumdodecylsulfaat [SDS] in 0,1 M NaOH). Incubeer het gerecht gedurende 15 minuten op een kanteltafel bij r.t. Breng het cellysaat over in een centrifugebuis en centrifugeer (17.000 x g, 5 min, 4 °C). Bewaar het supernatant bij -80 °C totdat de eiwitconcentratie wordt bepaald via de DC-eiwittest met runderserumalbumine als kalibratiestandaard (meestal bevat één schaal van 150 mm ongeveer 10 mg eiwitten).
- Bepaling van celaantallen uit parallelle schotels: Oogst de cellen van de parallelle schotel via trypsine zoals beschreven in stap 3.1.2 (gebruik 5 ml trypsine-EDTA voor de schaal van 150 mm) en verwijder het medium. Resuspendeer de celpellet in PBS (5 ml), meng goed en tel de cellen. Voer deze stap vlak voor de oogst uit via direct blussen om representatieve celtellingen te verkrijgen. Meet bovendien het volume van de cellen met een geschikte methode (bijvoorbeeld met een multisizermachine).
- TiO2 verrijking van inositolfosfaten
OPMERKING: Om zure ontleding van gefosforyleerde verbindingen te voorkomen, voert u alle verrijkingsstappen uit tot elutie op ijs en koelt u alle reagentia af tot 4 °C. Beperk de tijd voor de extractie tot een minimum (1,5-2 uur). Voer alle extractiestappen uit met 1 M PA.- Bereiding van kralen: Was TiO2-kralen (5 mg per monster) met ddH2O (1 ml) en centrifuge (3.500 x g, 1 min, 4 °C). Verwijder ddH2O en was de kralen met PA (1 ml). Verwijder PA door centrifugeren (3.500 x g, 1 min, 4 °C). Resuspendeer de kralen in PA (50 μL per monster).
- Voeg het supernatant dat gefosforyleerde verbindingen bevat (vergelijk punt 3.2, stap 3.2.5) toe aan de kragelsuspensie, vortex en draai het monster vervolgens gedurende 20 minuten bij 4 °C.
- Centrifugeer het monster (3.500 x g, 1 min, 4 °C) en gooi het supernatant weg. Was de kralen met PA (500 μL) en centrifugeer (3.500 x g, 1 min, 4 °C). Gooi het supernatant weg en herhaal de wasstap.
- Voeg NH4OH (200 μL, 3%) toe aan de kralen en resuspend. Draai het monster gedurende 5 minuten op r.t.
- Centrifugeer het monster (3.500 x g, 1 min) en breng het supernatant over in een nieuwe centrifugebuis.
- Herhaal de elutiestappen 3.3.4 en 3.3.5 en combineer de eluenten. Gooi de kralen weg.
- Centrifugeer de gecombineerde eluenten (17.000 x g, 1 min, 4 °C) om eventuele onoplosbare residuen te verwijderen.
- Droog het supernatant volledig onder vacuümverdamping (70 min, 60 °C, V-AQ). Voeg ddH2O (50 μL) toe aan de gedroogde extracten die InsP's bevatten. Vortex om het monster te mengen tot het volledig is opgelost. Bewaar het monster bij -20 °C tot de CE-ESI-MS-analyse.
4. Uitvoeren van de CE-ESI-MS runs
- Bereid een mengsel van interne standaarden met 40 μM [13C6]1,5-(PP)2-InsP4, 80 μM [13C6]5-PP-InsP5, 80 μM [13C6]1-PP-InsP5, 400 μM [13C6]InsP6 en 400 μM [13C6]Ins(1,3,4,5,6)P5. Bepaal de concentraties van SIL IS-oplossingen met kwantitatieve 31P en 1H NMR, met behulp van een gecertificeerde referentiestandaard, d.w.z. fosfazijnzuur.
