Summary
Het doel van dit protocol is om een modelsysteem te ontwikkelen voor het effect van hyperoxie op cystic fibrosis airway microbial communities. Kunstmatig sputummedium emuleert de samenstelling van sputum en hyperoxische cultuuromstandigheden modelleren de effecten van aanvullende zuurstof op microbiële longgemeenschappen.
Abstract
Van microbiële gemeenschappen in de luchtwegen wordt gedacht dat ze een belangrijke rol spelen bij de progressie van cystische fibrose (CF) en andere chronische longziekten. Microben zijn van oudsher geclassificeerd op basis van hun vermogen om zuurstof te gebruiken of te verdragen. Aanvullende zuurstof is een veel voorkomende medische therapie die wordt toegediend aan mensen met cystische fibrose (pwCF); bestaande studies over zuurstof en het luchtwegmicrobioom hebben zich echter gericht op hoe hypoxie (lage zuurstof) in plaats van hyperoxie (hoge zuurstof) de overwegend aerobe en facultatieve anaerobe microbiële longgemeenschappen beïnvloedt. Om deze kritieke kenniskloof aan te pakken, is dit protocol ontwikkeld met behulp van een kunstmatig sputummedium dat de samenstelling van sputum van pwCF nabootst. Het gebruik van filtersterilisatie, dat een transparant medium oplevert, maakt optische methoden mogelijk om de groei van eencellige microben in suspensieculturen te volgen. Om hyperoxische omstandigheden te creëren, maakt dit modelsysteem gebruik van gevestigde anaerobe kweektechnieken om hyperoxische omstandigheden te bestuderen; in plaats van zuurstof te verwijderen, wordt zuurstof aan culturen toegevoegd door dagelijks serumflessen te sparen met een mengsel van gecomprimeerde zuurstof en lucht. Sputum van 50 pwCF onderging dagelijks sparen gedurende een periode van 72 uur om het vermogen van dit model om differentiële zuurstofcondities te handhaven te verifiëren. Shotgun metagenomische sequencing werd uitgevoerd op gekweekte en niet-gekweekte sputummonsters van 11 pwCF om het vermogen van dit medium te verifiëren om de groei van commensale en pathogene microben te ondersteunen die vaak worden aangetroffen in cystic fibrosis sputum. Groeicurven werden verkregen uit 112 isolaten verkregen van pwCF om het vermogen van dit kunstmatige sputummedium te verifiëren om de groei van veel voorkomende cystische fibrose pathogenen te ondersteunen. We vinden dat dit model een breed scala aan pathogenen en commensalen in CF-sputum kan kweken, een gemeenschap herstelt die sterk lijkt op ongecultiveerd sputum onder normoxische omstandigheden en verschillende kweekfenotypen creëert onder verschillende zuurstofomstandigheden. Deze nieuwe aanpak kan leiden tot een beter begrip van onverwachte effecten veroorzaakt door het gebruik van zuurstof in pwCF op microbiële gemeenschappen in de luchtwegen en veel voorkomende respiratoire pathogenen.
Introduction
Cystic fibrosis (CF) is een genetische ziekte die wordt gekenmerkt door een onvermogen om dik slijm uit de longen te verwijderen, wat leidt tot herhaalde infecties en progressieve achteruitgang van de longfunctie die vaak resulteert in de noodzaak van longtransplantatie of de dood. Het luchtwegmicrobioom van mensen met cystische fibrose (pwCF) lijkt de ziekteactiviteit te volgen1, met een vermindering van microbiële diversiteit geassocieerd met nadelige langetermijnresultaten2,3. In klinische studies van pwCF is aanvullende zuurstoftherapie in verband gebracht met meer geavanceerde ziekte4,5, hoewel traditioneel het gebruik van zuurstoftherapie wordt gezien als eenvoudigweg een marker voor de ernst van de ziekte6. Recente studies van een klinische studie van patiënten met respiratoire insufficiëntie hebben aangetoond dat hogere zuurstofniveaus van patiënten paradoxaal genoeg geassocieerd zijn met een toename van ernstige bacteriële infecties en hogere mortaliteit7, wat suggereert dat aanvullende zuurstof kan bijdragen aan de pathogenese van de ziekte. Het effect van aanvullende zuurstof op het cystic fibrosis longmicrobioom en de bijbehorende long- en luchtwegmicrobiële gemeenschappen is niet goed bestudeerd.
Mechanistische studies kunnen vaak niet rechtstreeks op menselijke proefpersonen worden uitgevoerd vanwege logistieke problemen en mogelijke ethische problemen in verband met interventies met onbekend medisch voordeel of schade. Translationele benaderingen die menselijke biospecimens integreren in modelsystemen kunnen in deze gevallen belangrijke biologische inzichten bieden. Hoewel het vermogen om zuurstof te gebruiken of te verdragen van oudsher een belangrijk onderdeel is van microbiële classificatie, is er weinig bekend over hoe de therapeutische introductie van aanvullende zuurstof in het milieu microbiële gemeenschappen in de luchtwegen zou kunnen verstoren. Om licht te werpen op de onbekende effecten van extra zuurstof op de luchtwegmicrobiomen van pwCF, moesten we twee grote uitdagingen aanpakken; ten eerste, de creatie van een kweekmedium dat fysiologisch de samenstelling van CF-sputum benadert; ten tweede, de creatie van een modelsysteem dat het mogelijk maakt om gedurende langere tijd verhoogde zuurstofconcentraties in cultuur te behouden.
Kunstmatige sputummedia (ASM) worden veel gebruikt om longsputum ex vivo8,9,10na te bootsen, maar er is geen duidelijke consensus over een specifiek recept. Dit protocol beschrijft een recept en bereidingsstrategie voor kunstmatig sputummedium, zorgvuldig ontworpen om sputum van pwCF fysiologisch te benaderen. Tabel 1 geeft een overzicht van de gekozen receptwaarden op basis van gepubliceerde literatuur. Chemische basiscomponenten en pH werden gematcht met waarden geïdentificeerd door studies van menselijk CF-sputum11,12,13. Fysiologische voedingsstoffen met een lage concentratie werden toegevoegd met behulp van eigeel, dat werd opgenomen als 0,25% van het uiteindelijke volume10, evenals vitamine- en sporenmetaalmengsels14,15. Mucine, het belangrijkste bestanddeel van sputum16, werd opgenomen bij 1% w / v14. Hoewel arbeidsintensiever, werd filtersterilisatie gekozen boven de meer conventionele praktijk van warmtesterilisatie om potentiële problemen door warmte-geïnduceerde denaturatie van essentiële mediacomponenten te verminderen10. Een bijkomend voordeel van filtersterilisatie is dat het media genereert die transparant zijn (warmtesterilisatie kan troebele media creëren als gevolg van precipitatie en coagulatie van zouten en eiwitten), waardoor dit kunstmatige sputummedium kan worden gebruikt om microbiële groei te volgen op basis van toename van troebelheid.
Dit modelsysteem voor de hyperoxische cultuur is gebaseerd op anaerobe kweektechnieken waarbij zuurstof wordt toegevoegd in plaats van verwijderd, waardoor een model ontstaat voor het effect van aanvullend zuurstofgebruik voor pwCF. Figuur 1 en het bijbehorende zuurstofsparende protocol schetst de componenten van een zuurstofspaarsysteem, dat tegen lage kosten kan worden verkregen bij leveranciers van algemene laboratoria en ziekenhuizen. Dit systeem maakt het mengen van gecomprimeerde zuurstof en lucht tot vaste concentraties variërend van 21% -100% zuurstof mogelijk. De integratie van een zuurstofsensor maakt het mogelijk om de concentratie van het uitgaande gasmengsel te verifiëren en de uitstroomgassamenstelling van eerder gespargeerde serumflessen te controleren om te controleren of de zuurstofcondities binnen het gewenste bereik zijn gehouden.
Dit protocol schetst procedures voor het creëren van een kunstmatig sputummedium, de constructie en het gebruik van een zuurstofspaarsysteem en de toepassing van beide om CF-sputum te kweken onder differentiële zuurstofomstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie kreeg goedkeuring van de Partners Institutional Review Board (Protocol # 2018P002934). Inclusiecriterium omvatte volwassen patiënten met cystische fibrose die schriftelijke geïnformeerde toestemming gaven voor het onderzoek. Er was geen uitsluitingscriterium. Volgens protocolrichtlijnen werden alle sputummonsters verzameld van patiënten met cystische fibrose tijdens een gepland poliklinisch bezoek aan hun klinische zorgverlener.
1. Kunstmatige sputum medium voorbereiding
OPMERKING: De hier vermelde hoeveelheden zijn voor de productie van 1 l kunstmatig sputumhoudend eindmedium en gaan uit van de specifieke reagentia die in de materialentabelworden vermeld. De nummers moeten worden aangepast voor andere volumes of voor het gebruik van verschillende reagentia om hetzelfde eindproduct te garanderen. Zie tabel 1 voor streefconcentraties.
- Kunstmatige sputum chemische mix (ASCM)
OPMERKING: ASCM maakt 25% uit van het uiteindelijke medium volume. Het is houdbaar en kan in bulk of van tevoren worden bereid. Als het wordt voorbereid voor later gebruik, autoclaaf het chemische mengsel en bewaar het veilig bij kamertemperatuur.- Meng de samenstellende chemische stamoplossingen.
- Bereid 1 M NaCl-bouillon voor: voeg 58,44 g NaCl per liter steriel water toe.
- Bereid 1 M KCl bouillon voor: Voeg 74,55 g KCl per liter steriel water toe.
- Bereid 1 M MgSO4 bouillon: Voeg 246,47 g MgSO4·7H2O per liter steriel water toe, of 120,37 g watervrij MgSO4 per liter steriel water.
- Bereid 1 M glucosevoorraad voor: Voeg 180,16 g glucose per liter steriel water toe.
- Autoclaaf steriliseert de chemische stamoplossingen, evenals een lege fles van 250 ml. Voer de autoclaveerstappen uit tot ten minste standaardwaarden van 121 °C en 15 PSI gedurende 30 minuten.
- Voeg 80,59 ml steriel water toe aan de lege fles van 250 ml.
- Voeg 152,30 ml 1 M NaCl bouillon toe aan het mengsel.
- Voeg 15,8 ml bouillon van 1 M KCl toe aan het mengsel.
- Voeg 610 μL van 1 M MgSO4 bouillon toe aan het mengsel.
- Voeg 700 μL 1 M glucosebouillon toe aan het mengsel.
- Meng de samenstellende chemische stamoplossingen.
- Kunstmatige sputum mucine mix (ASMM)
OPMERKING: ASMM maakt 50% uit van het uiteindelijke medium volume. Zorg ervoor dat het op dezelfde dag wordt bereid als de laatste medium batch.- Voeg 450 ml steriel water toe aan een lege fles van 1 liter.
- Voeg 50 ml 10x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) toe aan de fles.
- Voeg een magnetische roerstaaf voor eenmalig gebruik toe aan de fles.
- Autoclaaf de fles met PBS en de roerstaaf.
- Meet 10 g mucinepoeder af en voeg het toe aan de PBS.
- Schud de fles krachtig voor voorafgaande menging.
- Plaats de fles op een hete plaat met een magneetroerder. Stel het vuur in op middelhoog richten op 50 °C en roersnelheid op 1100 tpm. Verhoog de snelheid geleidelijk zodat de stang niet van de magneet vliegt.
- Laat 15 min verwarmen en roeren.
- Pak de fles op met hittebestendige handschoenen. Observeer om te controleren of mucinepoeder uit de oplossing bezinkt.
- Als mucinepoeder niet volledig is opgelost, breng de fles dan terug naar de hitte / roerder gedurende intervallen van 5 minuten totdat deze volledig is opgelost.
- Laat het mucinemengsel afkoelen tot kamertemperatuur.
- Kunstmatige sputum biologische mix (ASBM)
OPMERKING: ASBM is 25% van het uiteindelijke medium volume. Bereid het op dezelfde dag als de laatste medium batch, en in tegenstelling tot de andere mixen, stel de componenten niet bloot aan enige hitte.- Ontdooi de 100x vitaminebouillon in een koelkast van 4 °C of op ijs.
OPMERKING: Portioneer de vitaminevoorraad voor in 10 ml aliquots om het aantal vries- / dooicycli te minimaliseren. - Voeg 124,24 ml steriel water toe aan de lege geautoclaveerde fles van 250 ml.
- Voeg 25,76 ml 50x essentiële aminozuurbouillon toe aan de mix.
- Voeg 80,14 ml 100x niet-essentiële aminozuurvoorraad toe aan de mix.
- Voeg 10 ml (ontdooide) 100x vitaminebouillon toe aan de mix.
- Voeg 1 ml 1000x sporenmetaalvoorraad toe aan het mengsel.
- Voeg 8,33 ml 30% eigeel-emulsie toe aan het mengsel.
- Voeg 400 μL van 10 g/L ferritinebouillon toe aan het mengsel.
- Meng de oplossing goed door handmatig te schudden.
- Ontdooi de 100x vitaminebouillon in een koelkast van 4 °C of op ijs.
- Kunstmatig sputummedium (ASM)
- Voeg 250 ml ASCM toe aan de fles van 1 l met ASMM.
- Voeg 250 ml ASBM toe aan de middelgrote fles.
- Titreer het medium met basis MOPS-buffer (1 M) om een pH van 6,3 te bereiken op een smal pH-papier. Voorafgaand aan de titratie zal het mediummengsel te zuur zijn.
- Koel het resulterende kunstmatige sputummedium bij 4 °C totdat het klaar is voor filtratie.
- Om het filtratieproces te starten, brengt u 200 ml ongefilterd kunstmatig sputummedium over naar een vacuümfiltratiesysteem met een poriegroottefilter van 0,22 μm.
- Sluit het filtersysteem aan op de vacuümpomp, zet de vacuümpomp aan, stel deze in op 70 mbar en plaats de kamer vervolgens op een orbitale shaker die met 90 tpm schudt in een koude ruimte bij 4 °C.
- Vul af met nog eens 150 ml van het medium als een aanzienlijke hoeveelheid wordt gefilterd. Het duurt 1-2 dagen om 1 L medium volledig te filteren.
- Herhaal dit met extra kamers totdat alle media zijn gefilterd.
OPMERKING: Probeer niet meer dan 350 ml van het medium door hetzelfde filter van 0,22 μm te filteren, omdat mucine het filter na verloop van tijd zal afsluiten.
- Koel gefilterd kunstmatig sputummedium bij 4 °C tot het klaar is voor gebruik. Gebruik ASM binnen een maand na voorbereiding voor het beste resultaat.
2. Zuurstof sparen
- Sparging station setup
OPMERKING: Dit protocol hoeft slechts één keer volledig te worden uitgevoerd, waarna de installatie kan worden onderhouden door eenvoudig onderhoud indien nodig. Zie figuur 1 voor een visueel schema van het zuurstofsparende systeem.- Verkrijg en beveilig de perslucht- en zuurstoftanks goed.
LET OP: Hoge druk maakt de tanks extreem gevaarlijk wanneer ze verkeerd worden behandeld. Zorg ervoor dat de tanks volledig zijn afgedicht en beveiligd, dat er geen lekken zijn wanneer de tank gesloten is en dat al het behandelend personeel volledig is opgeleid in het gebruik ervan. - Bevestig een luchtregelaar aan de persluchttank met een moersleutel. Voor een optimale stroomaflezing op de regelaar bevestigt u de regelaar zo dicht mogelijk bij een rechtopstaande positie.
- Bevestig een zuurstofregelaar aan de gecomprimeerde zuurstoftank en bevestig zo dicht mogelijk bij een rechtopstaande positie. Afhankelijk van de zuurstoftank kan het nodig zijn om de richting om aan te draaien om te keren.
- Sluit de buizen van de regelaars aan op een Y-connector om de gasstroom uit de twee tanks te combineren.
- Sluit de uitgang van de Y-connector aan op de centrale T-junctieklep.
- Sluit een kant van de centrale T-junctieklep aan op een gasdrukmeter.
- Sluit de andere kant van de gasdrukmeter aan op een steriel spuitfilter met een diameter van 25 mm met een poriegrootte van 0,22 μm.
- Bevestig een tweede spuitfilter met een diameter van 25 mm aan een spuit zonder zuiger om te worden gebruikt als gasafgifte tijdens het sparren.
- Sluit de laatste zijde van de centrale T-junctieklep aan op een tweede T-junctieklep voor de zuurstofmonitor.
- Sluit een spuitfilter met een diameter van 25 mm aan op de ene kant van deze tweede T-junctieklep, samen met slangen om naalden van 18 G te bevestigen.
- Sluit de laatste zijde van de tweede T-junctieklep aan op het zuurstofbewakingsapparaat.
- Sluit een afsnijbuis aan op de andere kant van het zuurstofbewakingsapparaat om te worden gebruikt als gasafgifte tijdens de bewaking.
LET OP: Let bij het testen/gebruiken van het zuurstofsparende systeem goed op de positie van de T-juncties en zorg ervoor dat deze overeenkomt met het beoogde pad door het systeem. Als u dit niet doet, zal dit resulteren in drukopbouw in het systeem en ervoor zorgen dat componenten falen en uit elkaar vallen. - Voor het onderhoud van het systeem en om het optimaal te laten werken, zijn de volgende praktijken gunstig.
- Versterk de verbindingen met royale hoeveelheden teflontape om hun afdichting aanzienlijk te verbeteren en de kans te verkleinen dat componenten loskomen van de interne druk.
- Houd het gecombineerde debiet onder de 10 l/min om de maximale druk te verminderen en storingen te voorkomen.
- Als een lek wordt vermoed, gebruik dan een reinigingsmiddeloplossing zoals in de handel verkrijgbare vloeistoflekdetectoren om de locatie gemakkelijk te identificeren, omdat deze boven eventuele gaslekken zal borrelen. Patch lekken met behulp van een polytetrafluorethyleen tape (bijv. Teflon).
- Vervang de spuitfilters met een diameter van 25 mm tweewekelijks in het zuurstofsparende systeem, maar dit varieert met de gebruiksfrequentie. Na verloop van tijd verminderen deeltjes die in het filter worden gevangen het gasdebiet en veroorzaken drukopbouw.
- Kalibreer de zuurstofmonitor op 21% zuurstof perslucht voordat u metingen uitvoert.
- Na voltooiing van het systeemgebruik schakelt u de tanks uit en laat u het overtollige gas van de regelaars ontluchten totdat de stroom volledig stopt.
- Verkrijg en beveilig de perslucht- en zuurstoftanks goed.
- Serumfles cultuur sparging
- Etiketteer 500 ml geautoclaveerde serumflessen met monsteridentificaties, datum / tijd van inenting en doelzuurstofpercentage.
- Voeg in een biologische kap 24 ml van het kunstmatige sputummedium toe aan elke serumfles die wordt opgezet.
- Voeg 1 ml van het sputum van de patiënt gehomogeniseerd met een naald van 18 G (indien nodig verdund met steriele zoutoplossing om voldoende monstervolume voor elke kweekconditie te verkrijgen) toe aan elke serumfles.
- Gebruik een steriel pincet en plaats de geautoclaveerde rubberen stoppen op de bovenkant van elke serumfles.
- Druk de rubberen stoppen naar beneden, zorg ervoor dat u de onderkant van de stop niet met de handen aanraakt.
- Haal de flessen van de kap, breng de aluminium afdichtingen aan en krimp ze. Verwijder het middenstuk van de afdichtingen.
- Veeg de bovenkant van flessen af met een alcoholdoekje en haal ze door een Bunsen-brandervlam.
- Bevestig een steriele naald van 18 G op een zuigerloze spuit met een filter. Steek deze gasafgifte eerst in de fles.
- Bevestig een steriele 18-G naald op de gasafgifte van het systeem en steek de gasafgiftever ook in de fles.
- Leid de T-splitsingen van de tanks door de zuurstofmonitor. Controleer of de beoogde zuurstofconcentratie door het systeem stroomt. Richt u op ongeveer 5 l/min gasstroom.
- Leid de T-splitsingen van de tanks om naar de gasafgifte. Het gas begint door de serumfles te stromen.
LET OP: Let goed op de manometer tijdens het zuurstofsparen. Als de druk onverwacht toeneemt, sluit u het systeem onmiddellijk uit. - Laat de zuurstofspaan gedurende 1 min door de serumfles lopen. Bij 5 L/min zorgt dit voor 10 luchtuitwisselingen en zorgt ervoor dat de interne atmosfeer de gewenste partiële druk bereikt.
- Verwijder de gasafgifte 18-G naald.
- Laat de druk in de serumfles opbouwen tot +1 atmosfeer (2 atmosferen op zeeniveau) en verwijder vervolgens onmiddellijk de gasafgiftever.
OPMERKING: Het handhaven van druk helpt bij het vasthouden van hyperoxische omstandigheden in de loop van de tijd. - Plaats de serumfles in een incubator shaker van 37 °C bij 150 RPM. Incubeer de monsters gedurende drie intervallen van 24 uur. Neem bij elk interval van 24 uur een aliquot voor downstream-analyse, spaar de monsters opnieuw en breng ze terug naar incubatie voor een totale incubatietijd van 72 uur.
- Uitstroom zuurstofmeting
- Kalibreer de zuurstofmeter op 21% perslucht en schakel vervolgens de tank uit.
- Leid de inname van de serumfles door de zuurstofmonitor en bevestig een steriele naald aan het uiteinde.
- Steek de naald door de rubberen stop in de serumfles.
- Wacht tot de uitstroommeting is gestabiliseerd. Een laag debiet uit de serumflessen betekent dat dit tot 2 minuten kan duren. Rapporteer het piekverschil met kamerlucht (aantal het verst van 21%).
- Als u meerdere metingen uitvoert, spoelt u het systeem tussen de metingen door met perslucht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze protocollen werden toegepast op 50 slijmoplossende sputummonsters van pwCF die zich presenteerden voor routinezorg aan een poliklinische cystic fibrosis-kliniek in het Massachusetts General Hospital in Boston, Massachusetts. Het sputum van elke patiënt werd gekweekt onder 21%, 50% en 100% zuurstofcondities met behulp van het kunstmatige sputummedium, met 0,5 ml aliquots uit elke cultuur na 24 uur, 48 uur en 72 uur kweektijd voor testen. Culturen werden gefotografeerd wanneer extracties werden gemaakt om visuele veranderingen te volgen. Bovendien werd voorafgaand aan het kweken een aliquot van 0,5 ml van elk primair sputummonster genomen. Dit resulteerde in 10 discrete monsters per patiënt en een uiteindelijke N van 500 monsters. Hiervan onderging sputum van 11 patiënten (11 ongecultiveerde sputa, 11 gekweekte sputa van 21% zuurstof bij 48 uur incubatie) nucleïnezuurextractie17, sequencingbibliotheken werden gegenereerd met behulp van een commerciële DNA-bibliotheekvoorbereidingskit en metagenomische sequencing werd uitgevoerd op een platform voor volledige genoomsequencing gericht op ~ 5 Gb sequentie per monster met 150 basenpaar, paired-end leest. Ruwe metingen werden verwerkt met behulp van de bioBakery suite van tools18, waaronder kwaliteitscontrole en verwijdering van menselijke "contaminant" sequenties en taxonomische profilering met de MetaPhlAn3 profiler19. Op het moment van nucleïnezuurextractie werden 10 miljoen cellen van Imtechella halotolerans, een halotolerante soort die normaal wordt aangetroffen in estuariumecosystemen en niet in menselijke microbiële gemeenschappen, in elk monster geprikt, waardoor de absolute microbiële belasting voor elk monster kan worden gekwantificeerd20.
Figuur 2 toont individuele en gemiddelde zuurstofmetingen en pH-waarden in de loop van het kweekproces voor 50 sputummonsters gekweekt onder elke zuurstofconditie en een voorbeeld van een visueel differentieel cultuurfenotype. De culturen werden bij 37 °C gehouden, behalve tijdens korte perioden waarin het sparen en verwijderen van monsters werd uitgevoerd. Met beide spaarintervallen van 12 uur en 24 uur werden verhoogde zuurstofconcentraties gehandhaafd, hoewel een daling in de loop van de tijd werd waargenomen voor alle drie de zuurstofcondities, waarbij 100% zuurstof daalde tot ongeveer 85%, 50% zuurstof daalde tot 40% en 21% zuurstof daalde tot 18%. De zuurstofcondities bleven verschillend en belangrijk is dat verhoogde zuurstofconcentraties gedurende het hele proces voor hyperoxische monsters werden gehandhaafd. pH-metingen toonden een grotere mate van variabiliteit, maar bleven ruim binnen een fysiologisch normaal bereik zonder statistisch significante veranderingen in de tijd. Deze metingen geven aan dat deze methoden discrete differentiële zuurstofcondities handhaven gedurende het hele kweekproces. Ten slotte wordt een voorbeeld getoond van een van de vele visuele cultuurfenotypen die differentieerden in zuurstofconcentratie. Dit monster had merkbare troebelheidsverschillen na 72 uur cultuur, met hogere zuurstof geassocieerd met lagere visuele troebelheid. Differentiële cultuurfenotypen ondersteunen de aanwezigheid van door hyperoxie geïnduceerde effecten op cultuurgemeenschappen.
Figuur 3 vergelijkt microbiële belasting, microbiële diversiteit en microbiële gemeenschapssamenstelling tussen ongecultiveerd sputum en gekweekt sputum (21% zuurstofconditie gedurende een periode van 48 uur). Metingen onthullen dat het enige grote verschil dat door de teelt wordt geïntroduceerd, een ongeveer 20-voudige toename van de microbiële belasting is in vergelijking met ongecultiveerd sputum. Het immuunsysteem en de typische mechanische sputumklaringsmechanismen zoals hoesten dienen normaal gesproken als een regulerend proces dat de microbiële belasting in de longen beperkt, zelfs in gevallen van disfunctie en infectie zoals die worden gezien bij pwCF. Ex vivo cultuur heeft dergelijke regulerende mechanismen niet en microbiële gemeenschappen zijn in plaats daarvan vrij om door te gaan naar cellulaire verzadiging. Alfa- en bètadiversiteitsstatistieken geven aan dat ondanks dit verschil in microbiële belasting, de onderliggende samenstelling van de gemeenschap goed bewaard blijft, met minimale wereldwijde verschillen die door het kweekproces worden geïntroduceerd.
Figuur 4 gaat dieper in op de vergelijking tussen ongekweekte en gekweekte sputummonsters, waarbij wordt gekeken naar de binaire aan-/afwezigheid van de 120 microbiële soorten die definitief zijn geïdentificeerd door shotgun metagenomics sequencing van gekweekt en ongecultiveerd sputum verkregen van 11 patiënten. Microben zijn geclusterd op basis van fylogenetische overeenkomsten. 46 (38,3%) van deze soorten werden geïdentificeerd in zowel ongekweekte als gekweekte monsters (cyaankleur), terwijl 35 (29,2%) uitsluitend werden geïdentificeerd in niet-gekweekte monsters (geel) en 39 (32,5%) uitsluitend werden geïdentificeerd in gekweekte monsters (blauw). Het is waarschijnlijk dat er een grotere pariteit is dan wat we hebben geïdentificeerd met behulp van sequencing in termen van wat aanwezig is en wat afwezig is, maar sommige taxa vallen in sommige gevallen onder de detectiedrempel voor sequencing. De verschillen geven wel aan dat het kweekproces enige vooringenomenheid introduceert in gekweekt ten opzichte van ongecultiveerd sputum. Met name het kweken verhoogt de aanwezigheid van schimmels zoals Candida en Aspergillus, evenals Enterobacterales-leden, waaronder Escherichia, Serratiaen Streptococcus-leden. Omgekeerd waren Bacteroidetes-leden zoals Prevotella en Clostridiales, die anaëroben zijn, aanwezig in niet-gekweekte monsters, maar niet aanwezig in gekweekte monsters. Dit kan worden toegeschreven aan het ontbreken van een anaerobe aandoening in ons experimentele model.
Figuur 5 toont op absorptie gebaseerde groeicurven van veel voorkomende CF-longpathogenen geïsoleerd uit sputum verkregen uit 50 verschillende pwCF. Deze isolaten vertegenwoordigen fenotypisch verschillende klinische isolaten verkregen met behulp van verrijkingscultuurprocedures van het Massachusetts General Hospital Clinical Microbiology Laboratory, en omvatten Pseudomonas aeruginosa (N = 53), Staphylococcus aureus (N = 37), Stenotrophomonas maltophilia (N = 12), Klebsiella pneumoniae (N = 3) en Achromobacter sp (N = 7). Groeicurven werden verkregen door elk isolaat te kweken in kunstmatige sputummedia bij 37 °C in het donker, waarbij ASM zonder bacteriële inenting als negatieve controle diende. De transparante kwaliteit van ASM (die te wijten is aan filter in plaats van warmtesterilisatie) maakt het mogelijk om optische metingen uit te voeren om groeicurven te schatten. Optische metingen bij 600 nm (OD600) werden elke 10 minuten genomen en de eerste 24 uur van elke curve worden weergegeven. De afwezigheid van veranderingen in optische metingen in de negatieve controle met alleen ASM duidt op culturen zonder verontreiniging. De hier getoonde demonstratieve curven volgen typische groeicurvepatronen die de levensvatbaarheid van dit ASM-recept aangeven als medium voor de op absorptie gebaseerde generatie van groeicurven.
| Kolom 1 | Kolom 2 | Kolom 3 | Kolom 4 | Kolom 5 | Kolom 6 | Kolom 7 | Kolom 8 | Kolom 9 | |
| Waarde | Comstock | Kirchner | Sriramulu · | Palmer | Flynn | Gallagher | Lai | Bron | |
| Mucine | 2% w / v | 0,5% w / v | 0,5% w / v | - | 1% w / v | 2% w / v | 1% w / v | Flynn | |
| Tafelzout | 85,5 mM | 85,5 mM | 85,5 mM | 66,6 mM | 89,8 mM | 85,5 mM | 152,3 mM | Lapierre · | |
| Kaliumchloride | 29,5 mM | 29,5 mM | 29,5 mM | 15,8 mM | - | 2,95 mM | 15,8 mM | Palmer | |
| Magnesiumsulfaat | - | - | - | 0,6 mM | 1mm | 1mm | 0,61 mM | Palmer | |
| IJzersulfaat | - | - | - | 0,0036 mM | - | - | - | - | |
| Ammoniumchloride | - | - | - | 2,3 mM | 60 meter | - | - | - | |
| Monokaliumfosfaat | - | - | - | 2,5 mM | 60 meter | - | - | - | |
| Glucose | - | - | - | 3,2 mM | 13 meter | 40 meter | 0,7 mM | Sambeek | |
| Lactaat | - | - | - | 9 meter | - | - | - | - | |
| Essentiële aminozuren | 14,45x | 0,25 g/l | 0,25 g/l | Per zuur | 0,5x | 0,375x | 1,29x | Palmer | |
| Niet-essentiële aminozuren | 28,9x | 0,25 g/l | 0,25 g/l | Per zuur | 0,25x | 0,5x | 8,01x | Palmer | |
| Vitaminen | - | - | - | - | - | 1x | 1x | Gallagher | |
| Sporenmetalen | - | - | - | - | 1x | 1x | 1x | Flynn | |
| Eigeel | 0.25% | 0.25% | 0.25% | - | - | 0.25% | 0.25% | Kirchner | |
| Ferritine | 0,0003 g/L | - | - | - | - | 0,0004 g/L | 0,0004 g/L | Gallagher | |
| Zalm Sperma DNA | 1,4 g/l | 4 g/l | 4 g/l | - | - | 1,4 g/l | - | - | |
| Dpta | - | - | 0,0059 g/L | - | - | - | - | - | |
| Ph | - | 6.9 | - | 6.8 | - | - | 6.3 | Lapierre · | |
| Opslag | 0 | 4° | - | - | 4° | 4° | 4° | Kirchner | |
| Sterilisatie | Autoclaaf | Filter | Autoclaaf | - | Autoclaaf | Autoclaaf | Filter | Kirchner | |
Tabel 1: Recept voor kunstmatig sputummedium afgeleid van literatuuronderzoek. (Kolom 1) Reagentia en sleutelwaarden bij de formulering van kunstmatig sputummedium. (Kolommen 2-7) Vergelijking van recepten uit bestaande literatuur8,9,10,12,14,15. (Kolommen 8-9) Kunstmatig sputum medium recept gedetailleerd in dit protocol en de overeenkomstige bronnen die elke geselecteerde waarde10,11,12,13,14,15informeerden.
| Kolom 1 | Kolom 2 | Kolom 3 |
| CF Sputum | ASM | |
| Totaal aminozuren | 10,25 mM | 10,76 mM |
| Alanine | 0,96 mM | 0,80 mM |
| Arginine | 0,17 mM | 0,94 mM |
| Asparagine | 0,91 mM | |
| Asparaginezuur | 0,45 mM | 0,80 mM |
| Cysteïne | 0,09 mM | 0,33 mM |
| Glutaminezuur | 0,84 mM | 0,80 mM |
| Glycine | 0,65 mM | 0,80 mM |
| Histidine | 0,28 mM | 0,35 mM |
| Isoleucine | 0,60 mM | 0,52 mM |
| Leucine | 0,87 mM | 0,52 mM |
| Lysine | 1,15 mM | 0,64 mM |
| Methionine | 0,34 mM | 0,13 mM |
| Ornithine | 0,36 mM | |
| Fenylalanine | 0,29 mM | 0,26 mM |
| Proline | 0,90 mM | 0,80 mM |
| Serine | 0,78 mM | 0,80 mM |
| Threonine | 0,58 mM | 0,52 mM |
| Tryptofaan | 0,07 mM | 0,06 mM |
| Tyrosine | 0,43 mM | 0,26 mM |
| Valine | 0,60 mM | 0,52 mM |
Tabel 2: Aminozuurconcentraties die eerder zijn beschreven in cystic fibrosis sputum en in kunstmatig sputum medium recept gedetailleerd in dit protocol. (Kolom 1) Belangrijke aminozuren. (Kolom 2) Aminozuurconcentraties van sputum van mensen met cystische fibrose12. (Kolom 3) Aminozuurconcentraties in kunstmatig sputummedium beschreven in dit protocol
Figuur 1: Aansluitschema van componenten van het zuurstofsparende systeem. Stroomdiagram van de verbindingen tussen componenten van het systeem dat wordt gebruikt om serumflessen te sparren tot gewenste zuurstofconcentraties tussen 21% en 100%. Het systeem heeft 3 gebruiksmodi die worden bepaald door de positie van de twee T-junctiekleppen. Het systeem kan gas uit de tanks leiden via de gasafgifte of via de zuurstofpercentagemonitor, evenals uitstroomgas van eerder gesproeide serumflessen door de monitor leiden om de concentratie te controleren nadat de tijd is verstreken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De beoogde zuurstofconcentraties worden ongeveer gehandhaafd met zowel 12 h als 24 h sparging intervallen, en de pH blijft in het fysiologische bereik tijdens het kweken. (A) Zuurstofmetingen uit de uitstroom van 12 h en 24 h zuurstofsparende intervallen over een periode van 72 h. (B) pH-metingen voor monsters gemeten om de 24 uur. (C) Een voorbeeldafbeelding van gekweekt monster CFB010 na 72 uur, met differentiële troebelheid tussen zuurstofconcentraties. De kleur geeft het beoogde zuurstofpercentage aan; foutbalken geven 95% betrouwbaarheidsintervallen aan. Kritische drempels worden benadrukt met stippellijnen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Kweken verhoogt de microbiële belasting, maar de onderliggende samenstelling van de gemeenschap blijft behouden. Ongekweekt sputum (geel) en gekweekt sputum (blauw) met behulp van kunstmatig sputummedium bij 21% zuurstof gedurende 48 uur. Aliquots ondergingen nucleïnezuurextractie en shotgun metagenomics sequencing om mogelijke bias geïntroduceerd door kweekomstandigheden te detecteren. (A) Absolute microbiële belasting (bepaald door spike-in controles) en alfa-diversiteitsmetrieken. Met behulp van lineaire gemengde effectenmodellen voorspelde ongecultiveerd versus gekweekt sputum microbiële belasting, maar geen alfadiversiteit. (B) Wijding van de eerste twee componenten van bètadiversiteitsmetingen, controlerend op verschil in microbiële belasting. Geen significant verschil in beide metrieken na PERMANOVA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: De meerderheid van de geïdentificeerde taxa zijn aanwezig in zowel bronsputum als cultuur, terwijl andere alleen voorkomen in bronsputum of cultuur. Shotgun metagenomics sequencing gebruikt om verschillen in microbiële gemeenschapssamenstelling tussen ongecultiveerde en gekweekte sputummonsters te vergelijken. Fylogenetische boom van alle geïdentificeerde microbiële soorten in gesequencede monsters (N = 120). Soorten gemarkeerd met geel (N = 35, 29,2%) werden alleen gezien in niet-gekweekte sputummonsters. Soorten gemarkeerd met blauw (N = 39, 32,5%) werden alleen gezien in kunstmatige sputum medium kweekmonsters. Soorten gemarkeerd met cyaan (N = 46, 38,3%) werden gezien in zowel niet-gekweekte als gekweekte monsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Kunstmatig sputummedium is voldoende transparant om te worden gebruikt als groeicurvemedium voor het kweken van klinische isolaten. Optimale dichtheidsmetingen bij 600 nm werden elke 10 minuten genomen en de eerste 24 uur van elke curve worden weergegeven. Grijze lijnen vertegenwoordigen individuele metingen en oranje lijnen vertegenwoordigen de gemiddelde absorptie voor elk taxon. Kunstmatige sputum medium blanco inbegrepen als een controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie werd een in vitro model ontwikkeld om het effect van hyperoxie op microbiële longgemeenschappen te bestuderen. Dit model, gebaseerd op kunstmatig sputummedium en dagelijks sparen van serumflessen, handhaaft verhoogde zuurstofconcentraties en ondersteunt de groei van microben geïdentificeerd in sputum van pwCF.
Er zijn verschillende kritische stappen van deze aanpak. Ten eerste is de keuze om filtersterilisatie te gebruiken in plaats van warmtesterilisatie van het kunstmatige sputummedium. Filtersterilisatie voorkomt denaturering van mucine en andere warmtegevoelige componenten van het medium en levert een helder medium op dat kan worden gebruikt voor optische metingen van microbiële groei. Hoewel filtersterilisatie is voorgesteld in andere protocollen10, hebben we ontdekt dat de toevoeging van orbitaal schudden tijdens het filtratieproces essentieel was om verstopping van het filter te voorkomen die anders optrad wanneer een minimale hoeveelheid van het bereide medium was gefilterd. Hoewel het gefilterde kunstmatige sputummedium een lager dan beoogde uiteindelijke mucineconcentratie kan hebben als gevolg van mucine-impactie in het filter, is aangetoond dat sputum van pwCF lagere mucineconcentraties heeft dan sputum van mensen zonder cystische fibrose21. De startmucineconcentratie van 1% die in dit protocol wordt gebruikt, is hoger dan in andere benaderingen die filtersterilisatie hebben gebruikt, waarbij één groep een startmucineconcentratie van 0,5%10gebruikt, terwijl typische recepten mucineconcentraties gebruiken variërend van 0,5% -2%(tabel 1). Dus zelfs met een verlies van mucine in het filtersterilisatieproces, heeft het uiteindelijke medium dat met behulp van dit protocol wordt bereid waarschijnlijk mucineconcentraties binnen het fysiologische bereik22.
De tweede is de samenstelling van kunstmatig sputummedium. Het recept voor kunstmatig sputummedium werd gekozen op basis van bestaande fysiologische studies van sputum van pwCF (tabel 1). Met behulp van shotgun metagenomics sequencing konden we verifiëren dat sputum gekweekt met dit kunstmatige sputummedium in grote lijnen de microbiële gemeenschapssamenstelling van ongecultiveerd sputum samenvat(figuur 3). Bij normoxische omstandigheden ondersteunde dit medium ook de groei van 112 verschillende klinische isolaten die veel voorkomende pathogenen vertegenwoordigen die zijn geïsoleerd uit het sputum van patiënten met cystische fibrose. Deze gegevens tonen dus aan dat deze formulering van kunstmatig sputummedium de groei van luchtwegmicrobiota van pwCF ondersteunt. Zalm sperma DNA, een veel voorkomende toevoeging aan bestaande recepten (tabel 1), werd weggelaten. Een beoogde toepassing van dit model is metagenomics sequencing, en dus werd zalmsperma-DNA niet opgenomen om de toevoeging van niet-microbiële nucleïnezuren te verminderen, omdat deze metingen na sequencing zouden worden uitgefilterd, waardoor onze effectieve sequencingdiepte zou afnemen. Hoewel sputum van pwCF hoge concentraties extracellulair DNA23heeft , een aanzienlijk deel ervan is microbieel van oorsprong24, en het onduidelijk is of de toevoeging van zalmsperma-DNA aan het kunstmatige sputummedium het fysiologischer maakt of dat de kweekbenadering die in dit protocol wordt beschreven, leidt tot hoge niveaus van microbieel afgeleid extracellulair DNA; we hebben in onze studies geen onderscheid gemaakt tussen extra- en intracellulaire DNA-concentraties. Toekomstige studies willen mogelijk de concentratie van extracellulair DNA verifiëren die door deze kweekmethode wordt gegenereerd.
Ten derde, voor zover wij weten, hebben geen gepubliceerde studies over cystische fibrose long microbiële gemeenschappen hyperoxische aandoeningen aangepakt. Dit model maakt gebruik van goedkope en algemeen beschikbare apparatuur van algemene laboratorium- of ziekenhuisleveranciers om een zuurstofspaarsysteem te bouwen. Belangrijke overwegingen voor het behoud van hyperoxische omstandigheden zijn het volume van het kweekmedium ten opzichte van de beschikbare headspace in de serumflessen. In de eerste pogingen tijdens de protocolontwikkeling werden serumflessen van 125 ml gebruikt. Het gebruik van serumflessen van 500 ml (waardoor een headspace van 475 ml tot 25 ml cultuurverhouding mogelijk was) maakte het echter mogelijk om de gewenste concentratie tot 24 uur te behouden, waardoor de frequentie van zuurstofbesparing werd verminderd. Deze aanpak genereert discrete zuurstofcondities, waardoor de gelijktijdige kweek van verschillende patiëntmonsters over meerdere zuurstofcondities mogelijk is. Andere hulpmiddelen uit de anaerobe cultuur kunnen worden gebruikt voor hyperoxische cultuur, waaronder het gebruik van anaërobe potten of Balch-achtige buizen die met zuurstof zijn bespat. Analyses van longmicrobiële gemeenschappen met behulp van metagenomics sequencing geven aan dat de totale alfa- en bètadiversiteit vergelijkbaar zijn tussen gekweekt en ongecultiveerd sputum. Bij het evalueren van de differentiële abundantie op soortniveau, kweken met 21% zuurstof, verrijkt voor de groei van aerobes en facultatieve anaëroben, waaronder Enterobacterale, Streptococcus en schimmels. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de uitsluiting van een anaërobe aandoening die is waargenomen in de luchtwegen van pwCF25,26. Toekomstige studies zouden de opname van stikstofgas in dit model kunnen overwegen om een reeks anoxische en oxische omstandigheden en overeenkomstige aerobe en anaërobe microbiota in microbiële gemeenschappen in de luchtwegen te bestuderen.
De belangrijkste principes die in deze protocollen worden beschreven, kunnen leerzaam zijn voor het uitvoeren van vergelijkbare studies met betrekking tot de invloed van zuurstof op complexe microbiële gemeenschappen of veel voorkomende longpathogenen. Zuurstof is de meest voorkomende therapie die wordt gebruikt bij de behandeling van alle geavanceerde longziekten, en een beter begrip van hoe het kan leiden tot bijkomende onverwachte effecten op microbiële gemeenschappen in de luchtwegen en veel voorkomende respiratoire pathogenen zal belangrijk zijn voor de zorg voor pwCF en andere chronische longziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Een deel van dit werk werd uitgevoerd in het Marine Biological Lab met steun van het Marine Biological Lab, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (subsidienummer 5600373) en een gift van de Simons Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BME Vitamins (100x) Solution | MilliporeSigma | B6891 | Concentrated solution of supplemental vitamins. |
| Crimper, 30 mm | DWK Life Sciences | 224307 | Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles. |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | Solid glucose powder (dextrorotatory isomer). |
| Diaphragm Pump ME 2 NT | VACUUBRAND | 20730003 | Vacuum pump for vacuum filtration. |
| Egg Yolk Emulsion | HiMedia | FD045 | Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline. |
| Ferritin, Cationized from Horse Spleen | MilliporeSigma | F7879 | Ferritin (iron-storage protein) solution. |
| FIREBOY plus Safety Bunsen Burner | Integra Biosciences | 144000 | Bunsen burner with user interface and safety features. |
| Hydrion pH Paper (1.0–14.0) | Micro Essential Laboratory | 94 | pH testing paper for the range of 1.0–14.0. |
| Hydrion pH Paper (4.0–9.0) | Micro Essential Laboratory | 55 | pH testing paper for the range of 4.0–9.0. |
| Hydrion pH Paper (6.0–8.0) | Micro Essential Laboratory | 345 | pH testing paper for the range of 6.0–8.0. |
| Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G | Smiths Medical | 401815 | 18 G needles with safety caps. |
| In-Line Pressure Gauge | MilliporeSigma | 20469 | Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure. |
| Innova 42 Incubated Shaker | Eppendorf | 2231000756 | Combination incubator/orbital shaker. |
| Luer-Lok Syringe with Attached Needle | Becton Dickinson | 309580 | Combination 3 mL syringe and 18 G needle. |
| Luer Valve Assortment | World Precision Instruments | 14011 | Valves for gas flow tubing. |
| LSE Orbital Shaker | ThermoFisher Scientific | 6780-NP | Orbital shaker to agitate media during filtration. |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | MilliporeSigma | M2773 | Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate). |
| Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-346-15FM | Air flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| MEM Amino Acids (50x) Solution | MilliporeSigma | M5550 | Concentrated solution of essential amino acids. |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution | MilliporeSigma | M7145 | Concentrated solution of non-essential amino acids. |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | MilliporeSigma | SLMP25SS | 0.22 µm polyethersulfone membrane sterile syringe filter. |
| Milli-Q Academic | MilliporeSigma | ZMQS60E01 | Milli-Q sterile water filtration system. |
| MiniOX 3000 Oxygen Monitor | MSA | 814365 | Gas flow oxygen percentage monitor. |
| MOPS Buffer (1 M, pH 9.0) | Boston BioProducts | BBM-90 | MOPS buffer for adjusting media pH. |
| Mucin from Porcine Stomach | MilliporeSigma | M2378 | Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder. |
| Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit | Harvard Apparatus | 72-1413 | Connectors for gas flow tubing. |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Library preparation for identification during sequencing. |
| NovaSeq 6000 Sequencing System | Illumina | 770-2016-025-N | Shotgun sequencing platform for generating sample reads. |
| Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-540-15FM | Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors | SunMed | 2001-01 | Tubing for connecting gas system components. |
| Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 | Molecular Biologicals International | MRGF-6235 | Concentrated phosphate-buffered saline solution. |
| PC 420 Hot Plate/Stirrer | Marshall Scientific | CO-PC420 | Combination hot plate/stirrer. |
| Potassium Chloride | MilliporeSigma | P9541 | Solid potassium chloride salt. |
| PTFE Disposable Stir Bars | ThermoFisher Scientific | 14-513-95 | Disposable magnetic stir bars. |
| PTFE Thread Seal Teflon Tape | VWR | 470042-938 | Teflon tape for reinforcing gas system connections. |
| Q-Gard 2 Purification Cartridge | MilliporeSigma | QGARD00D2 | Purification cartridge for Milli-Q system. |
| Reusable Media Storage Bottles | ThermoFisher Scientific | 06-423A | Bottles for mixing and storing culture media. |
| Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl | DWK Life Sciences | 224100-331 | Rubber stoppers for serum bottles. |
| Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL | DWK Life Sciences | 223952 | Glass serum bottles for sealed culturing. |
| Small Bore Extension Set | Braun Medical | 471960 | Tubing extension with luer lock connectors. |
| Sodium Chloride | MilliporeSigma | S3014 | Solid sodium chloride salt. |
| Spike-in Control I (High Microbial Load) | ZymoBIOMICS | D6320 | Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations |
| Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System | MilliporeSigma | S2GPU02RE | 250 mL 0.22 µm vacuum filtration chamber. |
| Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes | Professional Disposables International | H04082 | Disposable germicidal wipes for sterilization. |
| Trace Metals Mixture, 1000x | ThermoFisher Scientific | NC0112668 | Concentrated solution of physiological trace metals. |
| Unlined Aluminum Seal, 30 mm | DWK Life Sciences | 224187-01 | Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers. |
| USP Medical Grade Air Tank | Airgas | AI USP200 | Compressed air tank for input to sparging system. |
| USP Medical Grade Oxygen Tank | Airgas | OX USP200 | Compressed oxygen tank for input to sparging system. |
References
- Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLoS One. 13 (3), 0194060 (2018).
- Acosta, N., et al. Sputum microbiota is predictive of long-term clinical outcomes in young adults with cystic fibrosis. Thorax. 73 (11), 1016-1025 (2018).
- Muhlebach, M. S., et al. Initial acquisition and succession of the cystic fibrosis lung microbiome is associated with disease progression in infants and preschool children. PLoS Pathogens. 14 (1), 1006798 (2018).
- Zolin, A., Bossi, A., Cirilli, N., Kashirskaya, N., Padoan, R. Cystic fibrosis mortality in childhood. Data from European cystic fibrosis society patient registry. International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (9), (2018).
- Ramos, K. J., et al. Heterogeneity in survival in adult patients with cystic fibrosis with FEV1 30% of predicted in the United States. Chest. 30 (6), 1320-1328 (2017).
- Ramos, K. J., et al. Predictors of non-referral of patients with cystic fibrosis for lung transplant evaluation in the United States. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (2), 196-203 (2016).
- Girardis, M., et al. Effect of conservative vs conventional oxygen therapy on mortality among patients in an intensive care unit: The Oxygen-ICU randomized clinical trial. JAMA. 316 (15), 1583-1589 (2016).
- Comstock, W. J., et al. The WinCF model - An inexpensive and tractable microcosm of a mucus plugged bronchiole to study the microbiology of lung infections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55532 (2017).
- Diraviam Dinesh, S.
- Kirchner, S., et al. Use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against Pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3857 (2012).
- Grandjean Lapierre, S., et al. Cystic fibrosis respiratory tract salt concentration: An Exploratory Cohort Study. Medicine. 96 (47), Baltimore. 8423 (2017).
- Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
- Van Sambeek, L., Cowley, E. S., Newman, D. K., Kato, R. Sputum glucose and glycemic control in cystic fibrosis-related diabetes: a cross-sectional study. PLoS One. 10 (3), 0119938 (2015).
- Flynn, J. M., Niccum, D., Dunitz, J. M., Hunter, R. C. Evidence and role for bacterial mucin degradation in cystic fibrosis airway disease. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005846 (2016).
- Gallagher, T., et al. Liquid chromatography mass spectrometry detection of antibiotic agents in sputum from persons with cystic fibrosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 65 (2), (2021).
- Voynow, J. A., Rubin, B. K.
- Sui, H. Y., et al. Impact of DNA extraction method on variation in human and built environment microbial community and functional profiles assessed by shotgun metagenomics sequencing. Frontiers in Microbiology. 11, 953 (2020).
- McIver, L. J., et al. bioBakery: a meta'omic analysis environment. Bioinformatics. 34 (7), 1235-1237 (2018).
- Truong, D. T., et al. MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling. Nature Methods. 12 (10), 902-903 (2015).
- Stammler, F., et al. Adjusting microbiome profiles for differences in microbial load by spike-in bacteria. Microbiome. 4 (1), 28 (2016).
- Henke, M. O., Renner, A., Huber, R. M., Seeds, M. C., Rubin, B. K. MUC5AC and MUC5B mucins are decreased in cystic fibrosis airway secretions. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 86-91 (2004).
- Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyper concentration and increased osmotic pressure. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3047-3060 (2014).
- Matthews, L. W., Spector, S., Lemm, J., Potter, J. L. Studies on pulmonary secretions. I. The over-all chemical composition of pulmonary secretions from patients with cystic fibrosis, bronchiectasis, and laryngectomy. American Review of Respiratory Disease. 88, 199-204 (1963).
- Ibanez de Aldecoa, A. L., Zafra, O., Gonzalez-Pastor, J. E. Mechanisms and regulation of extracellular DNA release and its biological roles in microbial communities. Frontiers in Microbiology. 8, 1390 (2017).
- Tunney, M. M., et al. Detection of anaerobic bacteria in high numbers in sputum from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (9), 995-1001 (2008).
- Worlitzsch, D., et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Investigation. 109 (3), 317-325 (2002).
