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Medicine

研究辅助供氧对囊性纤维化气道微生物组影响的模型的设计与开发

Published: August 3, 2021 doi: 10.3791/62888
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 2, 4, 5, 1
1Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Molecular Biology & Biochemistry, University of California, Irvine, 3Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, 4Department of Microbiology & Immunology, Geisel School of Medicine at Dartmouth, 5Swiss i-research and teaching institute

Summary

该协议的目标是开发一个模型系统，用于高氧对囊性纤维化气道微生物群落的影响。 人工痰培养基模拟痰液的组成，高氧培养条件模拟了辅助氧气对肺微生物群落的影响。

Abstract

气道微生物群落被认为在囊性纤维化（CF）和其他慢性肺部疾病的进展中起重要作用。传统上，微生物是根据其使用或耐受氧气的能力进行分类的。辅助供氧是一种常见的药物治疗，用于囊性纤维化（pwCF）患者;然而，关于氧气和气道微生物组的现有研究集中在缺氧（低氧）而不是高氧（高氧）如何影响主要有氧和兼性厌氧肺微生物群落。为了解决这一关键的知识差距，该协议是使用模仿pwCF痰液组成的人造痰液培养基开发的。使用产生透明培养基的过滤器灭菌允许光学方法跟踪悬浮培养物中单细胞微生物的生长。为了创建高氧条件，该模型系统利用已建立的厌氧培养技术来研究高氧条件;不是除去氧气，而是通过每天用压缩氧气和空气的混合物喷射血清瓶将氧气添加到培养物中。来自50 pwCF的痰液每天进行72小时的喷射，以验证该模型维持差分氧条件的能力。对来自11 pwCF的培养和未培养的痰液样本进行霰弹枪宏基因组测序，以验证该培养基支持囊性纤维化痰中常见的共生和致病微生物生长的能力。从从pwCF获得的112株分离株中获得生长曲线，以验证这种人造痰培养基支持常见囊性纤维化病原体生长的能力。我们发现该模型可以在CF痰中培养各种病原体和共生菌，在正常氧条件下恢复与未培养痰高度相似的群落，并在不同的氧气条件下产生不同的培养表型。这种新方法可能会更好地理解在pwCF中使用氧气对气道微生物群落和常见呼吸道病原体引起的意外影响。

Introduction

囊性纤维化（CF）是一种遗传性疾病，其特征在于无法清除肺部的粘液，导致反复感染和进行性肺功能下降，通常导致需要肺移植或死亡。囊性纤维化（pwCF）患者的气道微生物组似乎跟踪疾病活动1，与不良长期结局相关的微生物多样性减少2，3。在pwCF的临床研究中，补充氧疗与更晚期的疾病4，5相关，尽管传统上，氧疗的使用仅被视为疾病严重程度的标志6 。最近一项针对呼吸衰竭患者的临床试验研究表明，较高的患者氧气水平与严重细菌感染的增加和更高的死亡率相矛盾7，这表明补充氧气可能有助于疾病的发病机制。补充氧气对囊性纤维化肺微生物组以及相关的肺和气道微生物群落的影响尚未得到很好的研究。

由于后勤困难以及与未知医疗益处或伤害的干预措施相关的潜在伦理问题，机械研究通常无法直接对人类受试者进行。在这些情况下，将人类生物标本整合到模型系统中的转化方法可以提供重要的生物学见解。虽然使用或耐受氧气的能力传统上是微生物分类的重要组成部分，但对于向环境引入辅助氧气的治疗性如何扰乱气道微生物群落知之甚少。为了阐明辅助供氧对pwCF气道微生物组的未知影响，我们需要解决两个主要挑战;首先，创建一种培养基，在生理上接近CF痰的组成;其次，创建一个模型系统，允许在较长的时间内保持培养物中升高的氧浓度。

人工痰培养基（ASM）被广泛用于模拟肺痰体外8、9、10，但对具体配方没有明确的共识。该协议描述了一种精心设计的人造痰液培养基配方和制备策略，以从生理上近似于来自pwCF的痰液。表1概述了基于已发表文献的所选配方值。基本化学成分和pH值与人类CF痰液研究确定的值相匹配11，12，13。使用蛋黄加入低浓度的生理营养素，其作为最终体积的0.25%加入，以及维生素和微量金属混合物14，15。粘蛋白是痰16的关键成分，包括在1%w / v14。虽然过滤器杀菌更费力，但过滤器灭菌被选择在更传统的热灭菌实践之上，以减少由热引起的基本介质组分变性的潜在问题10。过滤器灭菌的另一个好处是它产生透明的介质（由于盐和蛋白质的沉淀和凝固，热灭菌可以产生浑浊的介质），允许这种人造痰培养基用于根据浊度的增加来跟踪微生物生长。

该高氧培养模型系统基于厌氧培养技术，其中添加而不是去除氧气，从而为pwCF补充氧气的使用效果创建了模型。 图1 和相关氧气喷射方案概述了氧气喷射系统的组件，这些组件可以从一般实验室和医院供应商处以低成本获得。该系统能够将压缩氧气和空气混合到21%-100%氧气的固定浓度。氧气传感器的集成允许验证输出气体混合物的浓度，以及检查先前喷射的血清瓶的流出气体成分，以验证氧气条件是否保持在所需范围内。

该协议概述了创建人造痰液培养基的程序，氧气喷射系统的构建和使用，以及两者在差氧条件下用于培养CF痰液的应用。

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Protocol

该研究获得了合作伙伴机构审查委员会的批准（协议编号2018P002934）。纳入标准包括为研究提供书面知情同意书的囊性纤维化成年患者。没有排除标准。根据方案指南，所有痰液样本都是在预定的门诊就诊期间从囊性纤维化患者那里收集的。

1. 人工痰培养基制备

注：此处列出的数量用于生产1 L最终人造痰液，并假设材料表中列出的特定试剂。必须针对其他体积或使用不同的试剂调整数量，以确保相同的最终产品。目标浓度见表1。

  1. 人工痰液化学混合物
    注：ASCM占最终介质体积的25%。它具有货架稳定性，可以散装或提前制备。如果准备以后使用，请高压灭菌化学混合物并将其安全地储存在室温下。
    1. 混合组成化学原料溶液。
      1. 准备1M NaCl储备：每升无菌水加入58.44克NaCl。
      2. 准备1 M KCl储备：每升无菌水加入74.55克KCl。
      3. 准备1 M MgSO4储备：每升无菌水加入246.47克MgSO4·7H 2O，或每升无菌水120.37克无水MgSO4。
      4. 准备1M葡萄糖储备：每升无菌水加入180.16克葡萄糖。
    2. 高压灭菌器对化学储备溶液以及空的250 mL瓶进行灭菌。执行高压灭菌步骤至至少121°C和15 PSI的标准值30分钟。
    3. 将80.59毫升无菌水加入空的250毫升瓶中。
    4. 将152.30 mL的1 M NaCl原液加入混合物中。
    5. 将15.8 mL 1 M KCl原液加入混合物中。
    6. 向混合物中加入610μL1 M MgSO4 储备液。
    7. 向混合物中加入700μL1M葡萄糖储备。
  2. 人造痰粘蛋白混合物
    注：ASMM占最终介质体积的50%。确保它与最终的培养基批次在同一天制备。
    1. 将 450 mL 无菌水加入空的 1 L 瓶中。
    2. 将50毫升10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）加入瓶中。
    3. 将一次性磁力搅拌棒添加到瓶子中。
    4. 高压灭菌含有PBS的瓶子和搅拌棒。
    5. 取出10克粘蛋白粉，并将其添加到PBS中。
    6. 用力摇晃瓶子进行初步混合。
    7. 将瓶子放在带有磁力搅拌器的热板上。将热量设置为中高，目标温度为50°C，搅拌速度为1100 rpm。逐渐提高速度，使棒材不会从磁铁上飞落。
      1. 加热并搅拌15分钟。
      2. 戴上耐热手套拿起瓶子。观察以检查粘蛋白粉末是否从溶液中沉淀出来。
      3. 如果粘蛋白粉未完全溶解，请将瓶子放回加热/搅拌器5分钟，直到完全溶解。
    8. 让粘蛋白混合物冷却至室温。
  3. 人造痰生物混合物（ASBM）
    注：反舰弹道导弹为最终介质体积的25%。在与最终中等批次的同一天准备它，并且与其他混合物不同，不要将其组分暴露在任何热量下。
    1. 在4°C冰箱或冰上解冻100x维生素储备。
      注意：将维生素储备预先分成10毫升等分试样，以尽量减少冷冻/解冻循环的次数。
    2. 将124.24毫升无菌水加入空的高压灭菌的250毫升瓶中。
    3. 将 25.76 mL 50 倍必需氨基酸储备液加入混合物中。
    4. 将 80.14 mL 100 倍非必需氨基酸储备液加入混合物中。
    5. 将10毫升（解冻的）100倍维生素储备液加入混合物中。
    6. 将 1 mL 1000x 痕量金属原液加入混合物中。
    7. 将8.33毫升30%蛋黄乳液加入混合物中。
    8. 向混合物中加入400μL10g / L铁蛋白储备液。
    9. 通过手动摇匀将溶液混合均匀。
  4. 人工痰培养基
    1. 将250毫升ASCM加入1升含有ASMM的瓶子中。
    2. 将250毫升ASBM加入培养基瓶中。
    3. 用碱性MOPS缓冲液（1 M）滴定培养基，在窄范围pH纸上达到6.3的pH值。在滴定之前，培养基混合物会太酸性。
    4. 将所得的人造痰液介质冷藏在4°C，直到准备好过滤。
    5. 要开始过滤过程，请将200 mL未经过滤的人造痰液转移到具有0.22μm孔径过滤器的真空过滤系统中。
    6. 将过滤系统连接到真空泵，打开真空泵，将其设置为70 mbar，然后将腔室放在轨道振荡器上，在4°C的冷室中以90 rpm的速度振荡。
      1. 在过滤可观量的培养基时，再加入 150 mL 培养基。完全过滤1L培养基需要1-2天。
      2. 用额外的腔室重复上述步骤，直到所有培养基都被过滤干净。
        注意：尽量不要通过相同的0.22μm过滤器过滤超过350 mL的培养基，因为粘蛋白会随着时间的推移堵塞过滤器。
    7. 将过滤后的人造痰液冷藏在4°C，直到准备使用。在准备后的一个月内使用ASM以获得最佳效果。

2. 氧气喷射

  1. 喷射站设置
    注意：此协议只需完整完成一次，之后可以通过必要的简单维护来维护设置。有关氧气喷射系统的可视化示意图，请参见图1。
    1. 获取并正确固定压缩空气和氧气罐。
      注意：高压使储罐在处理不当时非常危险。确保储罐完全密封和固定，在储罐关闭时没有泄漏，并且所有处理人员都经过充分的使用培训。
    2. 用扳手将空气调节器连接到压缩空气罐。为了在调压阀上获得最佳流量读数，请将调压阀尽可能靠近直立位置。
    3. 将氧气调节器连接到压缩氧气罐，尽可能靠近直立位置。根据氧气罐的不同，可能需要反转方向以收紧。
    4. 将来自调压阀的管道连接到 Y 型连接器，以组合来自两个储罐的气流。
    5. 将 Y 型连接器的输出连接到中央 T 型接头阀。
    6. 将中央 T 型接头阀的一侧连接到气体压力表。
    7. 将气体压力表的另一侧连接到孔径为 0.22 μm 的 25 mm 无菌注射器过滤器。
    8. 将第二个直径为25 mm的注射器过滤器连接到注射器上，没有柱塞，可在喷射过程中用作气体释放。
    9. 将中央 T 型接头阀的最后一侧连接到氧气监测仪的第二个 T 型接头阀。
    10. 将直径为 25 mm 的注射器过滤器连接到第二个 T 型接头阀的一侧，以及用于连接 18 G 针头的管路。
    11. 将第二T型接头阀的最后一侧连接到氧气监测装置。
    12. 将切断管连接到氧气监测装置的另一侧，以便在监测期间用作气体释放。
      注意：在测试/使用氧气喷射系统时，请仔细注意T形结的位置，并确保其与通过系统的预期路径相匹配。如果不这样做，将导致系统内部的压力积聚，并导致组件失效并破裂 。
    13. 为了维护系统并使其以最佳性能工作，以下做法是有益的。
      1. 用大量特氟龙胶带加强连接，以大大改善其密封性，并减少组件脱离内部压力的机会。
      2. 将组合流量保持在10升/分钟以下，以减轻最大压力并防止故障。
      3. 如果怀疑泄漏，请使用洗涤剂溶液，例如市售液体泄漏探测器，以轻松识别其位置，因为它会在任何气体泄漏上方冒泡。使用聚四氟乙烯胶带（例如特氟龙）进行贴片泄漏。
      4. 每两周更换一次氧气喷射系统中直径为 25 mm 的注射器过滤器，但这会因使用频率而异。随着时间的推移，过滤器中夹住的颗粒会降低气体流速并导致压力积聚。
      5. 在进行测量之前，将氧气监测仪校准为21%氧气压缩空气。
      6. 系统使用完成后，关闭储罐并从调节器中排出多余的气体，直到流量完全停止。
  2. 血清瓶培养痉挛
    1. 在 500 mL 高压灭菌血清瓶上贴上标签，并标明样品标识符、接种日期/时间和目标氧含量。
    2. 在生物罩中，将24毫升人造痰培养基加入每个正在设置的血清瓶中。
    3. 将1mL用18-G针头匀浆的患者痰液（必要时用无菌盐水稀释以获得每种培养条件的足够体积的样品）加入每个血清瓶中。
    4. 使用无菌镊子，将高压灭菌的橡胶塞放在每个血清瓶的顶部。
    5. 按下橡胶塞，注意不要用手触摸塞子的底部。
    6. 从抽油烟机上取下瓶子，应用并压接铝封条。从密封件上取下中心件。
    7. 用酒精擦拭布擦拭瓶子的顶部，然后通过本生燃烧器火焰。
    8. 将无菌的18-G针头贴在带有过滤器的无柱塞注射器上。首先将此气体释放物插入瓶中。
    9. 将无菌的18-G针头固定在系统的气体输出端，并将气体输出针插入瓶子中。
    10. 将 T 形结从储罐通过氧气监测仪。验证目标氧浓度是否流经系统。目标气体流量约为 5 L/min。
    11. 将 T 形结从储罐重新路由到气体输出端。气体开始流经血清瓶。
      注意：在氧气喷射期间，请密切注意压力表。如果压力意外增加，请立即关闭系统。
    12. 在血清瓶中运行氧气喷射1分钟。在5 L / min时，这允许10次空气交换，并确保内部气氛达到所需的分压。
    13. 取出气体释放18-G针。
    14. 让血清瓶中的压力建立到+1大气压（海平面为2个大气压），然后立即取出气体输出针。
      注意：保持压力有助于随着时间的推移保持高氧状态。
    15. 将血清瓶放入37°C培养箱振荡器中，转速为150 RPM。将样品孵育三个24小时间隔。在每个24小时的间隔内，取等分试样进行下游分析，重新分流样品并将其返回孵育，总孵育时间为72小时。
  3. 流出量氧气测量
    1. 将氧气计校准为21%压缩空气，然后关闭储罐。
    2. 将血清瓶的摄入量通过氧气监测仪，并将无菌针头固定到底。
    3. 将针头穿过橡胶塞插入血清瓶中。
    4. 等待流出读数稳定下来。血清瓶流出的流速低，这意味着这可能需要长达2分钟的时间。报告与室内空气的峰值差异（从 21% 到最远的数字）。
    5. 如果执行多个读数，请在读数之间用压缩空气冲洗系统。

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Representative Results

这些方案应用于来自pwCF的50个痰液样本，这些样本在马萨诸塞州波士顿马萨诸塞州总医院的门诊囊性纤维化诊所进行常规护理。使用人造痰培养基在21%，50%和100%氧气条件下培养每位患者的痰液，在24小时，48小时和72小时的培养时间从每种培养物中取出0.5mL等分试样进行测试。当提取以跟踪视觉变化时，对培养物进行拍摄。此外，在培养前取每个原发痰样本的0.5mL等分试样。这导致每位患者有10个离散样本，最终N为500个样本。其中，来自11名患者的痰液（11名未培养的痰液，11名培养的痰液在孵育48小时时来自21%氧气）的痰液进行了核酸提取17次，使用商业DNA文库制备试剂盒生成测序文库，并在全基因组测序平台上进行宏基因组测序，靶向每个样品约5 Gb的序列，具有150个碱基对， 配对端读取。原始读数使用bioBakery工具套件18进行处理，其中包括质量控制和去除人类"污染物"序列以及使用MetaPhlAn3分析器19进行分类学分析。在核酸提取时，将1000万个盐酸Imtechella细胞（一种通常在河口生态系统中而不是人类微生物群落中发现的耐盐物种）的细胞被添加到每个样品中，从而可以量化每个样品的绝对微生物负荷20。

图2显示了在每种氧气条件下培养的50个痰液样品在培养过程中的单个和平均流出氧测量值和pH值，以及视觉差异培养表型的示例。将培养物保持在37°C，除非在进行喷射和去除样品等分试样的短暂时期。在12小时和24小时的喷射间隔下，氧气浓度保持升高，尽管观察到所有三种氧气条件随时间推移下降，100%氧气降至约85%，50%氧气降至40%，21%氧气降至18%。氧气条件仍然不同，重要的是，高氧样品在整个过程中保持升高的氧气浓度。pH测量显示出更大程度的变异性，但保持在生理正常范围内，随着时间的推移没有统计学上的显着变化。这些测量表明，这些方法在整个培养过程中保持离散的差分氧条件。最后，显示了许多视觉培养表型之一的示例，这些表型在氧浓度上存在差异。培养72小时后，该样品具有显着的浊度差异，较高的氧气与较低的视觉浊度相关。差异培养表型支持存在高氧诱导的对培养群落的影响。

图3比较了未培养的痰液和培养的痰液之间的微生物负荷，微生物多样性和微生物群落组成（21%氧气条件持续48小时）。测量显示，培养行为引入的唯一主要差异是与未培养的痰相比，微生物负荷增加约20倍。免疫系统和典型的机械排痰机制（如咳嗽）通常作为限制肺部微生物负荷的调节过程，即使在像pwCF中看到的功能障碍和感染的情况下也是如此。 离体 培养没有这样的调节机制，微生物群落可以自由地走向细胞饱和。α和β多样性指标表明，尽管微生物负荷存在差异，但潜在的群落组成仍然保存完好，培养过程引入的全局差异最小。

图4扩展了未培养和培养的痰液样本之间的比较，观察了通过鸟枪宏基因组学测序从11名患者获得的培养和未培养的痰液中最终确定的120种微生物物种的二元存在/不存在。微生物根据系统发育相似性进行聚类。这些物种中有46个（38.3%）在未养殖和养殖样品（青色）中鉴定，而35个（29.2%）在未养殖的样品（黄色）中专门鉴定，39个（32.5%）专门在养殖样品（蓝色）中鉴定。就存在和不存在的内容而言，可能存在比我们使用测序确定的更高的奇偶校验，但在某些情况下，某些分类群低于测序检测阈值。这些差异确实表明，与未培养的痰相比，培养过程在培养过程中引入了一些偏倚。最值得注意的是，培养会增加真菌的存在，如 念珠菌 和 曲霉菌，以及 肠杆菌 成员 ，包括大肠杆菌，沙雷氏菌和 链球菌 成员。相反， 拟杆菌 成员，如 Prevotella 和 梭状芽胞杆菌， 它们是厌氧菌，存在于未培养的样品中，但不存在于培养的样品中。这可能归因于我们的实验模型中缺乏厌氧条件。

图5显示了从50种不同pwCF获得的痰液中分离出的常见CF肺病原体的基于吸光度的生长曲线。这些分离株代表了使用马萨诸塞州总医院临床微生物实验室的富集培养程序获得的表型不同的临床分离株，包括 铜绿假单胞菌 （N = 53）， 金黄色葡萄球菌 （N = 37）， 嗜麦嗜甜葡萄球菌 （N = 12）， 肺炎克雷伯菌 （N = 3）和 嗜铬杆菌sp （N = 7）。通过在37°C的黑暗中在人造痰培养基中培养每个分离物来获得生长曲线，无细菌接种的ASM作为阴性对照。ASM的透明质量（这是由于过滤而不是热灭菌）允许进行光学测量以估计生长曲线。每10分钟采集一次600nm（OD 600）的光学读数，并显示每条曲线的前24小时。仅ASM阴性对照中光学读数没有变化表明培养物没有污染。这里显示的示范曲线遵循典型的生长曲线模式，表明该ASM配方作为基于吸光度的生长曲线生成的培养基的可行性。

第1栏 第2栏 第3栏 第4栏 第5栏 第6栏 第7栏 第8栏 第9栏
价值 康斯托克 基什内尔 斯里拉穆鲁 帕尔默 弗林 加拉格尔 来 源
粘蛋白 2% 带电位 0.5% 带电位 0.5% 带电位 - 1% w/v 2% 带电位 1% w/v 弗林
氯化钠 85.5 毫米 85.5 毫米 85.5 毫米 66.6 毫米 89.8 毫米 85.5 毫米 152.3 毫米 拉皮埃尔
氯化钾 29.5 毫米 29.5 毫米 29.5 毫米 15.8 毫米 - 2.95 毫米 15.8 毫米 帕尔默
硫酸镁 - - - 0.6 毫米 1 毫米 1 毫米 0.61 毫米 帕尔默
硫酸铁 - - - 0.0036 毫米M - - - -
氯化铵 - - - 2.3 平方米 60 毫米 - - -
磷酸一钾 - - - 2.5 毫米 60 毫米 - - -
葡萄糖 - - - 3.2 毫米 13 毫米 40 毫米 0.7 毫米 桑贝克
授乳 - - - 9 毫米 - - - -
必需氨基酸 14.45 倍 0.25 克/升 0.25 克/升 每酸 0.5 倍 0.375 倍 1.29 倍 帕尔默
非必需氨基酸 28.9 倍 0.25 克/升 0.25 克/升 每酸 0.25 倍 0.5 倍 8.01 倍 帕尔默
维生素 - - - - - 1 倍 1 倍 加拉格尔
痕量金属 - - - - 1 倍 1 倍 1 倍 弗林
蛋黄 0.25% 0.25% 0.25% - - 0.25% 0.25% 基什内尔
铁蛋白 0.0003 克/升 - - - - 0.0004 克/升 0.0004 克/升 加拉格尔
鲑鱼精子DNA 1.4 克/升 4 克/升 4 克/升 - - 1.4 克/升 - -
断续器 - - 0.0059 克/升 - - - - -
酸碱度 - 6.9 - 6.8 - - 6.3 拉皮埃尔
存储 0 4° - - 4° 4° 4° 基什内尔
灭菌 高压 釜 滤波器 高压 釜 - 高压 釜 高压 釜 滤波器 基什内尔

表1：来自文献综述的人造痰培养基配方。（专栏 1）人工痰液制剂中的试剂和关键值。（列 2-7）现存文献中食谱的比较8，9，10，12，14，15.（列 8-9）本方案中详细阐述了人工痰液配方和相应的来源，即告知各选择值10、11、12、13、14、15。

第1栏 第2栏 第3栏
CF 痰液 断续器
总氨基酸 10.25 毫米 10.76 毫米
丙氨酸 0.96 毫米 0.80 米M
精氨酸 0.17 毫米M 0.94 毫米
天冬酰胺 0.91 毫米M
天冬氨酸 0.45 毫米 0.80 米M
半胱氨酸 0.09 毫米 0.33 毫米
谷氨酸 0.84 毫米 0.80 米M
甘氨酸 0.65 毫米 0.80 米M
组氨酸 0.28 毫米 0.35 毫米M
异亮氨酸 0.60 平方米 0.52 毫米M
亮氨酸 0.87 毫米 0.52 毫米M
赖氨酸 1.15 毫米M 0.64 毫米
蛋氨酸 0.34 毫米 0.13 毫米
鸟氨酸 0.36 毫米
苯丙氨酸 0.29 毫米 0.26 毫米
脯氨酸 0.90 毫米 0.80 米M
丝氨酸 0.78 毫米 0.80 米M
苏氨酸 0.58 毫米 0.52 毫米M
色氨酸 0.07 毫米 0.06 毫米
酪氨酸 0.43 毫米 0.26 毫米
缬氨酸 0.60 平方米 0.52 毫米M

表2：先前在囊性痰和人造痰培养基配方中描述的氨基酸浓度，详见该协议。 （专栏 1）关键氨基酸。（专栏 2）囊性纤维化患者的痰液氨基酸浓度12.（专栏 3）本方案详述的人造痰培养基中的氨基酸浓度

Figure 1
图1：氧气喷射系统组件的连接示意图。 用于将血清瓶喷射到21%至100%之间所需氧气浓度的系统组件之间连接的流程图。该系统有3种使用模式，由两个T型接头阀的位置决定。该系统可以将气体从储罐中排出，通过气体输出或通过氧气百分比监测器，以及将先前喷射的血清瓶中的排出气体通过监测器，以在经过一段时间后检查浓度。 请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 2
图2：目标氧浓度在12小时和24小时的间隔内大致保持，并且在培养过程中pH值保持在生理范围内。 （A） 12小时和24小时氧气喷射间隔在72小时内流出氧气读数。（B）每24小时测量一次样品的pH读数（C）培养样品CFB010在72小时后的示例图像，显示不同氧浓度的差异浊度。颜色表示目标氧百分比;误差线表示 95% 置信区间。临界阈值用虚线强调。 请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 3
图3：培养增加了微生物负荷，但保留了潜在的群落组成。 未培养的痰（黄色）和培养的痰（蓝色）使用人造痰培养基在21%氧气下48小时。等分试样经过核酸提取和鸟枪宏基因组学测序，以检测培养条件引入的可能偏倚。（A） 绝对微生物负荷（由峰值对照确定）和α多样性指标。使用线性混合效应模型，未培养痰与培养痰液预测微生物负荷，但未预测α多样性。（B）确定β多样性指标的前两个组分，控制微生物负荷的差异。在PERMANOVA之后，这两个指标都没有显着差异。 请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 4
图4：大多数已确定的分类群同时存在于源痰和培养物中，而其他分类群仅出现在源痰或培养物中。 Shotgun 宏基因组学测序用于比较未培养和培养的痰液样本之间微生物群落组成的差异。测序样品中所有已鉴定微生物物种的系统发育树（N = 120）。标有黄色（N = 35，29.2%）的物种仅在未培养的痰液样本中可见。标有蓝色（N = 39，32.5%）的物种仅在人造痰培养基培养样品中可见。在未培养和培养的样品中都可以看到标有青色（N = 46，38.3%）的物种。 请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 5
图5：人工痰培养基足够透明，可用作培养临床分离株的生长曲线培养基。 每10分钟在600nm处获得最佳密度读数，并显示每条曲线的前24小时。灰线表示单个读数，橙色线表示每个分类单元的平均吸光度。人工痰液空白作为对照。 请点击此处查看此图的放大版本。

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Discussion

在这项研究中，开发了一个 体外 模型来研究高氧对肺微生物群落的影响。该模型基于人工痰培养基和血清瓶的每日喷射，可维持升高的氧气浓度，并支持在pwCF痰液中鉴定出的微生物的生长。

这种方法有几个关键步骤。首先是选择使用过滤灭菌而不是人工痰媒的热灭菌。过滤器灭菌可防止粘蛋白和培养基中其他热敏组分变性，并产生可用于微生物生长光学测量的透明培养基。虽然过滤器灭菌在其他方案10中已经提出，但我们发现在过滤过程中增加轨道振荡对于防止过滤器堵塞至关重要，否则当过滤了最少量的制备介质时就会发生这种情况。虽然过滤后的人造痰培养基可能由于过滤器中的粘蛋白嵌塞而具有低于预期的最终粘蛋白浓度，但来自pwCF的痰液已被证明具有比没有囊性纤维化的人的痰液更低的粘蛋白浓度21。该协议中使用的起始粘蛋白浓度为1%，高于使用过滤器灭菌的其他方法，其中一组使用起始粘蛋白浓度为0.5%10，而典型配方使用黏蛋白浓度范围为0.5%-2%（表1）。因此，即使在过滤灭菌过程中粘蛋白的损失，使用该协议制备的最终培养基也可能具有在生理范围内22的粘蛋白浓度。

第二种是人工痰培养基的组成。人工痰培养基的配方是根据现有的对来自pwCF的痰液的生理学研究选择的（表1）。使用鸟枪宏基因组学测序，我们能够验证用这种人造痰培养基培养的痰广泛地概括了未培养痰的微生物群落组成（图3）。在正常毒性条件下，该培养基还支持112种不同的临床分离株的生长，这些分离株代表从囊性纤维化患者的痰液中分离出的常见病原体。因此，这些数据表明，这种人工痰培养基的配方支持pwCF中气道微生物群的生长。鲑鱼精子DNA是现有配方的常见补充（表1），被省略。该模型的一个预期应用是宏基因组学测序，因此不包括鲑鱼精子DNA以减少非微生物核酸的添加，因为这些读数将在测序后被过滤掉，从而降低我们的有效测序深度。虽然来自pwCF的痰液具有高浓度的细胞外DNA23，但其中很大一部分是来自24的微生物，目前尚不清楚在人造痰液培养基中添加鲑鱼精子DNA是否使其更具生理性，或者该协议中描述的培养方法是否会导致高水平的微生物衍生的细胞外DNA;在我们的研究中，我们没有区分细胞外和细胞内DNA浓度。未来的研究可能希望验证这种培养方法产生的细胞外DNA的浓度。

第三，据我们所知，没有关于囊性纤维化肺微生物群落的已发表研究涉及高氧疾病。该模型使用来自一般实验室或医院供应商的廉价且常用的设备来构建氧气喷射系统。维持高氧状态的重要考虑因素包括培养基相对于血清瓶中可用顶空的体积。在方案制定期间的初始尝试中，使用了125 mL血清瓶。然而，使用500 mL血清瓶（允许475 mL顶空至25mL培养比）允许将所需浓度维持长达24小时，从而减少氧气喷射的频率。这种方法产生离散的氧气条件，从而允许在多种氧气条件下同时培养不同的患者样品。厌氧培养的其他工具可用于高氧培养，包括使用厌氧罐或用氧气喷射的Balch型管。使用宏基因组学测序对肺微生物群落的分析表明，培养和未培养的痰液之间的总体α和β多样性相当。当在物种水平上评估差异丰度时，在21%的氧气下培养，富集于有氧生物和兼性厌氧菌的生长，包括肠杆菌，链球菌和真菌。这可能是由于排除了在pwCF25，26的气道中观察到的厌氧病症。未来的研究可以考虑将氮气纳入该模型，以研究在气道微生物群落中发现的一系列缺氧和缺氧条件以及相应的好氧和厌氧微生物群。

这些方案中概述的关键原则可能对进行与氧气对复杂微生物群落或常见肺部病原体的影响相关的类似研究具有指导意义。氧气是治疗所有晚期肺部疾病最常用的疗法，更好地了解它如何导致对气道微生物群落和常见呼吸道病原体的附带意外影响对于pwCF和其他慢性肺部疾病的护理非常重要。

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Disclosures

作者没有利益冲突需要披露。

Acknowledgments

这项工作的一部分是在海洋生物实验室进行的，得到了海洋生物实验室，美国能源部（DE-SC0016127），NSF（MCB1822263），HHMI（授权号5600373）以及西蒙斯基金会的礼物的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BME Vitamins (100x) Solution MilliporeSigma B6891 Concentrated solution of supplemental vitamins.
Crimper, 30 mm DWK Life Sciences 224307 Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles.
D-(+)-Glucose MilliporeSigma G7021 Solid glucose powder (dextrorotatory isomer).
Diaphragm Pump ME 2 NT VACUUBRAND 20730003 Vacuum pump for vacuum filtration.
Egg Yolk Emulsion HiMedia FD045 Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline.
Ferritin, Cationized from Horse Spleen MilliporeSigma F7879 Ferritin (iron-storage protein) solution.
FIREBOY plus Safety Bunsen Burner Integra Biosciences 144000 Bunsen burner with user interface and safety features.
Hydrion pH Paper (1.0–14.0) Micro Essential Laboratory 94 pH testing paper for the range of 1.0–14.0.
Hydrion pH Paper (4.0–9.0) Micro Essential Laboratory 55 pH testing paper for the range of 4.0–9.0.
Hydrion pH Paper (6.0–8.0) Micro Essential Laboratory 345 pH testing paper for the range of 6.0–8.0.
Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G Smiths Medical 401815 18 G needles with safety caps.
In-Line Pressure Gauge MilliporeSigma 20469 Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure.
Innova 42 Incubated Shaker Eppendorf 2231000756 Combination incubator/orbital shaker.
Luer-Lok Syringe with Attached Needle Becton Dickinson 309580 Combination 3 mL syringe and 18 G needle.
Luer Valve Assortment World Precision Instruments 14011 Valves for gas flow tubing.
LSE Orbital Shaker ThermoFisher Scientific 6780-NP Orbital shaker to agitate media during filtration.
Magnesium Sulfate Heptahydrate MilliporeSigma M2773 Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate).
Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter Western Enterprises M1-346-15FM Air flow rate regulator with 15 L/min meter.
MEM Amino Acids (50x) Solution MilliporeSigma M5550 Concentrated solution of essential amino acids.
MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution MilliporeSigma M7145 Concentrated solution of non-essential amino acids.
Millex-GP Filter, 0.22 µm MilliporeSigma SLMP25SS 0.22 µm polyethersulfone membrane sterile syringe filter.
Milli-Q Academic MilliporeSigma ZMQS60E01 Milli-Q sterile water filtration system.
MiniOX 3000 Oxygen Monitor MSA 814365 Gas flow oxygen percentage monitor.
MOPS Buffer (1 M, pH 9.0) Boston BioProducts BBM-90 MOPS buffer for adjusting media pH.
Mucin from Porcine Stomach MilliporeSigma M2378 Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder.
Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit Harvard Apparatus 72-1413 Connectors for gas flow tubing.
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina FC-131-1096 Library preparation for identification during sequencing.
NovaSeq 6000 Sequencing System Illumina 770-2016-025-N Shotgun sequencing platform for generating sample reads.
Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter Western Enterprises M1-540-15FM Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter.
Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors SunMed 2001-01 Tubing for connecting gas system components.
Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 Molecular Biologicals International MRGF-6235 Concentrated phosphate-buffered saline solution.
PC 420 Hot Plate/Stirrer Marshall Scientific CO-PC420 Combination hot plate/stirrer.
Potassium Chloride MilliporeSigma P9541 Solid potassium chloride salt.
PTFE Disposable Stir Bars ThermoFisher Scientific 14-513-95 Disposable magnetic stir bars.
PTFE Thread Seal Teflon Tape VWR 470042-938 Teflon tape for reinforcing gas system connections.
Q-Gard 2 Purification Cartridge MilliporeSigma QGARD00D2 Purification cartridge for Milli-Q system.
Reusable Media Storage Bottles ThermoFisher Scientific 06-423A Bottles for mixing and storing culture media.
Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl DWK Life Sciences 224100-331 Rubber stoppers for serum bottles.
Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL DWK Life Sciences 223952 Glass serum bottles for sealed culturing.
Small Bore Extension Set Braun Medical 471960 Tubing extension with luer lock connectors.
Sodium Chloride MilliporeSigma S3014 Solid sodium chloride salt.
Spike-in Control I (High Microbial Load) ZymoBIOMICS D6320 Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations
Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System MilliporeSigma S2GPU02RE 250 mL 0.22 µm vacuum filtration chamber.
Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes Professional Disposables International H04082 Disposable germicidal wipes for sterilization.
Trace Metals Mixture, 1000x ThermoFisher Scientific NC0112668 Concentrated solution of physiological trace metals.
Unlined Aluminum Seal, 30 mm DWK Life Sciences 224187-01 Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers.
USP Medical Grade Air Tank Airgas AI USP200 Compressed air tank for input to sparging system.
USP Medical Grade Oxygen Tank Airgas OX USP200 Compressed oxygen tank for input to sparging system.

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Tags

医学，第174期，人工痰培养基，培养物，囊性纤维化（pwCF）患者，高氧，宏基因组学测序，气道微生物组
研究辅助供氧对囊性纤维化气道微生物组影响的模型的设计与开发
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Vieira, J., Gallagher, T., Sui, H. Y., Jesudasen, S., Whiteson, K., O'Toole, G. A., Hanselmann, K., Lai, P. S. Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome. J. Vis. Exp. (174), e62888, doi:10.3791/62888 (2021).

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