OPMERKING: Alle boven SIL interne normen (IS) met zuiverheiden hoger dan 96% werden gesynthetiseerd en geleverd door Fiedler groep15,27. Net als bij nucleotiden kunnen deze IS veel kristalwatermoleculen en diverse tegenionen dragen. In plaats van de stof te wegen en de concentratie te berekenen, wordt aanbevolen de concentratie te bepalen met 13C6 standaardoplossingen met kwantitatieve 31P NMR. - Meng 10 μL van het monster met 0,5 μL intern standaardmengsel in een injectieflacon met CE-monster. 2 μM [13C6]1,5-(PP)2-InsP4, 4 μM [13C6]5-PP-InsP5, 4 μM [13C6]1-PP-InsP5, 20 μM [13C6]InsP6 en 20 μM [13C6]Ins(1,3,4,5,6)P5 zijn de eindconcentraties in de monsters.
- Wanneer u het bevoorradingssysteem gebruikt, klikt u op de knop Fles wijzigen , plaatst u de voorbereide 250 ml CE-loopbuffer in de elektrolytfles en klikt u op Schone buizen. Bewaar de vulnaald in een injectieflacon met water.
- Stel ESI- en MS-parameters in zoals weergegeven in tabel 1. Optimaliseer de bronparameters met behulp van een Source Optimizer met een mengsel van inositol polyfosfaat normen. Verkrijg de mrm-instellingen (multiple reaction monitoring) met Masshunter Optimizer met alle standaarden. Pas de ESI- en MS/MS-instellingen aan voor verschillende instrumentatie.
- Voer een run uit voor de InsP-extracten en controleer het resultaat (figuur 2). Stel een volgorde in wanneer er meer voorbeelden zijn.
- Laat de MS na metingen in de stand-bymodus staan. Schakel de LC-pomp niet uit. De stroom van mantelvloeistof beschermt de spuitnaald. Vervang de CE-ESI-MS-sproeier door een LC-ESI-MS-sproeier wanneer er geen toevoer van mantelvloeistof is.
5. Data-analyse
- Open kwantitatieve analyse (voor QQQ) software, maak een batch voor alle monsters.
- Maak een nieuwe methode op basis van de verkregen MRM-gegevens. Stel de [13C6]Insp's in als interne standaarden - (ISTD). Controleer mrm compound setup, retention time setup, ISTD setup, concentration setup en qualifier setup. Geef de validatie door en sluit af om de methode toe te passen op de huidige batch. Sla de methode op.
- Controleer of elke piek in de batch goed is geïntegreerd; anders de piek handmatig integreren.
- Exporteer de resultaten naar een spreadsheet. Voer de kwantificering van inositol (pyro)fosfaten uit door de analytpiekrespons te vergelijken met de respectieve piekrespons van SIL IS met bekende concentraties. Theoretische en experimentele kalibratiecurven zijn weergegeven in tabel 2 voor 5-PP-InsP5, InsP6 en Ins(1,3,4,5,6)P5 met het lineaire bereik.
OPMERKING: De voorwaarde voor het toepassen van de theoretische kalibratiecurve is het gebruik van een hoogwaardig isotopisch patroon van gerichte analyten en met een geloofwaardige concentratie. Evalueer het lineaire bereik. Een kalibratiecurve is essentieel voor absolute kwantificering wanneer de volledige verwerving van de bovengenoemde isotopische normen onpraktisch is. - Bereken met de gemeten concentratie in de InsP-extractoplossing en het volume ervan de absolute hoeveelheden. Normaliseer verder de hoeveelheid door celtellingen of eiwitgehalte. Bereken de cellulaire concentratie op basis van het aantal cellen en het gemiddelde celvolume van HCT116 (1,68 fL).
Representative Results
De hier getoonde resultaten zijn bedoeld om het potentieel van CE-ESI-MS-analyse te illustreren. De gerapporteerde cijfers beschrijven een technisch foutloze CE-ESI-MS-run. Ten eerste wordt een mengsel van inositolpyrofosfaatnormen (figuur 1) en een zoogdiercelextract (figuur 2) gepresenteerd. Ten tweede wordt een vergelijking gegeven van twee HCT116-cellijnen (figuur 3) en met NaF behandelde HCT116 (figuur 4) cellen.
Geëxtraheerde ionenelektroferogrammen (EIE's) van inositol (pyro)fosfaatstandaarden met een concentratie van 2 μM zijn weergegeven in figuur 1. Metabolisme van inositolpyrosfaten bij zoogdieren met hun vereenvoudigde structuren wordt ingevoegd. De vier inositolpyrosfaten bij zoogdieren, 1,5-(PP)2-InsP4, 5-PP-InsP5, 1-PP-InsP5 en 5-PP-Ins(1,3,4,6)P4 worden goed onderscheiden met behulp van de beschreven methode. Een CE-ESI-MS run van HCT116UCL is afgebeeld in figuur 2. Met behulp van stabiele interne standaarden met isotooplabel (SIL) kan een absolute kwantificering gemakkelijk worden bereikt door de signaalrespons te vergelijken met de spiked-in SIL van de bekende concentratie. De geïntegreerde EIE's van het inositolfosfaat van InsP5 tot (PP)2-InsP4 en niet-geïntegreerde EIE's van hun isotopische patronen worden weergegeven. RSD's van alle analyten van zes technische herhalingen liggen binnen 4%. Met de gemeten concentratie en het volume van extracten kan de hoeveelheid analyten worden berekend. Met het celaantal en het celvolume, of eiwitgehalte, zijn absolute cellulaire concentratie (μM) of hoeveelheid genormaliseerd door eiwitgehalte (pmol / mg eiwit) meestal de uiteindelijke uitkomsten van een dergelijke analyse.
Volgens een eerdere studie hebben twee batches van diverged HCT116-cellen een variatie van InsP8-niveaus, HCT116UCL-cellen bevatten 6-voudig hogere niveaus van InsP8 dan HCT116NIH-cellen 29. Met de CE-MS-methode kan 1,5-(PP)2-InsP4 in HCT116NIH gemakkelijk worden gekwantificeerd (figuur 3) en HCT116UCL-cellen bevatten 7-voudig hogere niveaus van InsP8 dan in HCT116NIH. Bovendien wordt een significante accumulatie van 1,5-(PP)2-InsP4 in HCT116UCL-cellen parallel getrokken door een significant verhoogde 1-PP-InsP5, die nu kwantitatief wordt weergegeven in figuur 3.
PP-InsP-niveaus nemen toe door hun defosforylering te remmen met behulp van natriumfluoride. CE-ESI-MS-analyse van met NaF behandelde HCT116NIH-cellen toonde de -5-PP-InsP5-verhoging aan, samen met een vermindering van InsP6 en een verschijning van 5-PP-Ins (1,3,4,6) P4 (figuur 4). Bovendien is de verhoging van InsP8-niveaus merkbaar, terwijl 1-PP-InsP5 tot op zekere hoogte afneemt. 1-PP-InsP5 is niet volledig afwezig bij met NaF behandelde HCT116NIH, maar meestal onder de detectiegrens of kwantificering.
Figuur 1: Typische geëxtraheerde ionenelektroferogrammen (EIE's) van inositol (pyro)fosfaatnormen in CE-ESI-MS-analyse met behulp van het beschreven protocol. De concentratie van elke analyt is 2 μM. Het geïnjecteerde monstervolume is ca. 10 nL met een injectie op 50 mbar gedurende 10 s. Inserts tonen het metabolisme van inositol pyrofosfaten bij zoogdieren. IPPK: inositol pentakisfosfaat 2-kinase, IP6K: inositol hexakisfosfaatkinase, PPIP5K: difosfoinositol pentakisfosfaatkinase, DIPP1: difosfoinositolpolyfosfaatfoshydrolase 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatief InsP-profiel van HCT116UCL-cellen. (A) EIE's van de belangrijkste inositol (pyro)fosfaten in HCT116NIH en spiked SIL ISs 2 μM [13C6]1,5-(PP)2-InsP4 (1), 4 μM [13C 6]5-PP-InsP5 (2), 4 μM [13C6]1-PP-InsP5 (3), 20 μM [13C6]InsP6 (4), en 20 μM [13C6]Ins(1,3,4,5,6)P5 (5). Inserts tonen zes technische herhalingen van InsP-analyse door CE-ESI-MS, gegevens worden gepresenteerd als middelen ± SD. (B) Cellulaire concentratie van PP-InsP's en InsP's in menselijke cellijnen HCT116UCL en (C) PP-InsP's en InsP's hoeveelheid genormaliseerd door eiwitgehalte. Gegevens zijn middelen ± SEM uit drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Variatie in InsP8 niveaus tussen twee diverged HCT116 cellen. A) EIEs van inositolpyrofosfaat inHCT116UCL en HCT116NIH. InsP8 in HCT116UCL is aanzienlijk overvloediger dan in HCT116NIH. (B) Verhouding van inositolpyrofosfaat tot InsP6 (%) in