Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

सिस्टिक फाइब्रोसिस एयरवे माइक्रोबायोम पर पूरक ऑक्सीजन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल का डिजाइन और विकास

Published: August 3, 2021 doi: 10.3791/62888
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 2, 4, 5, 1
1Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Molecular Biology & Biochemistry, University of California, Irvine, 3Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, 4Department of Microbiology & Immunology, Geisel School of Medicine at Dartmouth, 5Swiss i-research and teaching institute

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य सिस्टिक फाइब्रोसिस एयरवे माइक्रोबियल समुदायों पर हाइपरऑक्सिया के प्रभाव के लिए एक मॉडल प्रणाली विकसित करना है। कृत्रिम थूक माध्यम थूक की संरचना का अनुकरण करता है, और हाइपरऑक्सिक संस्कृति की स्थिति फेफड़ों के माइक्रोबियल समुदायों पर पूरक ऑक्सीजन के प्रभाव को मॉडल करती है।

Abstract

एयरवे माइक्रोबियल समुदायों को सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) और अन्य पुरानी फेफड़े की बीमारियों की प्रगति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए सोचा जाता है । रोगाणुओं को पारंपरिक रूप से ऑक्सीजन का उपयोग करने या सहन करने की उनकी क्षमता के आधार पर वर्गीकृत किया गया है। पूरक ऑक्सीजन सिस्टिक फाइब्रोसिस (पीडब्ल्यूसीएफ) वाले लोगों को प्रशासित एक आम चिकित्सा चिकित्सा है; हालांकि, ऑक्सीजन और एयरवे माइक्रोबायोम पर मौजूदा अध्ययनों ने हाइपरऑक्सिया (उच्च ऑक्सीजन) के बजाय हाइपोक्सिया (कम ऑक्सीजन) पर ध्यान केंद्रित किया है, जो मुख्य रूप से एरोबिक और संकाय एनारोबिक फेफड़े माइक्रोबियल समुदायों को प्रभावित करता है। इस महत्वपूर्ण ज्ञान अंतर को दूर करने के लिए, इस प्रोटोकॉल को एक कृत्रिम थूक माध्यम का उपयोग करके विकसित किया गया था जो पीडब्ल्यूसीएफ से थूक की संरचना की नकल करता है। फिल्टर नसबंदी का उपयोग, जो एक पारदर्शी माध्यम पैदावार, ऑप्टिकल तरीकों निलंबन संस्कृतियों में एकल कोशिकीय रोगाणुओं के विकास का पालन करने के लिए अनुमति देता है । हाइपरऑक्सिक स्थितियां बनाने के लिए, यह मॉडल प्रणाली हाइपरऑक्सिक स्थितियों का अध्ययन करने के लिए स्थापित एनारोबिक संस्कृति तकनीकों का लाभ उठाती है; ऑक्सीजन को हटाने के बजाय, संकुचित ऑक्सीजन और हवा के मिश्रण के साथ सीरम की बोतलों की दैनिक स्परिंग द्वारा संस्कृतियों में ऑक्सीजन जोड़ा जाता है। ५० पीडब्ल्यूसीएफ से थूक एक ७२-एच अवधि के लिए दैनिक बख्शते से गुजरना इस मॉडल की क्षमता को सत्यापित करने के लिए अंतर ऑक्सीजन की स्थिति को बनाए रखने के लिए । शॉटगन मेटाजेनोमिक अनुक्रमण 11 पीडब्ल्यूसीएफ से सुसंस्कृत और असंस्कारी थूक के नमूनों पर किया गया था ताकि इस माध्यम की क्षमता को सत्यापित किया जा सके ताकि सिस्टिक फाइब्रोसिस थूक में आमतौर पर पाए जाने वाले कमेंसल और रोगजनक रोगाणुओं के विकास का समर्थन किया जा सके। सामान्य सिस्टिक फाइब्रोसिस रोगजनकों के विकास का समर्थन करने के लिए इस कृत्रिम थूक माध्यम की क्षमता को सत्यापित करने के लिए पीडब्ल्यूसीएफ से प्राप्त 112 आइसोले से विकास घटता प्राप्त किया गया था। हम पाते हैं कि यह मॉडल सीएफ थूक में विभिन्न प्रकार के रोगजनकों और कॉमेंसल्स को संस्कृति कर सकता है, एक समुदाय को ठीक करता है जो नॉर्मॉक्सिक परिस्थितियों में असंस्कारी थूक के समान होता है, और अलग-अलग ऑक्सीजन स्थितियों के तहत विभिन्न संस्कृति फेनोटाइप बनाता है। इस नए दृष्टिकोण से वायुमार्ग माइक्रोबियल समुदायों और आम श्वसन रोगजनकों पर पीडब्ल्यूसीएफ में ऑक्सीजन के उपयोग से प्रेरित अप्रत्याशित प्रभावों की बेहतर समझ हो सकती है।

Introduction

सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF) एक आनुवंशिक रोग है जो फेफड़ों से मोटी बलगम को साफ करने में असमर्थता की विशेषता है, जिससे बार-बार संक्रमण और प्रगतिशील फेफड़ों के कार्य में गिरावट आती है जिसके परिणामस्वरूप अक्सर फेफड़ों के प्रत्यारोपण या मृत्यु की आवश्यकता होती है। सिस्टिक फाइब्रोसिस (पीडब्ल्यूसीएफ) वाले लोगों का वायुमार्ग माइक्रोबायोम रोग गतिविधिकोट्रैक करने के लिए प्रकट होता है, जिसमें प्रतिकूल दीर्घकालिक परिणामों से जुड़ी माइक्रोबियल विविधता में कमी के साथ2,3। पीडब्ल्यूसीएफ के नैदानिक अध्ययनों में, पूरक ऑक्सीजन चिकित्सा अधिक उन्नत रोग4,5से जुड़ी हुई है, हालांकि परंपरागत रूप से, ऑक्सीजन थेरेपी के उपयोग को रोग गंभीरता 6 के लिए केवल एक मार्कर के रूप मेंदेखागया है। श्वसन विफलता के साथ रोगियों के एक नैदानिक परीक्षण से हाल के अध्ययनों से पता चला है कि उच्च रोगी ऑक्सीजन का स्तर विडंबना गंभीर जीवाणु संक्रमण और उच्च मृत्यु दर7में वृद्धि के साथ जुड़े रहे हैं, सुझाव है कि पूरक ऑक्सीजन रोग रोग रोगजनकता के लिए योगदान कर सकते हैं । सिस्टिक फाइब्रोसिस फेफड़ों माइक्रोबायोम और संबद्ध फेफड़ों और वायुमार्ग माइक्रोबियल समुदायों पर पूरक ऑक्सीजन के प्रभाव का अच्छी तरह से अध्ययन नहीं किया गया है।

सैन्य संबंधी कठिनाइयों और अज्ञात चिकित्सा लाभ या नुकसान के हस्तक्षेप से जुड़े संभावित नैतिक मुद्दों के कारण मशीनीकृत अध्ययन अक्सर मानव विषयों पर सीधे नहीं किए जा सकते हैं। मानव बायोस्पेसिमेंस को मॉडल सिस्टम में एकीकृत करने वाले ट्रांसलेशनल दृष्टिकोण इन मामलों में महत्वपूर्ण जैविक अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। जबकि ऑक्सीजन का उपयोग करने या बर्दाश्त करने की क्षमता परंपरागत रूप से माइक्रोबियल वर्गीकरण का एक महत्वपूर्ण घटक रहा है, थोड़ा कैसे पर्यावरण के लिए पूरक ऑक्सीजन के चिकित्सीय परिचय वायुमार्ग माइक्रोबियल समुदायों को परेशान कर सकता है के बारे में जाना जाता है । पीडब्ल्यूसीएफ के वायुमार्ग माइक्रोबायोम पर पूरक ऑक्सीजन के अज्ञात प्रभावों पर प्रकाश डाला, हमें दो प्रमुख चुनौतियों का समाधान करने की आवश्यकता थी; सबसे पहले, एक संस्कृति माध्यम का निर्माण जो शारीरिक रूप से सीएफ थूक की संरचना का अनुमान लगाता है; दूसरा, एक मॉडल प्रणाली का निर्माण जो समय की विस्तारित अवधि में संस्कृति में ऊंचा ऑक्सीजन सांद्रता के रखरखाव की अनुमति देता है।

कृत्रिम थूक मीडिया (एएसएम) का व्यापक रूप से फेफड़ों के थूक पूर्व वीवो8,9, 10का अनुकरण करने के लिए उपयोग कियाजाताहै, लेकिन किसी विशिष्ट नुस्खा पर कोई स्पष्ट आम सहमति नहीं है। यह प्रोटोकॉल एक कृत्रिम थूक माध्यम नुस्खा और तैयारी रणनीति का वर्णन करता है जो पीडब्ल्यूसीएफ से शारीरिक रूप से अनुमानित थूक के लिए सावधानीपूर्वक डिज़ाइन किया गया है। तालिका 1 प्रकाशित साहित्य के आधार पर चुने गए नुस्खा मूल्यों को रेखांकित करता है। मानव सीएफ थूक 11,12 ,13के अध्ययनों द्वारा पहचाने गए मूल रासायनिक घटकों और पीएच का मिलान किया गया . अंडे की जर्दी का उपयोग करके कम एकाग्रता वाले शारीरिक पोषक तत्वों को जोड़ा गया था, जिसे अंतिम मात्रा10के 0.25% के रूप में शामिल किया गया था, साथ ही विटामिन और ट्रेस धातु14,15को मिलाता था। थूक 16 का प्रमुख घटक म्यूसिनको 1%w/v14में शामिल किया गया था । हालांकि अधिक श्रम-प्रधान, फिल्टर नसबंदी गर्मी नसबंदी के अधिक पारंपरिक अभ्यास पर चुना गया था गर्मी से संभावित समस्याओं को कम करने के लिए आवश्यक मीडिया घटकों के denaturationप्रेरित 10। फिल्टर नसबंदी का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि यह मीडिया है कि पारदर्शी है उत्पन्न करता है (गर्मी नसबंदी वर्षा और लवण और प्रोटीन के जमावट के कारण टर्बिड मीडिया बना सकते हैं), इस कृत्रिम थूक मीडिया की अनुमति के लिए टर्बिडिटी में वृद्धि के आधार पर माइक्रोबियल विकास का पालन किया जा सकता है ।

हाइपरऑक्सिक संस्कृति के लिए यह मॉडल प्रणाली अवायवीय संस्कृति तकनीकों पर आधारित है जहां ऑक्सीजन को हटाने के बजाय जोड़ा जाता है, पीडब्ल्यूसीएफ के लिए पूरक ऑक्सीजन उपयोग के प्रभाव के लिए एक मॉडल बनाता है। चित्रा 1 और संबद्ध ऑक्सीजन स्पिंग प्रोटोकॉल ऑक्सीजन स्पिंग सिस्टम के घटकों को रेखांकित करता है, जिसे सामान्य प्रयोगशाला और अस्पताल आपूर्तिकर्ताओं से कम लागत पर प्राप्त किया जा सकता है। यह प्रणाली संकुचित ऑक्सीजन और हवा के मिश्रण को 21%-100% ऑक्सीजन से लेकर निश्चित सांद्रता में सक्षम बनाती है। ऑक्सीजन सेंसर का एकीकरण आउटपुट गैस मिश्रण की एकाग्रता के सत्यापन के साथ-साथ पहले से स्पर्गेड सीरम बोतलों की बहिर्वाह गैस संरचना की जांच करने की अनुमति देता है ताकि यह सत्यापित किया जा सके कि वांछित सीमा के भीतर ऑक्सीजन की स्थिति को बनाए रखा गया है।

यह प्रोटोकॉल एक कृत्रिम थूक माध्यम बनाने के लिए प्रक्रियाओं को रेखांकित करता है, ऑक्सीजन स्पिंग सिस्टम का निर्माण और उपयोग, और अंतर ऑक्सीजन स्थितियों के तहत संस्कृति सीएफ थूक दोनों के आवेदन।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

इस अध्ययन को पार्टनर्स इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड (प्रोटोकॉल # 2018P002934) से मंजूरी मिली । समावेशन मापदंड सिस्टिक फाइब्रोसिस के साथ वयस्क रोगियों को शामिल किया है जो अध्ययन के लिए लिखित सूचित सहमति प्रदान की है । बहिष्कार का कोई मापदंड नहीं था । प्रोटोकॉल दिशानिर्देशों के अनुसार, सभी थूक के नमूने अपने नैदानिक प्रदाता के साथ एक अनुसूचित आउट पेशेंट यात्रा के दौरान सिस्टिक फाइब्रोसिस वाले रोगियों से एकत्र किए गए थे।

1. कृत्रिम थूक मध्यम तैयारी

नोट: यहां सूचीबद्ध मात्रा अंतिम कृत्रिम थूक माध्यम के 1 एल के उत्पादन के लिए कर रहे हैं, और सामग्री तालिकामें सूचीबद्ध विशिष्ट अभिकर्दक मान । संख्या को अन्य खंडों के लिए या एक ही अंतिम उत्पाद सुनिश्चित करने के लिए विभिन्न अभिकर् ती के उपयोग के लिए समायोजित किया जाना चाहिए। लक्ष्य सांद्रता के लिए तालिका 1 देखें।

  1. कृत्रिम थूक रासायनिक मिश्रण (ASCM)
    नोट: ASCM अंतिम मध्यम मात्रा का 25% बनाता है । यह शेल्फ-स्थिर है और थोक में या पहले से तैयार किया जा सकता है। यदि बाद में उपयोग के लिए तैयार किया जा रहा है, तो रासायनिक मिश्रण को ऑटोक्लेव करें और इसे कमरे के तापमान पर सुरक्षित रूप से स्टोर करें।
    1. घटक रासायनिक स्टॉक समाधान मिलाएं।
      1. 1 एम एनएसीएल स्टॉक तैयार करें: बाँझ पानी के प्रति लीटर एनएसीएल के 58.44 ग्राम जोड़ें।
      2. तैयार करें 1 एम केसीएल स्टॉक: 74.55 ग्राम केसीएल प्रति लीटर बाँझ पानी जोड़ें।
      3. 1 एम एमजीएसओ4 स्टॉक तैयार करें: 246.47 ग्राम MgSO4· 7H2O प्रति लीटर बाँझ पानी, या 120.37 ग्राम निर्जल MgSO4 प्रति लीटर बाँझ पानी जोड़ें।
      4. 1 एम ग्लूकोज स्टॉक तैयार करें: बाँझ पानी के प्रति लीटर ग्लूकोज के 180.16 ग्राम जोड़ें।
    2. ऑटोक्लेव रासायनिक स्टॉक समाधान, साथ ही एक खाली 250 एमएल बोतल को निष्फल करें। 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस और 15 पीएसआई के कम से कम मानक मूल्यों के लिए ऑटोक्लेविंग चरणों का प्रदर्शन करें।
    3. खाली 250 एमएल की बोतल में 80.59 एमएल बाँझ पानी डालें।
    4. मिश्रण करने के लिए 1 एम एनएसीएल स्टॉक के 152.30 एमएल जोड़ें।
    5. मिश्रण करने के लिए 1 एम केसीएल स्टॉक के 15.8 एमएल जोड़ें।
    6. मिक्स में 1 एम एमजीएसओ 4 स्टॉक का 610माइक्रोल डालें।
    7. मिश्रण करने के लिए 1 एम ग्लूकोज स्टॉक के 700 μL जोड़ें।
  2. कृत्रिम थूक म्यूसिन मिक्स (एएसएमएम)
    नोट: ASMM अंतिम मध्यम मात्रा का 50% बनाता है। सुनिश्चित करें कि इसे अंतिम मध्यम बैच के समान ही दिन तैयार किया जाए।
    1. एक खाली 1 एल बोतल में बाँझ पानी की 450 एमएल जोड़ें।
    2. बोतल में 10x फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) का 50 एमएल जोड़ें।
    3. बोतल में एक डिस्पोजेबल चुंबकीय हलचल बार जोड़ें।
    4. पीबीएस और हलचल बार युक्त बोतल को ऑटोक्लेव करें।
    5. 10 ग्राम म्यूसिन पाउडर को मापें और इसे पीबीएस में जोड़ें।
    6. प्रारंभिक मिश्रण के लिए बोतल को सख्ती से हिलाएं।
    7. एक चुंबकीय उभारकर के साथ एक गर्म थाली पर बोतल रखें। मध्यम-उच्च लक्ष्यीकरण 50 डिग्री सेल्सियस और 1100 आरपीएम करने के लिए गति सरगर्मी करने के लिए गर्मी निर्धारित करें। धीरे-धीरे गति को रैंप करें ताकि बार चुंबक से उड़ न जाए।
      1. गर्मी और 15 मिनट के लिए हलचल करने के लिए अनुमति दें।
      2. गर्मी प्रतिरोधी दस्ताने के साथ बोतल उठाओ। जांच करने के लिए निरीक्षण करें कि क्या म्यूसिन पाउडर समाधान से बाहर निकलता है।
      3. यदि म्यूसिन पाउडर पूरी तरह से भंग नहीं होता है, तो बोतल को 5-मिनट के अंतराल के लिए गर्मी/रबड़ में वापस करें जब तक कि यह पूरी तरह से भंग न हो जाए।
    8. म्यूसिन मिश्रण को कमरे के तापमान में ठंडा होने दें।
  3. कृत्रिम थूक जैविक मिश्रण (एएसबीएम)
    नोट: ASBM अंतिम मध्यम मात्रा का 25% है। इसे अंतिम मध्यम बैच के रूप में उसी दिन तैयार करें, और अन्य मिश्रणों के विपरीत, इसके घटकों को किसी भी गर्मी में बेनकाब न करें।
    1. 100x विटामिन स्टॉक को 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में या बर्फ पर गल लें।
      नोट: फ्रीज/गल चक्र की संख्या को कम करने के लिए 10 एमएल एलिकोट्स में विटामिन स्टॉक को प्री-भाग करें ।
    2. खाली ऑटोक्लेव 250 एमएल की बोतल में 124.24 एमएल बाँझ पानी जोड़ें।
    3. मिश्रण करने के लिए 50x आवश्यक अमीनो एसिड स्टॉक के 25.76 एमएल जोड़ें।
    4. मिश्रण में 100x गैर-आवश्यक अमीनो एसिड स्टॉक का 80.14 एमएल जोड़ें।
    5. मिश्रण करने के लिए (गल) 100x विटामिन स्टॉक के 10 मिलीएल जोड़ें।
    6. मिश्रण करने के लिए 1000x ट्रेस धातुओं स्टॉक के 1 ml जोड़ें।
    7. मिश्रण करने के लिए 30% अंडे की जर्दी पायस के 8.33 एमएल जोड़ें।
    8. मिक्स में 10 ग्राम/एल फेरिटिन स्टॉक का 400 माइक्रोल डालें।
    9. मैनुअल मिलाते हुए के माध्यम से समाधान को अच्छी तरह से मिलाएं।
  4. कृत्रिम थूक माध्यम (एएसएम)
    1. एएसएमएम युक्त 1 एल बोतल में एएससीएम की 250 एमएल जोड़ें।
    2. मध्यम बोतल में एएसबीएम का 250 एमएल जोड़ें।
    3. एक संकीर्ण रेंज पीएच पेपर पर 6.3 के पीएच तक पहुंचने के लिए बुनियादी एमओपी बफर (1 एम) के साथ माध्यम को टिट्रेट करें। टिटरेशन से पहले, मध्यम मिश्रण बहुत अम्लीय होगा।
    4. परिणामी कृत्रिम थूक माध्यम को 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा करें जब तक कि यह निस्पंदन के लिए तैयार न हो जाए।
    5. फिल्ट्रेशन प्रक्रिया शुरू करने के लिए, अनफ़िल्टर्ड कृत्रिम थूक माध्यम के 200 एमएल को 0.22 माइक्रोन पोर आकार फिल्टर के साथ वैक्यूम फिल्ट्रेशन सिस्टम में स्थानांतरित करें।
    6. निस्पंदन प्रणाली को वैक्यूम पंप से कनेक्ट करें, वैक्यूम पंप चालू करें, इसे 70 mbar पर सेट करें, और फिर कक्ष को 4 डिग्री सेल्सियस पर एक ठंडे कमरे में 90 आरपीएम पर मिलाते हुए एक कक्षीय शेखर पर रखें।
      1. एक प्रशंसनीय राशि के रूप में माध्यम के अतिरिक्त 150 एमएल के साथ टॉप ऑफ फ़िल्टर किया जाता है। पूरी तरह से 1 एल मीडियम को फिल्टर करने में 1-2 दिन लगते हैं।
      2. अतिरिक्त कक्षों के साथ दोहराएं जब तक कि सभी मीडिया फ़िल्टर न हो जाए।
        नोट: कोशिश करें कि एक ही 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से माध्यम के 350 एमएल से अधिक फ़िल्टर न करें क्योंकि म्यूसिन समय के साथ फ़िल्टर को प्लग करेगा।
    7. उपयोग के लिए तैयार होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर कृत्रिम थूक माध्यम को ठंडा करें। सर्वोत्तम परिणामों की तैयारी के एक महीने के भीतर एएसएम का उपयोग करें।

