Summary
Målet med detta protokoll är att utveckla ett modellsystem för effekten av hyperoxia på cystisk fibros luftvägarna mikrobiella samhällen. Konstgjorda sputum medium efterliknar sammansättningen av sputum, och hyperoxic kultur villkor modellera effekterna av kompletterande syre på lung mikrobiella samhällen.
Abstract
Luftvägarna mikrobiella samhällen tros spela en viktig roll i utvecklingen av cystisk fibros (CF) och andra kroniska lungsjukdomar. Mikrober har traditionellt klassificerats baserat på deras förmåga att använda eller tolerera syre. Extra syre är en vanlig medicinsk terapi som ges till personer med cystisk fibros (pwCF); Befintliga studier på syre och luftvägsmikrobiomet har dock fokuserat på hur hypoxi (lågt syre) snarare än hyperoxi (högt syre) påverkar de övervägande aeroba och fakultetsmässiga anaeroba lungmikrobiella samhällena. För att ta itu med denna kritiska kunskapslucka utvecklades detta protokoll med hjälp av ett artificiellt sputum medium som efterliknar sammansättningen av sputum från pwCF. Användningen av filtersterilisering, som ger ett transparent medium, gör det möjligt för optiska metoder att följa tillväxten av encelliga mikrober i suspensionskulturer. För att skapa hyperoxiska förhållanden utnyttjar detta modellsystem etablerade anaeroba odlingstekniker för att studera hyperoxiska förhållanden; Istället för att avlägsna syre tillsätts syre till kulturer genom daglig sparning av serumflaskor med en blandning av komprimerat syre och luft. Sputum från 50 pwCF genomgick daglig sparging under en 72-h period för att verifiera förmågan hos denna modell att upprätthålla differentiella syreförhållanden. Hagelgevär metagenomisk sekvensering utfördes på odlade och uncultured sputum prover från 11 pwCF att verifiera förmågan hos detta medium att stödja tillväxten av commensal och patogena mikrober som ofta finns i cystisk fibros sputum. Tillväxt kurvor erhölls från 112 isolat erhålls från pwCF att verifiera förmågan hos detta konstgjorda sputum medium att stödja tillväxten av gemensamma cystisk fibros patogener. Vi finner att denna modell kan odla en mängd olika patogener och commensals i CF sputum, återhämtar ett samhälle som mycket liknar uncultured sputum under normoxic villkor, och skapar olika kultur fenotyper under varierande syre villkor. Detta nya tillvägagångssätt kan leda till en bättre förståelse av oförutsedda effekter som orsakas av användning av syre i pwCF på luftvägarna mikrobiella samhällen och gemensamma luftvägarna patogener.
Introduction
Cystisk fibros (CF) är en genetisk sjukdom som kännetecknas av en oförmåga att rensa tjock slem från lungorna, vilket leder till upprepade infektioner och progressiv lungfunktionsnedgång som ofta resulterar i behovet av lungtransplantation eller död. Luftvägsmikrobiomet hos personer med cystisk fibros (pwCF) verkar spåra sjukdomsaktivitet1, med en minskning av mikrobiell mångfald i samband med negativa långsiktiga resultat2,3. I kliniska studier av pwCF har kompletterande syreterapi associerats med mer avancerad sjukdom4,5, men traditionellt har användningen av syreterapi setts som helt enkelt en markör för sjukdomens svårighetsgrad6. Nyligen genomförda studier från en klinisk studie av patienter med andningssvikt har visat att högre patientens syrenivåer paradoxalt nog är förknippade med en ökning av allvarliga bakterieinfektioner och högre dödlighet7, vilket tyder på att extra syre kan bidra till sjukdomspatogenes. Effekten av extra syre på cystisk fibros lung mikrobiom och tillhörande lung- och luftvägarna mikrobiella samhällen har inte studerats väl.
Mekanistiska studier kan ofta inte utföras direkt på mänskliga ämnen på grund av logistiska svårigheter och potentiella etiska frågor i samband med interventioner av okänd medicinsk nytta eller skada. Translationella metoder som integrerar mänskliga biospecimens i modellsystem kan erbjuda viktiga biologiska insikter i dessa fall. Medan förmågan att använda eller tolerera syre traditionellt har varit en viktig komponent i mikrobiell klassificering, är lite känt om hur den terapeutiska introduktionen av extra syre till miljön kan störa luftvägarna mikrobiella samhällen. För att belysa de okända effekterna av extra syre på pwCF:s luftvägsmikrobiomer behövde vi ta itu med två stora utmaningar. För det första skapandet av ett odlingsmedium som fysiologiskt approximerar sammansättningen av CF sputum; För det andra, skapandet av ett modellsystem som gör det möjligt att upprätthålla förhöjda syrekoncentrationer i kulturen under längre tidsperioder.
Konstgjorda sputum media (ASM) används ofta för att efterlikna lung sputum ex vivo8,9,10, men det finns ingen tydlig konsensus om ett specifikt recept. Detta protokoll beskriver en konstgjord sputum medium recept och beredning strategi noggrant utformad för fysiologiskt approximim sputum från pwCF. I tabell 1 beskrivs de valda receptvärdena baserat på publicerad litteratur. Grundläggande kemiska komponenter och pH matchades med värden som identifierats genom studier av human CF sputum11,12,13. Låg koncentration fysiologiska näringsämnen tillsattes med äggula, som inkluderades som 0,25% av den slutliga volymen10, liksom vitamin och spårmetallblandningar14,15. Mucin, nyckelkomponenten i sputum16, inkluderades vid 1% w/v14. Även om det var mer arbetsintensivt valdes filtersterilisering över den mer konventionella metoden med värmesterilisering för att minska potentiella problem från värmeinducerad denaturering av väsentliga mediekomponenter10. En ytterligare fördel med filtersterilisering är att det genererar media som är transparenta (värmesterilisering kan skapa grumliga medier på grund av utfällning och koagulering av salter och proteiner), vilket gör att detta konstgjorda sputummedium kan användas för att följa mikrobiell tillväxt baserat på ökningar av grumlighet.
Detta modellsystem för den hyperoxiska kulturen är baserat på anaeroba odlingstekniker där syre tillsätts snarare än avlägsnas, vilket skapar en modell för effekten av kompletterande syreanvändning för pwCF. Figur 1 och det tillhörande syresparningsprotokollet beskriver komponenterna i ett syresparsystem, som kan erhållas till låg kostnad från allmänna laboratorie- och sjukhusleverantörer. Detta system möjliggör blandning av komprimerat syre och luft till fasta koncentrationer som sträcker sig från 21%-100% syre. Integreringen av en syresensor möjliggör verifiering av koncentrationen av utgångsgasblandningen, samt kontroll av utflödesgassammansättningen hos tidigare spargade serumflaskor för att verifiera att syreförhållandena har hållits inom önskat intervall.
Detta protokoll beskriver förfaranden för att skapa ett artificiellt sputum medium, konstruktion och användning av ett syre sparging system, och tillämpningen av båda att odla CF sputum under differentiella syreförhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie fick godkännande från Partners Institutional Review Board (protokoll # 2018P002934). Inklusionskriteriumet inkluderade vuxna patienter med cystisk fibros som gav skriftligt informerat samtycke till studien. Det fanns inget uteslutningskriterium. Enligt protokoll riktlinjer samlades alla sputum prover från patienter med cystisk fibros under ett planerat öppenvårdsbesök med sin kliniska leverantör.
1. Konstgjord Sputum Medium Förberedelse
OBS: De kvantiteter som anges här är för produktion av 1 L slutligt artificiellt sputummedium och antar de specifika reagenser som anges i materialtabellen. Siffrorna skall justeras för andra volymer eller för användning av olika reagenser för att säkerställa samma slutprodukt. Se tabell 1 för målkoncentrationer.
- Konstgjord sputum kemisk blandning (ASCM)
OBS: ASCM utgör 25% av den slutliga medelvolymen. Den är hyllstabil och kan beredas i bulk eller i förväg. Om du är förberedd för senare användning, autoklav den kemiska blandningen och förvara den säkert i rumstemperatur.- Blanda de ingående kemiska lagerlösningarna.
- Förbered 1 M NaCl-buljong: Tillsätt 58,44 g NaCl per liter sterilt vatten.
- Förbered 1 M KCl-buljong: Tillsätt 74,55 g KCl per liter sterilt vatten.
- Förbered 1 M MgSO4-buljong: Tillsätt 246,47 g MgSO4·7H2O per liter sterilt vatten, eller 120,37 g vattenfri MgSO4 per liter sterilt vatten.
- Förbered 1 M glukosbuljong: Tillsätt 180,16 g glukos per liter sterilt vatten.
- Autoklav steriliserar de kemiska lagerlösningarna, samt en tom 250 ml flaska. Utför autoklavingstegen till minst standardvärdena 121 °C och 15 PSI i 30 minuter.
- Tillsätt 80,59 ml sterilt vatten till den tomma 250 ml-flaskan.
- Tillsätt 152,30 ml 1 M NaCl-lager till blandningen.
- Tillsätt 15,8 ml 1 M KCl-lager till blandningen.
- Tillsätt 610 μL 1 M MgSO4-buljong till blandningen.
- Tillsätt 700 μL 1 M glukosbuljong till blandningen.
- Blanda de ingående kemiska lagerlösningarna.
- Konstgjord sputum mucin mix (ASMM)
OBS: ASMM utgör 50% av den slutliga medelvolymen. Se till att den är förberedd samma dag som den slutliga mellansatsen.- Tillsätt 450 ml sterilt vatten till en tom 1 L-flaska.
- Tillsätt 50 ml 10x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till flaskan.
- Tillsätt en engångsmagnetisk omrörning till flaskan.
- Autoklav flaskan som innehåller PBS och omrörningsstången.
- Mät ut 10 g mucinpulver och tillsätt det till PBS.
- Skaka flaskan kraftigt för preliminär blandning.
- Placera flaskan på en kokplatta med magnetomrörare. Ställ in värmen på medelhög inriktning 50 °C och omrörningshastigheten till 1100 varv/min. Öka hastigheten gradvis så att stången inte flyger av magneten.
- Låt värmas upp och rör om i 15 minuter.
- Plocka upp flaskan med värmebeständiga handskar. Kontrollera om mucinpulvret sätter sig ur lösningen.
- Om mucinpulvret inte är helt upplöst, sätt tillbaka flaskan till värme/omrörare i 5 minuters intervall tills den är helt upplöst.
- Låt mucinblandningen svalna till rumstemperatur.
- Konstgjord sputum biologisk blandning (ASBM)
OBS: ASBM är 25% av den slutliga medelvolymen. Förbered den på samma dag som den slutliga mellansatsen, och till skillnad från de andra blandningarna, utsätt inte dess komponenter för någon värme.- Tina 100x vitaminbuljong i ett kylskåp på 4 °C eller på is.
OBS: Förportionera vitaminlagret i 10 ml alikvoter för att minimera antalet frysnings-/upptiningscykler. - Tillsätt 124,24 ml sterilt vatten till den tomma autoklaverade 250 ml-flaskan.
- Tillsätt 25,76 ml 50x essentiell aminosyrabuljong till blandningen.
- Tillsätt 80,14 ml 100x icke-essentiell aminosyrabuljong till blandningen.
- Tillsätt 10 ml (tinat) 100x vitaminbuljong till blandningen.
- Tillsätt 1 ml 1000x spårmetalllager till blandningen.
- Tillsätt 8,33 ml 30% äggulamulsion till blandningen.
- Tillsätt 400 μL 10 g/L ferritinbuljong till blandningen.
- Blanda lösningen väl genom manuell skakning.
- Tina 100x vitaminbuljong i ett kylskåp på 4 °C eller på is.
- Artificiellt sputummedium (ASM)
- Tillsätt 250 ml ASCM till 1 L-flaskan som innehåller ASMM.
- Tillsätt 250 ml ASBM till mediumflaskan.
- Titrera mediet med grundläggande MOPS-buffert (1 M) för att nå ett pH-pH på 6,3 på ett smalt pH-papper. Före titrering kommer mediumblandningen att vara för sur.
- Kyl det resulterande konstgjorda sputummediet vid 4 °C tills det är klart för filtrering.
- För att starta filtreringsprocessen, överför 200 ml ofiltrerat artificiellt sputummedium till ett vakuumfiltreringssystem med ett 0,22 μm porstorleksfilter.
- Anslut filtreringssystemet till vakuumpumpen, slå på vakuumpumpen, ställ in den på 70 mbar och placera sedan kammaren på en orbital shaker som skakar vid 90 varv/min i ett kallt rum vid 4 °C.
- Toppa med ytterligare 150 ml medium som en märkbar mängd filtreras. Det tar 1-2 dagar att filtrera 1 L medium helt.
- Upprepa med ytterligare kammare tills alla medier är filtrerade.
OBS: Försök att inte filtrera mer än 350 ml medium genom samma 0,22 μm-filter eftersom mucin kommer att ansluta filtret med tiden.
- Kyl filtrerat artificiellt sputummedium vid 4 °C tills det är klart för användning. Använd ASM inom en månad efter förberedelse för bästa resultat.
2. Syresparning
- Inställningar för sparingstation
OBS: Detta protokoll bör bara behöva göras i sin helhet en gång, varefter installationen kan upprätthållas genom enkelt underhåll vid behov. Se bild 1 för ett visuellt schema för syresparsystemet.- Få tag i och säkra trycklufts- och syretankarna ordentligt.
VARNING: Högt tryck gör tankarna extremt farliga när de hanteras fel. Se till att tankarna är helt förseglade och säkrade, det finns inga läckor när tanken är stängd och att all hanteringspersonal är fullt utbildad i deras användning. - Fäst en luftregulator på tryckluftstanken med en skiftnyckel. För optimal flödesavläsning på regulatorn, fäst regulatorn så nära som möjligt i upprätt läge.
- Fäst en syreregulator på den komprimerade syretanken och fäst så nära som möjligt i upprätt läge. Beroende på syretanken kan man behöva vända riktningen för att dra åt.
- Anslut slangen från regulatorerna till en Y-kontakt för att kombinera gasflödet från de två tankarna.
- Anslut Y-kontaktens utgång till den centrala T-kopplingsventilen.
- Anslut ena sidan av den centrala T-kopplingsventilen till en gastrycksmätare.
- Anslut den andra sidan av gastrycksmätaren till ett sterilt sprutfilter med diametern 25 mm med en porstorlek på 0,22 μm.
- Fäst ett andra sprutfilter med en diameter på 25 mm på en spruta utan kolv som ska användas som gasutsläpp under spargning.
- Anslut den sista sidan av den centrala T-kopplingsventilen till en andra T-kopplingsventil för syremätaren.
- Anslut ett sprutfilter med diametern 25 mm på ena sidan av denna andra T-kopplingsventil, tillsammans med slangar för att fästa 18 G nålar.
- Anslut den andra T-kopplingsventilens sista sida till syreövervakningsapparaten.
- Anslut ett avskärningsrör till andra sidan av syreövervakningsapparaten som ska användas som gasutsläpp under övervakningen.
VARNING: Vid provning/användning av syresparningssystemet, var noga med T-korsningarnas läge och se till att det matchar den avsedda vägen genom systemet. Underlåtenhet att göra detta kommer att resultera i tryckuppbyggnad inuti systemet och orsaka komponenter att misslyckas och komma isär . - För att underhålla systemet och för att hålla det i drift med optimal prestanda är följande metoder fördelaktiga.
- Förstärk kopplingarna med liberala mängder Teflon tejp för att avsevärt förbättra deras tätning och minska risken för komponenter som kommer ifrån det interna trycket.
- Håll det kombinerade flödet under 10 L/min för att minska maximalt tryck och förhindra fel.
- Om en läcka misstänks, använd en tvättmedelslösning som kommersiellt tillgängliga vätskeläckagedetektorer för att enkelt identifiera dess plats, eftersom den kommer att bubbla över eventuella gasläckor. Patch läcker med hjälp av en Polytetrafluoroetylen tejp (t.ex. Teflon).
- Byt ut sprutfiltren med 25 mm diameter i syresparningssystemet varannan vecka, men detta varierar med användningsfrekvensen. Med tiden minskar partiklar som fångas i filtret gasflödet och orsakar tryckuppbyggnader.
- Kalibrera syremätaren till 21% syrekomprimerad luft innan mätningar utförs.
- När systemanvändningen är klar stänger du av tankarna och avluftar överskottsgasen från regulatorerna tills flödet helt stannar.
- Få tag i och säkra trycklufts- och syretankarna ordentligt.
- Serumflaska kultur sparsam
- Etikett 500 ml autoklaverade serumflaskor med providentifierare, datum/tid för inokulering och målsyreprocent.
- I en biologisk huva, tillsätt 24 ml av det konstgjorda sputummediet till varje serumflaska som ställs in.
- Tillsätt 1 ml av patientens sputum homogeniserat med en 18-G nål (utspädd med steril koksaltlösning om nödvändigt för att erhålla tillräcklig mängd prov för varje odlingstillstånd) till varje serumflaska.
- Använd sterila pincett, placera de autoklaverade gummipropparna på toppen av varje serumflaska.
- Tryck ner gummipropparna, var försiktig så att du inte rör vid proppens undersida med händerna.
- Ta bort flaskorna från huven, applicera och pressa aluminiumtätningarna. Ta bort mittstycket från tätningarna.
- Torka av toppen av flaskorna med en alkoholservett och passera dem genom en Bunsen brännbrännare flamma.
- Fäst en steril 18 G-nål på en kolvfri spruta med ett filter. Sätt först in gasutsläppet i flaskan.
- Fäst en steril 18 G-nål på gasutgången från systemet och sätt in gasutmatningsnålen i flaskan också.
- Led T-korsningarna från tankarna genom syremätaren. Kontrollera att målsyrekoncentrationen flödar genom systemet. Sikta in dig på cirka 5 L/min gasflöde.
- Omdirigera T-korsningarna från tankarna till gasutgången. Gasen börjar flöda genom serumflaskan.
VARNING: Var uppmärksam på tryckmätaren under syresparning. Om trycket ökar oväntat stänger du av systemet omedelbart. - Kör syresparge genom serumflaskan i 1 min. Vid 5 L/min möjliggör detta 10 luftväxlingar och säkerställer att den inre atmosfären når önskat partiellt tryck.
- Ta bort gasutsläppet 18 G nål.
- Låt trycket i serumflaskan byggas upp till +1 atmosfär (2 atmosfärer vid havsnivå) och ta sedan omedelbart bort gasutmatningsnålen.
OBS: Att upprätthålla tryckhjälpmedel retention av hyperoxiska förhållanden över tid. - Placera serumflaskan i en inkubatorskakapparat på 37 °C vid 150 varv/min. Inkubera proverna i tre 24-timmarsintervaller. Vid varje 24-timmars intervall, ta en alikvot för nedströmsanalys, spara proverna igen och återföra dem till inkubation under en total inkubationstid på 72 timmar.
- Syremätning av utflöde
- Kalibrera syremätaren till 21% tryckluft och stäng sedan av tanken.
- För intaget av serumflaskan genom syrgasmätaren och fäst en steril nål i slutet.
- För in nålen genom gummiproppen i serumflaskan.
- Vänta tills utflödesavläsningen stabiliseras. Ett lågt flöde ur serumflaskorna innebär att detta kan ta upp till 2 min. Rapportera toppskillnaden från rumsluften (nummer längst från 21 %).
- Om du utför flera avläsningar, spola systemet med tryckluft mellan avläsningarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dessa protokoll tillämpades på 50 expectorated sputum prover från pwCF presenterar för rutinmässig vård till en öppenvården cystisk fibros klinik vid Massachusetts General Hospital i Boston, Massachusetts. Varje patients sputum odlades under 21%, 50% och 100% syre villkor med hjälp av konstgjorda sputum medium, med 0,5 mL alikvoter tas från varje kultur vid 24 h, 48 h och 72 h kultur tid för testning. Kulturer fotograferades när extraktioner gjordes för att spåra visuella förändringar. Dessutom togs en 0,5 mL alikvot av varje primärt sputumprov före odling. Detta resulterade i 10 diskreta prover per patient och en slutlig N på 500 prover. Av dessa genomgick sputum från 11 patienter (11 uncultured sputa, 11 odlad sputa från 21% syre vid 48 h inkubation) nukleinsyra extraktion17, sekvensering bibliotek genererades med hjälp av ett kommersiellt DNA-bibliotek förberedelse kit, och metagenomisk sekvensering utfördes på en hel genomsekvensering plattform som riktar sig ~ 5 Gb sekvens per prov med 150 baspar, parkopplade läsningar. Råa läsningar bearbetades med hjälp av bioBakery-sviten med verktyg18, som inkluderar kvalitetskontroll och avlägsnande av mänskliga "förorening" sekvenser och taxonomisk profilering med MetaPhlAn3 profiler19. Vid tidpunkten för utvinning av nukleinsyra spikades 10 miljoner celler av Imtechella halotolerans, en halotolerantart som normalt finns i mynningsekosystem och inte i mänskliga mikrobiella samhällen, i varje prov, vilket möjliggjorde kvantifiering av absolut mikrobiell belastning för varje prov20.
Figur 2 visar individuella och genomsnittliga utflödessyremätningar och pH-nivåer under odlingsprocessen för 50 sputumprover som odlas under varje syretillstånd och ett exempel på en visuell differentialkulturfenotyp. Kulturer bibehölls vid 37 °C utom under korta perioder då sparsamhet och avlägsnande av prov alikvoter utfördes. Med båda sparging intervallen 12 h och 24 h, förhöjd syre koncentrationer bibehölls, även om en minskning över tiden observerades för alla tre syre villkor, med 100% syre faller till cirka 85%, 50% syre faller till 40% och 21% syre faller till 18%. Syre villkor förblev distinkta, och viktigt, förhöjda syre koncentrationer bibehölls under hela processen för hyperoxic prover. pH-mätningar visade en större grad av variabilitet men höll sig väl inom ett fysiologiskt normalt intervall utan statistiskt signifikanta förändringar över tid. Dessa mätningar visar att dessa metoder upprätthåller diskreta differentiella syreförhållanden under hela odlingsprocessen. Slutligen visas ett exempel på en av många visuella kultur fenotyper som differentierade över syrekoncentrationen. Detta prov hade markerat grumlighet skillnader efter 72 h av kultur, med högre syre är associerad med lägre visuella grumlighet. Differentiell kultur fenotyper stöder förekomsten av hyperoxia-inducerade effekter på kultur samhällen.
Figur 3 jämför mikrobiell belastning, mikrobiell mångfald och mikrobiell samhällssammansättning mellan okulturerat sputum och odlat sputum (21% syretillstånd under en period av 48 h). Mätningar visar den enda stora skillnaden som introduceras av odlingen för att vara en cirka 20-faldig ökning av mikrobiell belastning jämfört med okultturerad sputum. Immunsystemet och de typiska mekaniska sputum clearance mekanismerna såsom hosta fungerar normalt som en regleringsprocess som begränsar den mikrobiella belastningen i lungan, även i fall av dysfunktion och infektion som de som ses i pwCF. Ex vivo-kulturen har inga sådana regleringsmekanismer, och mikrobiella samhällen är istället fria att gå vidare mot cellulär mättnad. Alfa- och betadiversitetsmått indikerar att trots denna skillnad i mikrobiell belastning är den underliggande samhällssammansättningen fortfarande välbevarad, med minimala globala skillnader som introduceras av kulturprocessen.
Figur 4 bygger vidare på jämförelsen mellan okrturerade och odlade sputumprover, där man tittar på den binära närvaron/frånvaron av de 120 mikrobiella arter som slutgiltigt identifierats av hagelgevärmetagenomiksekvensering från odlad och okulturerad sputum som erhållits från 11 patienter. Mikrober är grupperade baserat på fylogenetiska likheter. 46 (38,3%) av dessa arter identifierades i både okulturerade och odlade prover (cyanfärg), medan 35 (29,2%) identifierades uteslutande i okulturerade prover (gula) och 39 (32,5%) identifierades uteslutande i odlade prover (blå). Det är troligt att det finns större paritet än vad vi identifierade med hjälp av sekvensering när det gäller vad som finns och vad som saknas, men vissa taxa faller under tröskelvärdet för sekvenseringsdetektering i vissa fall. Skillnaderna tyder på att kulturprocessen introducerar viss partiskhet i kulturen jämfört med okulturerat sputum. Framför allt ökar odling närvaron av svampar som Candida och Aspergillus, liksom Enterobacterales medlemmar inklusive Escherichia, Serratiaoch Streptococcus medlemmar. Omvänt var Bacteroidetes medlemmar som Prevotella och Clostridiales, som är anaerober, närvarande i okrtyrade prover men inte närvarande i odlade prover. Detta kan hänföras till bristen på ett anaerobt villkor i vår experimentella modell.
Figur 5 visar absorbansbaserade tillväxtkurvor av vanliga CF-lungpatogener isolerade från sputum som erhållits från 50 olika pwCF. Dessa isolat representerar fenotypiskt olika kliniska isolat som erhållits med hjälp av anrikningskulturprocedurer från Massachusetts General Hospital Clinical Microbiology Laboratory, och inkluderar Pseudomonas aeruginosa (N = 53), Staphylococcus aureus (N = 37), Stenotrophomonas maltophilia (N = 12), Klebsiella pneumoniae (N = 3) och Achromobacter sp (N = 7). Tillväxt kurvor erhölls genom att odla varje isolat i konstgjorda sputum media vid 37 °C i mörkret, med ASM sans bakteriell inokulering fungerar som en negativ kontroll. Den transparenta kvaliteten på ASM (som beror på filter snarare än värmesterilisering) gör det möjligt att genomföra optiska åtgärder för att uppskatta tillväxtkurvor. Optiska avläsningar vid 600 nm (OD600) togs var 10: e minut, och de första 24 h i varje kurva visas. Frånvaron av förändringar i optiska avläsningar i DEN ASM-endast negativa kontrollen indikerar kulturer fria från förorening. De demonstrativa kurvorna som visas här följer typiska tillväxtkurvor som indikerar livskraften hos detta ASM-recept som ett medium för absorbansbaserad generering av tillväxtkurvor.
| Kolumn 1 | Kolumn 2 | Kolumn 3 | Kolumn 4 | Kolumn 5 | Kolumn 6 | Kolumn 7 | Kolumn 8 | Kolumn 9 | |
| Värde | Comstock | Kirchner | Sriramulu | Palmer | Flynn | Gallagher | Lundberg | Källa | |
| Mucin | 2 % v/v | 0.5% w/v | 0.5% w/v | - | 1 % med v | 2 % v/v | 1 % med v | Flynn | |
| Koksalt | 85,5 mM | 85,5 mM | 85,5 mM | 66,6 mM | 89,8 mM | 85,5 mM | 152,3 mM | Lapierre | |
| Kaliumklorid | 29,5 mM | 29,5 mM | 29,5 mM | 15,8 mM | - | 2,95 mM | 15,8 mM | Palmer | |
| Magnesiumsulfat | - | - | - | 0,6 mM | 1 mM | 1 mM | 0.61 mM | Palmer | |
| Järnsulfat | - | - | - | 0.0036 mM | - | - | - | - | |
| Ammoniumklorid | - | - | - | 2,3 mM | 60 mM | - | - | - | |
| Monopotassiumfosfat | - | - | - | 2,5 mM | 60 mM | - | - | - | |
| Glukos | - | - | - | 3,2 mM | 13 mM | 40 mM | 0,7 mM | Sambeek | |
| Laktat | - | - | - | 9 mM | - | - | - | - | |
| Essentiella aminosyror | 14.45x | 0,25 g/L | 0,25 g/L | Per syra | 0,5x | 0.375x | 1.29x | Palmer | |
| Icke-essentiella aminosyror | 28.9x | 0,25 g/L | 0,25 g/L | Per syra | 0.25x | 0,5x | 8.01x | Palmer | |
| Vitaminer | - | - | - | - | - | 1x | 1x | Gallagher | |
| Spåra metaller | - | - | - | - | 1x | 1x | 1x | Flynn | |
| Äggula | 0.25% | 0.25% | 0.25% | - | - | 0.25% | 0.25% | Kirchner | |
| Ferritin | 0.0003 g/L | - | - | - | - | 0.0004 g/L | 0.0004 g/L | Gallagher | |
| Lax spermie-DNA | 1,4 g/L | 4 g/L | 4 g/L | - | - | 1,4 g/L | - | - | |
| DPTA | - | - | 0.0059 g/L | - | - | - | - | - | |
| pH | - | 6.9 | - | 6.8 | - | - | 6.3 | Lapierre | |
| Lagring | 0 | 4° | - | - | 4° | 4° | 4° | Kirchner | |
| Sterilisering | Autoklav | Filter | Autoklav | - | Autoklav | Autoklav | Filter | Kirchner | |
Tabell 1: Artificiellt sputum medium recept härlett från genomgång av litteratur. (Kolumn 1) Reagenser och nyckelvärden vid formulering av artificiellt sputummedium. (Kolumner 2-7) Jämförelse av recept från extant litteratur8,9,10,12,14,15. (Kolumnerna 8-9) Artificiellt sputum medium recept som beskrivs i detta protokoll och motsvarande källor som informerade varje valt värde10,11,12,13,14,15.
| Kolumn 1 | Kolumn 2 | Kolumn 3 |
| CF Sputum | ASM | |
| Totala aminosyror | 10.25 mM | 10.76 mM |
| Alanin | 0.96 mM | 0,80 mM |
| Arginin | 0.17 mM | 0,94 mM |
| Asparagin | 0.91 mM | |
| Asparabinsyra | 0,45 mM | 0,80 mM |
| Cystein | 0,09 mM | 0.33 mM |
| Glutaminsyra | 0.84 mM | 0,80 mM |
| Glycin | 0.65 mM | 0,80 mM |
| Histidin | 0.28 mM | 0,35 mM |
| Isoleucin | 0,60 mM | 0.52 mM |
| Leucin | 0.87 mM | 0.52 mM |
| Lysin | 1,15 mM | 0.64 mM |
| Metionin | 0,34 mM | 0.13 mM |
| Ornithine | 0.36 mM | |
| Fenylalanin | 0.29 mM | 0.26 mM |
| Prolin | 0.90 mM | 0,80 mM |
| Serin | 0.78 mM | 0,80 mM |
| Treonin | 0,58 mM | 0.52 mM |
| Tryptofan | 0,07 mM | 0,06 mM |
| Tyrosin | 0.43 mM | 0.26 mM |
| Valin | 0,60 mM | 0.52 mM |
Tabell 2: Aminosyrakoncentrationer som tidigare beskrivits i cystisk fibros sputum och i konstgjorda sputum medium recept som beskrivs i detta protokoll. (Kolumn 1) Viktiga aminosyror. (Kolumn 2) Aminosyrakoncentrationer av sputum från personer med cystisk fibros12. (Kolumn 3) Aminosyrakoncentrationer i artificiellt sputummedium som beskrivs i detta protokoll
Bild 1: Anslutningsschema för syrebesparande systemkomponenter. Flödesdiagram över anslutningarna mellan komponenter i systemet som används för att sparra serumflaskor till önskade syrekoncentrationer mellan 21% och 100%. Systemet har 3 användningssätt som bestäms av placeringen av de två T-kopplingsventilerna. Systemet kan leda gas från tankarna genom gasutgången eller genom syreprocentmätaren, samt leda utflödesgas från tidigare spargade serumflaskor genom monitorn för att kontrollera koncentrationen efter att tiden har gått. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Målsyrekoncentrationerna bibehålls ungefär med både 12 h och 24 h sparintervall, och pH förblir i det fysiologiska intervallet under odlingen. ( A) Utflöde syreavläsningar från 12 h och 24 h syresparintervaller under en 72-h period. b)pH-avläsningar för prover som mäts var 24:e timme (C) En exempelbild av odlat prov CFB010 efter 72 h, med differentiell grumlighet över syrekoncentrationerna. Färgen anger målsyreprocenten. felstaplar anger 95 % konfidensintervall. Kritiska tröskelvärden betonas med streckade linjer. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Odling ökar den mikrobiella belastningen, men den underliggande samhällssammansättningen bevaras. Uncultured sputum (gul) och odlad sputum (blå) med hjälp av konstgjorda sputum medium vid 21% syre för 48 h. Aliquots genomgick nukleinsyra extraktion och hagelgevär metagenomics sekvensering för att upptäcka möjliga bias infördes från kulturförhållanden. (A) Absolut mikrobiell belastning (bestäms av spike-in-kontroller) och alfa mångfalds mått. Med hjälp av linjära blandade effekter modeller, uncultured vs. odlad sputum förutspådde mikrobiell belastning men inte alfa mångfald. (B) Ordination av de två första komponenterna i betamångfaldsmått, som styr för skillnad i mikrobiell belastning. Ingen signifikant skillnad i något av måtten efter PERMANOVA. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Majoriteten av den identifierade taxan finns i både källsputum och kultur, medan andra endast förekommer i källsputum eller kultur. Hagelgevär metagenomics sekvensering används för att jämföra skillnader i mikrobiell samhällssammansättning mellan uncultured och odlade sputum prover. Fylogenetiskt träd av alla identifierade mikrobiella arter i sekvenserade prover (N = 120). Arter märkta med gult (N = 35, 29,2%) sågs endast i okredade sputumprover. Arter märkta med blått (N = 39, 32,5%) sågs endast i konstgjorda sputum medium kulturprover. Arter märkta med cyan (N = 46, 38,3%) sågs i både okulturerade och odlade prover. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Artificiellt sputummedium är tillräckligt transparent för att kunna användas som tillväxtkurvamedium för odling av kliniska isolat. Optimala densitetsavläsningar vid 600 nm togs var 10: e minut, och de första 24 h i varje kurva visas. Grå linjer representerar enskilda avläsningar och orange linjer representerar den genomsnittliga absorbansen för varje taxon. Artificiell sputum medium tom ingår som en kontroll. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie utvecklades en in vitro-modell för att studera effekten av hyperoxia på lungmikrobiella samhällen. Denna modell, baserad på artificiell sputum medium och daglig sparning av serumflaskor, upprätthåller förhöjda syrekoncentrationer och stöder tillväxten av mikrober som identifierats i sputum från pwCF.
Det finns flera kritiska steg i detta tillvägagångssätt. Först är valet att använda filtersterilisering snarare än värmesterilisering av det konstgjorda sputummediet. Filtersterilisering förhindrar denaturering av mucin och andra värmekänsliga komponenter i mediet och ger ett tydligt medium som kan användas för optiska mått på mikrobiell tillväxt. Medan filtersterilisering har föreslagits i andra protokoll10, har vi funnit att tillsatsen av orbital skakning under filtreringsprocessen var avgörande för att förhindra igensättning av filtret som annars inträffade när en minsta mängd av det beredda mediet hade filtrerats. Medan det filtrerade konstgjorda sputummediet kan ha en lägre än avsedd slutlig mucinkoncentration på grund av mucinpåverkan i filtret, har sputum från pwCF visat sig ha lägre mucinkoncentrationer än sputum från personer utan cystisk fibros21. Den startande mucinkoncentrationen på 1% som används i detta protokoll är högre än i andra metoder som har använt filtersterilisering, med en grupp som använder en starts mucinkoncentration på 0,5%10, medan typiska recept använder mucinkoncentrationer från 0,5%-2% (tabell 1). Således, även med förlust av mucin i filtersteriliseringsprocessen, det slutliga mediet som framställs med detta protokoll sannolikt kommer att ha mucinkoncentrationer inom det fysiologiska intervallet22.
Den andra är sammansättningen av artificiellt sputummedium. Receptet på artificiellt sputummedium valdes baserat på befintliga fysiologiska studier av sputum från pwCF (Tabell 1). Med hjälp av hagelgevär metagenomics sekvensering, kunde vi verifiera att sputum odlas med detta konstgjorda sputum medium i stort sett rekapitulerar den mikrobiella samhällssammansättningen av uncultured sputum (figur 3). Vid normoxic villkor stödde detta medium också tillväxten av 112 olika kliniska isolat som representerar vanliga patogener isolerade från sputum av cystisk fibros patienter. Dessa data visar således att denna formulering av artificiellt sputum medium stöder tillväxten av luftvägarna mikrobiota från pwCF. Laxsperma DNA, ett vanligt tillägg till befintliga recept (tabell 1), utelämnades. En avsedd tillämpning av denna modell är metagenomisk sekvensering, och därför inkluderades inte laxsperma DNA för att minska tillsatsen av icke-mikrobiella nukleinsyror eftersom dessa avläsningar skulle filtreras bort efter sekvensering, vilket minskar vårt effektiva sekvenseringsdjup. Medan sputum från pwCF har höga koncentrationer av extracellulärt DNA23, är en betydande del av det mikrobiellt ursprung24, och det är oklart om tillsats av laxspermame DNA till det konstgjorda sputummediet gör det mer fysiologiskt eller om den kulturmetod som beskrivs i detta protokoll leder till höga nivåer av mikrobiellt härlett extracellulärt DNA; Vi gjorde ingen åtskillnad mellan extra- och intracellulära DNA-koncentrationer i våra studier. Framtida studier kan vilja verifiera koncentrationen av extracellulärt DNA som genereras av denna odlingsmetod.
För det tredje, såvitt vi vet, har inga publicerade studier på cystisk fibros lung mikrobiella samhällen behandlat hyperoxiska villkor. Denna modell använder billig och allmänt tillgänglig utrustning från allmänna laboratorie- eller sjukhusleverantörer för att bygga ett syresparsystem. Viktiga överväganden för upprätthållandet av hyperoxiska förhållanden inkluderar volymen av odlingsmediet i förhållande till det tillgängliga huvudutrymmet i serumflaskorna. I de första försöken under protokoll utveckling, 125 mL serum flaskor användes. Användningen av 500 ml serumflaskor (vilket möjliggör ett 475 ml huvudutrymme till 25 ml odlingsförhållande) tillät dock bibehållandet av önskad koncentration i upp till 24 timmar, vilket minskade frekvensen av syresparning. Detta tillvägagångssätt genererar diskreta syre villkor, vilket möjliggör samtidig kultur av olika patient prover över flera syre villkor. Andra verktyg från anaerob kultur kan utnyttjas för hyperoxisk kultur, inklusive användning av anaeroba burkar eller Balch-typ rör sparged med syre. Analyser av lung mikrobiella samhällen med hjälp av metagenomics sekvensering visar att övergripande alfa och beta mångfald är jämförbara mellan odlade och uncultured sputum. Vid utvärdering av differentiellt överflöd på artnivå, odling vid 21% syre, berikad för tillväxt av aerober och fakultetsaerober, inklusive Enterobacterale, Streptococcus och svampar. Detta beror sannolikt på att ett anaerobt tillstånd har uteslutits i luftvägarna i pwCF25,26. Framtida studier skulle kunna överväga införandet av kvävegas i denna modell för att studera en rad anoxiska och oxiska tillstånd och motsvarande aerob och anaerob mikrobiota som finns i luftvägarnas mikrobiella samhällen.
De viktigaste principerna som beskrivs i dessa protokoll kan vara lärorika för genomförandet av liknande studier relaterade till syrepåverkan på komplexa mikrobiella samhällen eller vanliga lungpatogener. Syre är den vanligaste terapin som används vid behandling av alla avancerade lungsjukdomar, och en bättre förståelse för hur det kan leda till oavsiktliga oväntade effekter på mikrobiella samhällen i luftvägarna och vanliga luftvägspatogener kommer att vara viktigt för vården av pwCF och andra kroniska lungsjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
En del av detta arbete utfördes på Marine Biological Lab med stöd från Marine Biological Lab, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (bidragsnummer 5600373) och en gåva från Simons Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BME Vitamins (100x) Solution | MilliporeSigma | B6891 | Concentrated solution of supplemental vitamins. |
| Crimper, 30 mm | DWK Life Sciences | 224307 | Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles. |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | Solid glucose powder (dextrorotatory isomer). |
| Diaphragm Pump ME 2 NT | VACUUBRAND | 20730003 | Vacuum pump for vacuum filtration. |
| Egg Yolk Emulsion | HiMedia | FD045 | Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline. |
| Ferritin, Cationized from Horse Spleen | MilliporeSigma | F7879 | Ferritin (iron-storage protein) solution. |
| FIREBOY plus Safety Bunsen Burner | Integra Biosciences | 144000 | Bunsen burner with user interface and safety features. |
| Hydrion pH Paper (1.0–14.0) | Micro Essential Laboratory | 94 | pH testing paper for the range of 1.0–14.0. |
| Hydrion pH Paper (4.0–9.0) | Micro Essential Laboratory | 55 | pH testing paper for the range of 4.0–9.0. |
| Hydrion pH Paper (6.0–8.0) | Micro Essential Laboratory | 345 | pH testing paper for the range of 6.0–8.0. |
| Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G | Smiths Medical | 401815 | 18 G needles with safety caps. |
| In-Line Pressure Gauge | MilliporeSigma | 20469 | Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure. |
| Innova 42 Incubated Shaker | Eppendorf | 2231000756 | Combination incubator/orbital shaker. |
| Luer-Lok Syringe with Attached Needle | Becton Dickinson | 309580 | Combination 3 mL syringe and 18 G needle. |
| Luer Valve Assortment | World Precision Instruments | 14011 | Valves for gas flow tubing. |
| LSE Orbital Shaker | ThermoFisher Scientific | 6780-NP | Orbital shaker to agitate media during filtration. |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | MilliporeSigma | M2773 | Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate). |
| Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-346-15FM | Air flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| MEM Amino Acids (50x) Solution | MilliporeSigma | M5550 | Concentrated solution of essential amino acids. |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution | MilliporeSigma | M7145 | Concentrated solution of non-essential amino acids. |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | MilliporeSigma | SLMP25SS | 0.22 µm polyethersulfone membrane sterile syringe filter. |
| Milli-Q Academic | MilliporeSigma | ZMQS60E01 | Milli-Q sterile water filtration system. |
| MiniOX 3000 Oxygen Monitor | MSA | 814365 | Gas flow oxygen percentage monitor. |
| MOPS Buffer (1 M, pH 9.0) | Boston BioProducts | BBM-90 | MOPS buffer for adjusting media pH. |
| Mucin from Porcine Stomach | MilliporeSigma | M2378 | Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder. |
| Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit | Harvard Apparatus | 72-1413 | Connectors for gas flow tubing. |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Library preparation for identification during sequencing. |
| NovaSeq 6000 Sequencing System | Illumina | 770-2016-025-N | Shotgun sequencing platform for generating sample reads. |
| Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-540-15FM | Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors | SunMed | 2001-01 | Tubing for connecting gas system components. |
| Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 | Molecular Biologicals International | MRGF-6235 | Concentrated phosphate-buffered saline solution. |
| PC 420 Hot Plate/Stirrer | Marshall Scientific | CO-PC420 | Combination hot plate/stirrer. |
| Potassium Chloride | MilliporeSigma | P9541 | Solid potassium chloride salt. |
| PTFE Disposable Stir Bars | ThermoFisher Scientific | 14-513-95 | Disposable magnetic stir bars. |
| PTFE Thread Seal Teflon Tape | VWR | 470042-938 | Teflon tape for reinforcing gas system connections. |
| Q-Gard 2 Purification Cartridge | MilliporeSigma | QGARD00D2 | Purification cartridge for Milli-Q system. |
| Reusable Media Storage Bottles | ThermoFisher Scientific | 06-423A | Bottles for mixing and storing culture media. |
| Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl | DWK Life Sciences | 224100-331 | Rubber stoppers for serum bottles. |
| Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL | DWK Life Sciences | 223952 | Glass serum bottles for sealed culturing. |
| Small Bore Extension Set | Braun Medical | 471960 | Tubing extension with luer lock connectors. |
| Sodium Chloride | MilliporeSigma | S3014 | Solid sodium chloride salt. |
| Spike-in Control I (High Microbial Load) | ZymoBIOMICS | D6320 | Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations |
| Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System | MilliporeSigma | S2GPU02RE | 250 mL 0.22 µm vacuum filtration chamber. |
| Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes | Professional Disposables International | H04082 | Disposable germicidal wipes for sterilization. |
| Trace Metals Mixture, 1000x | ThermoFisher Scientific | NC0112668 | Concentrated solution of physiological trace metals. |
| Unlined Aluminum Seal, 30 mm | DWK Life Sciences | 224187-01 | Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers. |
| USP Medical Grade Air Tank | Airgas | AI USP200 | Compressed air tank for input to sparging system. |
| USP Medical Grade Oxygen Tank | Airgas | OX USP200 | Compressed oxygen tank for input to sparging system. |
References
- Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLoS One. 13 (3), 0194060 (2018).
- Acosta, N., et al. Sputum microbiota is predictive of long-term clinical outcomes in young adults with cystic fibrosis. Thorax. 73 (11), 1016-1025 (2018).
- Muhlebach, M. S., et al. Initial acquisition and succession of the cystic fibrosis lung microbiome is associated with disease progression in infants and preschool children. PLoS Pathogens. 14 (1), 1006798 (2018).
- Zolin, A., Bossi, A., Cirilli, N., Kashirskaya, N., Padoan, R. Cystic fibrosis mortality in childhood. Data from European cystic fibrosis society patient registry. International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (9), (2018).
- Ramos, K. J., et al. Heterogeneity in survival in adult patients with cystic fibrosis with FEV1 30% of predicted in the United States. Chest. 30 (6), 1320-1328 (2017).
- Ramos, K. J., et al. Predictors of non-referral of patients with cystic fibrosis for lung transplant evaluation in the United States. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (2), 196-203 (2016).
- Girardis, M., et al. Effect of conservative vs conventional oxygen therapy on mortality among patients in an intensive care unit: The Oxygen-ICU randomized clinical trial. JAMA. 316 (15), 1583-1589 (2016).
- Comstock, W. J., et al. The WinCF model - An inexpensive and tractable microcosm of a mucus plugged bronchiole to study the microbiology of lung infections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55532 (2017).
- Diraviam Dinesh, S.
- Kirchner, S., et al. Use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against Pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3857 (2012).
- Grandjean Lapierre, S., et al. Cystic fibrosis respiratory tract salt concentration: An Exploratory Cohort Study. Medicine. 96 (47), Baltimore. 8423 (2017).
- Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
- Van Sambeek, L., Cowley, E. S., Newman, D. K., Kato, R. Sputum glucose and glycemic control in cystic fibrosis-related diabetes: a cross-sectional study. PLoS One. 10 (3), 0119938 (2015).
- Flynn, J. M., Niccum, D., Dunitz, J. M., Hunter, R. C. Evidence and role for bacterial mucin degradation in cystic fibrosis airway disease. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005846 (2016).
- Gallagher, T., et al. Liquid chromatography mass spectrometry detection of antibiotic agents in sputum from persons with cystic fibrosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 65 (2), (2021).
- Voynow, J. A., Rubin, B. K.
- Sui, H. Y., et al. Impact of DNA extraction method on variation in human and built environment microbial community and functional profiles assessed by shotgun metagenomics sequencing. Frontiers in Microbiology. 11, 953 (2020).
- McIver, L. J., et al. bioBakery: a meta'omic analysis environment. Bioinformatics. 34 (7), 1235-1237 (2018).
- Truong, D. T., et al. MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling. Nature Methods. 12 (10), 902-903 (2015).
- Stammler, F., et al. Adjusting microbiome profiles for differences in microbial load by spike-in bacteria. Microbiome. 4 (1), 28 (2016).
- Henke, M. O., Renner, A., Huber, R. M., Seeds, M. C., Rubin, B. K. MUC5AC and MUC5B mucins are decreased in cystic fibrosis airway secretions. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 86-91 (2004).
- Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyper concentration and increased osmotic pressure. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3047-3060 (2014).
- Matthews, L. W., Spector, S., Lemm, J., Potter, J. L. Studies on pulmonary secretions. I. The over-all chemical composition of pulmonary secretions from patients with cystic fibrosis, bronchiectasis, and laryngectomy. American Review of Respiratory Disease. 88, 199-204 (1963).
- Ibanez de Aldecoa, A. L., Zafra, O., Gonzalez-Pastor, J. E. Mechanisms and regulation of extracellular DNA release and its biological roles in microbial communities. Frontiers in Microbiology. 8, 1390 (2017).
- Tunney, M. M., et al. Detection of anaerobic bacteria in high numbers in sputum from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (9), 995-1001 (2008).
- Worlitzsch, D., et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Investigation. 109 (3), 317-325 (2002).