beide HCT116-cellen. HCT116UCL-cellen bevatten 7-voudig hogere niveaus van InsP8 in vergelijking met in HCT116NIH, terwijl de 5-PP-InsP5-niveaus gelijk zijn. Gegevens zijn middelen ± SEM uit drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Inositol (pyro)fosfaat niveaus in HCT116NIH cellen, met NaF behandeling. (A) EIE's van inositol (pyro)fosfaat in HCT116NIH met natriumfluoridebehandeling (NaF, 10 mM). Niveaus van inositolpyrofosfaat, waaronder 1,5-(PP)2-InsP4, 5-PP-InsP5 en 5-PP-Ins(1,3,4,6)P 4 verhogen viahet blokkeren van hun defosforylering met behulp van NaF. (B) Inositol (pyro)fosfaat niveaus (hoeveelheden worden genormaliseerd door eiwitgehalte) in onbehandelde en NaF-behandelde HCT116NIH cellen. Gegevens zijn middelen ± SEM uit drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: CE-ESI-MS parameterinstellingen. Source parameter en iFunnel parameters worden geoptimaliseerd door Source en iFunnel Optimizer. MSM parameter instellingen voor inositol (pyro)fosfaten worden geoptimaliseerd door MassHunter Optimizer. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Theoretische en experimentele regressievergelijking. De concentratie van [13C6]5-PP-InsP5 [13C6]InsP6 en [13C6]Ins (1, 3, 4, 5, 6)P5 is respectievelijk 4 μM, 20 μM en 20 μM. Voor regressievergelijking is de 5-PP-InsP5-concentratie op 0,04 μM, 0,1 μM, 0,2 μM, 0,4 μM, 1 μM, 2 μM, 4 μM, 8 μM, 16 μM, 24 μM. InsP6 en Ins (1, 3, 4, 5, 6)P5 concentratie is op 0,2 μM, 0,5 μM, 1 μM, 2 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 120 μM. x is concentratie, y is (Area InsP)12C/(Area InsP)13C. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Discussion
Hier gepresenteerd is een praktische en gevoelige methode voor de kwantificering van sterk geladen inositol pyrofosfaten in zoogdiercellen. Door deze analysebenadering te combineren met de huidige state-of-the-art InsP-extractie met perchloorzuur gevolgd door verrijking met TiO2, heeft CE-ESI-MS-analyse ongekende voordelen. Met betrekking tot de doorvoer, gevoeligheid, stabiliteit, absolute kwantificering, isomeeridentificatie en matrixafhankelijkheid onderscheidt deze methode zich in vergelijking met andere benaderingen. Dit protocol is van toepassing op zoogdiercellen, maar deze strategie slaagt inderdaad in veel verschillende monsters (bijv. Gist, planten, parasieten, muizenweefsels, enz.).
Het toegepaste extractieprotocol herstelt PP-InsP's en InsP6 volledig uit zoogdiercelextracten16,19. Het zal ook vele andere anionische metabolieten extraheren, met name fosfaatbevattende soorten, bijvoorbeeld suikerfosfaten en nucleotiden. Evaluatie van het herstel en de ontbinding voor de analyten van de gebruiker met dit protocol zou noodzakelijk zijn.
Over het algemeen werkt het CE-ESI-MS-systeem soepel en biedt het plaats aan ongeveer 200 monsters per week met behulp van dit protocol. In tegenstelling tot HPLC wordt CE echter al lange tijd beschouwd als een methode voor experts en gespecialiseerde personen, waardoor de markt werd beperkt en de toepassing ervan werd beperkt. Een CE-ESI-MS-apparaat is dus meestal afwezig in analytische vermogens. Mensen die CE-ESI-MS-analyses willen uitvoeren, hebben waarschijnlijk geen CE-ervaring en zullen meer tijd besteden aan het oplossen van problemen. Hier worden de kritieke stappen gemarkeerd. Eerst en vooral is de kwaliteit van de capillaire snede. De gevoeligheid en stabiliteit van ESI-spray zijn meestal afhankelijk van een eersteklas capillaire snede. Ten tweede moet het capillaire uitlaatuiteinde precies 0,1 mm uit de spuitpunt liggen. De spuitnaald en het CE-capillair moeten in de axiale richting zijn. De kwaliteit van de ESI-spray is van cruciaal belang voor kwantificering; er moeten technische runs worden uitgevoerd om de herhaalbaarheid te evalueren.
Met het beschreven protocol is de limiet van kwantificering (LOQ) voor PP-Insp's 40 nM met een injectie op 50 mbar gedurende 10 s (10 nL). Er zijn verschillende benaderingen om de gevoeligheid van de methode verder te verhogen. Ten eerste zal een injectie op 100 mbar gedurende 20 s (40 nL) nog steeds resulteren in een goede piekvorm en voldoende resolutie voor regio-isomeren 5-PP-InsP5 en 1-PP-InsP5. Ten tweede kunnen InsP-extracten worden opgelost in een kleinere hoeveelheid water. Ten derde kan de verblijftijd worden verlengd wanneer minder MRM-overgangen worden gebruikt voor kwantificering. Bovendien zou een CE-MS-ionenbron met behulp van een ultralage mantelvloeistofstroom de gevoeligheid aanzienlijk verhogen.
De CE-loopbuffer met pH 9 biedt de beste resolutie tussen InsP 6-InsP8. Bij het verhogen van de pH tot 9,7 zal de resolutie onder InsP 3-InsP6 aanzienlijk verbeteren. Vanwege de uitstekende resolutie wordt een kortere capillaire lengte van 72 cm aanbevolen voor het verder verhogen van de doorvoer. Bovendien verlaagt een hogere CE-cassettetemperatuur bij 40 °C de viscositeit van de waterige elektroforetische buffer en versnelt hun beweging onder EOF. Volgens verschillende onderzoeksvereisten kunnen wijzigingen van deze methode de Analyse van InsP's en PP-Insp's verder vergemakkelijken. Daarom hebben de beschreven CE-ESI-MS-protocollen het potentieel om nieuwe onderzoeksmogelijkheden te openen naar deze veelzijdige familie van signaalmoleculen.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
Dit project heeft financiering ontvangen van de European Research Council (ERC) in het kader van het Horizon 2020 onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie (subsidieovereenkomst nr. 864246, aan HJJ). DQ erkent de financiële steun van het Brigitte-Schlieben-Lange-Programm. AS wordt ondersteund door de MRC-programmasubsidie MR/T028904/1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Greiner Bio-One | 616201 | - |
| 15 cm tissue culture dishes | Thermo Fisher | 168381 | - |
| 2.0 mL microcentrifuge tubes | Greiner Bio-One | 623201 | - |
| 50 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 227261 | - |
| 96-well plates | Thermo Fisher | 260836 | for the DC protein assay |
| CE fused silica capillary | CS Chromatographie | 105180 | 50 µM i.d. 360 µM o.d. |
| Pipette tips | Starlab | I1054-0001, S1111-6701, S1113-1700, S1111-3700 | 10 mL, 1000 µL, 200 µL, 10 µL pipette tips |
| Serological pipets | TPP | 94550, 94525, 94010, 94005 | 50 mL, 25, mL, 10 mL, 5 mL serological pipettes |
| T75 flasks | TPP | 90076 | - |
| Chemicals and Reagents | |||
| NaOH | AppliChem | A6829,0500 | sodium hydroxide pellets for molecular biology, for preparation of cell lysis buffer |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | - |
| Ammonium acetate | Thermo Fisher | 1677373 | HPLC grade |
| BSA | Thermo Fisher | 23209 | albumin standard (2.0 mg/mL) for standard curve preparation |
| DC protein assay | Biorad | 5000116 | DC protein assay reagents package |
| DMEM | Gibco | 41966029 | high glucose, pyruvate |
| FBS | Gibco | 10270106, 10500064 (heat inactivated) | 10270106 for HCT116UCL, 10500064 for HCT116NIH |
| Isopropanol | Carl Roth | AE73.2 | 99.95% LC-MS grade |
| NH4OH, 10% | Carl Roth | 6756.1 | for preparation of 3% NH4OH |
| PBS | Gibco | 10010015 | - |
| Perchloric acid, 70% | Carl Roth | 9216.1 | for preparation of 1 M perchloric acid |
| SDS | SERVA | 20760.02 | for preparation of cell lysis buffer |
| Sodium fluoride | Sigma Aldrich | S7920 | - |
| TiO2 beads | GL Sciences | 5020-75000 | 5 µm particle size |
| Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | trypan blue stain (0.4%) |
| Ultrapure (Type 1) water | Milli-Q | ZRQSVP3WW | model: Direct-Q 3 UV Water Purification System |
| Equipment | |||
| Analytical balance | Mettler Toledo | 30105893 | model: XPE26; for weighing of beads (5-6 mg per sample) |
| Automated cell counter | Logos Biosystems | L40002 | model: LUNA-II Automated Cell Counter |
| Benchtop centrifuge | Hettich | 1401 | model: UNIVERSAL 320 |
| Benchtop centrifuge with cooling | VWR | 521-1647P | model: Microstar 17R |
| CE system | Agilent | G7100A | - |
| CE/MS Adapter Kit | Agilent | G1603A | - |
| CE/MS Sprayer Kit | Agilent | G1607A | - |
| Cell counting slides | Logos Biosystems | L12001 | LUNA Cell Counting Slides |
| Centrifugal evaporator | Eppendorf | 5305000304 | model: Concentrator plus complete system |
| ESI source | Agilent | AJS ESI | - |
| Super Support Film | Nisshin EM Co. Ltd, Tokyo | 647 | |
| Humidified incubator | Binder | 9040-0088 | model: CB E6.1, for cultivation of mammalian cells |
| Ice box | - | - | should provide enough space for samples, dishes, etc. |
| Isocratic LC system | Agilent | G7110B 1260 Iso Pump | model: Infinity II Quaternary system |
| MSD | Agilent | G6495C | triple quadrupole |
| Multiplate reader | Tecan | 30086375 | model: SPARK 10 M |
| Pipette filler | Thermo Fisher | 10072332 | for serological pipettes |
| Pipettes | Brand | 705884, 705880, 705878, 705872, 705870 | various pipettes |
| Rotator | Labnet | H5500 | model: Mini LabRoller Rotator |
| Shortix capillary column cutter | SGT | S0020 | - |
| Test tube shaker (vortex mixer) | Carl Roth | HXH6.1 | model: Rotilabo-Mini Vortex |
| Tilt table | Labnet | S0600 | model: EDURO MiniMix Nutating Mixer |
| Water bath | Thermo Fisher | FSGPD05 | model: Isotemp GPD 05 |
| Software | |||
| MassHunter Workstation | Agilent | Version 10.1 | - |
| MassHunter Workstation LC/MS Data Acquisition | Agilent | Version 10.1 | - |
| MassHunter Workstation Optimizer | Agilent | Version 10.1 | - |
| MassHunter Workstation Qualitative Analysis | Agilent | Version 10.0 | - |
| QQQ Quantitaion Analysis | Agilent | Version 10.1 | - |
References
- Stephens, L., et al. The detection, purification, structural characterization, and metabolism of diphosphoinositol pentakisphosphate(s) and bisdiphosphoinositol tetrakisphosphate(s). The Journal of Biological Chemistry. 268 (6), 4009-4015 (1993).
- Menniti, F. S., Miller, R. N., Putney, J. W. Jr, Shears, S. B. Turnover of inositol polyphosphate pyrophosphates in pancreatoma cells. The Journal of Biological Chemistry. 268 (6), 3850-3856 (1993).
- Shears, S. B. Inositol pyrophosphates: Why so many phosphates. Advances in Biological Regulation. 57, 203-216 (2015).
- Irvine, R. F., Schell, M. J. Back in the water: the return of the inositol phosphates. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (5), 327-338 (2001).
- Szijgyarto, Z., Garedew, A., Azevedo, C., Saiardi, A. Influence of inositol pyrophosphates on cellular energy dynamics. Science. 334 (6057), 802-805 (2011).
- Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
- Chakraborty, A., et al. Inositol pyrophosphates inhibit Akt signaling, thereby regulating insulin sensitivity and weight gain. Cell. 143 (6), 897-910 (2010).
- Bittner, T., et al. Photolysis of caged inositol pyrophosphate InsP8 directly modulates intracellular Ca2+ oscillations and controls C2AB domain localization. Journal of the American Chemical Society. 142 (24), (2020).
- Hauke, S., et al. Photolysis of cell-permeant caged inositol pyrophosphates controls oscillations of cytosolic calcium in a β-cell line. Chemical Science. 10 (9), 2687-2692 (2019).
- Saiardi, A., Sciambi, C., McCaffery, J. M., Wendland, B., Snyder, S. H. Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14206-14211 (2002).
- Koldobskiy, M. A., et al. p53-mediated apoptosis requires inositol hexakisphosphate kinase-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (49), 20947 (2010).
- Rao, F., et al. Inositol hexakisphosphate kinase-1 mediates assembly/disassembly of the CRL4-signalosome complex to regulate DNA repair and cell death. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16005 (2014).
- Williams, S. P., Gillaspy, G. E., Perera, I. Y. Biosynthesis and possible functions of inositol pyrophosphates in plants. Frontiers in Plant Science. 6, 67 (2015).
- Wilson, M. S. C., Livermore, T. M., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates: between signalling and metabolism. The Biochemical Journal. 452 (3), 369-379 (2013).
- Harmel, R. K., et al. Harnessing 13C-labeled myo-inositol to interrogate inositol phosphate messengers by NMR. Chemical Science. 10 (20), 5267-5274 (2019).
- Qiu, D., et al. Analysis of inositol phosphate metabolism by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nature Communications. 11 (1), 6035 (2020).
- Azevedo, C., Saiardi, A. Extraction and analysis of soluble inositol polyphosphates from yeast. Nature Protocols. 1 (5), 2416-2422 (2006).
- Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of radioactive labelling to elucidate inositol polyphosphate signalling. Phosphate Labeling and Sensing in Chemical Biology. , 67-87 (2017).
- Wilson, M. S. C., Bulley, S. J., Pisani, F., Irvine, R. F., Saiardi, A. A novel method for the purification of inositol phosphates from biological samples reveals that no phytate is present in human plasma or urine. Open Biology. 5 (3), 150014 (2015).
- Losito, O., Szijgyarto, Z., Resnick, A. C., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates and their unique metabolic complexity: analysis by gel electrophoresis. PloS One. 4 (5), 5580 (2009).
- Dong, J., et al. Inositol pyrophosphate InsP8 acts as an intracellular phosphate signal in arabidopsis. Molecular Plant. 12 (11), 1463-1473 (2019).
- Riemer, E., et al. ITPK1 is an InsP6/ADP phosphotransferase that controls systemic phosphate homeostasis in Arabidopsis. bioRxiv. , (2020).
- Whitfield, H., et al. An ATP-responsive metabolic cassette comprised of inositol tris/tetrakisphosphate kinase 1 (ITPK1) and inositol pentakisphosphate 2-kinase (IPK1) buffers diphosphosphoinositol phosphate levels. The Biochemical Journal. 477 (14), 2621-2638 (2020).
- Ito, M., et al. Hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantitative analysis of mammalian-derived inositol poly/pyrophosphates. Journal of chromatography. A. 1573, 87-97 (2018).
- Mantilla, B. S., Amaral, L. D. D., Jessen, H. J., Docampo, R. the inositol pyrophosphate biosynthetic pathway of Trypanosoma cruzi. ACS Chemical Biology. 16 (2), 283-292 (2021).
- Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Inositol phosphates purification using titanium dioxide beads. Bio-Protocol. 8 (15), 2959 (2018).
- Puschmann, R., Harmel, R. K., Fiedler, D. Scalable chemoenzymatic synthesis of inositol pyrophosphates. Biochemistry. 58 (38), 3927-3932 (2019).
- Gu, C., et al. KO of 5-InsP7 kinase activity transforms the HCT116 colon cancer cell line into a hypermetabolic, growth-inhibited phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 11968-11973 (2017).
- Gu, C., Wilson, M. S. C., Jessen, H. J., Saiardi, A., Shears, S. B. Inositol Pyrophosphate Profiling of Two HCT116 Cell Lines Uncovers Variation in InsP8 Levels. PloS One. 11 (10), 0165286 (2016).