2. ऑक्सीजन स्परिंग

  1. स्परिंग स्टेशन सेटअप
    नोट: इस प्रोटोकॉल को केवल एक बार पूर्ण रूप से किए जाने की आवश्यकता होनी चाहिए, जिसके बाद सेटअप को आवश्यक रूप से सरल रखरखाव के माध्यम से बनाए रखा जा सकता है। ऑक्सीजन स्परिंग सिस्टम के एक दृश्य योजनाबद्ध के लिए चित्रा 1 देखें।
    1. संकुचित हवा और ऑक्सीजन टैंक प्राप्त करें और ठीक से सुरक्षित करें।
      सावधानी: उच्च दबाव टैंकों को अत्यंत खतरनाक बनाता है जब गलत तरीके से। सुनिश्चित करें कि टैंक पूरी तरह से सील और सुरक्षित हैं, टैंक बंद होने पर कोई लीक नहीं होता है, और सभी हैंडलिंग कर्मियों को उनके उपयोग में पूरी तरह से प्रशिक्षित किया जाता है।
    2. एक रिंच के साथ संकुचित वायु टैंक के लिए एक वायु नियामक संलग्न करें। नियामक पर इष्टतम प्रवाह पढ़ने के लिए, नियामक को एक ईमानदार स्थिति के जितना संभव हो उतना करीब संलग्न करें।
    3. संकुचित ऑक्सीजन टैंक में ऑक्सीजन नियामक संलग्न करें, जो एक ईमानदार स्थिति के जितना संभव हो उतना करीब संलग्न करता है। ऑक्सीजन टैंक के आधार पर, किसी को कसने के लिए दिशा को उलटा करने की आवश्यकता हो सकती है।
    4. दो टैंकों से गैस प्रवाह को संयोजित करने के लिए नियामकों से एक वाई-कनेक्टर से ट्यूबिंग कनेक्ट करें।
    5. वाई-कनेक्टर के आउटपुट को सेंट्रल टी-जंक्शन वाल्व से कनेक्ट करें।
    6. केंद्रीय टी-जंक्शन वाल्व के एक तरफ गैस प्रेशर गेज से कनेक्ट करें।
    7. गैस प्रेशर गेज के दूसरे पक्ष को 0.22 माइक्रोन पोर आकार के साथ 25 मिमी व्यास बाँझ सिरिंज फिल्टर से कनेक्ट करें।
    8. एक दूसरे 25 मिमी व्यास सिरिंज फिल्टर एक प्लंजर के बिना एक सिरिंज के लिए देते है sparging के दौरान एक गैस रिलीज के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा ।
    9. ऑक्सीजन मॉनिटर के लिए एक दूसरे टी जंक्शन वाल्व के लिए केंद्रीय टी जंक्शन वाल्व के अंतिम पक्ष कनेक्ट करें।
    10. 18 जी सुइयों को संलग्न करने के लिए ट्यूबिंग के साथ-साथ इस दूसरे टी-जंक्शन वाल्व के एक तरफ 25 मिमी व्यास सिरिंज फिल्टर कनेक्ट करें।
    11. ऑक्सीजन निगरानी तंत्र के लिए दूसरे टी जंक्शन वाल्व के अंतिम पक्ष कनेक्ट करें।
    12. निगरानी के दौरान गैस रिलीज के रूप में उपयोग किए जाने वाले ऑक्सीजन निगरानी तंत्र के दूसरी तरफ एक कट-ऑफ ट्यूब को कनेक्ट करें।
      सावधानी: ऑक्सीजन स्पिंग सिस्टम का परीक्षण/उपयोग करते समय, टी-जंक्शनों की स्थिति पर सावधानीपूर्वक ध्यान दें और यह सुनिश्चित करें कि यह प्रणाली के माध्यम से इच्छित मार्ग से मेल खाता है । ऐसा न करने पर सिस्टम के अंदर प्रेशर बिल्डअप होगा और घटक विफल हो जाएंगे और अलग हो जाएंगे ।
    13. सिस्टम के रखरखाव के लिए और इसे इष्टतम प्रदर्शन पर काम करने के लिए, निम्नलिखित प्रथाएं फायदेमंद हैं।
      1. टेफ्लॉन टेप की उदार मात्रा के साथ कनेक्शन को मजबूत करने के लिए बहुत अपनी मुहर में सुधार और आंतरिक दबाव से अलग आने वाले घटकों की संभावना को कम ।
      2. अधिकतम दबाव को कम करने और विफलताओं को रोकने के लिए संयुक्त प्रवाह दर को 10 एल/मिनट के तहत रखें ।
      3. यदि रिसाव का संदेह है, तो अपने स्थान की आसानी से पहचान करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तरल रिसाव डिटेक्टरों जैसे डिटर्जेंट समाधान का उपयोग करें, क्योंकि यह किसी भी गैस लीक से ऊपर बुलबुला होगा। पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन टेप (जैसे, टेफ्लॉन) का उपयोग करके पैच लीक होता है।
      4. ऑक्सीजन स्पिलिंग सिस्टम द्वि-साप्ताहिक में 25 मिमी व्यास सिरिंज फिल्टर को बदलें, लेकिन यह उपयोग आवृत्ति के साथ भिन्न होता है। समय के साथ, फिल्टर में पकड़े गए कण गैस प्रवाह दर को कम करते हैं और दबाव buildups का कारण बनते हैं।
      5. माप करने से पहले ऑक्सीजन मॉनिटर को 21% ऑक्सीजन संकुचित हवा में कैलिब्रेट करें।
      6. सिस्टम उपयोग के पूरा होने पर, टैंकों को बंद कर दें और नियामकों से अतिरिक्त गैस का खून करें जब तक कि प्रवाह पूरी तरह से बंद न हो जाए।
  2. सीरम बोतल संस्कृति बख्शते
    1. नमूना पहचानकर्ताओं के साथ 500 एमएल ऑटोक्लेव सीरम की बोतलों को लेबल करें, टीका लगाने की तारीख/समय, और लक्ष्य ऑक्सीजन प्रतिशत।
    2. एक जैविक हुड में, प्रत्येक सीरम बोतल स्थापित करने के लिए कृत्रिम थूक माध्यम के 24 एमएल जोड़ें।
    3. प्रत्येक सीरम की बोतल में 18-जी सुई (प्रत्येक संस्कृति स्थिति के लिए पर्याप्त मात्रा में नमूना प्राप्त करने के लिए आवश्यक होने पर बाँझ नमकीन के साथ पतला) के साथ रोगी थूक के 1 एमएल जोड़ें।
    4. बाँझ चिमटी का उपयोग करना, प्रत्येक सीरम की बोतल के शीर्ष पर ऑटोक्लेव रबर डाट जगह है ।
    5. रबर डाट नीचे दबाएं, ध्यान रखें कि हाथों से डाट के नीचे को न छुएं।
    6. हुड से बोतलों को निकालें, लागू करें और एल्यूमीनियम जवानों को समेटना। सील से केंद्र टुकड़ा निकालें।
    7. एक शराब पोंछ के साथ बोतलों के शीर्ष नीचे पोंछ और उन्हें एक Bunsen बर्नर लौ के माध्यम से गुजरती हैं।
    8. एक फिल्टर के साथ एक गिरने वाले-कम सिरिंज के लिए एक बाँझ 18-जी सुई प्रत्यय। इस गैस को पहले बोतल में डालें।
    9. सिस्टम से गैस उत्पादन के लिए एक बाँझ 18-जी सुई प्रत्यय और बोतल में गैस उत्पादन सुई डालने के रूप में अच्छी तरह से ।
    10. ऑक्सीजन मॉनिटर के माध्यम से टैंकों से टी-जंक्शनों को रूट करें। सत्यापित करें कि लक्ष्य ऑक्सीजन एकाग्रता प्रणाली के माध्यम से बह रही है। गैस प्रवाह के लगभग 5 L/min लक्ष्य ।
    11. टी-जंक्शनों को टैंकों से गैस उत्पादन के माध्यम से रीरूट करें। सीरम की बोतल के जरिए गैस बहने लगती है।
      सावधानी: ऑक्सीजन स्परिंग के दौरान प्रेशर गेज पर करीब से ध्यान दें। यदि दबाव अप्रत्याशित रूप से बढ़ जाता है, तो सिस्टम को तुरंत बंद कर दिया जाए।
    12. 1 मिनट के लिए सीरम की बोतल के माध्यम से ऑक्सीजन स्पैर्ग चलाएं। 5 एल/मिनट पर, यह 10 एयर एक्सचेंजों के लिए अनुमति देता है और यह सुनिश्चित करता है कि आंतरिक वातावरण वांछित आंशिक दबाव तक पहुंचता है ।
    13. गैस रिलीज 18-जी सुई निकालें।
    14. सीरम की बोतल में दबाव को + 1 वायुमंडल (समुद्र तल पर 2 वायुमंडल) बनाने की अनुमति दें और फिर तुरंत गैस उत्पादन सुई को हटा दें।
      नोट: समय के साथ हाइपरऑक्सिक स्थितियों के दबाव एड्स प्रतिधारण बनाए रखना।
    15. सीरम की बोतल को 150 आरपीएम पर 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर शेकर में रखें। तीन 24-h अंतराल के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें। प्रत्येक 24-h अंतराल पर, डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए एक aliquot ले, नमूनों को फिर से बख्शते हैं और उन्हें 72 घंटे के कुल इनक्यूबेशन समय के लिए इनक्यूबेशन में वापस करें।
  3. बहिर्वाह ऑक्सीजन माप
    1. ऑक्सीजन मीटर को 21% संकुचित हवा में कैलिब्रेट करें, और फिर टैंक को बंद कर दें।
    2. ऑक्सीजन मॉनिटर के माध्यम से सीरम की बोतल का सेवन करें और अंत तक बाँझ सुई को प्रत्यय करें।
    3. सीरम की बोतल में रबर डाट के माध्यम से सुई डालें।
    4. बहिर्वाह पढ़ने को स्थिर करने के लिए प्रतीक्षा करें। सीरम की बोतलों में से एक कम प्रवाह दर का मतलब है कि यह 2 मिनट तक लग सकता है । कमरे की हवा से पीक अंतर की रिपोर्ट करें (संख्या 21% से दूर)।
    5. यदि कई रीडिंग प्रदर्शन करते हैं, तो रीडिंग के बीच संकुचित हवा के साथ सिस्टम को फ्लश करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इन प्रोटोकॉल pwCF से ५० गर्भवती थूक नमूनों के लिए नियमित देखभाल के लिए बोस्टन, मैसाचुसेट्स में मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल में एक आउट पेशेंट सिस्टिक फाइब्रोसिस क्लिनिक के लिए प्रस्तुत करने के लिए लागू किया गया । प्रत्येक रोगी के थूक को कृत्रिम थूक माध्यम का उपयोग करके 21%, 50%, और 100% ऑक्सीजन की स्थिति के तहत सुसंस्कृत किया गया था, जिसमें प्रत्येक संस्कृति से 24 घंटे, 48 घंटे और परीक्षण के लिए 72 घंटे की संस्कृति समय लिया गया था। संस्कृतियों फोटो खिंचवाने जब निष्कर्षण दृश्य परिवर्तन को ट्रैक करने के लिए किया गया । इसके अलावा, प्रत्येक प्राथमिक थूक के नमूने का 0.5 एमएल एलिकोट खेती से पहले लिया गया था। इसके परिणामस्वरूप प्रति रोगी 10 असतत नमूने और ५०० नमूनों का अंतिम एन हुआ । इनमें से, 11 रोगियों से थूक (11 असंस्कारी स्पूटा, इनक्यूबेशन के 48 घंटे में 21% ऑक्सीजन से 11 सुसंस्कृत स्पूटा) न्यूक्लिक एसिड एक्सट्रेक्शन17,अनुक्रमण पुस्तकालयों को एक वाणिज्यिक डीएनए पुस्तकालय तैयारी किट का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था, और एक पूरे जीनोम अनुक्रमण मंच पर मेटेग्नोमिक अनुक्रमण किया गया था, जिसमें 150 बेस जोड़ी के साथ प्रति नमूना अनुक्रम के ~ 5 जीबी बनती-अंत पढ़ता है । रॉ रीड्स कोटूल्स 18के बायो बेकरी सुइट का उपयोग करके संसाधित किया गया था, जिसमें गुणवत्ता नियंत्रण और मानव "संदूषक" दृश्यों को हटाना और मेटाफलन3 प्रोफाइलर19के साथ वर्गीकरण प्रोफाइलिंग शामिल है। न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के समय, इम्टेकेला हैलोटोलेरन्सकी 10 मिलियन कोशिकाएं, जो सामान्य रूप से मुहाना पारिस्थितिक तंत्र में पाई जाने वाली एक हैलोटोलेरेंट प्रजातियां थीं, न कि मानव माइक्रोबियल समुदायों में, प्रत्येक नमूने में नुकीला था, जिससे प्रत्येक नमूना20के लिए पूर्ण माइक्रोबियल लोड का मात्राकरण होता था।

चित्रा 2 प्रत्येक ऑक्सीजन स्थिति के तहत सुसंस्कृत 50 थूक नमूनों के लिए संस्कृति प्रक्रिया के दौरान व्यक्तिगत और औसत बहिर्वाह ऑक्सीजन माप और पीएच स्तर दिखाता है और एक दृश्य अंतर संस्कृति फेनोटाइप का एक उदाहरण है। संस्कृतियों को संक्षिप्त अवधि के दौरान छोड़कर 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया था जब नमूना aliquots को बख्शते और हटाने का प्रदर्शन किया गया था। 12 घंटे और 24 घंटे के दोनों बख्शते अंतराल के साथ, ऊंचा ऑक्सीजन सांद्रता बनाए रखा गया था, हालांकि समय के साथ एक बूंद सभी तीन ऑक्सीजन की स्थिति के लिए मनाया गया था, १००% ऑक्सीजन लगभग ८५%, ५०% ऑक्सीजन ४०% तक गिरने के साथ, और 21% ऑक्सीजन 18% तक गिरने । ऑक्सीजन की स्थिति अलग बनी रही, और महत्वपूर्ण बात, हाइपरऑक्सिक नमूनों के लिए प्रक्रिया भर में ऊंचा ऑक्सीजन सांद्रता बनाए रखा गया था । पीएच माप परिवर्तनशीलता की एक बड़ी डिग्री दिखाया, लेकिन समय के साथ कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण परिवर्तन के साथ एक शारीरिक रूप से सामांय सीमा के भीतर अच्छी तरह से रहे । इन मापों से संकेत मिलता है कि ये विधियां संस्कृति प्रक्रिया के दौरान असतत अंतर ऑक्सीजन की स्थिति को बनाए रखते हैं। अंत में, ऑक्सीजन एकाग्रता में विभेदित कई दृश्य संस्कृति फेनोटाइप में से एक का एक उदाहरण दिखाया गया है। इस नमूने में 72 घंटे की संस्कृति के बाद टर्बिडिटी मतभेद ों को चिह्नित किया गया था, जिसमें कम दृश्य टर्बिडिटी से जुड़े उच्च ऑक्सीजन थे। अंतर संस्कृति फेनोटाइप संस्कृति समुदायों पर हाइपरऑक्सिया-प्रेरित प्रभावों की उपस्थिति का समर्थन करते हैं।

चित्र 3 ने असंस्कारी थूक और सुसंस्कृत थूक (48 एच की अवधि के लिए 21% ऑक्सीजन स्थिति) के बीच माइक्रोबियल लोड, माइक्रोबियल विविधता और माइक्रोबियल समुदाय संरचना की तुलना की है। मापन से पता चलता है कि असंस्कारी लंग की तुलना में माइक्रोबियल लोड में लगभग 20 गुना वृद्धि होने के लिए खेती के कार्य द्वारा पेश किए गए एकमात्र प्रमुख अंतर का पता चलता है । प्रतिरक्षा प्रणाली और खांसी जैसे विशिष्ट यांत्रिक थूक निकासी तंत्र आम तौर पर फेफड़ों में माइक्रोबियल लोड को सीमित करने वाली नियामक प्रक्रिया के रूप में काम करते हैं, यहां तक कि पीडब्ल्यूसीएफ में देखे गए रोग और संक्रमण के मामलों में भी। पूर्व वीवो संस्कृति में ऐसा कोई नियामक तंत्र नहीं है, और माइक्रोबियल समुदाय इसके बजाय सेलुलर संतृप्ति की ओर आगे बढ़ने के लिए स्वतंत्र हैं। अल्फा और बीटा विविधता मैट्रिक्स से संकेत मिलता है कि माइक्रोबियल लोड में इस अंतर के बावजूद, अंतर्निहित समुदाय संरचना अच्छी तरह से संरक्षित बनी हुई है, जिसमें संस्कृति प्रक्रिया द्वारा पेश किए गए न्यूनतम वैश्विक मतभेद हैं।

चित्रा 4 असंस्कारी और सुसंस्कृत थूक के नमूनों के बीच तुलना पर फैलता है, बाइनरी उपस्थिति को देखते हुए/१२० माइक्रोबियल प्रजातियों की अनुपस्थिति को निर्णायक रूप से शॉटगन मेटाजन्नोमिक्स द्वारा पहचाना गया 11 रोगियों से प्राप्त सुसंस्कृत और असंस्कारी थूक से अनुक्रमण । रोगाणुओं को फिलोजेनेटिक समानताओं के आधार पर संकुल किया जाता है। इन प्रजातियों में से 46 (38.3%) की पहचान असंस्कारी और सुसंस्कृत नमूनों (सियान रंग) दोनों में की गई थी, जबकि 35 (29.2%) विशेष रूप से असंस्कारी नमूनों (पीले) में पहचाने गए थे और 39 (32.5%) विशेष रूप से सुसंस्कृत नमूनों (नीले) में पहचाने गए थे। यह संभावना है कि वर्तमान और क्या अनुपस्थित है, इस संदर्भ में अनुक्रमण का उपयोग करके हमने जो पहचान की है, उससे अधिक समानता है, लेकिन कुछ मामलों में कुछ टैक्सा अनुक्रमण का पता लगाने की सीमा से नीचे आते हैं । मतभेदों से संकेत मिलता है कि संस्कृति प्रक्रिया असंस्कारी थूक की तुलना में सुसंस्कृत में कुछ पूर्वाग्रह का परिचय । सबसे विशेष रूप से, खेती कैंडिडा और एस्परगिलसजैसे कवक की उपस्थिति को बढ़ाती है, साथ ही एस्चेरिचिया, सेरतियाऔर स्ट्रेप्टोकोकस सदस्यों सहित एंटेरोबैक्टीरेस सदस्यों को बढ़ाती है। इसके विपरीत, प्रीवोटेला और क्लोस्ट्रिडिकल्स जैसे बैक्टीरियोइडेट सदस्य, जो एनारोब हैं, असंस्कारी नमूनों में मौजूद थे लेकिन सुसंस्कृत नमूनों में मौजूद नहीं थे। यह हमारे प्रयोगात्मक मॉडल में एक अवायवीय स्थिति की कमी के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है।

चित्रा 5 50 विभिन्न पीडब्ल्यूसीएफ से प्राप्त थूक से अलग आम CF फेफड़ों के रोगजनकों के अवशोषण आधारित विकास घटता से पता चलता है। ये आइसोलेटेड मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल नैदानिक माइक्रोबायोलॉजी प्रयोगशाला से संवर्धन संस्कृति प्रक्रियाओं का उपयोग करके प्राप्त फेनोटाइपिक रूप से विभिन्न नैदानिक आइसोलेटेड का प्रतिनिधित्व करते हैं, और इसमें स्यूडोमोनास एरुगिनोसा (एन = 53), स्टेफिलोकोकस ऑरियस (एन = 37), स्टेनोट्रोट्रोमोनास माल्टोफिलिया (एन = 12), क्लॉबेबिसिएला निमोनिया (एन = 3) और एक्रोमॉकेटर स्पीकर शामिल हैं। (एन = 7) । अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर कृत्रिम थूक मीडिया में प्रत्येक आइसोल्ड को बनाकर विकास घटता प्राप्त किया गया था, जिसमें एएसएम बिना बैक्टीरियल टीका नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करते थे। एएसएम की पारदर्शी गुणवत्ता (जो गर्मी नसबंदी के बजाय फिल्टर के कारण है) विकास घटता अनुमान लगाने के लिए ऑप्टिकल उपायों के संचालन के लिए अनुमति देता है । 600 एनएम (OD600) पर ऑप्टिकल रीडिंग हर 10 मिनट में लिया गया था, और प्रत्येक वक्र के पहले 24 घंटे दिखाए जाते हैं। एएसएम-केवल नकारात्मक नियंत्रण में ऑप्टिकल रीडिंग में परिवर्तन की अनुपस्थिति संस्कृतियों को संदूषण से मुक्त इंगित करती है। यहां दिखाए गए प्रदर्शनात्मक घटता विशिष्ट विकास वक्र पैटर्न का पालन करते हैं जो विकास घटता की अवशोषण-आधारित पीढ़ी के लिए एक माध्यम के रूप में इस एएसएम नुस्खा की व्यवहार्यता का संकेत देते हैं।

कॉलम 1 कॉलम 2 कॉलम 3 कॉलम 4 कॉलम 5 कॉलम 6 कॉलम 7 कॉलम 8 कॉलम 9
मूल्य कॉमस्टॉक किर्चनर श्रीरामुलु पामर फ्लिन गैलागर लाइ स्रोत
म्यूसिन 2% w/v 0.5% w/v 0.5% w/v - 1% w/v 2% w/v 1% w/v फ्लिन
सोडियम क्लोराइड 85.5 mM 85.5 mM 85.5 mM 66.6 mM 89.8 mM 85.5 mM 152.3 mM लैपियरे
पोटेशियम क्लोराइड 29.5 mM 29.5 mM 29.5 mM 15.8 mM - 2.95 mM 15.8 mM पामर
मैग्नीशियम सल्फेट - - - 0.6 mM 1 mm 1 mm 0.61 mm पामर
आयरन सल्फेट - - - 0.0036 mM - - - -
अमोनियम क्लोराइड - - - 2.3 mM 60 एमएमएम - - -
मोनोपोटेसियम फॉस्फेट - - - 2.5 mM 60 एमएमएम - - -
ग्लूकोज़ - - - 3.2 mM 13 एमएमएम 40 एमएमएम 0.7 mM सांबीक
लैक्टेट - - - 9 एमएमएम - - - -
आवश्यक अमीनो एसिड 14.45x 0.25 ग्राम/एल 0.25 ग्राम/एल प्रति एसिड 0.5x 0.375x 1.29x पामर
गैर-आवश्यक अमीनो एसिड 28.9x 0.25 ग्राम/एल 0.25 ग्राम/एल प्रति एसिड 0.25x 0.5x 8.01x पामर
विटामिन - - - - - 1x 1x गैलागर
ट्रेस धातु - - - - 1x 1x 1x फ्लिन
अंडे की जर्दी 0.25% 0.25% 0.25% - - 0.25% 0.25% किर्चनर
फेरिटिन 0.0003 जी/एल - - - - 0.0004 जी/एल 0.0004 जी/एल गैलागर
सामन शुक्राणु डीएनए 1.4 ग्राम/एल 4 जी/एल 4 जी/एल - - 1.4 ग्राम/एल - -
डीपीटीए - - 0.0059 जी/एल - - - - -
पीएच - 6.9 - 6.8 - - 6.3 लैपियरे
गोदाम 0 4° - - 4° 4° 4° किर्चनर
नसबंदी ऑटोक्लेव छानना ऑटोक्लेव - ऑटोक्लेव ऑटोक्लेव छानना किर्चनर

तालिका 1: कृत्रिम थूक माध्यम नुस्खा साहित्य की समीक्षा से प्राप्त। (कॉलम 1) कृत्रिम थूक माध्यम के निर्माण में अभिकर् ता और प्रमुख मूल्य। (कॉलम2-7) वर्तमान साहित्य 8 ,9, 10,12,14,15से व्यंजनों की तुलना । (कॉलम8-9) कृत्रिम थूक माध्यम नुस्खा इस प्रोटोकॉल में विस्तृत और इसी सूत्रों ने प्रत्येक चयनितमूल्य 10 ,11,12,13,14,15को सूचित किया ।

कॉलम 1 कॉलम 2 कॉलम 3
सीएफ थूक एएसएम
कुल अमीनो एसिड 10.25 mM 10.76 mM
एलेनिन 0.96 mM 0.80 mM
आर्जिनिन 0.17 mM 0.94 mM
शतावरी 0.91 mM
एस्पार्टिक एसिड 0.45 mM 0.80 mM
सिस्टीन 0.09 mM 0.33 mM
ग्लूटामिक एसिड 0.84 mM 0.80 mM
ग्लाइसिन 0.65 mM 0.80 mM
हिस्टिडीन 0.28 mM 0.35 mM
आइसोल्यूसिन 0.60 mM 0.52 mM
ल्यूसिन 0.87 mM 0.52 mM
Lysine 1.15 mM 0.64 mM
मेथियोनिन 0.34 mM 0.13 mM
ऑर्निथाइन 0.36 mM
फेनिलानाइन 0.29 mM 0.26 mM
प्रोलाइन 0.90 एमएमएम 0.80 mM
सेरीन 0.78 mM 0.80 mM
थ्रेनिन 0.58 mM 0.52 mM
ट्रिप्टोफान 0.07 mM 0.06 mM
टायरोसिन 0.43 mM 0.26 mM
वलिन 0.60 mM 0.52 mM

तालिका 2: अमीनो एसिड सांद्रता पहले सिस्टिक फाइब्रोसिस थूक में वर्णित है और कृत्रिम थूक माध्यम नुस्खा में इस प्रोटोकॉल में विस्तृत । (कॉलम 1) कुंजी अमीनो एसिड। (कॉलम2) सिस्टिक फाइब्रोसिस12वाले लोगों से थूक की अमीनो एसिड सांद्रता । (कॉलम3) कृत्रिम थूक माध्यम में अमीनो एसिड सांद्रता इस प्रोटोकॉल में विस्तृत

Figure 1
चित्रा 1:ऑक्सीजन स्परिंग सिस्टम घटकों का कनेक्शन योजनाबद्ध। सिस्टम के घटकों के बीच कनेक्शन का प्रवाह आरेख 21% और 100% के बीच वांछित ऑक्सीजन सांद्रता के लिए सीरम की बोतलों को बख्शने के लिए उपयोग किया जाता है। सिस्टम में दो टी-जंक्शन वाल्व की स्थिति द्वारा निर्धारित उपयोग के 3 तरीके हैं। प्रणाली गैस उत्पादन के माध्यम से या ऑक्सीजन प्रतिशत मॉनिटर के माध्यम से टैंकों से गैस मार्ग कर सकते हैं, साथ ही समय बीत जाने के बाद एकाग्रता की जांच करने के लिए मॉनिटर के माध्यम से पहले से स्पर्गेड सीरम की बोतलों से मार्ग बहिर्वाह गैस । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:लक्ष्य ऑक्सीजन सांद्रता लगभग 12 घंटे और 24 घंटे बख्शते अंतराल दोनों के साथ बनाए रखा जाता है, और पीएच संस्कृति के दौरान शारीरिक सीमा में रहता है । (A)72-h अवधि में 12 घंटे और 24 घंटे ऑक्सीजन स्परिंग अंतराल से ऑक्सीजन रीडिंग बहिर्वाह। (ख)नमूनों के लिए पीएच रीडिंग हर 24 घंटे मापा जाता है (ग)७२ घंटे के बाद सुसंस्कृत नमूना CFB010 की एक उदाहरण छवि, ऑक्सीजन सांद्रता में अंतर टर्बिडिटी प्रदर्शित । रंग लक्ष्य ऑक्सीजन प्रतिशत इंगित करता है; त्रुटि सलाखों 95% विश्वास अंतराल निरूपित करते हैं। क्रिटिकल थ्रेसहोल्ड को धराशायी लाइनों के साथ जोर दिया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:संस्कृति माइक्रोबियल लोड बढ़ाता है, लेकिन अंतर्निहित समुदाय संरचना संरक्षित है। 48 घंटे के लिए 21% ऑक्सीजन पर कृत्रिम थूक माध्यम का उपयोग करते हुए असंस्कारी थूक (पीला) और सुसंस्कृत थूक (नीला)। अलीकोट संस्कृति की स्थितियों से शुरू किए गए संभावित पूर्वाग्रह का पता लगाने के लिए न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण और शॉटगन मेटाजेनोमिक्स अनुक्रमण से गुजरा। (A)निरपेक्ष माइक्रोबियल लोड (स्पाइक-इन कंट्रोल्स द्वारा निर्धारित) और अल्फा विविधता मैट्रिक्स। रैखिक मिश्रित प्रभाव मॉडल का उपयोग करना, असंसंस्कृत बनाम सुसंस्कृत थूक माइक्रोबियल लोड की भविष्यवाणी की, लेकिन अल्फा विविधता नहीं । (ख)बीटा विविधता मैट्रिक्स के पहले दो घटकों का समन्वय, माइक्रोबियल लोड में अंतर के लिए नियंत्रित करना । PERMANOVA के बाद या तो मीट्रिक में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4:पहचाने गए टैक्सा के बहुमत स्रोत थूक और संस्कृति दोनों में मौजूद हैं, जबकि अन्य केवल स्रोत थूक या संस्कृति में दिखाई देते हैं। शॉटगन मेटाजेनोमिक्स अनुक्रमण का उपयोग असंस्कारी और सुसंस्कृत थूक नमूनों के बीच माइक्रोबियल समुदाय संरचना में मतभेदों की तुलना करने के लिए किया जाता है। अनुक्रमित नमूनों (एन = 120) में सभी पहचाने गए माइक्रोबियल प्रजातियों का फिलोजेनेटिक पेड़। पीले रंग के साथ चिह्नित प्रजातियों (एन = ३५, २९.२%) केवल असंस्कारी थूक के नमूनों में देखा गया । नीले रंग के साथ चिह्नित प्रजातियों (एन = ३९, ३२.५%) केवल कृत्रिम थूक मध्यम संस्कृति के नमूनों में देखा गया । सियान (एन = 46, 38.3%) के साथ चिह्नित प्रजातियां असंस्कारी और सुसंस्कृत दोनों नमूनों में देखी गईं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5:कृत्रिम थूक माध्यम नैदानिक आइसोले बनाने के लिए एक विकास वक्र माध्यम के रूप में उपयोग करने के लिए पर्याप्त रूप से पारदर्शी है। 600 एनएम पर इष्टतम घनत्व रीडिंग हर 10 मिनट में ली गई थी, और प्रत्येक वक्र के पहले 24 घंटे दिखाए जाते हैं। ग्रे लाइनें व्यक्तिगत रीडिंग का प्रतिनिधित्व करती हैं, और नारंगी रेखाएं प्रत्येक टैक्सन के लिए मतलब अवशोषण का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृत्रिम थूक मध्यम रिक्त नियंत्रण के रूप में शामिल है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस अध्ययन में, फेफड़ों के माइक्रोबियल समुदायों पर हाइपरऑक्सिया के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक इन विट्रो मॉडल विकसित किया गया था। कृत्रिम थूक माध्यम और सीरम की बोतलों के दैनिक स्परिंग पर आधारित यह मॉडल, ऊंचा ऑक्सीजन सांद्रता रखता है और पीडब्ल्यूसीएफ से थूक में पहचाने गए रोगाणुओं के विकास का समर्थन करता है।

इस दृष्टिकोण के कई महत्वपूर्ण कदम हैं । सबसे पहले कृत्रिम थूक माध्यम की गर्मी-नसबंदी के बजाय फिल्टर-नसबंदी का उपयोग करना विकल्प है। फ़िल्टर-नसबंदी म्यूसिन और मध्यम के अन्य गर्मी-संवेदनशील घटकों को विकृत करने से रोकती है और एक स्पष्ट माध्यम पैदा करती है जिसका उपयोग माइक्रोबियल विकास के ऑप्टिकल उपायों के लिए किया जा सकता है। जबकि अन्य प्रोटोकॉल10में फ़िल्टर-नसबंदी का प्रस्ताव किया गया है, हमने पाया है कि फ़िल्टैप प्रक्रिया के दौरान कक्षीय झटकों का जोड़ फिल्टर के क्लोजिंग को रोकने के लिए आवश्यक था जो अन्यथा तब हुआ जब तैयार माध्यम की न्यूनतम मात्रा फ़िल्टर की गई थी। जबकि फ़िल्टर किए गए कृत्रिम थूक माध्यम में फ़िल्टर में म्यूसिन प्रभाव के कारण कम-से-इरादा अंतिम म्यूसिन एकाग्रता हो सकती है, पीडब्ल्यूसीएफ से थूक को सिस्टिक फाइब्रोसिस21के बिना लोगों से थूक की तुलना में कम म्यूसिन सांद्रता दिखाई गई है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले 1% की शुरुआती म्यूसिन एकाग्रता अन्य दृष्टिकोणों की तुलना में अधिक है जिन्होंने फिल्टर-नसबंदी का उपयोग किया है, एक समूह 0.5%10की शुरुआती म्यूसिन एकाग्रता का उपयोग करता है, जबकि विशिष्ट व्यंजन 0.5%-2%(तालिका 1)से लेकर म्यूसिन सांद्रता का उपयोग करते हैं। इस प्रकार, यहां तक कि फिल्टर-नसबंदी प्रक्रिया में म्यूसिन की हानि के साथ, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके तैयार किए गए अंतिम माध्यम में शारीरिक सीमा22के भीतर म्यूसिन सांद्रता होने की संभावना है।

दूसरा कृत्रिम थूक माध्यम की संरचना है। कृत्रिम थूक माध्यम के लिए नुस्खा पीडब्ल्यूसीएफ(तालिका 1)से थूक के मौजूदा शारीरिक अध्ययन के आधार पर चुना गया था । शॉटगन मेटाजेनोमिक्स अनुक्रमण का उपयोग करके, हम यह सत्यापित करने में सक्षम थे कि इस कृत्रिम थूक माध्यम के साथ सुसंस्कृत थूक मोटे तौर पर असभ्य थूक(चित्रा 3)की माइक्रोबियल समुदाय संरचना को पुनः प्राप्त करता है। नॉर्मॉक्सिक स्थितियों में, इस माध्यम ने सिस्टिक फाइब्रोसिस रोगियों के थूक से अलग आम रोगजनकों का प्रतिनिधित्व करने वाले 112 विभिन्न नैदानिक आइसोले के विकास का भी समर्थन किया। इस प्रकार, ये आंकड़े दर्शाते हैं कि कृत्रिम थूक माध्यम का यह निर्माण पीडब्ल्यूसीएफ से एयरवे माइक्रोबायोटा के विकास का समर्थन करता है। सामन शुक्राणु डीएनए, मौजूदा व्यंजनों(तालिका 1)के लिए एक आम इसके अलावा, लोप कर दिया गया था । इस मॉडल का एक इरादा आवेदन मेटाजेनोमिक्स अनुक्रमण है, और इस प्रकार सामन शुक्राणु डीएनए को गैर-माइक्रोबियल न्यूक्लिक एसिड के अलावा कम करने के लिए शामिल नहीं किया गया था क्योंकि इन रीड्स को अनुक्रमण के बाद फ़िल्टर किया जाएगा, इस प्रकार हमारी प्रभावी अनुक्रमण गहराई कम हो जाएगी। जबकि पीडब्ल्यूसीएफ से थूक में अतिरिक्त डीएनए23की उच्च सांद्रता है, इसका एक महत्वपूर्ण अनुपात मूल24में माइक्रोबियल है, और यह स्पष्ट नहीं है कि कृत्रिम थूक माध्यम में सामन शुक्राणु डीएनए के अलावा इसे अधिक शारीरिक बनाता है या क्या इस प्रोटोकॉल में वर्णित संस्कृति दृष्टिकोण माइक्रोबियल-व्युत्पन्न बाहीय डीएनए के उच्च स्तर की ओर जाता है; हमने अपनी पढ़ाई में अतिरिक्त और अंतर-सेलुलर डीएनए सांद्रता के बीच अंतर नहीं किया । भविष्य के अध्ययन इस संस्कृति विधि द्वारा उत्पन्न बाह्य डीएनए की एकाग्रता को सत्यापित करना चाहते हैं।

तीसरा, हमारे ज्ञान के लिए, सिस्टिक फाइब्रोसिस फेफड़ों माइक्रोबियल समुदायों पर कोई प्रकाशित अध्ययन हाइपरऑक्सिक स्थितियों को संबोधित किया है । यह मॉडल ऑक्सीजन स्पिंग सिस्टम बनाने के लिए सामान्य प्रयोगशाला या अस्पताल आपूर्तिकर्ताओं से सस्ती और आमतौर पर उपलब्ध उपकरणों का उपयोग करता है। हाइपरऑक्सिक स्थितियों के रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण विचारों में सीरम की बोतलों में उपलब्ध हेडस्पेस के सापेक्ष संस्कृति माध्यम की मात्रा शामिल है। प्रोटोकॉल विकास के दौरान प्रारंभिक प्रयासों में, 125 एमएल सीरम बोतलों का उपयोग किया गया था। हालांकि, 500 एमएल सीरम बोतलों का उपयोग (475 एमएल हेडस्पेस से 25 एमएल संस्कृति अनुपात के लिए अनुमति देना) ने 24 घंटे तक वांछित एकाग्रता के रखरखाव की अनुमति दी, इस प्रकार ऑक्सीजन की आवृत्ति को कम किया। यह दृष्टिकोण असतत ऑक्सीजन की स्थिति उत्पन्न करता है, इस प्रकार कई ऑक्सीजन स्थितियों में विभिन्न रोगी नमूनों की एक साथ संस्कृति की अनुमति देता है। एनारोबिक संस्कृति से अन्य उपकरणों को हाइपरऑक्सिक संस्कृति के लिए लीवरेज किया जा सकता है, जिसमें ऑक्सीजन के साथ एनारोबिक जार या बाल्च-प्रकार की ट्यूबों का उपयोग शामिल है। मेटाजेनोमिक्स अनुक्रमण का उपयोग करके फेफड़ों के माइक्रोबियल समुदायों के विश्लेषण से संकेत मिलता है कि समग्र अल्फा और बीटा विविधता सुसंस्कृत और असंस्कारी थूक के बीच तुलनीय है। प्रजातियों के स्तर पर अंतर बहुतायत का मूल्यांकन करते समय, 21% ऑक्सीजन पर खेती, एंटेरोबैक्टीरेल, स्ट्रेप्टोकोकस और कवक सहित एयरोबॉब्स और संकाय एनारोब के विकास के लिए समृद्ध। पीडब्ल्यूसीएफ25,26के वायुमार्ग में पाई गई अवायबीय स्थिति के बहिष्करण के कारण यह संभावना है . भविष्य के अध्ययनों से इस मॉडल में नाइट्रोजन गैस को शामिल करने पर विचार कर सकते है anoxic और ऑक्सीक स्थितियों की एक श्रृंखला का अध्ययन करने और इसी एरोबिक और अवायवीय माइक्रोबायोटा वायुमार्ग माइक्रोबियल समुदायों में पाया ।

इन प्रोटोकॉलों में उल्लिखित प्रमुख सिद्धांत जटिल माइक्रोबियल समुदायों या आम फेफड़ों के रोगजनकों पर ऑक्सीजन के प्रभाव से संबंधित समान अध्ययनों के संचालन के लिए शिक्षाप्रद हो सकते हैं। ऑक्सीजन सबसे आम चिकित्सा सभी उन्नत फेफड़ों के रोगों के इलाज में इस्तेमाल किया है, और यह कैसे वायुमार्ग माइक्रोबियल समुदायों और आम श्वसन रोगजनकों पर संपाश्र्वक अप्रत्याशित प्रभाव के लिए नेतृत्व कर सकते है की एक बेहतर समझ pwCF और अंय पुराने फेफड़ों के रोगों की देखभाल के लिए महत्वपूर्ण होगा ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम का एक हिस्सा समुद्री जैविक प्रयोगशाला, डीओई (DE-SC0016127), एनएसएफ (MCB1822263), HHMI (अनुदान संख्या 5600373), और सिमंस फाउंडेशन से एक उपहार से समर्थन के साथ समुद्री जैविक प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BME Vitamins (100x) Solution MilliporeSigma B6891 Concentrated solution of supplemental vitamins.
Crimper, 30 mm DWK Life Sciences 224307 Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles.
D-(+)-Glucose MilliporeSigma G7021 Solid glucose powder (dextrorotatory isomer).
Diaphragm Pump ME 2 NT VACUUBRAND 20730003 Vacuum pump for vacuum filtration.
Egg Yolk Emulsion HiMedia FD045 Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline.
Ferritin, Cationized from Horse Spleen MilliporeSigma F7879 Ferritin (iron-storage protein) solution.
FIREBOY plus Safety Bunsen Burner Integra Biosciences 144000 Bunsen burner with user interface and safety features.
Hydrion pH Paper (1.0–14.0) Micro Essential Laboratory 94 pH testing paper for the range of 1.0–14.0.
Hydrion pH Paper (4.0–9.0) Micro Essential Laboratory 55 pH testing paper for the range of 4.0–9.0.
Hydrion pH Paper (6.0–8.0) Micro Essential Laboratory 345 pH testing paper for the range of 6.0–8.0.
Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G Smiths Medical 401815 18 G needles with safety caps.
In-Line Pressure Gauge MilliporeSigma 20469 Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure.
Innova 42 Incubated Shaker Eppendorf 2231000756 Combination incubator/orbital shaker.
Luer-Lok Syringe with Attached Needle Becton Dickinson 309580 Combination 3 mL syringe and 18 G needle.
Luer Valve Assortment World Precision Instruments 14011 Valves for gas flow tubing.
LSE Orbital Shaker ThermoFisher Scientific 6780-NP Orbital shaker to agitate media during filtration.
Magnesium Sulfate Heptahydrate MilliporeSigma M2773 Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate).
Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter Western Enterprises M1-346-15FM Air flow rate regulator with 15 L/min meter.
MEM Amino Acids (50x) Solution MilliporeSigma M5550 Concentrated solution of essential amino acids.
MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution MilliporeSigma M7145 Concentrated solution of non-essential amino acids.
Millex-GP Filter, 0.22 µm MilliporeSigma SLMP25SS 0.22 µm polyethersulfone membrane sterile syringe filter.
Milli-Q Academic MilliporeSigma ZMQS60E01 Milli-Q sterile water filtration system.
MiniOX 3000 Oxygen Monitor MSA 814365 Gas flow oxygen percentage monitor.
MOPS Buffer (1 M, pH 9.0) Boston BioProducts BBM-90 MOPS buffer for adjusting media pH.
Mucin from Porcine Stomach MilliporeSigma M2378 Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder.
Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit Harvard Apparatus 72-1413 Connectors for gas flow tubing.
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina FC-131-1096 Library preparation for identification during sequencing.
NovaSeq 6000 Sequencing System Illumina 770-2016-025-N Shotgun sequencing platform for generating sample reads.
Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter Western Enterprises M1-540-15FM Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter.
Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors SunMed 2001-01 Tubing for connecting gas system components.
Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 Molecular Biologicals International MRGF-6235 Concentrated phosphate-buffered saline solution.
PC 420 Hot Plate/Stirrer Marshall Scientific CO-PC420 Combination hot plate/stirrer.
Potassium Chloride MilliporeSigma P9541 Solid potassium chloride salt.
PTFE Disposable Stir Bars ThermoFisher Scientific 14-513-95 Disposable magnetic stir bars.
PTFE Thread Seal Teflon Tape VWR 470042-938 Teflon tape for reinforcing gas system connections.
Q-Gard 2 Purification Cartridge MilliporeSigma QGARD00D2 Purification cartridge for Milli-Q system.
Reusable Media Storage Bottles ThermoFisher Scientific 06-423A Bottles for mixing and storing culture media.
Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl DWK Life Sciences 224100-331 Rubber stoppers for serum bottles.
Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL DWK Life Sciences 223952 Glass serum bottles for sealed culturing.
Small Bore Extension Set Braun Medical 471960 Tubing extension with luer lock connectors.
Sodium Chloride MilliporeSigma S3014 Solid sodium chloride salt.
Spike-in Control I (High Microbial Load) ZymoBIOMICS D6320 Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations
Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System MilliporeSigma S2GPU02RE 250 mL 0.22 µm vacuum filtration chamber.
Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes Professional Disposables International H04082 Disposable germicidal wipes for sterilization.
Trace Metals Mixture, 1000x ThermoFisher Scientific NC0112668 Concentrated solution of physiological trace metals.
Unlined Aluminum Seal, 30 mm DWK Life Sciences 224187-01 Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers.
USP Medical Grade Air Tank Airgas AI USP200 Compressed air tank for input to sparging system.
USP Medical Grade Oxygen Tank Airgas OX USP200 Compressed oxygen tank for input to sparging system.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLoS One. 13 (3), 0194060 (2018).
  2. Acosta, N., et al. Sputum microbiota is predictive of long-term clinical outcomes in young adults with cystic fibrosis. Thorax. 73 (11), 1016-1025 (2018).
  3. Muhlebach, M. S., et al. Initial acquisition and succession of the cystic fibrosis lung microbiome is associated with disease progression in infants and preschool children. PLoS Pathogens. 14 (1), 1006798 (2018).
  4. Zolin, A., Bossi, A., Cirilli, N., Kashirskaya, N., Padoan, R. Cystic fibrosis mortality in childhood. Data from European cystic fibrosis society patient registry. International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (9), (2018).
  5. Ramos, K. J., et al. Heterogeneity in survival in adult patients with cystic fibrosis with FEV1 30% of predicted in the United States. Chest. 30 (6), 1320-1328 (2017).
  6. Ramos, K. J., et al. Predictors of non-referral of patients with cystic fibrosis for lung transplant evaluation in the United States. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (2), 196-203 (2016).
  7. Girardis, M., et al. Effect of conservative vs conventional oxygen therapy on mortality among patients in an intensive care unit: The Oxygen-ICU randomized clinical trial. JAMA. 316 (15), 1583-1589 (2016).
  8. Comstock, W. J., et al. The WinCF model - An inexpensive and tractable microcosm of a mucus plugged bronchiole to study the microbiology of lung infections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55532 (2017).
  9. Diraviam Dinesh, S. Artificial sputum medium. Protocol Exchange. , Version 1 (2010).
  10. Kirchner, S., et al. Use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against Pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3857 (2012).
  11. Grandjean Lapierre, S., et al. Cystic fibrosis respiratory tract salt concentration: An Exploratory Cohort Study. Medicine. 96 (47), Baltimore. 8423 (2017).
  12. Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
  13. Van Sambeek, L., Cowley, E. S., Newman, D. K., Kato, R. Sputum glucose and glycemic control in cystic fibrosis-related diabetes: a cross-sectional study. PLoS One. 10 (3), 0119938 (2015).
  14. Flynn, J. M., Niccum, D., Dunitz, J. M., Hunter, R. C. Evidence and role for bacterial mucin degradation in cystic fibrosis airway disease. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005846 (2016).
  15. Gallagher, T., et al. Liquid chromatography mass spectrometry detection of antibiotic agents in sputum from persons with cystic fibrosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 65 (2), (2021).
  16. Voynow, J. A., Rubin, B. K. Mucins, mucus, and sputum. Chest. 135 (2), 505-512 (2009).
  17. Sui, H. Y., et al. Impact of DNA extraction method on variation in human and built environment microbial community and functional profiles assessed by shotgun metagenomics sequencing. Frontiers in Microbiology. 11, 953 (2020).
  18. McIver, L. J., et al. bioBakery: a meta'omic analysis environment. Bioinformatics. 34 (7), 1235-1237 (2018).
  19. Truong, D. T., et al. MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling. Nature Methods. 12 (10), 902-903 (2015).
  20. Stammler, F., et al. Adjusting microbiome profiles for differences in microbial load by spike-in bacteria. Microbiome. 4 (1), 28 (2016).
  21. Henke, M. O., Renner, A., Huber, R. M., Seeds, M. C., Rubin, B. K. MUC5AC and MUC5B mucins are decreased in cystic fibrosis airway secretions. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 86-91 (2004).
  22. Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyper concentration and increased osmotic pressure. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3047-3060 (2014).
  23. Matthews, L. W., Spector, S., Lemm, J., Potter, J. L. Studies on pulmonary secretions. I. The over-all chemical composition of pulmonary secretions from patients with cystic fibrosis, bronchiectasis, and laryngectomy. American Review of Respiratory Disease. 88, 199-204 (1963).
  24. Ibanez de Aldecoa, A. L., Zafra, O., Gonzalez-Pastor, J. E. Mechanisms and regulation of extracellular DNA release and its biological roles in microbial communities. Frontiers in Microbiology. 8, 1390 (2017).
  25. Tunney, M. M., et al. Detection of anaerobic bacteria in high numbers in sputum from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (9), 995-1001 (2008).
  26. Worlitzsch, D., et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Investigation. 109 (3), 317-325 (2002).

Tags

चिकित्सा अंक 174 कृत्रिम थूक माध्यम संस्कृति सिस्टिक फाइब्रोसिस (पीडब्ल्यूसीएफ) हाइपरऑक्सिया मेटाजेनोमिक्स अनुक्रमण एयरवे माइक्रोबायोम वाले लोग
सिस्टिक फाइब्रोसिस एयरवे माइक्रोबायोम पर पूरक ऑक्सीजन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल का डिजाइन और विकास
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vieira, J., Gallagher, T., Sui, H.… More

Vieira, J., Gallagher, T., Sui, H. Y., Jesudasen, S., Whiteson, K., O'Toole, G. A., Hanselmann, K., Lai, P. S. Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome. J. Vis. Exp. (174), e62888, doi:10.3791/62888 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter