Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

En tredimensionel spheroid model til at undersøge tumor-stromal interaktion i hepatocellulær karcinom

Published: September 30, 2021 doi: 10.3791/62868
Automatic Translation
*1,2, *2, 2, 2, *3, *4,5
1Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Minia University, 2National Institute for Health Research Birmingham Liver Biomedical Research Unit and Centre for Liver and Gastrointestinal Research, Institute of Immunology and Immunotherapy, University of Birmingham, 3Newcastle Fibrosis Research Group, Biosciences Institute, Faculty of Medical Sciences, Newcastle University, 4Newcastle University Translational and Clinical Research Institute, Faculty of Medical Sciences, Newcastle University, 5The Liver Unit, Department of Medicine, Freeman Hospital, Newcastle-upon-Tyne Hospitals NHS Foundation Trust
* These authors contributed equally

Summary

Omfattende in vitro-modeller , der trofast generobrer den relevante menneskelige sygdom, mangler. Den nuværende undersøgelse præsenterer tre-dimensionelle (3D) tumor spheroid skabelse og kultur, en pålidelig in vitro værktøj til at studere tumor-stromal interaktion i human hepatocellulær karcinom.

Abstract

Aggressivitet og mangel på veltolereret og bredt effektive behandlinger for avanceret hepatocellulær karcinom (HCC), den fremherskende form for leverkræft, rationalisere sin rang som den næsthyppigste årsag til kræft-relaterede død. Prækliniske modeller skal tilpasses for at generobre de menneskelige forhold for at vælge de bedste terapeutiske kandidater til klinisk udvikling og støtte leveringen af personlig medicin. Tre-dimensionelle (3D) cellulære spheroid modeller viser lovende som en spirende in vitro alternativ til to-dimensionelle (2D) monolayer kulturer. Her beskriver vi en 3D tumor spheroid model, der udnytter de enkelte cellers evne til at samle, når de vedligeholdes i hængende dråber, og er mere repræsentativ for et in vivo-miljø end standardmonomer. Desuden kan 3D-spheroider produceres ved at kombinere homotypice eller heterotypice celler, mere reflekterende af den cellulære heterogenitet in vivo, potentielt muliggør undersøgelse af miljømæssige interaktioner, der kan påvirke progression og behandling svar. Den nuværende forskning optimerede celletætheden til at danne 3D homotypic og heterotypic tumorspheroider ved at immobilisere celleaffjedring på lågene på standard 10 cm3 Petriskåle. Langsgående analyse blev udført for at generere vækstkurver for homotypic versus heterotypic tumor / fibroblaster spheroids. Endelig blev de proliferative virkninger af fibroblaster (COS7-celler) og levermyofibroblaster (LX2) på homotypic tumor (Hep3B) spheroider undersøgt. En såningstæthed på 3.000 celler (i 20 μL-medier) gav med succes Huh7/COS7 heterotypic spheroids, som viste en støt stigning i størrelse op til kultur dag 8, efterfulgt af væksthæmning. Dette fund blev bekræftet ved hjælp af Hep3B homotypic spheroids dyrkes i LX2 (human hepatisk stellate celle linje) betinget medium (CM). LX2 CM udløste spredningen af Hep3B spheroids sammenlignet med kontrol tumorspheroider. Afslutningsvis har denne protokol vist, at 3D tumorspheroider kan bruges som et simpelt, økonomisk og prescreen in vitro-værktøj til at studere tumor-stromale interaktioner mere omfattende.

Introduction

Den globale forekomst og dødelighed fra leverkræft er fortsat med at stige, på trods af fremskridt i behandlinger for leversygdom og de fleste andre former for kræft. I 2018 overgik leverkræft kolorektal og mavekræft for at blive den næsthyppigste årsag til kræftrelateret død globalt1. I 2020 var der mere end 9.00.000 nye diagnoser, der tegner sig for 4,7% af de samlede kræfttilfælde på verdensplan1. Dette er især skuffende, da de væsentlige risikofaktorer for udviklingen af HCC, den mest almindelige form for leverkræft, er godt karakteriseret2. Skrumpelever er den mest almindelige risikofaktor for udviklingen af HCC, med 80% af tilfældene udvikler sig på baggrund af etablerede skrumpelever2. Kroniske leversygdomme, som udvikler sig til skrumpelever, og dermed HCC, omfatter Hepatitis B-virus (HBV), Hepatitis C-virus (HCV), alkohol-relaterede leversygdom (ARLD), ikke-alkoholiske fedtlever sygdomme (NAFLD) - sidstnævnte tilskrives fedme og type 2 diabetes mellitus (T2DM)2,3. De nuværende forvaltningsprotokoller for HCC er faseafhængige og begrænsede for dem med fremskreden kræft, som oftest har et dårligt resultat4. Der har været betydelige fremskridt ved hjælp af kinase hæmmere og, for nylig, immun-onkologi behandlinger, men realistisk, gavner kun et mindretal af patienter med fremskreden leverkræft5. Desuden er der bekymring for, at HCCs opstår hos patienter med NAFLD - den hurtigst voksende underliggende årsag, der tegner sig for mere end 50% af nydiagnosticerede HCC tilfælde i vestlige nationer, kan være mere resistente over for programmeret død 1 (PD1) checkpoint hæmmer terapi6.

Der har været en massiv investering i kliniske forsøg for patienter med HCC, herunder betydelige forbedringer i kliniske forsøg og deres endpoints7. Efter et årti med fiaskoer er disse investeringer begyndt at ændre patienternes muligheder. Virkeligheden er imidlertid, at den samlede andel af respondenter fortsat er relativt dårlig, med patienter rekrutteret til forsøg ofte dårligt repræsenterer dem, der passes i klinikkerne. Faren er, at fremskridtene er dyre og gavner de få snarere end de mange. Efterhånden som der opstår flere kandidatbehandlinger til engangsbrug eller kombination, er det vigtigt at have prækliniske modeller mere prædiktive for in vivo-reaktioner. Disse vil sandsynligvis være modeller, der inkorporerer yderligere faktorer, der bidrager til variationen set i patientens reaktioner, der bedre afspejler menneskelig HCC-heterogenitet og patologisk kompleksitet8. Systemer, der genskaber de in vivo patofysiologiske tilstande i HCC er nødvendige for at hjælpe med at forstå biologi tumor evolution, vækst og progression. De eksisterende eksperimentelle modeller for kroniske leversygdomme og HCC falder normalt ind under tre hovedkategorier: in vivo dyrebaserede modeller (gennemgået i 9), in vitro-kulturer10 og ex vivo11,12 modeller. Dyrebaserede tilgange anvendes i vid udstrækning til at studere kroniske leversygdomme, herunder HCC; Den genetiske variation, høje driftsomkostninger og de forskellige immunsystemer mellem arter er imidlertid blandt de vigtigste begrænsninger for anvendelsen af sådanne modeller9. Mens nogle ex vivo modeller giver et glimrende værktøj til at fokusere på humane væv i forhold til andre in vitro celle linje modeller, væv tilgængelighed og den begrænsede eksperimentelle tid kursus hindre deres udnyttelse i stor skala.

På den anden side er in vitro-cellelinjemodellerne fortsat en god mulighed for forskere, der arbejder med begrænsede ressourcer, med et mindre behov for at have en konstant forsyning af frisk humant væv10. Disse modeller giver også et værktøj, der kan bruges som en første skærm til at hjælpe med mål validering af lægemiddelvalg, før du går videre til mere komplekse in vivo modeller. Den nylige ændring af de traditionelle 2D monolayer kulturer i 3D-kulturer har forbedret effekten af disse in vitro-modeller13,14.

3D in vitro-modeller kan generobre kritiske funktioner, der ses under menneskelige normale og patologiske forhold. Under fysiologiske forhold indledes signaltransduktion gennem cellulær krydstale og interaktion med andre bindevævsmolekyler, nemlig de ekstracellulære matrixproteiner (ECM), der danner et 3D-interaktionsnetværk15,16. Tumoren udvikler sig i en 3D sfærisk form under ondartet transformation, for hvilken ilt og næringsstoffer er let rigelige i ikke-tumor / tumor interfase. Samtidig dominerer hypoxiske tilstande ved tumorkernen. Denne heterogenitet i næringsstof tilgængelighed resulterer i aktivering af rumligt forskellige signalering og metaboliske veje, der regulerer tumorigenese. Disse betingelser er dårligt rekapituleret i de konventionelle 2D monolayer kulturer14, hvor celler vokser på stiv kultur plast på en fysiologisk irrelevant måde. Kræftceller kommunikerer også med andre ikke-parenkymale celler, den primære kilde til ECM, vækst, og invasion signalering inden for tumor mikromiljø. I modsætning til 2D-kulturer kan 3D in vitro-modeller give en mere passende platform til at studere denne tumor-stromal interaktion17.

3D-modeller er meget udbredt i HCC-feltet, og de varierer i den måde, mikrovævet dannes18,19,20,21,22,23. De fleste af disse modeller brugte enten de ultralave bindingsplader18,19,20,21,22 eller trans-brønde23 i processen med spheroid dannelse. Protokollen beskrevet introducerer hængende dråbe teknik som en alternativ, plast-fri, og omkostningseffektiv in vitro 3D tumor spheroid model. Dette kan lette vurderingen af parakrine og autokrine roller fibroblaster på spredningen af tumorceller i et 3D-format.

Protocol

1. Celleforberedelse

  1. Udfør alle forsøg under sterile forhold i klasse II laminar flow mikrobiologisk sikkerhedsskab (se Materialetabel).
    1. Tænd emhætten og sørg for stabilisering af luftstrømmen.
    2. Sprøjt grundigt den indvendige hætteoverflade med 70% ethanol for at eliminere enhver mulig forurening fra tidligere brugere.
    3. Klargør 5% af en desinfektionsmiddelopløsning i et 500 mL glasbæger. Kassér eventuelle celle supernatant eller cellerester inde i opløsningen.
    4. Rengør alle mikropipetter og tipbokse grundigt med 70% ethanol.
  2. Forbered friske cellekulturmedier ved at supplere Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) høje glukosemedier med 10% varmedeaktiveret fosterkvægsserum (FBS), 1% penicillin/streptomycin (100 enhed/mL penicillin og 100 μg/mL streptomycin) og 2 mM L-glutamin. For LX2 levercelle linje, reducere koncentrationen af FBS supplement til 2%.
  3. Varme kulturmedier, før de indleder eksperimentet.
  4. Tag Huh7 og Hep3B HCC tumor cellelinjer og COS7 og LX2 fibroblast cellelinjer fra deres opbevaring rack i flydende nitrogen. Hurtigt optø kryopreserverede celler.
  5. Fortynd optøede celler med 2 mL friske kulturmedier. Centrifugeceller ved 200 x g i 4 min ved stuetemperatur. Kassér supernatanten og genbrug cellepillen i 1 mL friske varme kulturmedier.
  6. Frøceller i T75 celle kultur kolbe. Inkuber cellerne i en cellekulturinkubator i 5% CO2 ved 37 °C i 95% befugtede forhold, indtil cellerne når 60%-70% sammenløb.

2. Cellesamling

  1. Aspirate kultur medier og vaske celler tre gange med fosfat buffer saltvand (PBS).
  2. Tilsæt 2 mL forvarmet 1x Trypsin for at løsne klæbende celler fra bunden af T75-kolberne. Inkuberes ved 37 °C i en inkubator i 4 min.
  3. Inaktivere trypsin ved at tilføje 4 mL af komplette kultur medier. Celleaffjedrings- og centrifugecellerne opsamles ved 200 x g i 4 min ved stuetemperatur. Kassér supernatanten og genbrug cellerne i 4 ML friske kulturmedier.

3. Celletælling

  1. Hvirvl forsigtigt celleaffjedringen for at sikre en homogen fordeling af cellerne i centrifugerøret.
  2. Ved hjælp af en 10 μL pipette blandes 10 μL celleaffjedring med 10 μL trypanblå. Rør forsigtigt blandingen op og ned fire gange for at sikre fuldstændig farvning af den ydre celleoverflade med farvestoffet.
  3. Tæl antallet af celler ved hjælp af et hæmocytometer.
    1. Først skal du placere en coverlip over hæmocytometertællingsområdet, før du indlæser den farvede celleaffjedring.
    2. Placer pipettespidsen, der indeholder celleaffjedringen, i hæmocytometerets V-rille. Udvis forsigtigt spidsens indhold ind i tællediaset.
    3. Lad gyllen falde til for at nøjes i et par minutter, før du fastgør den på mikroskopstadiet til celletælling.
      BEMÆRK: For at undgå dobbelttælling skal du kun tælle cellerne på de to sider af den store firkant.
    4. Tæl i celler, der overlapper den øverste eller højre afgørelse, og undgå dem, der overlapper bunden eller venstre afgørelse.
  4. Beregn det samlede antal celler.
    BEMÆRK: Celletal pr. ml = Equation 1

4. Indsamling af fibroblast betingede medier (CM)

  1. Aspirere kulturmedier og vask LX2-cellerne tre gange med PBS.
  2. Tilsæt 2 mL forvarmet 1x Trypsin for at løsne klæbende celler fra bunden af T75-kolberne. Kolben inkuberes ved 37 °C i en inkubator i 4 min.
  3. Inaktivere trypsin ved at tilføje 4 mL af komplette kultur medier. Celleaffjedrings- og centrifugecellerne opsamles ved 200 x g i 4 min ved stuetemperatur. Tæl cellerne som pr. trin 3.
  4. Frø 1 x 106 LX2 celler i 10 cm3 retter i 48 timer ved 37 °C.
  5. Saml fibroblast CM efter 48 timer. Centrifuge ved 200 x g i 4 min ved stuetemperatur for at pellet eventuelle flydende celler. Sterilt filter cm'en ved hjælp af et 0,22 μm filter, der er fastgjort på bunden af 20 mL sprøjter.
  6. Saml den supernatante CM. Aliquot CM i 2 ML rør og opbevares ved -80 °C til yderligere formål.
    BEMÆRK: Opløsningen kan opbevares i 6 måneder ved -80 °C.

5. Validering af celletætheder for perfekte spheroids

  1. Aspirere kulturmedier og vask HCC-cellelinjerne tre gange med PBS.
  2. Tilsæt 2 mL forvarmet 1x Trypsin for at løsne klæbende celler fra bunden af T75-kolberne. Inkuberes ved 37 °C i en inkubator i 4 min.
  3. Inaktivere trypsin ved at tilføje 4 mL af komplette kultur medier. Celleaffjedrings- og centrifugecellerne opsamles ved 200 x g i 4 min ved stuetemperatur.
  4. Tæl cellerne som pr. trin 3.
  5. Pipette forskellige tætheder fra tumor cellelinjer (12000, 6000, 3000, 1500, 1000, 750, 500, 250 og 125 celler) i 20 μL af medier på den indvendige overflade af en 10 cm3 låg af en Petri parabol.
  6. Tilsæt 10 mL steril PBS til bunden af skålen for at give fugtige betingelser for spheroidedannelsesprocessen.
  7. Vend låget på 10 cm3 skålen for at gøre det muligt for mediet, herunder celleaffjedringen, at hænge over et fugtigt miljø. Lad de hængende dråber stå i 3 dage.
  8. Tag billeder af spheroids ved 50x forstørrelse ved hjælp af et omvendt mikroskop 3 dage efter hængende de oprindelige dråber.

6. Heterotypic tumor / stromal spheroids

  1. Suspendere 1500 Huh7 HCC celler med 1500 COS7 pattedyr fibroblast celler (1:1 forhold) i hængende dråber til at danne kugler. Tilsæt 10 mL steril PBS til bunden af skålen for at give fugtige forhold for spheroiderne.
  2. Vend låget på 10 cm3 skålen for at gøre det muligt for mediet, herunder celleaffjedringen, at hænge over et fugtigt miljø. Lad de hængende dråber stå i 3 dage.
  3. Tag billeder af spheroiderne ved hjælp af et omvendt mikroskop fra dag 3 til dag 10 af kultur.
    1. Sæt 10 cm3 skålen på mikroskopstadiet. Juster mikroskopets forstørrelse ved 50x for alle spheroider.
    2. Åbn mikroskopsoftwaren på den tilsluttede computer, og juster dens fokus for at få et klart billede af hver spheroid. Brug captureværktøjet på mikroskopsoftwaren til at gemme de erhvervede billeder.

7. Homotypic Hep3B spheroids i LX2 CM

  1. Ophæng 3000 Hep3B HCC-celler i de hængende dråber for at danne kugler. Tilsæt 10 mL steril PBS til bunden af skålen for at give fugtige forhold for spheroiderne.
  2. Vend låget på 10 cm3 skålen for at gøre det muligt for mediet, herunder celleaffjedringen, at hænge over et fugtigt miljø. Lad de hængende dråber stå i 3 dage.
  3. Overfør Hep3B-spheroider til 20 μL friske CM fra LX2-celler i hængende dråber.
    BEMÆRK: Brug sterile autoklavede ufiltrerede 200 μL pipettespidser i spheroideoverførselsprocessen for at undgå forstyrrelser eller skader på de dannede spheroider. Dette er også for at fjerne eventuelle resterende celler, der forbliver fastgjort til de vigtigste enkelt spheroid.
    1. Brug en autoklavet 20 μL pipette til overførselsprocessen. Juster pipettevolumenet til 2 μL. Fastgør pipettespidsen til pipetten.
    2. Vend låget på den 10 cm3 skål, hvor spheroiderne blev dannet. Fastgør låget på scenen af et let mikroskop. Juster mikroskopets fine fokus for at gøre hver spheroid synlig.
    3. Tøm forsigtigt luften fra mikropipetten ved at trykke på stempelknappen. Indsæt pipettespidsen i dråben, herunder spheroiden, der skal overføres. Kom meget tæt på spheroiden uden at røre den med spidsen.
    4. Slip forsigtigt trykket på stempelknappen, så spheroiden suges ind i mikropipettespidsen i 2 μL-mediet.
    5. Overfør spheroiden til en ny dråbe hængende på en ny 10 cm3 skål, der har nye medier / konditioneret medier / behandling.
      BEMÆRK: Sørg for, at alle spheroids overføres til den nye 10 cm3 skål ved hjælp af lysmikroskopet.
  4. Tag billeder af spheroids ved 50x forstørrelse ved hjælp af et omvendt mikroskop fra overførselsdagen (dag 3) til dag 7 af kultur i LX2 CM.

8. Beregning af spheroid volumen

  1. Tildel en entydig numerisk identifikator for hver spheroid, så billeder fra matchede spheroider kan fanges dagligt.
  2. Analyser billeder af de voksende spheroids ved hjælp af en billedanalyse softwarepakke.
    1. Åbn hvert spheroid-billede i softwarepakken. Brug af frihåndsmarkeringsværktøjet og skitserer hver spheroid. Vælg Angiv måling på rullelisten Analyse, og derefter Område. Tryk på OK.
    2. Tegn manuelt en cirkel omkring hver spheroid. Når kuglen er cirklet, skal du trykke på Ctrl + M for at give programmet mulighed for at beregne spheroidområdet i Pixel. Konverter arealet af spheroiden til et volumen.
      BEMÆRK: Volumen af spheroidmm3 =0,09403 × Equation 2
    3. Beregn ændringen i spheroid volumen i forhold til dens volumen på den første dag i billedoptagelse.
      BEMÆRK: Dette er at normalisere spheroid volumen til startvolumen og forbedre nøjagtigheden i betragtning af den naturlige variation i startstørrelsen.

Representative Results

Celler, der dyrkes i et flerlags 3D-format, afspejler mere præcist kompleksiteten af tumormikromiljøet end konventionelle 2D-kulturer24,25. Tidligere har mange undersøgelser suppleret spheroids kulturmedier med forskellige mitogener og vækstfaktorer26 for at indlede spheroid dannelse. I denne undersøgelse, dog, tilføjelsen af fibroblaster, eller deres CM, giver væsentlige mitogener og vækstfaktorer til at fremskynde spheroid vækst.

Figur 1 viser data fra en pilotundersøgelse, hvor Huh7 menneskelige HCC-celler blev sået i en faldende såtæthedstæthed fra 12.000 ned til 125 celler i 20 μL friske medier i 3 dage. En såningstæthed på 12.000 celler gav spheroider med en asymmetrisk form, som ikke blev korrigeret selv efter halvering af cellesåningstætheden. Men spheroids skabt af 3000 celler syntes mere afrundede (Figur 1, øverste række). Yderligere reduktion af cellekoncentrationen lykkedes hverken at danne enkelte kugler (125, 250, 500 celletæthedssfærer) eller havde et almindeligt sfærisk udseende (1000 og 1500 celletæthedsspheroider). Det er værd at nævne, at mange små kugler blev dannet ved en tæthed på 500 tumorceller; Men kun én lille spheroid blev fanget ved 50x forstørrelse (Figur 1, øverste række). Den samme optimerede protokol blev anvendt på COS7 primat nyre fibroblast celle linje (Figur 1, midterste række). Suspension 125, 250 og 500 COS7 fibroblaster i 20 μL hængende dråber resulterede i en afrundet spheroide med flere mindre spheroids, mens højere celletætheder (1000, 1500 og 3000) dannede enkelt semi-afrundede spheroids. Svarende til Huh7 tumor spheroids, højere celle suspensioner (6.000 og 12.000 celler / kugle) resulterede i dannelsen af uregelmæssige celle aggregater, og dermed højere celle koncentrationer blev kasseret (Figur 1, midterste række). Lave tætheder af Huh7/COS7 heterotypic celle suspensioner (125, 250 og 500 celler / kugle) genereret en enkelt spheroid med flere flydende eller semi-vedhæftede spheroids (Figur 1, nederste række). 1000- og 1500-celle heterotypice spheroider var semi-afrundede, mens en såningstæthed på 3000 celler (1500 pr. celletype) gav en afrundet 3D-spheroid. Som tidligere nævnt resulterede højere celletætheder i dannelsen af aggregater snarere end veldefinerede spheroider (Figur 1, nederste række). Afslutningsvis blev 3000 celletæthedsspheroider afrundet, svarende til menneskelige HCC tumorer, og blev tilpasset til yderligere eksperimenter. Dyrkning af celleaffjedringerne som hængende dråber i 3 dage var tilstrækkeligt til at fremme spheroid dannelse.

Efter optimering af den bedste cellekoncentration og tidspunkt for spheroid dannelse i den nuværende sammenhæng, den proliferative virkning af co-culturing tumor og fibroblast cellelinjer blev vurderet langsgående. Figur 2 og figur 3 viser, at Huh7/COS7 heterotypic spheroids (3000 samlede celletal pr. spheroid) overvåges fra dag 3 til dag 10. Homotypic Huh7 og COS7 spheroids (1500 celler hver) tjente som kontrol. Fra dag 4 voksede heterotypice spheroider i en ideel rundlignende form sammenlignet med homotypic spheroids (Figur 2). Det oprindelige volumen af den heterotypice spheroid var større end hver homotypic spheroid. Væksten af spheroider blev beregnet som ændringen i deres volumen i forhold til det oprindelige volumen på dagen for spheroid dannelse for at undgå normal variation i spheroid volumen (dag 3, Figur 3). Heterotypic spheroids oprindeligt viste en hurtig vækstfase starter fra dag 4 til dag 7 efterfulgt af en langsommere fase af vækst på dag 8 (Tal 2, øverste række, og figur 3). Spheroid volumen faldt på dag 9 og 10, muligvis afspejler udtømning af næringsstoffer eller en hypoksisk kerne og celledød.

I modsætning hertil voksede homotypic Huh7 og COS7 spheroids i et meget langsommere tempo (Figur 2, midterste og nederste rækker; Figur 3). Homotypic spheroids udstillet en relativt statisk vækstkurve indtil den femte dag i kulturen (to dage efter spheroid dannelse). Fra dag 6 begyndte de homotypic spheroids at vise en gradvis stigning i deres vækstkurve, om end i en betydeligt lavere hastighed end de heterotypice spheroids (figur 3). Afslutningsvis, tumor / fibroblast heterotypic spheroids vokse med en højere hastighed end homotypic spheroids tyder på, at den direkte kontakt af tumorceller og fibroblaster øger størrelsen af tumor spheroids.

Endelig blev der for at validere ovenstående resultater og for at undersøge de parakrine virkninger af mesenkymale celler på spredningen af HCC-spheroider i en leverrelateret sammenhæng dyrket 3-dages gamle homotypic Hep3B HCC-spheroider i regelmæssige friske medier eller CM fra LX2-leveransceller (figur 4 og figur 5) i yderligere 4 dage. Ved første øjekast dannede 3000 Hep3B-celler perfekt afrundede spheroider efter 3 dage (figur 4). Hep3B spheroids viste konstant spredning i friske medier fra dag 3 til dag 7 (Figur 4, øverste række). Vækstraten blev forbedret, da Hep3B spheroids blev opretholdt i LX2 CM (Figur 4, lavere række). Denne medieafhængige konvertering i Hep3B spheroid vækst udstillet statistisk signifikans fra dag 4 til slutningen af eksperimentet (Figur 5), hvilket tyder på en fibroblast-drevet spredning af tumor spheroids.

Afslutningsvis har denne undersøgelse med succes ændret de eksisterende 3D spheroid kulturer til at udnytte krydstale mellem HCC tumorceller og forskellige fibroblast cellelinjer og undersøge den proliferative betydning af denne direkte og indirekte cellulære interaktion (Figur 6). Yderligere karakterisering af de dannede spheroids er nødvendig for at forbedre, hvordan tumorceller interagerer med det omgivende mikromiljø.

Figure 1
Figur 1: Optimering af den optimale celletæthed til spheroid dannelse. Kolonner repræsenterer forskellige cellesåningstætheder, og rækker repræsenterer spheroider dannet af Huh7-celler (øverste række), COS7-celler (midterste række) og Huh7/COS7 heterotypic celler (nederste række). Billeder repræsenterer spheroids dannet efter suspension 125, 250, 500, 1000, 1500, 3000, 6000 og 12000 celler (fra venstre mod højre) i 20 μL medier i 3 dage. Pilotundersøgelsen omfattede to spheroider pr. tilstand, og billederne blev taget ved 50x forstørrelse, skalalinje = 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Heterotypic versus homotypic spheroid vækst. Kolonner repræsenterer den dag, hvor spheroidebilleder blev taget, og rækker viser repræsentative billeder til spheroider dannet af Huh7-celler (øverste række), COS7-celler (midterste række) og Huh7/COS7-celler (nederste række). Billederne repræsenterer de spheroids dannet efter suspension 3000 celler fra hver betingelse (homotypic Huh7, COS7, eller Huh7/COS7 heterotypic spheroids) af forskellige tidspunkter fra venstre mod højre. Eksperimentet omfattede 10 spheroids per betingelse, og billederne blev taget ved 50x forstørrelse, skala bar = 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Langsgående analyse af heterotypic versus homotypic spheroid vækst. Grafen viser vækstkurven af heterotypic Huh7/COS7 spheroids versus homotypic Huh7 og COS7 spheroids. Data præsenteres som gennemsnitlige ± s..m; n = 10 uafhængige spheroider. ** p < 0,01; p < 0,001. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Vækst af homotypic Hep3B spheroids i LX2 CM. Kolonner repræsenterer den dag, hvor spheroid billeder blev fanget, og rækker viser repræsentative billeder af Hep3B spheroids dyrkes i friske DMEM kultur medier (øverste række) eller LX2 CM (nederste række). Eksperimentet omfattede syv spheroids per betingelse (friske medier eller LX2 CM), og billeder blev taget på 50x forstørrelse, skala bar = 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Langsgående analyse af den homotypic Hep3B spheroid vækst. Grafen viser vækstkurven af Hep3B spheroids i friske DMEM kultur medier eller LX2 CM. Data præsenteres som gennemsnitlige ± s..m; n = 7 uafhængige spheroider. p < 0,001. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Skematisk repræsentation af spheroiddannelsesprocessen. Celleaffjedringen ledes på det indvendige låg på 10 cm3 Petri-skål. Låget er omvendt og opbevares i 3 dage for at give mulighed for homotypic eller heterotypic spheroid dannelse. Spheroid billeder er taget ved 50x forstørrelse. Figuren oprettes ved hjælp af et webbaseret billedillustrationsværktøj (se Materialetabel). Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Den sammenhæng, hvori de eksperimentelle cellelinjer vokser, påvirker deres genekspressionsprofil, vejanalyse og funktionelle kriterier. For eksempel, i brystkræftceller, koordineringen mellem forskellige onkogne veje bevares kun, hvis kræftceller dyrkes i 3D kropsbygning27. Deregulerede gener i 3D melanom og brystkræft spheroider, men ikke i monolayer celler, er mere relevante for in vivo menneskelige tumor28,29. For eksempel var β1 integrinniveauer i bryst epitelceller og tumormodstykker lavere end niveauer dyrket i et 2D-format29. Desuden har fibroblaster i 3D-strukturer tendens til at migrere tydeligt med hensyn til morfologi og hastighed sammenlignet med dem, der dyrkes på plast30. Derudover aktiverer vækstsubstratets mekaniske stivhed specifikke veje, der fremmer ondartet transformation af normale epitelceller via deregulering af den ekstracellulære signalregulerede kinase (ERK) / Rho i epitelceller31. Disse faktorer favoriserer overgangen fra konventionel 2D-kultur til 3D spheroid modeller, som 3D-kulturer er mere i overensstemmelse med menneskers sygdom.

Den nuværende undersøgelse brugte konventionelle laboratorieværktøjer og forsyninger til at producere en 3D tumor spheroid model. De dannede spheroids reagerede på spredningssignalerne fra fibroblaster, som det fremgår af deres signifikant øgede vækst. Denne model tilhører kategorien flercellede tumorspheroider. Der er tre andre kategorier af 3D tumor spheroids, herunder tumorosfærer32, væv-afledt tumor kugler33,34, og organotypic multicellulære spheroids35. I flercellede tumorspheroider suspenderes tumorceller under lav vedhæftningsforhold, så de kan samles sammen for at danne kugler uden at røre bunden af kulturbeholderen36. Flere tilgange er blevet anvendt til at levere denne forankring-uafhængig teknik, lige fra roterende systemer, flydende overlay teknikker, og ubestrøget ultra-lav vedhæftet fil U-formede plader37. I HCC bruger de fleste in vitro spheroid-kulturer de ultralave fastgørelsesplader 24- eller 96-brøndplader til at danne afrundede spheroids18,19,20,21,22. Denne teknik er dog ikke omkostningseffektiv og udelukker ikke nogen utilsigtet celleplastkontakt. Andre systemer bruger trans-brønde23 eller lever skiver12 til at producere lever mikro-væv. Brug af humane væv i translationelt arbejde er guldstandarden, men ikke altid tilgængelig eller tilgængelig for mange forskningsgrupper. Den nuværende tilgang nydt godt af den hængende dråber teori. Celle suspension er tilføjet, således at tumor spheroids er dannet i en tilgængelig flydende luft interface til at danne enkelt afrundede kugler38. Fordele ved at bruge denne teknik er manglen på enhver celle-plast kontakt og den lethed at studere autokrine og parakrine krydstale mellem tumor og fibroblast celler. Denne model blev yderligere valideret i en anden undersøgelse, der tydede betydningen af den ikke-parenkymale TREM2 for at beskytte leveren mod HCC-udvikling39. Dette arbejde viste, at mængden af både Hep3B og PLC/PRF5 spheroids var højere i kontrol LX2 CM versus TREM2-overekspressing LX2 CM i en Wnt-afhængig måde39.

I den nuværende undersøgelse blev fibroblaster blandet med tumorceller før spheroid dannelse for at undersøge de proliferative virkninger af denne co-kultur. Andre har tilføjet fibroblaster, endotelceller, og immunceller med tumorcelle suspension efter at have dannet en tumor spheroid at studere stromal celle migration i tumor40,41. Den nuværende heterotypic spheroid model viste et lignende vækstmønster til de tidligere rapporterede modeller og den oprindelige in vivo tumor; spheroids viser eksponentiel vækst efterfulgt af en forsinket vækstfase, sandsynligvis på grund af udtømning af næringsstoffer og udvidelse af den nekrotiske kerne42. I stedet for at tilføje vækstfaktorer og mitogener for at hjælpe spheroid dannelse, denne undersøgelse brugt en mere fysiologisk tilgang ved at have disse vækstfaktorer fra direkte kontakt med fibroblaster eller deres sekretom i fibroblast CM. Det er vigtigt at nævne, at LX2-celler kan aktiveres yderligere ved behandling med TGFβ1 eller PDGF43. LX2-celler er blevet behandlet med 10 ng/mL TGFβ1 i 48 timer, før mediet fjernes til forskellige eksperimentelle indstillinger. LX2-celler blev vasket tre gange med PBS (for at udelukke enhver direkte TGFβ1-effekt), og derefter blev der tilføjet friske medier i yderligere 24 timer, før CM blev indsamlet. CM indsamlet fra TGFβ1-stimuleret LX2 induceret Hep3B spheroids vækst i en højere hastighed end CM fra kontrol LX2 (data ikke vist). Dette fleksible system kan egne sig til co-kulturer af forskellige kræftceller plus / minus fibroblaster, samt patient-afledte linjer. Det kan også tilbyde en medium-throughput screening assay for lægemidler, der hurtigt kunne vedtages og indsættes i en translationel drug discovery pipeline til at informere dosering for in vivo undersøgelser.

En begrænsning af den nuværende undersøgelse er brugen af de udødeliggjorte cellelinjer i spheroid dannelse snarere end frisk isolerede HCC tumorceller og kræft-associerede fibroblaster. En anden begrænsning er at sammenligne den homotypic Hep3B spheroid vækst mellem CM fra LX2 og i friske medier i stedet for CM fra andre ikke-fibroblast cellelinjer. Sidstnævnte begrænsning kunne løses ved genetisk modifikation af et gen af interesse i fibroblaster efterfulgt af anvendelse af CM fra vilde type versus genetisk manipuleret fibroblast til homotypic spheroids.

Disclosures

FO er direktør og aktionær i Fibrofind Limited.

Acknowledgments

MYWZ er finansieret af Ministeren for Erhverv, Energi og Industriel Strategi og Newton-prisen 2020 som en del af Storbritanniens officielle udviklingsbistand "ODA" og Newton-fond. SS er støttet af Cancer Research UK Advanced Clinician Scientist stipendium C53575/A29959. SS, FO og HR modtager støtte som en del af HUNTER, finansieret gennem et partnerskab mellem Cancer Research UK, Fondazione AIRC og Fundacion Cientifica de la Asociacion Espanola Contra el Cancer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Trypsin Sigma Aldrich 59429C
2 mL tubes Eppendorf
Biorender Biorender.com Online
Class II laminar flow BioMAT2 hood Medair Technologies
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Biosera M-D1107
Excel sofware Microsoft office 365
Graphpad prism sofware GraphPad software
Heat deactivated fetal bovine serum (FBS) life tech 105000064
Image J software Fiji
L-glutamine Sigma Aldrich G7513-100ml
Penicillin/streptomycin (100 unit/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin) Sigma Aldrich P0781-100ml
Petri dish 90 mm, triple vented Greiner 633175
Trypan blue Sigma Aldrich T8154
Virkon™ Broad Spectrum Disinfectant, 5kg Bucket Rely+On™ SCI-129999
Ziess inverted microscope Ziess

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferlay, J., et al. Cancer statistics for the year 2020: an overview. International Journal of Cancer. , (2021).
  2. Llovet, J. M., et al. Hepatocellular carcinoma. Nature Reviews Disease Primers. 7 (1), 6 (2021).
  3. Reeves, H. L., Zaki, M. Y., Day, C. P. Hepatocellular carcinoma in obesity, Type 2 diabetes, and NAFLD. Digestive Diseases & Sciences. 61 (5), 1234-1245 (2016).
  4. Forner, A., Reig, M., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 391 (10127), 1301-1314 (2018).
  5. Reig, M., et al. Diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma. Update of the consensus document of the AEEH, AEC, SEOM, SERAM, SERVEI, and SETH. Medicina Clinica (Barc). 156 (9), 1-30 (2021).
  6. Pfister, D., et al. NASH limits anti-tumour surveillance in immunotherapy-treated HCC. Nature. 592 (7854), 450-456 (2021).
  7. Llovet, J. M., et al. Trial design and endpoints in hepatocellular carcinoma: AASLD consensus conference. Hepatology. 73, Suppl 1 158-191 (2021).
  8. Llovet, J. M., Hernandez-Gea, V. Hepatocellular carcinoma: reasons for phase III failure and novel perspectives on trial design. Clinical Cancer Research. 20 (8), 2072-2079 (2014).
  9. Brown, Z. J., Heinrich, B., Greten, T. F. Mouse models of hepatocellular carcinoma: an overview and highlights for immunotherapy research. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 15 (9), 536-554 (2018).
  10. Nikolic, M., Sustersic, T., Filipovic, N. In vitro models and on-chip systems: Biomaterial interaction studies with tissues generated using lung epithelial and liver metabolic cell lines. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 120 (2018).
  11. Clark, A. M., Ma, B., Taylor, D. L., Griffith, L., Wells, A. Liver metastases: Microenvironments and ex-vivo models. Experimental Biology and Medicine. 241 (15), 1639-1652 (2016).
  12. Paish, H. L., et al. A bioreactor technology for modeling fibrosis in human and rodent precision-cut liver slices. Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).
  13. Brassard-Jollive, N., Monnot, C., Muller, L., Germain, S. In vitro 3D systems to model tumor angiogenesis and interactions with stromal cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 594903 (2020).
  14. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  15. Kleinman, H. K., Philp, D., Hoffman, M. P. Role of the extracellular matrix in morphogenesis. Current Opinion in Biotechnology. 14 (5), 526-532 (2003).
  16. Bissell, M. J., Radisky, D. C., Rizki, A., Weaver, V. M., Petersen, O. W. The organizing principle: microenvironmental influences in the normal and malignant breast. Differentiation. 70 (9-10), 537-546 (2002).
  17. Ronnov-Jessen, L., Petersen, O. W., Koteliansky, V. E., Bissell, M. J. The origin of the myofibroblasts in breast cancer. Recapitulation of tumor environment in culture unravels diversity and implicates converted fibroblasts and recruited smooth muscle cells. Journal of Clinical Investigations. 95 (2), 859-873 (1995).
  18. Shao, H., et al. A novel stromal fibroblast-modulated 3D tumor spheroid model for studying tumor-stroma interaction and drug discovery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), e60660 (2020).
  19. Song, Y., et al. Activated hepatic stellate cells play pivotal roles in hepatocellular carcinoma cell chemoresistance and migration in multicellular tumor spheroids. Scientific Reports. 6, 36750 (2016).
  20. Pingitore, P., et al. Human multilineage 3D spheroids as a model of liver steatosis and fibrosis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), (2019).
  21. Kozyra, M., et al. Human hepatic 3D spheroids as a model for steatosis and insulin resistance. Scientific Reports. 8 (1), 14297 (2018).
  22. Khawar, I. A., et al. Three dimensional mixed-cell spheroids mimic stroma-mediated chemoresistance and invasive migration in hepatocellular carcinoma. Neoplasia. 20 (8), 800-812 (2018).
  23. Feaver, R. E., et al. Development of an in vitro human liver system for interrogating non-alcoholic steatohepatitis. Journal of Clinical Investigations Insight. 1 (20), 90954 (2016).
  24. Wartenberg, M., et al. Regulation of the multidrug resistance transporter P-glycoprotein in multicellular tumor spheroids by hypoxia-inducible factor (HIF-1) and reactive oxygen species. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 17 (3), 503-505 (2003).
  25. Chen, R., et al. Screening candidate metastasis-associated genes in three-dimensional HCC spheroids with different metastasis potential. International Journal of Clinical Experimental Pathology. 7 (5), 2527-2535 (2014).
  26. Venkataraman, G., et al. Preferential self-association of basic fibroblast growth factor is stabilized by heparin during receptor dimerization and activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (2), 845-850 (1996).
  27. Bissell, M. J., et al. Tissue structure, nuclear organization, and gene expression in normal and malignant breast. Cancer Research. 59, 1757-1763 (1999).
  28. Ghosh, S., et al. Three-dimensional culture of melanoma cells profoundly affects gene expression profile: a high density oligonucleotide array study. Journal of Cellular Physiology. 204 (2), 522-531 (2005).
  29. Delcommenne, M., Streuli, C. H. Control of integrin expression by extracellular matrix. Journal of Biological Chemistry. 270 (45), 26794-26801 (1995).
  30. Meshel, A. S., Wei, Q., Adelstein, R. S., Sheetz, M. P. Basic mechanism of three-dimensional collagen fibre transport by fibroblasts. Nature Cell Biology. 7 (2), 157-164 (2005).
  31. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
  32. Yu, M., et al. Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345 (6193), 216-220 (2014).
  33. Weiswald, L. B., et al. Newly characterised ex vivo colospheres as a three-dimensional colon cancer cell model of tumour aggressiveness. British Journal of Cancer. 101 (3), 473-482 (2009).
  34. Kondo, J., et al. Retaining cell-cell contact enables preparation and culture of spheroids composed of pure primary cancer cells from colorectal cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6235-6240 (2011).
  35. Rajcevic, U., et al. Colorectal cancer derived organotypic spheroids maintain essential tissue characteristics but adapt their metabolism in culture. Proteome Sciences. 12, 39 (2014).
  36. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
  37. Friedrich, J., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Experimental anti-tumor therapy in 3-D: spheroids--old hat or new challenge. International Journal of Radiation Biology. 83 (11-12), 849-871 (2007).
  38. Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnology & Bioengineering. 83 (2), 173-180 (2003).
  39. Esparza-Baquer, A., et al. TREM-2 defends the liver against hepatocellular carcinoma through multifactorial protective mechanisms. Gut. 70 (7), 1345-1361 (2021).
  40. Dangles-Marie, V., et al. A three-dimensional tumor cell defect in activating autologous CTLs is associated with inefficient antigen presentation correlated with heat shock protein-70 down-regulation. Cancer Research. 63 (13), 3682-3687 (2003).
  41. Timmins, N. E., Dietmair, S., Nielsen, L. K. Hanging-drop multicellular spheroids as a model of tumour angiogenesis. Angiogenesis. 7 (2), 97-103 (2004).
  42. Mayer, B., et al. Multicellular gastric cancer spheroids recapitulate growth pattern and differentiation phenotype of human gastric carcinomas. Gastroenterology. 121 (4), 839-852 (2001).
  43. Xu, L., et al. Human hepatic stellate cell lines, LX-1 and LX-2: new tools for analysis of hepatic fibrosis. Gut. 54 (1), 142-151 (2005).

Tags

Kræftforskning Udgave 175
En tredimensionel spheroid model til at undersøge tumor-stromal interaktion i hepatocellulær karcinom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zaki, M. Y. W., Shetty, S.,… More

Zaki, M. Y. W., Shetty, S., Wilkinson, A. L., Patten, D. A., Oakley, F., Reeves, H. A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma. J. Vis. Exp. (175), e62868, doi:10.3791/62868 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter