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Cancer Research

हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा में ट्यूमर-स्ट्रोमल इंटरैक्शन की जांच करने के लिए एक त्रि-आयामी गोलाकार मॉडल

Published: September 30, 2021 doi: 10.3791/62868
Automatic Translation
*1,2, *2, 2, 2, *3, *4,5
1Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Minia University, 2National Institute for Health Research Birmingham Liver Biomedical Research Unit and Centre for Liver and Gastrointestinal Research, Institute of Immunology and Immunotherapy, University of Birmingham, 3Newcastle Fibrosis Research Group, Biosciences Institute, Faculty of Medical Sciences, Newcastle University, 4Newcastle University Translational and Clinical Research Institute, Faculty of Medical Sciences, Newcastle University, 5The Liver Unit, Department of Medicine, Freeman Hospital, Newcastle-upon-Tyne Hospitals NHS Foundation Trust
* These authors contributed equally

Summary

व्यापक इन विट्रो मॉडल जो प्रासंगिक मानव रोग को ईमानदारी से दोहराते हैं, की कमी है। वर्तमान अध्ययन तीन आयामी (3 डी) ट्यूमर गोलाकार निर्माण और संस्कृति प्रस्तुत करता है, जो मानव हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा में ट्यूमर-स्ट्रोमल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय इन विट्रो उपकरण है।

Abstract

जिगर के कैंसर के प्रमुख रूप उन्नत हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी) के लिए अच्छी तरह से सहन किए गए और व्यापक रूप से प्रभावी उपचारों की आक्रामकता और कमी, कैंसर से संबंधित मृत्यु के दूसरे सबसे आम कारण के रूप में अपनी रैंक को तर्कसंगत बनाती है। प्रीक्लिनिकल मॉडल को नैदानिक विकास के लिए सर्वोत्तम चिकित्सीय उम्मीदवारों का चयन करने और व्यक्तिगत दवा के वितरण में सहायता करने के लिए मानव स्थितियों को दोहराने के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता है। त्रि-आयामी (3 डी) सेलुलर गोलाकार मॉडल दो आयामी (2 डी) मोनोलेयर संस्कृतियों के लिए एक उभरते हुए इन विट्रो विकल्प के रूप में वादा दिखाते हैं। यहां, हम एक 3 डी ट्यूमर गोलाकार मॉडल का वर्णन करते हैं जो लटकने वाली बूंदों में बनाए रखने पर अलग-अलग कोशिकाओं की कुल होने की क्षमता का शोषण करता है, और मानक मोनोलेयर्स की तुलना में विवो वातावरण में अधिक प्रतिनिधि है। इसके अलावा, 3 डी गोलाकार होमोटाइपिक या हेटरोटाइपिक कोशिकाओं के संयोजन से उत्पादित किया जा सकता है, विवो में सेलुलर विषमता का अधिक प्रतिबिंबित करता है, संभावित रूप से पर्यावरणीय इंटरैक्शन के अध्ययन को सक्षम करता है जो प्रगति और उपचार प्रतिक्रियाओं को प्रभावित कर सकता है। वर्तमान शोध ने मानक 10 सेमी 3 पेट्री व्यंजनों के ढक्कन पर सेल निलंबन को स्थिर करके 3 डी होमोटाइपिक और हेटरोटाइपिक ट्यूमर गोलाकार बनाने के लिए सेल घनत्व को अनुकूलित किया। अनुदैर्ध्य विश्लेषण होमोटाइपिक बनाम हेटरोटाइपिक ट्यूमर / फाइब्रोब्लास्ट्स गोलाकार के लिए विकास वक्र उत्पन्न करने के लिए किया गया था। अंत में, होमोटाइपिक ट्यूमर (हेप 3 बी) गोलाकार पर फाइब्रोब्लास्ट (सीओएस 7 कोशिकाओं) और यकृत मायोफाइब्रोब्लास्ट्स (एलएक्स 2) के प्रोलिफेरेटिव प्रभाव की जांच की गई थी। 3,000 कोशिकाओं (20 μL मीडिया में) के एक सीडिंग घनत्व ने सफलतापूर्वक Huh7 / COS7 हेटरोटाइपिक गोलाकार उत्पन्न किया, जिसने संस्कृति दिन 8 तक आकार में स्थिर वृद्धि प्रदर्शित की, जिसके बाद विकास मंदता हुई। इस खोज की पुष्टि LX2 (मानव यकृत ताराकार सेल लाइन) वातानुकूलित माध्यम (सीएम) में सुसंस्कृत हेप 3 बी होमोटाइपिक गोलाकार का उपयोग करके की गई थी। LX2 सीएम नियंत्रण ट्यूमर गोलाकार की तुलना में Hep3B गोलाकार के प्रसार को ट्रिगर किया। अंत में, इस प्रोटोकॉल से पता चला है कि 3 डी ट्यूमर गोलाकार का उपयोग ट्यूमर-स्ट्रोमल इंटरैक्शन का अधिक व्यापक रूप से अध्ययन करने के लिए विट्रो टूल में एक सरल, किफायती और प्रीस्क्रीन के रूप में किया जा सकता है।

Introduction

जिगर की बीमारी और अधिकांश अन्य प्रकार के कैंसर के उपचार में प्रगति के बावजूद जिगर के कैंसर से वैश्विक घटनाओं और मृत्यु दर में वृद्धि जारी रही है। 2018 में, यकृत कैंसर ने कोलोरेक्टल और पेट के कैंसर को पार कर लिया और वैश्विक स्तर पर कैंसर से संबंधित मौत का दूसरा सबसे आम कारण बन गया। 2020 में, 9,00,000 से अधिक नए निदान थे, जो दुनिया भर में कुल कैंसर के मामलों का 4.7% था। यह विशेष रूप से निराशाजनक है, यह देखते हुए कि एचसीसी के विकास के लिए महत्वपूर्ण जोखिम कारक, यकृत कैंसर का सबसे आम रूप, अच्छी तरह से विशेषता है2। सिरोसिस एचसीसी के विकास के लिए सबसे आम जोखिम कारक है, जिसमें 80% मामले स्थापित सिरोसिस 2 की पृष्ठभूमि पर विकसित होते हैं। क्रोनिक जिगर की बीमारियां, जो सिरोसिस में प्रगति करती हैं, और परिणामस्वरूप एचसीसी, में हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी), हेपेटाइटिस सी वायरस (एचसीवी), शराब से संबंधित यकृत रोग (एआरएलडी), गैर-अल्कोहल फैटी लिवर रोग (एनएएफएलडी) शामिल हैं - बाद में मोटापे और टाइप 2 मधुमेह मेलिटस (टी 2 डीएम) 2,3 के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है। एचसीसी के लिए वर्तमान प्रबंधन प्रोटोकॉल चरण-निर्भर हैं और उन्नत कैंसर वाले लोगों के लिए सीमित हैं, जिनके पास अक्सर खराब परिणाम होते हैं4। किनेज अवरोधकों का उपयोग करके महत्वपूर्ण प्रगति हुई है और हाल ही में, प्रतिरक्षा-ऑन्कोलॉजी उपचार, हालांकि वास्तविक रूप से, उन्नत यकृत कैंसर वाले रोगियों के केवल एक अल्पसंख्यक को लाभ पहुंचाते हैं5। इसके अलावा, इस बात की चिंता है कि एनएएफएलडी वाले रोगियों में उत्पन्न होने वाले एचसीसी - सबसे तेजी से बढ़ते अंतर्निहित कारण, पश्चिमी देशों में नए निदान किए गए एचसीसी मामलों के 50% से अधिक के लिए लेखांकन, क्रमादेशित मृत्यु 1 (पीडी 1) चेकपॉइंट इनहिबिटर थेरेपी 6 के लिए अधिक प्रतिरोधी हो सकता है।

एचसीसी वाले रोगियों के लिए नैदानिक परीक्षणों में बड़े पैमाने पर निवेश किया गया है, जिसमें नैदानिक परीक्षणों और उनके समापन बिंदु 7 में महत्वपूर्ण सुधार शामिल हैं। विफलताओं के एक दशक के बाद, इन निवेशों ने रोगियों के लिए अवसरों को बदलना शुरू कर दिया है। हालांकि, वास्तविकता यह है कि उत्तरदाताओं का समग्र अनुपात अपेक्षाकृत खराब रहता है, परीक्षणों में भर्ती किए गए रोगियों को अक्सर क्लिनिकों में देखभाल करने वालों का खराब प्रतिनिधित्व होता है। खतरा यह है कि अग्रिम महंगे हैं और कई के बजाय कुछ को लाभ पहुंचाते हैं। जैसा कि एकल-उपयोग या संयोजन के लिए अधिक उम्मीदवार उपचार उभरते हैं, विवो प्रतिक्रियाओं में प्रीक्लिनिकल मॉडल को अधिक भविष्यवाणी करना आवश्यक है। ये ऐसे मॉडल होने की संभावना है जो रोगी प्रतिक्रियाओं में देखी जाने वाली परिवर्तनशीलता में योगदान देने वाले अतिरिक्त कारकों को शामिल करते हैं जो मानव एचसीसी विषमता और रोग जटिलता को बेहतर ढंग से प्रतिबिंबित करते हैं। एचसीसी की इन विवो pathophysiological स्थितियों को फिर से बनाने वाली प्रणालियों को ट्यूमर विकास, विकास और प्रगति के जीव विज्ञान को समझने में मदद करने के लिए आवश्यक है। क्रोनिक जिगर की बीमारियों और एचसीसी के मौजूदा प्रयोगात्मक मॉडल आमतौर पर तीन मुख्य श्रेणियों के तहत आते हैं: विवो पशु-आधारित मॉडल (9 में समीक्षा की गई), इन विट्रो संस्कृतियों 10, और पूर्व विवो 11,12 मॉडल में। एचसीसी सहित पुरानी जिगर की बीमारियों का अध्ययन करने के लिए पशु-आधारित दृष्टिकोणों का बड़े पैमाने पर उपयोग किया जाता है; हालांकि, आनुवांशिक परिवर्तनशीलता, उच्च चलने वाली लागत, और प्रजातियों के बीच विभिन्न प्रतिरक्षा प्रणाली इस तरह के मॉडल को लागू करने के लिए मुख्य सीमाओं में से एक हैं। जबकि कुछ पूर्व विवो मॉडल अन्य इन विट्रो सेल लाइन मॉडल की तुलना में मानव ऊतकों पर ध्यान केंद्रित करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण प्रदान करते हैं, ऊतक की उपलब्धता और सीमित प्रयोगात्मक समय पाठ्यक्रम बड़े पैमाने पर उनके उपयोग में बाधा डालते हैं।

दूसरी ओर, इन विट्रो सेल लाइन मॉडल सीमित संसाधनों के साथ काम करने वाले वैज्ञानिकों के लिए एक अच्छा विकल्प बने हुए हैं, जिसमें ताजा मानव ऊतकों की निरंतर आपूर्ति की कम आवश्यकता होती है। ये मॉडल एक उपकरण भी प्रदान करते हैं जिसका उपयोग विवो मॉडल में अधिक जटिल होने से पहले दवा चयन के लक्ष्य सत्यापन में मदद करने के लिए पहली स्क्रीन के रूप में किया जा सकता है। 3 डी संस्कृतियों में पारंपरिक 2 डी मोनोलेयर संस्कृतियों के हाल के संशोधन ने इन इन विट्रो मॉडल13,14 की प्रभावकारिता में सुधार किया है।

3 डी इन विट्रो मॉडल मानव सामान्य और रोग संबंधी स्थितियों में देखी जाने वाली महत्वपूर्ण विशेषताओं को दोहरा सकते हैं। शारीरिक परिस्थितियों के तहत, सिग्नल ट्रांसडक्शन सेलुलर क्रॉसस्टॉक और अन्य संयोजी ऊतक अणुओं के साथ बातचीत के माध्यम से शुरू किया जाता है, अर्थात्, एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन, एक 3 डी इंटरैक्शन नेटवर्क 15,16 बनाते हैं। ट्यूमर घातक परिवर्तन के दौरान एक 3 डी गोलाकार रूप में विकसित होता है, जिसके लिए ऑक्सीजन और पोषक तत्व गैर-ट्यूमर / ट्यूमर इंटरफेज़ में आसानी से प्रचुर मात्रा में होते हैं। उसी समय, ट्यूमर कोर पर हाइपोक्सिक स्थितियां प्रबल होती हैं। पोषक तत्वों की उपलब्धता में इस विषमता के परिणामस्वरूप स्थानिक रूप से अलग-अलग सिग्नलिंग और चयापचय मार्गों की सक्रियता होती है जो कि नियंत्रित करते हैं। इन स्थितियों को पारंपरिक 2 डी मोनोलेयर संस्कृतियों 14 में खराब रूप से पुनरावृत्ति की जाती है, जिसमें कोशिकाएं शारीरिक रूप से अप्रासंगिक फैशन में कठोर संस्कृति प्लास्टिक पर बढ़ती हैं। कैंसर कोशिकाएं अन्य गैर-पैरेन्काइमल कोशिकाओं के साथ भी संवाद करती हैं, जो ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर ईसीएम, विकास और आक्रमण सिग्नलिंग का प्राथमिक स्रोत है। 2 डी संस्कृतियों के विपरीत, 3 डी इन विट्रो मॉडल इस ट्यूमर-स्ट्रोमल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक अधिक उपयुक्त मंच प्रदान कर सकते हैं।

एचसीसी क्षेत्र में 3 डी मॉडल का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, और वे सूक्ष्म ऊतक के गठन के तरीके में भिन्न होते हैं18,19,20,21,22,23। इनमें से अधिकांश मॉडलों ने गोलाकार गठन की प्रक्रिया में या तो अल्ट्रा-लो बाइंडिंग प्लेट18,19,20,21,22 या ट्रांस-वेल्स 23 का उपयोग किया। वर्णित प्रोटोकॉल एक वैकल्पिक, प्लास्टिक मुक्त, और लागत प्रभावी इन विट्रो 3 डी ट्यूमर गोलाकार मॉडल के रूप में फांसी की बूंद तकनीक का परिचय देता है। यह एक 3 डी प्रारूप में ट्यूमर कोशिकाओं के प्रसार पर फाइब्रोब्लास्ट की पैराक्राइन और ऑटोक्राइन भूमिकाओं का आकलन करने की सुविधा प्रदान कर सकता है।

Protocol

1. सेल तैयारी

  1. कक्षा II लैमिनर प्रवाह सूक्ष्मजीवविज्ञानी सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ परिस्थितियों के तहत सभी प्रयोगों को निष्पादित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    1. हुड को चालू करें और एयरफ्लो के स्थिरीकरण के लिए अनुमति दें।
    2. पिछले उपयोगकर्ताओं से किसी भी संभावित संदूषण को खत्म करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ आंतरिक हुड सतह को अच्छी तरह से स्प्रे करें।
    3. एक 500 मिलीलीटर ग्लास बीकर में एक कीटाणुनाशक समाधान का 5% तैयार करें। समाधान के अंदर किसी भी सेल supernatant या सेल मलबे को छोड़ दें।
    4. 70% इथेनॉल के साथ सभी माइक्रोपिपेट्स और टिप बक्से को अच्छी तरह से साफ करें।
  2. Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) उच्च ग्लूकोज मीडिया को 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेनिसिलिन की 100 इकाई / एमएल और स्ट्रेप्टोमाइसिन के 100 μg / mL) और 2 mM L-glutamine के साथ पूरक करके ताजा सेल संस्कृति मीडिया तैयार करें। LX2 हेपेटिक ताराकार सेल लाइन के लिए, FBS पूरक की एकाग्रता को 2% तक कम करें।
  3. प्रयोग शुरू करने से पहले गर्म संस्कृति मीडिया।
  4. तरल नाइट्रोजन में अपने भंडारण रैक से Huh7 और Hep3B HCC ट्यूमर सेल लाइनों और COS7 और LX2 फाइब्रोब्लास्ट सेल लाइनों को लें। तेजी से डीफ्रॉस्ट क्रायोप्रिजर्व्ड कोशिकाओं.
  5. ताजा संस्कृति मीडिया के 2 मिलीलीटर के साथ पिघला हुआ कोशिकाओं को पतला करें। कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज कोशिकाएं। supernatant को त्यागें और ताजा गर्म संस्कृति मीडिया के 1 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend.
  6. T75 सेल संस्कृति फ्लास्क में बीज कोशिकाओं. 95% humidified स्थितियों में 37 °C पर 5% CO2 में एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें जब तक कि कोशिकाएं 60% -70% confluency तक नहीं पहुंच जातीं।

2. सेल संग्रह

  1. एस्पिरेट संस्कृति मीडिया और फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ तीन बार कोशिकाओं को धोना।
  2. T75 फ्लास्क के नीचे से अनुयायी कोशिकाओं को अलग करने के लिए पूर्व-गर्म 1x ट्रिप्सिन के 2 एमएल जोड़ें। 4 मिनट के लिए एक इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. पूर्ण संस्कृति मीडिया के 4 एमएल जोड़कर ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करें। कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए 200 x g पर सेल निलंबन और सेंट्रीफ्यूज कोशिकाओं को इकट्ठा करें। supernatant को त्यागें और 4 mL ताजा संस्कृति मीडिया में कोशिकाओं resuspend.

3. सेल गिनती

  1. सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में कोशिकाओं के समरूप वितरण को सुनिश्चित करने के लिए धीरे से सेल निलंबन भंवर।
  2. एक 10 μL पिपेट का उपयोग करते हुए, ट्रिपैन नीले रंग के 10 μL के साथ सेल निलंबन के 10 μL मिश्रण। डाई के साथ बाहरी सेल की सतह के पूर्ण धुंधलापन को सुनिश्चित करने के लिए मिश्रण को धीरे से चार बार ऊपर और नीचे करें।
  3. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।
    1. सबसे पहले, दाग सेल निलंबन लोड करने से पहले हेमोसाइटोमीटर गिनती क्षेत्र पर एक कवरस्लिप रखें।
    2. हेमोसाइटोमीटर के वी नाली में सेल निलंबन युक्त पिपेट टिप रखें। धीरे से गिनती स्लाइड में टिप सामग्री निष्कासित करें.
    3. सेल गिनती के लिए माइक्रोस्कोप चरण पर इसे ठीक करने से पहले कुछ मिनटों के लिए बसने के लिए घोल छोड़ दें।
      नोट:: डबल-गिनती से बचने के लिए, केवल बड़े वर्ग के दो पक्षों पर कक्षों की गिनती।
    4. शीर्ष या दाएं शासन को ओवरलैप करने वाली कोशिकाओं में गिनती करें और नीचे या बाएं फैसले को ओवरलैप करने वालों से बचें।
  4. कक्षों की कुल संख्या की गणना करें.
    नोट: सेल संख्या प्रति मिलीलीटर = Equation 1

4. फाइब्रोब्लास्ट वातानुकूलित मीडिया का संग्रह (मुख्यमंत्री)

  1. एस्पिरेट संस्कृति मीडिया और पीबीएस के साथ तीन बार एलएक्स 2 कोशिकाओं को धोएं।
  2. T75 फ्लास्क के नीचे से अनुयायी कोशिकाओं को अलग करने के लिए पूर्व-गर्म 1x ट्रिप्सिन के 2 एमएल जोड़ें। 4 मिनट के लिए एक इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर फ्लास्क को इनक्यूबेट करें।
  3. पूर्ण संस्कृति मीडिया के 4 एमएल जोड़कर ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करें। कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए 200 x g पर सेल निलंबन और सेंट्रीफ्यूज कोशिकाओं को इकट्ठा करें। चरण 3 के अनुसार कक्षों की गणना करें।
  4. बीज 1 x 106 LX2 कोशिकाओं में 10 सेमी 3 व्यंजनों में 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर.
  5. 48 ज के बाद fibroblast मुख्यमंत्री ले लीजिए. किसी भी फ्लोटिंग कोशिकाओं को गोली मारने के लिए कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज। बाँझ 20 mL सिरिंज के तल पर तय एक 0.22 μm फ़िल्टर का उपयोग कर मुख्यमंत्री फ़िल्टर.
  6. Supernatant मुख्यमंत्री ले लीजिए। 2 mL ट्यूबों में मुख्यमंत्री को एलीकोट करें और आगे के अनुप्रयोगों के लिए -80 °C पर स्टोर करें।
    नोट: समाधान -80 डिग्री सेल्सियस पर 6 महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।

5. सही गोलाकार के लिए सेल घनत्व मान्य

  1. एस्पिरेट संस्कृति मीडिया और पीबीएस के साथ एचसीसी सेल लाइनों को तीन बार धोएं।
  2. T75 फ्लास्क के नीचे से अनुयायी कोशिकाओं को अलग करने के लिए पूर्व-गर्म 1x ट्रिप्सिन के 2 एमएल जोड़ें। 4 मिनट के लिए एक इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. पूर्ण संस्कृति मीडिया के 4 एमएल जोड़कर ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करें। कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए 200 x g पर सेल निलंबन और सेंट्रीफ्यूज कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
  4. चरण 3 के अनुसार कक्षों की गणना करें।
  5. पिपेट ट्यूमर सेल लाइनों (12000, 6000, 3000, 1500, 1000, 750, 500, 250, और 125 कोशिकाओं) से विभिन्न घनत्व एक पेट्री डिश के 10 सेमी 3 ढक्कन की आंतरिक सतह पर मीडिया के 20 μL में।
  6. गोलाकार गठन की प्रक्रिया के लिए आर्द्र स्थिति प्रदान करने के लिए पकवान के तल पर बाँझ पीबीएस के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
  7. सेल निलंबन सहित मीडिया को आर्द्र वातावरण पर लटकाने की अनुमति देने के लिए 10 सेमी 3 डिश के ढक्कन को उलटें। लटकते हुए बूंदों को 3 दिनों के लिए छोड़ दें।
  8. मूल बूंदों को लटकाने के 3 दिन बाद एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 50x आवर्धन पर गोलाकार की छवियों को लें।

6. Heterotypic ट्यूमर /

  1. 1500 COS7 स्तनधारी फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं (1: 1 अनुपात) के साथ 1500 Huh7 HCC कोशिकाओं को लटकने वाली बूंदों में गोले बनाने के लिए निलंबित करें। गोलाकार के लिए आर्द्र स्थिति प्रदान करने के लिए पकवान के तल पर बाँझ पीबीएस के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
  2. सेल निलंबन सहित मीडिया को आर्द्र वातावरण पर लटकाने की अनुमति देने के लिए 10 सेमी 3 डिश के ढक्कन को उलटें। लटकते हुए बूंदों को 3 दिनों के लिए छोड़ दें।
  3. संस्कृति के दिन 3 से दिन 10 तक एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके गोलाकार की छवियां लें।
    1. माइक्रोस्कोप चरण पर 10 सेमी 3 पकवान रखो। सभी गोलाकार के लिए 50x पर माइक्रोस्कोप के आवर्धन को समायोजित करें।
    2. संलग्न कंप्यूटर पर माइक्रोस्कोप सॉफ़्टवेयर खोलें और प्रत्येक गोलाकार की एक स्पष्ट छवि रखने के लिए अपना फोकस समायोजित करें। अधिग्रहित चित्रों को सहेजने के लिए माइक्रोस्कोप सॉफ़्टवेयर पर कैप्चर उपकरण का उपयोग करें।

7. Homotypic Hep3B गोलाकार LX2 मुख्यमंत्री में

  1. गोले बनाने के लिए लटकने वाली बूंदों में 3000 हेप 3 बी एचसीसी कोशिकाओं को निलंबित करें। गोलाकार के लिए आर्द्र स्थिति प्रदान करने के लिए पकवान के तल पर बाँझ पीबीएस के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
  2. सेल निलंबन सहित मीडिया को आर्द्र वातावरण पर लटकाने की अनुमति देने के लिए 10 सेमी 3 डिश के ढक्कन को उलटें। लटकते हुए बूंदों को 3 दिनों के लिए छोड़ दें।
  3. लटकने वाली बूंदों में LX2 कोशिकाओं से ताजा सीएम के 20 μL में Hep3B गोलाकार स्थानांतरित करें।
    नोट: गठित गोलाकार के लिए किसी भी व्यवधान या चोट से बचने के लिए गोलाकार हस्तांतरण की प्रक्रिया में बाँझ autoclaved unfiltered 200 μL पिपेट युक्तियों का उपयोग करें। यह किसी भी अवशिष्ट कोशिकाओं को खत्म करने के लिए भी है जो मुख्य एकल गोलाकार से असंबद्ध रहते हैं।
    1. स्थानांतरण प्रक्रिया के लिए एक autoclaved 20 μL पिपेट का उपयोग करें। पिपेट आयतन को 2 μL में समायोजित करें। पिपेट टिप को पिपेट से जोड़ें।
    2. 10 सेमी 3 डिश के ढक्कन को उलटें जिस पर गोलाकार का गठन किया गया था। एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के चरण पर ढक्कन को ठीक करें। प्रत्येक गोलाकार दृश्यमान बनाने के लिए माइक्रोस्कोप के ठीक फोकस को समायोजित करें।
    3. प्लंजर बटन दबाकर माइक्रोपिपेट से हवा को सावधानीपूर्वक खाली करें। स्थानांतरित करने के लिए गोलाकार सहित बूंद में पिपेट टिप डालें। टिप के साथ इसे छूने के बिना गोलाकार के बहुत करीब हो जाओ।
    4. धीरे प्लंजर बटन पर दबाव जारी करने के लिए 2 μL मीडिया में micropipette टिप में गोलाकार के सक्शन की अनुमति देने के लिए.
    5. गोलाकार को एक नए 10 सेमी 3 डिश पर लटकने वाली एक नई बूंद में स्थानांतरित करें, जिसमें नए मीडिया / वातानुकूलित मीडिया / उपचार हो।
      नोट:: सुनिश्चित करें कि सभी गोलाकार सफलतापूर्वक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर नए 10 सेमी 3 डिश के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं।
  4. हस्तांतरण के दिन (दिन 3) से एलएक्स 2 सीएम में संस्कृति के दिन 7 तक एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 50x आवर्धन पर गोलाकार की छवियों को लें।

8. गोलाकार आयतन की गणना

  1. प्रत्येक गोलाकार के लिए एक अद्वितीय सांख्यिक पहचानकर्ता असाइन करें ताकि मिलान किए गए गोलाकार से छवियों को दैनिक रूप से कैप्चर किया जा सके.
  2. एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग कर बढ़ते गोलाकार की छवियों का विश्लेषण करें।
    1. सॉफ़्टवेयर पैकेज के भीतर प्रत्येक गोलाकार छवि खोलें। Freehand चयन उपकरण का उपयोग करना और प्रत्येक गोलाकार रूपरेखा. विश्लेषण ड्रॉपडाउन बटन से, मापन सेट करें, और तब क्षेत्र का चयन करें. ठीक दबाएँ.
    2. मैन्युअल रूप से प्रत्येक गोलाकार के चारों ओर एक वृत्त आरेखित करें। एक बार गोले को घेर लेने के बाद, प्रोग्राम को पिक्सेल में गोलाकार क्षेत्र की गणना करने की अनुमति देने के लिए Ctrl + M दबाएँ। गोलाकार के क्षेत्र को एक आयतन में कनवर्ट करें.
      नोट: गोलाकारmm3 का आयतन = 0.09403 × Equation 2
    3. छवि कैप्चर के पहले दिन इसकी मात्रा के सापेक्ष गोलाकार आयतन में परिवर्तन की गणना करें।
      नोट:: यह प्रारंभिक वॉल्यूम के लिए गोलाकार वॉल्यूम को सामान्य करने और प्रारंभिक आकार में प्राकृतिक भिन्नता को देखते हुए सटीकता में सुधार करने के लिए है।

Representative Results

बहु-स्तरीय 3 डी प्रारूप में सुसंस्कृत कोशिकाएं पारंपरिक 2 डी संस्कृतियों 24,25 की तुलना में ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट की जटिलता को अधिक सटीक रूप से प्रतिबिंबित करती हैं। इससे पहले, कई अध्ययनों ने गोलाकार गठन शुरू करने के लिए विभिन्न माइटोजेन और विकास कारकों के साथ गोलाकार संस्कृति मीडिया को पूरक किया है26। इस अध्ययन में, हालांकि, फाइब्रोब्लास्ट, या उनके सीएम के अलावा, गोलाकार विकास में तेजी लाने के लिए आवश्यक माइटोजेन और विकास कारक प्रदान करता है।

चित्रा 1 एक पायलट अध्ययन से डेटा को दर्शाता है जिसमें Huh7 मानव एचसीसी कोशिकाओं को 3 दिनों के लिए 20 μL ताजा मीडिया में 12,000 से 125 कोशिकाओं तक 12,000 से शुरू होने वाले अवरोही सीडिंग घनत्व में बीज दिया गया था। 12,000 कोशिकाओं के एक सीडिंग घनत्व ने एक असममित आकार के साथ गोलाकार उत्पन्न किया, जिसे सेल सीडिंग घनत्व को आधा करने के बाद भी सही नहीं किया गया था। हालांकि, 3000 कोशिकाओं से बनाए गए गोलाकार अधिक गोल दिखाई दिए (चित्रा 1, ऊपरी पंक्ति)। सेल एकाग्रता में और कमी न तो एकल क्षेत्रों (125, 250, 500 सेल-घनत्व क्षेत्रों) के गठन में सफल रही और न ही एक नियमित गोलाकार जैसी उपस्थिति (1000 और 1500 सेल-घनत्व गोलाकार) थी। यह ध्यान देने योग्य है कि कई छोटे गोले 500 ट्यूमर कोशिकाओं के घनत्व पर बनाए गए थे; हालांकि, केवल एक छोटे से गोलाकार को 50x आवर्धन (चित्रा 1, ऊपरी पंक्ति) पर कब्जा कर लिया गया था। एक ही अनुकूलित प्रोटोकॉल COS7 प्राइमेट गुर्दे फाइब्रोब्लास्ट सेल लाइन (चित्रा 1, मध्य पंक्ति) पर लागू किया गया था। 20 μL लटकने वाली बूंदों में 125, 250, और 500 COS7 फाइब्रोब्लास्ट को निलंबित करने के परिणामस्वरूप कई छोटे गोलाकार के साथ एक गोल गोलाकार गोलाकार हुआ, जबकि उच्च सेल घनत्व (1000, 1500, और 3000) ने एकल अर्ध-गोल गोलाकार गोलाकार का गठन किया। Huh7 ट्यूमर गोलाकार के समान, उच्च सेल निलंबन (6,000 और 12,000 कोशिकाओं / क्षेत्र) के परिणामस्वरूप अनियमित सेल समुच्चय का गठन हुआ, और इसलिए उच्च सेल सांद्रता को छोड़ दिया गया (चित्रा 1, मध्य पंक्ति)। Huh7/COS7 हेटरोटाइपिक सेल सस्पेंशन (125, 250, और 500 कोशिकाओं / गोले) के कम घनत्व ने कई फ्लोटिंग या अर्ध-संलग्न गोलाकार (चित्रा 1, निचली पंक्ति) के साथ एक एकल गोलाकार उत्पन्न किया। 1000- और 1500-सेल हेटरोटाइपिक गोलाकार अर्ध-गोल थे, जबकि 3000 कोशिकाओं (1500 प्रति सेल प्रकार) के एक सीडिंग घनत्व ने एक गोल 3 डी गोलाकार दिया। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, उच्च सेल घनत्व के परिणामस्वरूप अच्छी तरह से परिभाषित गोलाकार (चित्रा 1, निचली पंक्ति) के बजाय समुच्चय का गठन हुआ। निष्कर्ष में, 3000 सेल-घनत्व गोलाकार थे, मानव एचसीसी ट्यूमर के समान, और आगे के प्रयोगों के लिए अनुकूलित किए गए थे। 3 दिनों के लिए लटकने वाली बूंदों के रूप में सेल निलंबन को संवर्धित करना गोलाकार गठन को बढ़ावा देने के लिए पर्याप्त था।

वर्तमान संदर्भ में गोलाकार गठन के लिए सबसे अच्छी कोशिका एकाग्रता और समय बिंदु को अनुकूलित करने के बाद, सह-संवर्धित ट्यूमर और फाइब्रोब्लास्ट सेल लाइनों के प्रोलिफेरेटिव प्रभाव का अनुदैर्ध्य रूप से मूल्यांकन किया गया था। आंकड़े 2 और चित्रा 3 Huh7 / COS7 heterotypic गोलाकार (प्रति गोलाकार 3000 कुल सेल संख्या) दिन 3 से दिन 10 तक निगरानी से पता चलता है। Homotypic Huh7 और COS7 गोलाकार (1500 कोशिकाओं प्रत्येक) नियंत्रण के रूप में कार्य किया। दिन 4 से शुरू, heterotypic गोलाकार homotypic गोलाकार (चित्रा 2) की तुलना में एक आदर्श दौर की तरह आकार में वृद्धि हुई। हेटरोटाइपिक गोलाकार की प्रारंभिक मात्रा प्रत्येक होमोटाइपिक गोलाकार की तुलना में बड़ी थी। गोलाकार की वृद्धि की गणना गोलाकार आयतन (दिन 3, चित्रा 3) में सामान्य भिन्नता से बचने के लिए गोलाकार गठन के दिन प्रारंभिक आयतन के सापेक्ष उनकी मात्रा में परिवर्तन के रूप में की गई थी। हेटरोटाइपिक गोलाकार ने शुरू में दिन 4 से दिन 7 तक शुरू होने वाले एक तेजी से विकास चरण को दिखाया, जिसके बाद दिन 8 पर विकास का धीमा चरण (आंकड़े 2, ऊपरी पंक्ति और चित्रा 3)। गोलाकार की मात्रा 9 और 10 दिनों में कम हो गई, संभवतः पोषक तत्वों की कमी या हाइपोक्सिक कोर और सेल मृत्यु को दर्शाती है।

इसके विपरीत, homotypic Huh7 और COS7 गोलाकार बहुत धीमी दर से बढ़े (चित्रा 2, मध्य और नीचे की पंक्तियां; चित्रा 3)। होमोटाइपिक गोलाकार ने संस्कृति के पांचवें दिन तक एक अपेक्षाकृत स्थिर विकास वक्र का प्रदर्शन किया (गोलाकार गठन के दो दिन बाद)। दिन 6 से शुरू करते हुए, होमोटाइपिक गोलाकार ने अपने विकास वक्र में क्रमिक वृद्धि दिखाना शुरू कर दिया, हालांकि हेटरोटाइपिक गोलाकार (चित्रा 3) की तुलना में काफी कम दर पर। अंत में, ट्यूमर / फाइब्रोब्लास्ट हेटरोटाइपिक गोलाकार होमोटाइपिक गोलाकार की तुलना में उच्च दर से बढ़ते हैं, यह सुझाव देते हुए कि ट्यूमर कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट्स का सीधा संपर्क ट्यूमर गोलाकार के आकार को बढ़ाता है।

अंत में, उपरोक्त निष्कर्षों को मान्य करने और जिगर से संबंधित संदर्भ में एचसीसी गोलाकार के प्रसार पर मेसेनकाइमल कोशिकाओं के पैराक्राइन प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, 3-दिन पुराने होमोटाइपिक हेप 3 बी एचसीसी गोलाकार को नियमित रूप से ताजा मीडिया या सीएम में एलएक्स 2 हेपेटिक ताराकार कोशिकाओं (चित्रा 4 और चित्रा 5) से अतिरिक्त 4 दिनों के लिए उगाया गया था। पहली नज़र में, 3000 हेप 3 बी कोशिकाओं ने 3 दिनों के बाद पूरी तरह से गोल गोलाकार गोलाकार का गठन किया (चित्रा 4)। Hep3B गोलाकार दिन 3 से दिन 7 (चित्रा 4, ऊपरी पंक्ति) तक ताजा मीडिया में निरंतर प्रसार दिखाया। विकास दर को बढ़ाया गया था जब Hep3B गोलाकार LX2 सीएम (चित्रा 4, निचली पंक्ति) में बनाए रखा गया था। हेप 3 बी गोलाकार विकास में इस मीडिया-निर्भर रूपांतरण ने दिन 4 से प्रयोग के अंत तक सांख्यिकीय महत्व का प्रदर्शन किया (चित्रा 5), ट्यूमर गोलाकार के फाइब्रोब्लास्ट-संचालित प्रसार का सुझाव दिया।

निष्कर्ष में, इस अध्ययन ने एचसीसी ट्यूमर कोशिकाओं और विभिन्न फाइब्रोब्लास्ट सेल लाइनों के बीच क्रॉसस्टॉक का फायदा उठाने और इस प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष सेलुलर इंटरैक्शन (चित्रा 6) के प्रोलिफेरेटिव महत्व की जांच करने के लिए मौजूदा 3 डी गोलाकार संस्कृतियों को सफलतापूर्वक संशोधित किया है। गठित गोलाकार के आगे के लक्षण वर्णन को बेहतर बनाने के लिए आवश्यक है कि ट्यूमर कोशिकाएं आसपास के माइक्रोएन्वायरमेंट के साथ कैसे बातचीत करती हैं।

Figure 1
चित्रा 1: गोलाकार गठन के लिए इष्टतम सेल घनत्व का अनुकूलन। स्तंभ विभिन्न सेल सीडिंग घनत्व का प्रतिनिधित्व करते हैं, और पंक्तियां Huh7 कोशिकाओं (शीर्ष पंक्ति), COS7 कोशिकाओं (मध्य पंक्ति), और Huh7/COS7 हेटरोटाइपिक कोशिकाओं (नीचे की पंक्ति) से गठित गोलाकार का प्रतिनिधित्व करती हैं। छवियां 3 दिनों के लिए 20 μL मीडिया में 125, 250, 500, 1000, 1500, 3000, 6000, और 12000 कोशिकाओं (बाएं से दाएं) को निलंबित करने के बाद गठित गोलाकार का प्रतिनिधित्व करती हैं। पायलट अध्ययन में प्रति शर्त दो गोलाकार शामिल थे, और छवियों को 50x आवर्धन, स्केल बार = 200 μm पर लिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: हेटेरोटाइपिक बनाम होमोटाइपिक गोलाकार विकास। स्तंभ उस दिन का प्रतिनिधित्व करते हैं जिस पर गोलाकार छवियों को लिया गया था, और पंक्तियाँ Huh7 कोशिकाओं (शीर्ष पंक्ति), COS7 कोशिकाओं (मध्य पंक्ति), और Huh7/COS7 कोशिकाओं (निचली पंक्ति) से बने गोलाकार के लिए प्रतिनिधि छवियां दिखाती हैं। छवियां प्रत्येक स्थिति (homotypic Huh7, COS7, या Huh7 / COS7 heterotypic गोलाकार) से 3000 कोशिकाओं को निलंबित करने के बाद गठित गोलाकार का प्रतिनिधित्व करती हैं, जो बाएं से दाएं अलग-अलग समय बिंदुओं के हैं। प्रयोग में प्रति शर्त 10 गोलाकार शामिल थे, और छवियों को 50x आवर्धन, स्केल बार = 200 μm पर लिया गया था। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: हेटरोटाइपिक बनाम होमोटाइपिक गोलाकार विकास का अनुदैर्ध्य विश्लेषण। ग्राफ हेटरोटाइपिक Huh7/COS7 गोलाकार बनाम homotypic Huh7 और COS7 गोलाकार के विकास वक्र को दर्शाता है। डेटा को माध्य ± के रूप में प्रस्तुत किया जाता है.m; n = 10 स्वतंत्र गोलाकार। ** पी < 0.01; पी < 0.001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: LX2 सेमी में Homotypic Hep3B गोलाकार की वृद्धि। कॉलम उस दिन का प्रतिनिधित्व करते हैं जिस पर गोलाकार छवियों पर कब्जा कर लिया गया था, और पंक्तियां ताजा डीएमईएम संस्कृति मीडिया (शीर्ष पंक्ति) या एलएक्स 2 सीएम (नीचे की पंक्ति) में सुसंस्कृत हेप 3 बी गोलाकार की प्रतिनिधि छवियों को दिखाती हैं। प्रयोग में प्रति शर्त सात गोलाकार (ताजा मीडिया या LX2 CM) शामिल थे, और छवियों को 50x आवर्धन, स्केल बार = 200 μm पर लिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: होमोटाइपिक हेप 3 बी गोलाकार विकास का अनुदैर्ध्य विश्लेषण। ग्राफ ताजा DMEM संस्कृति मीडिया या LX2 CM में Hep3B गोलाकार के विकास वक्र को दर्शाता है। डेटा को माध्य ± s.e.m के रूप में प्रस्तुत किया जाता है; n = 7 स्वतंत्र गोलाकार। पी < 0.001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: गोलाकार गठन प्रक्रिया का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। सेल निलंबन 10 सेमी 3 पेट्री-डिश के आंतरिक ढक्कन पर पाइप किया गया है। ढक्कन को उलटा किया जाता है और होमोटाइपिक या हेटरोटाइपिक गोलाकार गठन की अनुमति देने के लिए 3 दिनों के लिए रखा जाता है। गोलाकार छवियों को 50x आवर्धन पर लिया जाता है। आंकड़ा एक वेब-आधारित विज्ञान चित्रण उपकरण का उपयोग करके बनाया गया है ( सामग्री की तालिका देखें)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

जिस संदर्भ में प्रयोगात्मक सेल लाइनें बढ़ती हैं, वे उनके जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल, मार्ग विश्लेषण और कार्यात्मक मानदंडों को प्रभावित करती हैं। उदाहरण के लिए, स्तन कैंसर कोशिकाओं में, विभिन्न ऑन्कोजेनिक मार्गों के बीच समन्वय केवल तभी बनाए रखा जाता है जब कैंसर कोशिकाओं को 3 डी संरचना 27 में उगाया जाता है। 3 डी मेलेनोमा और स्तन कैंसर गोलाकार में विनियमित जीन, लेकिन मोनोलेयर कोशिकाओं में नहीं, विवो मानव ट्यूमर 28,29 में अधिक प्रासंगिक हैं। उदाहरण के लिए, स्तन उपकला कोशिकाओं और ट्यूमर समकक्षों में π1 इंटीग्रिन का स्तर 2 डी प्रारूप 29 में उगाए गए स्तरों की तुलना में कम था। इसके अलावा, 3 डी संरचनाओं में फाइब्रोब्लास्ट प्लास्टिक 30 पर सुसंस्कृत लोगों की तुलना में आकृति विज्ञान और गति के संदर्भ में स्पष्ट रूप से माइग्रेट करते हैं। इसके अलावा, विकास सब्सट्रेट की यांत्रिक कठोरता विशिष्ट मार्गों को सक्रिय करती है जो उपकला कोशिकाओं में बाह्य कोशिकीय सिग्नल-विनियमित किनेज (ईआरके)/ Rho के विनियमन के माध्यम से सामान्य उपकला कोशिकाओं के घातक परिवर्तन को प्रोत्साहित करती है31। ये कारक पारंपरिक 2 डी संस्कृति से 3 डी गोलाकार मॉडल में संक्रमण का पक्ष लेते हैं, क्योंकि 3 डी संस्कृतियां मानव रोग को ध्यान में रखते हुए अधिक हैं।

वर्तमान अध्ययन में 3 डी ट्यूमर गोलाकार मॉडल का उत्पादन करने के लिए पारंपरिक प्रयोगशाला उपकरणों और आपूर्ति का उपयोग किया गया था। गठित गोलाकार ने फाइब्रोब्लास्ट से आने वाले प्रसार संकेतों का जवाब दिया, जैसा कि उनके काफी वृद्धि वाले विकास से दिखाया गया है। यह मॉडल बहुकोशिकीय ट्यूमर गोलाकार श्रेणी से संबंधित है। 3 डी ट्यूमर गोलाकार की तीन अन्य श्रेणियां हैं, जिनमें ट्यूमरोस्फीयर 32, ऊतक-व्युत्पन्न ट्यूमर क्षेत्र 33,34, और ऑर्गेनोटाइपिक बहुकोशिकीय गोलाकार 35 शामिल हैं। बहुकोशिकीय ट्यूमर गोलाकार में, ट्यूमर कोशिकाओं को कम आसंजन स्थितियों में निलंबित कर दिया जाता है ताकि उन्हें संस्कृति पोत 36 के तल को छूने के बिना गोले बनाने के लिए एक साथ एकत्रित करने की अनुमति मिल सके। इस एंकरेज-स्वतंत्र तकनीक को वितरित करने के लिए कई दृष्टिकोणों को नियोजित किया गया है, जिसमें घूर्णन प्रणाली, तरल ओवरले तकनीक, और अनकोटेड अल्ट्रा-कम अनुलग्नक यू-आकार की प्लेटें 37 शामिल हैं। एचसीसी में, इन विट्रो गोलाकार संस्कृतियों में से अधिकांश गोल गोलाकार 18,19,20,21,22 बनाने के लिए अल्ट्रा-लो अटैचमेंट 24- या 96-वेल प्लेटों का उपयोग करते हैं। हालांकि, यह तकनीक लागत प्रभावी नहीं है और किसी भी आकस्मिक सेल-प्लास्टिक संपर्क को बाहर नहीं करती है। अन्य प्रणालियां जिगर के सूक्ष्म ऊतकों का उत्पादन करने के लिए ट्रांस-वेल्स 23 या यकृत स्लाइस 12 का उपयोग करती हैं। ट्रांसलेशनल काम में मानव ऊतकों का उपयोग करना सोने का मानक है लेकिन कई शोध समूहों द्वारा हमेशा उपलब्ध या सुलभ नहीं है। वर्तमान दृष्टिकोण को फांसी की बूंदों के सिद्धांत से लाभ हुआ। सेल निलंबन जोड़ा जाता है ताकि ट्यूमर गोलाकार एकल गोल क्षेत्रों को बनाने के लिए एक सुलभ तरल-हवा इंटरफ़ेस में बनाया जा सके। इस तकनीक का उपयोग करने के फायदे किसी भी सेल-प्लास्टिक संपर्क की कमी और ट्यूमर और फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं के बीच ऑटोक्राइन और पैराक्राइन क्रॉसस्टॉक का अध्ययन करने में आसानी है। इस मॉडल को एक अन्य अध्ययन में आगे मान्य किया गया था, जिसमें एचसीसी विकास 39 से जिगर की रक्षा में गैर-पैरेन्काइमल TREM2 के महत्व को समझाया गया था। इस काम से पता चला है कि Hep3B और PLC / PRF5 गोलाकार दोनों की मात्रा नियंत्रण LX2 CM बनाम TREM2-overexpressing LX2 CM को WNT-निर्भर तरीके से 39 में अधिक थी।

वर्तमान अध्ययन में, इस सह-संस्कृति के प्रोलिफेरेटिव प्रभाव की जांच करने के लिए गोलाकार गठन से पहले फाइब्रोब्लास्ट्स को ट्यूमर कोशिकाओं के साथ मिलाया गया था। दूसरों ने ट्यूमर 40,41 में स्ट्रोमल सेल माइग्रेशन का अध्ययन करने के लिए ट्यूमर गोलाकार बनाने के बाद ट्यूमर सेल निलंबन के साथ फाइब्रोब्लास्ट, एंडोथेलियल कोशिकाओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं को जोड़ा है। वर्तमान हेटरोटाइपिक गोलाकार मॉडल ने पहले रिपोर्ट किए गए मॉडल और विवो ट्यूमर में मूल के समान विकास पैटर्न दिखाया; गोलाकार एक विलंबित विकास चरण के बाद घातीय विकास दिखाते हैं, शायद पोषक तत्वों की कमी और परिगलित कोर 42 के विस्तार के कारण। गोलाकार गठन में मदद करने के लिए विकास कारकों और माइटोजेन को जोड़ने के बजाय, इस अध्ययन ने फाइब्रोब्लास्ट सीएम में फाइब्रोब्लास्ट या उनके स्राव के साथ सीधे संपर्क से इन विकास कारकों को होने से अधिक शारीरिक दृष्टिकोण का उपयोग किया। यह उल्लेख करना आवश्यक है कि LX2 कोशिकाओं को TGFπ1 या PDGF43 के साथ इलाज करके आगे सक्रिय किया जा सकता है। LX2 कोशिकाओं को विभिन्न प्रयोगात्मक सेटिंग्स के लिए मीडिया को हटाने से पहले 48 घंटे के लिए 10 ng / mL TGFπ1 के साथ इलाज किया गया है। एलएक्स 2 कोशिकाओं को पीबीएस के साथ तीन बार धोया गया था (किसी भी प्रत्यक्ष टीजीएफ 1 प्रभाव को बाहर करने के लिए), और फिर सीएम को इकट्ठा करने से पहले ताजा मीडिया को एक और 24 घंटे के लिए जोड़ा गया था। TGF 1-प्रेरित LX2 से एकत्र किए गए मुख्यमंत्री ने नियंत्रण LX2 (डेटा नहीं दिखाया गया है) से मुख्यमंत्री की तुलना में उच्च दर पर हेप 3 बी गोलाकार के विकास को प्रेरित किया। यह लचीली प्रणाली विभिन्न कैंसर कोशिकाओं की सह-संस्कृतियों के साथ-साथ फाइब्रोब्लास्ट्स के साथ-साथ रोगी-व्युत्पन्न लाइनों को उधार दे सकती है। यह दवाओं के लिए एक मध्यम-थ्रूपुट स्क्रीनिंग परख भी प्रदान कर सकता है जिसे जल्दी से अपनाया जा सकता है और विवो अध्ययनों में खुराक को सूचित करने के लिए एक ट्रांसलेशनल दवा खोज पाइपलाइन में डाला जा सकता है।

वर्तमान अध्ययन की एक सीमा ताजा अलग एचसीसी ट्यूमर कोशिकाओं और कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट के बजाय गोलाकार गठन में अमर सेल लाइनों का उपयोग है। एक अन्य सीमा एलएक्स 2 से सीएम के बीच होमोटाइपिक हेप 3 बी गोलाकार के विकास की तुलना कर रही है और अन्य गैर-फाइब्रोब्लास्ट सेल लाइनों से सीएम के बजाय ताजा मीडिया में। उत्तरार्द्ध सीमा को फाइब्रोब्लास्ट में रुचि के जीन के आनुवंशिक संशोधन द्वारा संबोधित किया जा सकता है, जिसके बाद सीएम को जंगली प्रकार बनाम आनुवंशिक रूप से इंजीनियर फाइब्रोब्लास्ट से होमोटाइपिक गोलाकार में लागू किया जा सकता है।

Disclosures

एफओ फाइब्रोफिंड लिमिटेड का एक निदेशक और शेयरधारक है।

Acknowledgments

MYWZ को ब्रिटेन के आधिकारिक विकास सहायता "ओडीए" और न्यूटन फंड के हिस्से के रूप में व्यापार, ऊर्जा और औद्योगिक रणनीति के लिए राज्य सचिव और न्यूटन पुरस्कार 2020 द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। एसएस कैंसर रिसर्च यूके उन्नत चिकित्सक वैज्ञानिक फैलोशिप C53575 / A29959 द्वारा समर्थित है। एसएस, एफओ, और एचआर हंटर के हिस्से के रूप में धन प्राप्त करते हैं, जो कैंसर रिसर्च यूके, फोंडाज़ियोन एआईआरसी, और फंडासियन साइंटिफिका डे ला एसोसियासिओन एस्पेनोला कॉन्ट्रा एल कैंसर के बीच साझेदारी के माध्यम से वित्त पोषित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Trypsin Sigma Aldrich 59429C
2 mL tubes Eppendorf
Biorender Biorender.com Online
Class II laminar flow BioMAT2 hood Medair Technologies
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Biosera M-D1107
Excel sofware Microsoft office 365
Graphpad prism sofware GraphPad software
Heat deactivated fetal bovine serum (FBS) life tech 105000064
Image J software Fiji
L-glutamine Sigma Aldrich G7513-100ml
Penicillin/streptomycin (100 unit/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin) Sigma Aldrich P0781-100ml
Petri dish 90 mm, triple vented Greiner 633175
Trypan blue Sigma Aldrich T8154
Virkon™ Broad Spectrum Disinfectant, 5kg Bucket Rely+On™ SCI-129999
Ziess inverted microscope Ziess

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कैंसर अनुसंधान अंक 175
हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा में ट्यूमर-स्ट्रोमल इंटरैक्शन की जांच करने के लिए एक त्रि-आयामी गोलाकार मॉडल
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Zaki, M. Y. W., Shetty, S.,… More

Zaki, M. Y. W., Shetty, S., Wilkinson, A. L., Patten, D. A., Oakley, F., Reeves, H. A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma. J. Vis. Exp. (175), e62868, doi:10.3791/62868 (2021).

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