Summary
Målet med denne protokollen er å utvikle et modellsystem for effekten av hyperoksia på cystiske fibrose luftveismikrobielle samfunn. Kunstig sputummedium emulerer sammensetningen av sputum, og hyperoksiske kulturforhold modellerer effekten av supplerende oksygen på lungemikrobielle samfunn.
Abstract
Luftveis mikrobielle samfunn antas å spille en viktig rolle i utviklingen av cystisk fibrose (CF) og andre kroniske lungesykdommer. Mikrober har tradisjonelt blitt klassifisert basert på deres evne til å bruke eller tolerere oksygen. Supplerende oksygen er en vanlig medisinsk terapi administrert til personer med cystisk fibrose (pwCF); Imidlertid har eksisterende studier på oksygen og luftveismikrobiomet fokusert på hvordan hypoksi (lavt oksygen) i stedet for hyperoksi (høyt oksygen) påvirker de overveiende aerobe og fakultets anaerobe lungemikrobielle samfunnene. For å løse dette kritiske kunnskapsgapet ble denne protokollen utviklet ved hjelp av et kunstig sputummedium som etterligner sammensetningen av sputum fra pwCF. Bruken av filtersterilisering, som gir et gjennomsiktig medium, gjør det mulig for optiske metoder å følge veksten av encellede mikrober i suspensjonskulturer. For å skape hyperoksiske forhold utnytter dette modellsystemet etablerte anaerobe kultiveringsteknikker for å studere hyperoksiske forhold; I stedet for å fjerne oksygen, tilsetter oksygen til kulturer ved daglig sparring av serumflasker med en blanding av trykkoksygen og luft. Sputum fra 50 pwCF gjennomgikk daglig sparring i en 72-timers periode for å verifisere denne modellens evne til å opprettholde differensialoksygenforhold. Hagle metagenomisk sekvensering ble utført på kultiverte og ukulturerte sputumprøver fra 11 pwCF for å verifisere dette mediets evne til å støtte veksten av kommensale og patogene mikrober som vanligvis finnes i cystisk fibrose sputum. Vekstkurver ble oppnådd fra 112 isolasjoner hentet fra pwCF for å verifisere evnen til dette kunstige sputummediet for å støtte veksten av vanlige cystiske fibrosepatogener. Vi finner at denne modellen kan dyrke et bredt utvalg av patogener og commensals i CF sputum, gjenoppretter et samfunn som ligner sterkt på ukulturert sputum under normoksiske forhold, og skaper forskjellige kulturfenotyper under varierende oksygenforhold. Denne nye tilnærmingen kan føre til en bedre forståelse av uforutsiktede effekter forårsaket av bruk av oksygen i pwCF på luftveis mikrobielle samfunn og vanlige respiratoriske patogener.
Introduction
Cystisk fibrose (CF) er en genetisk sykdom preget av manglende evne til å fjerne tykt slim fra lungene, noe som fører til gjentatte infeksjoner og progressiv lungefunksjonsnedgang som ofte resulterer i behovet for lungetransplantasjon eller død. Luftveismikrobiomet til personer med cystisk fibrose (pwCF) ser ut til å spore sykdomsaktivitet1, med en reduksjon i mikrobielt mangfold forbundet med ugunstige langsiktige resultater2,3. I kliniske studier av pwCF har supplerende oksygenbehandling vært forbundet med mer avansert sykdom4,5, men tradisjonelt har bruk av oksygenbehandling blitt sett på som bare en markør for sykdoms alvorlighetsgrad6. Nyere studier fra en klinisk studie av pasienter med luftveissvikt har vist at høyere oksygennivå hos pasienter paradoksalt nok er forbundet med en økning i alvorlige bakterielle infeksjoner og høyere dødelighet7, noe som tyder på at supplerende oksygen kan bidra til sykdomspatogenese. Effekten av supplerende oksygen på cystisk fibrose lungemikrobiom og tilhørende lunge- og luftveismikrobielle samfunn er ikke godt studert.
Mekanistiske studier kan ofte ikke utføres direkte på mennesker på grunn av logistiske vanskeligheter og potensielle etiske problemer knyttet til intervensjoner av ukjent medisinsk nytte eller skade. Translasjonelle tilnærminger som integrerer menneskelige biospecimens i modellsystemer, kan gi viktig biologisk innsikt i disse tilfellene. Mens evnen til å bruke eller tolerere oksygen tradisjonelt har vært en viktig komponent i mikrobiell klassifisering, er det lite kjent om hvordan den terapeutiske innføringen av supplerende oksygen til miljøet kan perturb luftveis mikrobielle samfunn. For å belyse de ukjente effektene av supplerende oksygen på luftveismikrobiomene til pwCF, måtte vi ta opp to store utfordringer; for det første, opprettelsen av et kulturmedium som fysiologisk tilnærmer sammensetningen av CF sputum; For det andre, opprettelsen av et modellsystem som tillater vedlikehold av forhøyede oksygenkonsentrasjoner i kulturen over lengre perioder.
Kunstige sputummedier (ASM) er mye brukt til å etterligne lunge sputum ex vivo8,9,10, men det er ingen klar konsensus om en bestemt oppskrift. Denne protokollen beskriver en kunstig sputum medium oppskrift og forberedelse strategi nøye designet for fysiologisk omtrentlig sputum fra pwCF. Tabell 1 skisserer de valgte oppskriftsverdiene basert på publisert litteratur. Grunnleggende kjemiske komponenter og pH ble matchet med verdier identifisert av studier av human CF sputum11,12,13. Lav konsentrasjon fysiologiske næringsstoffer ble tilsatt ved hjelp av eggeplomme, som ble inkludert som 0,25% av det endelige volumet10, samt vitamin- og spormetallblandinger14,15. Mucin, nøkkelkomponenten i sputum16, ble inkludert ved 1% m/ v14. Selv om det var mer arbeidskrevende, ble filtersterilisering valgt over den mer konvensjonelle praksisen med varmesterilisering for å redusere potensielle problemer fra varmeindusert denaturering av essensielle mediekomponenter10. En ekstra fordel med filtersterilisering er at den genererer medier som er gjennomsiktige (varmesterilisering kan skape uklare medier på grunn av nedbør og koagulasjon av salter og proteiner), slik at dette kunstige sputummediet kan brukes til å følge mikrobiell vekst basert på økning i turbiditet.
Dette modellsystemet for den hyperoksiske kulturen er basert på anaerobe kultiveringsteknikker der oksygen tilsetts i stedet for å fjernes, og skaper en modell for effekten av supplerende oksygenbruk for pwCF. Figur 1 og den tilhørende oksygensparingsprotokollen skisserer komponentene i et oksygensparingssystem, som kan oppnås til lave kostnader fra generelle laboratorie- og sykehusleverandører. Dette systemet gjør det mulig å blande trykkoksygen og luft til faste konsentrasjoner fra 21% -100% oksygen. Integreringen av en oksygensensor gjør det mulig å verifisere konsentrasjonen av utgangsgassblandingen, samt sjekke utstrømningsgasssammensetningen til tidligere sparte serumflasker for å bekrefte at oksygenforholdene er opprettholdt innenfor ønsket område.
Denne protokollen skisserer prosedyrer for å skape et kunstig sputummedium, bygging og bruk av et oksygensparingssystem, og anvendelsen av både til kultur CF sputum under differensial oksygenforhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien fikk godkjenning fra Partners Institutional Review Board (Protokoll # 2018P002934). Inklusjonskriteriet omfattet voksne pasienter med cystisk fibrose som ga skriftlig informert samtykke til studien. Det var ikke noe eksklusjonskriterium. I henhold til protokollretningslinjer ble alle sputumprøver samlet inn fra pasienter med cystisk fibrose under et planlagt poliklinisk besøk hos deres kliniske leverandør.
1. Kunstig Sputum Medium Forberedelse
MERK: Mengder som er oppført her er for produksjon av 1 L endelig kunstig sputum medium, og anta de spesifikke reagensene som er oppført i materialtabellen. Tallene må justeres for andre volumer eller for bruk av forskjellige reagenser for å sikre det samme sluttproduktet. Se tabell 1 for målkonsentrasjoner.
- Kunstig sputum kjemisk blanding (ASCM)
MERK: ASCM utgjør 25% av det endelige mellomvolumet. Den er hyllestabil og kan tilberedes i bulk eller på forhånd. Hvis du er forberedt på senere bruk, autoklaverer du den kjemiske blandingen og lagrer den trygt ved romtemperatur.- Bland de bestandsløsningene for bestanden.
- Forbered 1 M NaCl lager: Tilsett 58,44 g NaCl per liter sterilt vann.
- Forbered 1 M KCl lager: Tilsett 74,55 g KCl per liter sterilt vann.
- Forbered 1 M MgSO4 lager: Tilsett 246,47 g MgSO4·7H2O per liter sterilt vann, eller 120,37 g vannfri MgSO4 per liter sterilt vann.
- Forbered 1 M glukose lager: Tilsett 180,16 g glukose per liter sterilt vann.
- Autoklav steriliserer kjemiske lagerløsninger, samt en tom 250 ml flaske. Utfør autoklaveringstrinnene til minst standardverdier på 121 °C og 15 PSI i 30 minutter.
- Tilsett 80,59 ml sterilt vann til den tomme 250 ml flasken.
- Tilsett 152,30 ml 1 M NaCl-lager i blandingen.
- Tilsett 15,8 ml 1 M KCl lager i blandingen.
- Tilsett 610 μL 1 M MgSO4 lager i blandingen.
- Tilsett 700 μL 1 M glukoselager i blandingen.
- Bland de bestandsløsningene for bestanden.
- Kunstig sputum mucin blanding (ASMM)
MERK: ASMM utgjør 50% av det endelige mellomvolumet. Forsikre deg om at den er forberedt på samme dag som den endelige mellomstore batchen.- Tilsett 450 ml sterilt vann i en tom 1 L flaske.
- Tilsett 50 ml 10x fosfatbufret saltvann (PBS) i flasken.
- Tilsett en magnet rørestang til flasken.
- Autoklaver flasken som inneholder PBS og rørestangen.
- Mål ut 10 g mucinpulver og legg det til PBS.
- Rist flasken kraftig for foreløpig blanding.
- Plasser flasken på en varm plate med magnetisk omrører. Sett varmen til middels høy målretting 50 °C og rørehastigheten til 1100 o/min. Ramp opp hastigheten gradvis slik at stangen ikke flyr av magneten.
- La det varme og rør i 15 min.
- Plukk opp flasken med varmebestandige hansker. Vær oppmerksom på om mucinpulveret legger seg ut av oppløsningen.
- Hvis mucinpulveret ikke er helt oppløst, må du returnere flasken til varme/rører i intervaller på 5 minutter til den er helt oppløst.
- La mucinblandingen avkjøles til romtemperatur.
- Kunstig sputum biologisk blanding (ASBM)
MERK: ASBM er 25% av det endelige mellomvolumet. Forbered det på samme dag som den endelige mellomstore batchen, og i motsetning til de andre blandingene, må du ikke utsette komponentene for varme.- Tine 100x vitaminbestanden i et 4 °C kjøleskap eller på is.
MERK: Før del vitaminbestanden i 10 ml aliquots for å minimere antall fryse-/tinesykluser. - Tilsett 124,24 ml sterilt vann til den tomme autoklavede 250 ml flasken.
- Tilsett 25,76 ml 50x essensiell aminosyre til blandingen.
- Tilsett 80,14 ml 100x ikke-essensiell aminosyre til blandingen.
- Tilsett 10 ml (tint) 100x vitaminbestand til blandingen.
- Tilsett 1 ml 1000x spormetaller til blandingen.
- Tilsett 8,33 ml 30% eggeplommeemulsjon til blandingen.
- Tilsett 400 μL 10 g/l ferritin lager til blandingen.
- Bland løsningen godt via manuell risting.
- Tine 100x vitaminbestanden i et 4 °C kjøleskap eller på is.
- Kunstig sputummedium (ASM)
- Tilsett 250 ml ASCM i 1 L-flasken som inneholder ASMM.
- Tilsett 250 ml ASBM i den mellomstore flasken.
- Titer mediet med grunnleggende MOPS-buffer (1 M) for å nå en pH på 6,3 på et pH-papir med smalt område. Før titrering vil mediumblandingen være for sur.
- Kjøl det resulterende kunstige sputummediet ved 4 °C til det er klart til filtrering.
- For å starte filtreringsprosessen, overfør 200 ml ufiltrert kunstig sputummedium til et vakuumfiltreringssystem med et 0,22 μm porestørrelsesfilter.
- Koble filtreringssystemet til vakuumpumpen, slå på vakuumpumpen, sett den til 70 mbar, og plasser deretter kammeret på en orbital shaker som rister ved 90 rpm i et kaldt rom ved 4 °C.
- Topp av med ytterligere 150 ml av mediet som en merkbar mengde filtreres. Det tar 1-2 dager å filtrere 1 L middels helt.
- Gjenta med flere kamre til alle mediene er filtrert.
MERK: Prøv å ikke filtrere mer enn 350 ml av mediet gjennom det samme 0,22 μm filteret, siden mucin vil plugge filteret over tid.
- Kjølefiltrert kunstig sputummedium ved 4 °C til det er klart til bruk. Bruk ASM innen en måned etter forberedelse for best resultat.
2. Oksygensparing
- Oppsett av sparringsstasjon
MERK: Denne protokollen trenger bare å gjøres i sin helhet en gang, hvoretter oppsettet kan opprettholdes gjennom enkelt vedlikehold etter behov. Se figur 1 for et visuelt skjema av oksygensparingssystemet.- Få tak i og sikre trykkluft- og oksygentankene på riktig måte.
FORSIKTIG: Høyt trykk gjør tankene ekstremt farlige når de blir feilbehandlet. Påse at tankene er helt forseglet og sikret, det er ingen lekkasjer når tanken er lukket, og at alt håndteringspersonell er fullt opplært i bruken. - Fest en luftregulator til trykklufttanken med en skiftenøkkel. For optimal strømningsavlesning på regulatoren, fest regulatoren så nært som mulig til en oppreist stilling.
- Fest en oksygenregulator til den komprimerte oksygentanken, og fest så nært som mulig til en oppreist stilling. Avhengig av oksygentanken, kan det hende man må snu retningen for å stramme.
- Koble slangen fra regulatorene til en Y-kontakt for å kombinere gassstrømmen fra de to tankene.
- Koble utgangen på Y-kontakten til den sentrale T-koblingsventilen.
- Koble den ene siden av den sentrale T-koblingsventilen til en gasstrykkmåler.
- Koble den andre siden av gasstrykkmåleren til et sterilt sprøytefilter med en oppløsning på 25 mm med en porestørrelse på 0,22 μm.
- Fest et sprøytefilter med en ekstra diameter på 25 mm til en sprøyte uten at et stempel kan brukes som gassutløsning under sparring.
- Koble den siste siden av den sentrale T-koblingsventilen til en ekstra T-koblingsventil for oksygenmonitoren.
- Koble et sprøytefilter med 25 mm diameter til den ene siden av denne andre T-koblingsventilen, sammen med slanger for å feste 18 G nåler.
- Koble den siste siden av den andre T-koblingsventilen til oksygenovervåkingsapparatet.
- Koble et avkuttet rør til den andre siden av oksygenovervåkingsapparatet som skal brukes som gassutløsning under overvåking.
FORSIKTIG: Når du tester/bruker oksygensparingssystemet, må du være oppmerksom på posisjonen til T-kryssene og sørge for at det samsvarer med den tiltenkte banen gjennom systemet. Unnlatelse av å gjøre dette vil resultere i trykkoppbygging inne i systemet og føre til at komponenter svikter og kommer fra hverandre . - For vedlikehold av systemet og for å holde det i gang med optimal ytelse, er følgende praksis gunstig.
- Forsterk forbindelsene med liberale mengder Teflon-tape for å forbedre forseglingen betydelig og redusere sjansen for at komponenter kommer fra det indre trykket.
- Hold den kombinerte strømningshastigheten under 10 l/min for å redusere maksimalt trykk og forhindre feil.
- Hvis det mistenkes en lekkasje, bruk en vaskemiddelløsning som kommersielt tilgjengelige væskelekkasjedetektorer for å identifisere plasseringen enkelt, da den vil boble over eventuelle gasslekkasjer. Lappelekkasjer ved hjelp av et Polytetrafluoretylenbånd (f.eks.
- Skift ut sprøytefiltrene med 25 mm diameter i oksygensparingssystemet to ganger i uken, men dette varierer med bruksfrekvensen. Over tid reduserer partikler som fanges i filteret gassstrømmen og forårsaker trykkoppbygginger.
- Kalibrer oksygenmonitoren til 21 % oksygen trykkluft før du utfører målinger.
- Etter ferdigstillelse av systembruken, slå av tankene og luft overflødig gass fra regulatorene til strømmen helt stopper.
- Få tak i og sikre trykkluft- og oksygentankene på riktig måte.
- Serum flaske kultur sparring
- Etikett 500 ml autoklavede serumflasker med prøveidentifikatorer, dato/klokkeslett for inokulering og måloksygenprosent.
- I en biologisk hette legger du til 24 ml av det kunstige sputummediet til hver serumflaske som settes opp.
- Tilsett 1 ml av pasientens sputum homogenisert med en 18 G nål (fortynnet med steril saltvann om nødvendig for å oppnå tilstrekkelig volum prøve for hver kulturtilstand) til hver serumflaske.
- Bruk sterile pinsett, plasser de autoklavede gummiproppene på toppen av hver serumflaske.
- Trykk ned gummiproppene, pass på at du ikke berører undersiden av proppen med hendene.
- Fjern flaskene fra hetten, påfør og krymp aluminiumstetningene. Fjern midtstykket fra tetningene.
- Tørk av toppen av flasker med en alkoholserviett og før dem gjennom en Bunsen brennerflamme.
- Fest en steril 18 G kanyle til en stempelløs sprøyte med et filter. Sett denne gassutløsningen inn i flasken først.
- Fest en steril 18 G nål til gassutgangen fra systemet og sett gassutgangsnålen inn i flasken også.
- Før T-kryssene fra tankene gjennom oksygenmonitoren. Kontroller at oksygenkonsentrasjonen for målet strømmer gjennom systemet. Mål ca. 5 l/min gassstrøm.
- Omruting av T-kryssene fra tankene til gassproduksjonen. Gassen begynner å strømme gjennom serumflasken.
FORSIKTIG: Vær oppmerksom på trykkmåleren under oksygensparing. Hvis trykket øker uventet, må du slå av systemet umiddelbart. - Kjør oksygenspurge gjennom serumflasken i 1 min. Ved 5 L/min gir dette mulighet for 10 luftutvekslinger og sikrer at den indre atmosfæren når ønsket delvis trykk.
- Fjern gassutløsningen 18 G nål.
- La trykket i serumflasken bygge til +1 atmosfære (2 atmosfærer på havnivå) og fjern deretter gassutgangsnålen umiddelbart.
MERK: Opprettholdelse av trykk bidrar til oppbevaring av hyperoksiske forhold over tid. - Plasser serumflasken i en 37 °C inkubator shaker ved 150 o/min. Inkuber prøvene i tre intervaller på 24 timer. Ved hvert 24-timers intervall, ta en aliquot for nedstrømsanalyse, sparre prøvene på nytt og returner dem til inkubasjon for en total inkubasjonstid på 72 timer.
- Måling av utstrømningsoksygen
- Kalibrer oksygenmåleren til 21 % trykkluft, og slå deretter av tanken.
- Før serumflaskeinntaket gjennom oksygenmonitoren og fest en steril nål til enden.
- Sett nålen gjennom gummiproppen i serumflasken.
- Vent til utstrømningsavlesningen stabiliserer seg. En lav strømningshastighet ut av serumflaskene betyr at dette kan ta opptil 2 minutter. Rapporter toppforskjellen fra romluft (antall lengst fra 21%).
- Hvis du utfører flere avlesninger, skyller du systemet med trykkluft mellom avlesningene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Disse protokollene ble brukt på 50 ekspektorerte sputumprøver fra pwCF som presenterte for rutinemessig behandling til en poliklinisk cystisk fibroseklinikk ved Massachusetts General Hospital i Boston, Massachusetts. Hver pasients sputum ble dyrket under 21%, 50% og 100% oksygenforhold ved hjelp av det kunstige sputummediet, med 0,5 ml aliquots tatt fra hver kultur ved 24 timer, 48 timer og 72 timers kulturtid for testing. Kulturer ble fotografert da det ble gjort ekstraksjoner for å spore visuelle endringer. I tillegg ble en 0,5 ml aliquot av hver primære sputumprøve tatt før culturing. Dette resulterte i 10 diskrete prøver per pasient og en endelig N på 500 prøver. Av disse, sputum fra 11 pasienter (11 ukulturerte sputa, 11 kultivert sputa fra 21% oksygen ved 48 t inkubasjon) gjennomgikk nukleinsyreutvinning17, sekvenseringsbiblioteker ble generert ved hjelp av et kommersielt DNA-biblioteksforberedelsessett, og metagenomisk sekvensering ble utført på en hel genomsekvensplattform rettet mot ~ 5 Gb sekvens per prøve med 150 basepar, parede leseoperasjoner. Rålesninger ble behandlet ved hjelp av bioBakery-pakken med verktøy18, som inkluderer kvalitetskontroll og fjerning av menneskelige "forurensning" sekvenser og taksonomisk profilering med MetaPhlAn3 profiler19. På tidspunktet for nukleinsyreutvinning ble 10 millioner celler av Imtechella halotolerans, en halotolerant art som normalt finnes i elvemunningsøkosystemer og ikke i menneskelige mikrobielle samfunn, pigget inn i hver prøve, slik at kvantifisering av absolutt mikrobiell belastning for hver prøve20.
Figur 2 viser individuelle og gjennomsnittlige utstrømningsoksygenmålinger og pH-nivåer i løpet av kulturprosessen for 50 sputumprøver dyrket under hver oksygentilstand og et eksempel på en visuell differensialkulturfenotype. Kulturer ble opprettholdt ved 37 °C, unntatt i korte perioder da sparring og fjerning av prøve aliquots ble utført. Med både sparsomme intervaller på 12 timer og 24 timer ble forhøyede oksygenkonsentrasjoner opprettholdt, selv om det ble observert et fall over tid for alle tre oksygenforholdene, med 100% oksygen som falt til ca. 85%, 50% oksygen som falt til 40%, og 21% oksygen faller til 18%. Oksygenforholdene forble distinkte, og viktigst av alt ble forhøyede oksygenkonsentrasjoner opprettholdt gjennom hele prosessen for hyperoksiske prøver. pH-målinger viste større grad av variasjon, men holdt seg godt innenfor et fysiologisk normalt område uten statistisk signifikante endringer over tid. Disse målingene indikerer at disse metodene opprettholder diskrete differensialoksygenforhold gjennom hele kulturprosessen. Til slutt vises et eksempel på en av mange visuelle kulturfenotyper som differensieres på tvers av oksygenkonsentrasjon. Denne prøven hadde markert turbiditetsforskjeller etter 72 timers kultur, med høyere oksygen forbundet med lavere synsturbiditet. Differensialkultur fenotyper støtter tilstedeværelsen av hyperoksiainduserte effekter på kultursamfunn.
Figur 3 sammenligner mikrobiell belastning, mikrobielt mangfold og mikrobiell samfunnssammensetning mellom ukulturert sputum og dyrket sputum (21 % oksygentilstand i en periode på 48 timer). Målinger viser den eneste store forskjellen som ble innført ved kultiveringshandlingen å være en omtrent 20 ganger økning i mikrobiell belastning sammenlignet med ukulturert sputum. Immunsystemet og de typiske mekaniske sputumklaringsmekanismene som hoste tjener normalt som en regulatorisk prosess som begrenser mikrobiell belastning i lungen, selv i tilfeller av dysfunksjon og infeksjon som de som er sett i pwCF. Ex vivo kultur har ingen slike regulatoriske mekanismer, og mikrobielle samfunn står i stedet fritt til å fortsette mot cellulær metning. Alfa- og betamangfoldsmålinger indikerer at til tross for denne forskjellen i mikrobiell belastning, forblir den underliggende samfunnssammensetningen godt bevart, med minimale globale forskjeller introdusert av kulturprosessen.
Figur 4 utvider sammenligningen mellom ukulturerte og kultiverte sputumprøver, og ser på binær tilstedeværelse/fravær av de 120 mikrobielle artene som endelig identifiseres ved haglemetagenomisk sekvensering fra kultivert og ukulturert sputum hentet fra 11 pasienter. Mikrober er gruppert basert på fylogenetiske likheter. 46 (38,3 %) av disse artene ble identifisert i både ukulturerte og kultiverte prøver (cyanfarge), mens 35 (29,2 %) utelukkende ble identifisert i ukulturerte prøver (gul) og 39 (32,5 %) ble utelukkende identifisert i kultiverte prøver (blå). Det er sannsynlig at det er større paritet enn det vi identifiserte ved hjelp av sekvensering når det gjelder hva som er til stede og hva som er fraværende, men noen taxa faller under terskelen for sekvenseringsdeteksjon i noen tilfeller. Forskjellene tyder på at kulturprosessen introduserer en viss skjevhet i kultivert sammenlignet med ukulturert sputum. Spesielt øker kulturing tilstedeværelsen av sopp som Candida og Aspergillus, samt Enterobacterales-medlemmer, inkludert Escherichia, Serratiaog Streptococcus-medlemmer. På den annen side var bakterioideter medlemmer som Prevotella og Clostridiales, som er anaerober, til stede i ukulturerte prøver, men ikke til stede i kultiverte prøver. Dette kan tilskrives mangelen på en anaerob tilstand i vår eksperimentelle modell.
Figur 5 viser absorbansbaserte vekstkurver av vanlige CF-lungepatogener isolert fra sputum hentet fra 50 forskjellige pwCF. Disse isolasjonene representerer fenotypisk forskjellige kliniske isolasjoner oppnådd ved hjelp av berikelseskulturprosedyrer fra Massachusetts General Hospital Clinical Microbiology Laboratory, og inkluderer Pseudomonas aeruginosa (N = 53), Staphylococcus aureus (N = 37), Stenotrophomonas maltofili (N = 12), Klebsiella pneumoniae (N = 3), og Achromobacter (N = 7). Vekstkurver ble oppnådd ved å dyrke hver isolat i kunstige sputummedier ved 37 °C i mørket, med ASM sans bakteriell inokulasjon som en negativ kontroll. Den gjennomsiktige kvaliteten på ASM (som skyldes filter i stedet for varmesterilisering) gjør det mulig å gjennomføre optiske tiltak for å estimere vekstkurver. Optiske avlesninger på 600 nm (OD600) ble tatt hvert 10. Fraværet av endringer i optiske avlesninger i den kun ASM-negative kontrollen indikerer kulturer uten forurensning. De demonstrative kurvene som vises her, følger typiske vekstkurvemønstre som indikerer levedyktigheten til denne ASM-oppskriften som et medium for absorbansbasert generering av vekstkurver.
| Kolonne 1 | Kolonne 2 | Kolonne 3 | Kolonne 4 | Kolonne 5 | Kolonne 6 | Kolonne 7 | Kolonne 8 | Kolonne 9 | |
| Verdi | Comstock | Kirchner | Sriramulu | Palmer | Flynn | Gallagher | Lai | Kilde | |
| Mucin | 2 % m/v | 0,5 % m/v | 0,5 % m/v | - | 1 % m/v | 2 % m/v | 1 % m/v | Flynn | |
| Natriumklorid | 85,5 mM | 85,5 mM | 85,5 mM | 66,6 mM | 89,8 mM | 85,5 mM | 152,3 mM | Lapierre | |
| Kaliumklorid | 29,5 mM | 29,5 mM | 29,5 mM | 15,8 mM | - | 2,95 mM | 15,8 mM | Palmer | |
| Magnesiumsulfat | - | - | - | 0,6 mM | 1 mM | 1 mM | 0,61 mM | Palmer | |
| Jernsulfat | - | - | - | 0,0036 mM | - | - | - | - | |
| Ammoniumklorid | - | - | - | 2,3 mM | 60 mM | - | - | - | |
| Monopotassium fosfat | - | - | - | 2,5 mM | 60 mM | - | - | - | |
| Glukose | - | - | - | 3,2 mM | 13 mM | 40 mM | 0,7 mM | Sambeek | |
| Laktat | - | - | - | 9 mM | - | - | - | - | |
| Essensielle aminosyrer | 14,45x | 0,25 g/l | 0,25 g/l | Per syre | 0,5x | 0,375x | 1,29x | Palmer | |
| Ikke-essensielle aminosyrer | 28,9x | 0,25 g/l | 0,25 g/l | Per syre | 0,25x | 0,5x | 8.01x | Palmer | |
| Vitaminer | - | - | - | - | - | 1x | 1x | Gallagher | |
| Spor metaller | - | - | - | - | 1x | 1x | 1x | Flynn | |
| Eggeplomme | 0.25% | 0.25% | 0.25% | - | - | 0.25% | 0.25% | Kirchner | |
| Ferritin | 0,0003 g/l | - | - | - | - | 0,0004 g/l | 0,0004 g/l | Gallagher | |
| Laks Sperm DNA | 1,4 g/l | 4 g/l | 4 g/l | - | - | 1,4 g/l | - | - | |
| DPTA | - | - | 0,0059 g/l | - | - | - | - | - | |
| Ph | - | 6.9 | - | 6.8 | - | - | 6.3 | Lapierre | |
| Lagring | 0 | 4° | - | - | 4° | 4° | 4° | Kirchner | |
| Sterilisering | Autoklav | Filter | Autoklav | - | Autoklav | Autoklav | Filter | Kirchner | |
Tabell 1: Kunstig sputum medium oppskrift avledet fra gjennomgang av litteratur. (Kolonne 1) Reagenser og nøkkelverdier i formuleringen av kunstig sputummedium. (Kolonne 2-7) Sammenligning av oppskrifter fra extant litteratur8,9,10,12,14,15. (Kolonne 8-9) Kunstig sputum medium oppskrift detaljert i denne protokollen og de tilsvarende kildene som informerte hver valgte verdi10,11,12,13,14,15.
| Kolonne 1 | Kolonne 2 | Kolonne 3 |
| CF Sputum | ASM | |
| Totalt antall aminosyrer | 10,25 mM | 10,76 mM |
| Alanin | 0,96 mM | 0,80 mM |
| Arginine | 0,17 mM | 0,94 mM |
| Aspargin | 0,91 mM | |
| Asparaginsyre | 0,45 mM | 0,80 mM |
| Kystein | 0,09 mM | 0,33 mM |
| Glutaminsyre | 0,84 mM | 0,80 mM |
| Glysin | 0,65 mM | 0,80 mM |
| Histidin | 0,28 mM | 0,35 mM |
| Isoleucin | 0,60 mM | 0,52 mM |
| Leucine | 0,87 mM | 0,52 mM |
| Lysin | 1,15 mM | 0,64 mM |
| Metionin | 0,34 mM | 0,13 mM |
| Ornithine | 0,36 mM | |
| Fenylalanin | 0,29 mM | 0,26 mM |
| Proline | 0,90 mM | 0,80 mM |
| Serin | 0,78 mM | 0,80 mM |
| Threonine | 0,58 mM | 0,52 mM |
| Tryptofan | 0,07 mM | 0,06 mM |
| Tyrosin | 0,43 mM | 0,26 mM |
| Valine | 0,60 mM | 0,52 mM |
Tabell 2: Aminosyrekonsentrasjoner som tidligere er beskrevet i cystisk fibrose sputum og i kunstig sputum medium oppskrift detaljert i denne protokollen. (Kolonne 1) Viktige aminosyrer. (Kolonne 2) Aminosyrekonsentrasjoner av sputum fra personer med cystisk fibrose12. (Kolonne 3) Aminosyrekonsentrasjoner i kunstig sputum medium detaljert i denne protokollen
Figur 1: Tilkoblingsskjema for komponenter for oksygensparingssystem. Strømningsdiagram over forbindelsene mellom komponentene i systemet som brukes til å sparre serumflasker til ønskede oksygenkonsentrasjoner mellom 21% og 100%. Systemet har 3 bruksmåter bestemt av posisjonen til de to T-koblingsventilene. Systemet kan rute gass fra tankene gjennom gassutgangen eller gjennom oksygenprosentmonitoren, samt rute utstrømningsgass fra tidligere sparsomme serumflasker gjennom skjermen for å sjekke konsentrasjonen etter at tiden er gått. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Måloksygenkonsentrasjonene opprettholdes omtrent med både 12 t og 24 timers sparingintervaller, og pH forblir i det fysiologiske området under kultur. (A) Utstrømning av oksygenmålinger fra 12 t og 24 timers oksygensparingsintervaller over en 72-timers periode. (B) pH-avlesninger for prøver målt hver 24. (C) Et eksempelbilde av kultivert prøve CFB010 etter 72 timer, som viser differensial turbiditet på tvers av oksygenkonsentrasjoner. Fargen indikerer måloksygenprosent; feilfelt angir konfidensintervaller på 95 %. Kritiske terskler fremheves med stiplede linjer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Culturing øker mikrobiell belastning, men underliggende samfunnssammensetning bevares. Ukulturert sputum (gul) og dyrket sputum (blå) ved hjelp av kunstig sputummedium ved 21% oksygen i 48 timer. Aliquots gjennomgikk nukleinsyreutvinning og hagle metagenomisk sekvensering for å oppdage mulige skjevheter introdusert fra kulturforhold. (A) Absolutt mikrobiell belastning (bestemt av spike-in-kontroller) og alfamangfoldmålinger. Ved hjelp av lineære blandede effektmodeller forutsa ukulturert vs. kultivert sputum mikrobiell belastning, men ikke alfamangfold. (B) Ordinasjon av de to første komponentene i betamangfoldsmålinger, som kontrollerer for forskjell i mikrobiell belastning. Ingen signifikant forskjell i noen av beregningene etter PERMANOVA. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Flertallet av identifiserte taxa er til stede i både kilde sputum og kultur, mens andre bare vises i kilde sputum eller kultur. Haglemetagenomisk sekvensering som brukes til å sammenligne forskjeller i mikrobiell samfunnssammensetning mellom ukulturerte og kultiverte sputumprøver. Fylogenetisk tre av alle identifiserte mikrobielle arter i sekvenserte prøver (N = 120). Arter merket med gult (N = 35, 29,2%) ble bare sett i ukulturerte sputumprøver. Arter merket med blått (N = 39, 32,5%) ble bare sett i kunstige sputummediumkulturprøver. Arter merket med cyan (N = 46, 38,3%) ble sett i både ukulturerte og kultiverte prøver. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Kunstig sputummedium er tilstrekkelig gjennomsiktig til å brukes som vekstkurvemedium for å dyrke kliniske isolasjoner. Optimale tetthetsavlesninger på 600 nm ble tatt hvert 10. Grå linjer representerer individuelle avlesninger, og oransje linjer representerer gjennomsnittlig absorbans for hver takson. Kunstig sputum medium blank inkludert som en kontroll. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien ble en in vitro-modell utviklet for å studere effekten av hyperoksia på lungemikrobielle samfunn. Denne modellen, basert på kunstig sputummedium og daglig sparging av serumflasker, opprettholder forhøyede oksygenkonsentrasjoner og støtter veksten av mikrober identifisert i sputum fra pwCF.
Det er flere kritiske trinn i denne tilnærmingen. Først er valget å bruke filtersterilisering i stedet for varmesterilisering av det kunstige sputummediet. Filtersterilisering forhindrer denaturering av mucin og andre varmefølsomme komponenter i mediet og gir et klart medium som kan brukes til optiske mål på mikrobiell vekst. Mens filtersterilisering er foreslått i andre protokoller10, har vi funnet ut at tilsetning av orbital risting under filtreringsprosessen var avgjørende for å forhindre tilstopping av filteret som ellers skjedde når en minimumsmengde av det forberedte mediet var filtrert. Mens det filtrerte kunstige sputummediet kan ha en lavere enn tiltenkt endelig mucinkonsentrasjon på grunn av mucinpåvirkning i filteret, har sputum fra pwCF vist seg å ha lavere mucinkonsentrasjoner enn sputum fra personer uten cystisk fibrose21. Start mucinkonsentrasjonen på 1% som brukes i denne protokollen er høyere enn i andre tilnærminger som har brukt filtersterilisering, med en gruppe som bruker en start mucinkonsentrasjon på 0,5%10, mens typiske oppskrifter bruker mucinkonsentrasjoner fra 0,5% -2% (Tabell 1). Således, selv med tap av mucin i filtersteriliseringsprosessen, vil det endelige mediet som er utarbeidet ved hjelp av denne protokollen sannsynligvis ha mucinkonsentrasjoner innenfor det fysiologiske området22.
Den andre er sammensetningen av kunstig sputummedium. Oppskriften på kunstig sputummedium ble valgt ut fra eksisterende fysiologiske studier av sputum fra pwCF (tabell 1). Ved hjelp av haglemetagenomisk sekvensering kunne vi bekrefte at sputum dyrket med dette kunstige sputummediet, i stor grad rekapitulerer den mikrobielle samfunnssammensetningen av ukulturert sputum (figur 3). Ved normoksiske forhold støttet dette mediet også veksten av 112 forskjellige kliniske isolasjoner som representerer vanlige patogener isolert fra sputum av cystiske fibrosepasienter. Dermed viser disse dataene at denne formuleringen av kunstig sputummedium støtter veksten av luftveismikrobiota fra pwCF. Lakse sperm DNA, et vanlig tillegg til eksisterende oppskrifter (Tabell 1), ble utelatt. En tiltenkt anvendelse av denne modellen er metagenomisk sekvensering, og dermed ble lakse sperm DNA ikke inkludert for å redusere tilsetningen av ikke-mikrobielle nukleinsyrer, da disse lesningene ville bli filtrert ut etter sekvensering, og dermed redusere vår effektive sekvenseringsdybde. Mens sputum fra pwCF har høye konsentrasjoner av ekstracellulært DNA23, en betydelig andel av det er mikrobielt opprinnelse24, og det er uklart om tilsetningen av lakse sperm DNA til det kunstige sputummediet gjør det mer fysiologisk eller om kulturtilnærmingen beskrevet i denne protokollen fører til høye nivåer av mikrobielt avledet ekstracellulært DNA; vi skilte ikke mellom ekstra- og intracelle-DNA-konsentrasjoner i studiene våre. Fremtidige studier kan ønske å verifisere konsentrasjonen av ekstracellulært DNA generert av denne dyrkingsmetoden.
For det tredje, så vidt vi vet, har ingen publiserte studier på cystisk fibrose lungemikrobielle samfunn adressert hyperoksiske tilstander. Denne modellen bruker billig og allment tilgjengelig utstyr fra generelle laboratorie- eller sykehusleverandører for å bygge et oksygensparingssystem. Viktige hensyn for vedlikehold av hyperoksiske forhold inkluderer volumet av kulturmediet i forhold til tilgjengelig hoderom i serumflaskene. I innledende forsøk under protokollutvikling ble det brukt 125 ml serumflasker. Bruken av 500 ml serumflasker (som tillater et 475 ml hoderom til 25 ml kulturforhold) tillot imidlertid vedlikehold av ønsket konsentrasjon i opptil 24 timer, og dermed reduserte oksygensparingsfrekvensen. Denne tilnærmingen genererer diskrete oksygenforhold, og tillater dermed samtidig kultur av forskjellige pasientprøver på tvers av flere oksygenforhold. Andre verktøy fra anaerob kultur kan utnyttes for hyperoksisk kultur, inkludert bruk av anaerobe krukker eller Balch-type rør spart med oksygen. Analyser av lungemikrobielle samfunn ved hjelp av metagenomisk sekvensering tyder på at det samlede alfa- og betamangfoldet er sammenlignbart mellom kultivert og ukulturert sputum. Ved evaluering av differensialoverflod på artsnivå, kultivering på 21% oksygen, beriket for veksten av aerober og fakultetsanaerober, inkludert Enterobacterale, Streptococcus og sopp. Dette skyldes sannsynligvis utelukkelse av en anaerob tilstand som er observert i luftveiene til pwCF25,26. Fremtidige studier kan vurdere inkludering av nitrogengass i denne modellen for å studere en rekke anoksiske og oksiske forhold og tilsvarende aerob og anaerob mikrobiota som finnes i luftveismikrobielle samfunn.
De viktigste prinsippene som er skissert i disse protokollene, kan være lærerike for gjennomføringen av lignende studier relatert til påvirkning av oksygen på komplekse mikrobielle samfunn eller vanlige lungepatogener. Oksygen er den vanligste behandlingen som brukes til å behandle alle avanserte lungesykdommer, og en bedre forståelse av hvordan det kan føre til sikkerhetsmessige uforutsiktede effekter på luftveis mikrobielle samfunn og vanlige respiratoriske patogener vil være viktig for omsorgen for pwCF og andre kroniske lungesykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
En del av dette arbeidet ble utført ved Marine Biological Lab med støtte fra Marine Biological Lab, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (tilskuddsnummer 5600373), og en gave fra Simons Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BME Vitamins (100x) Solution | MilliporeSigma | B6891 | Concentrated solution of supplemental vitamins. |
| Crimper, 30 mm | DWK Life Sciences | 224307 | Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles. |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | Solid glucose powder (dextrorotatory isomer). |
| Diaphragm Pump ME 2 NT | VACUUBRAND | 20730003 | Vacuum pump for vacuum filtration. |
| Egg Yolk Emulsion | HiMedia | FD045 | Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline. |
| Ferritin, Cationized from Horse Spleen | MilliporeSigma | F7879 | Ferritin (iron-storage protein) solution. |
| FIREBOY plus Safety Bunsen Burner | Integra Biosciences | 144000 | Bunsen burner with user interface and safety features. |
| Hydrion pH Paper (1.0–14.0) | Micro Essential Laboratory | 94 | pH testing paper for the range of 1.0–14.0. |
| Hydrion pH Paper (4.0–9.0) | Micro Essential Laboratory | 55 | pH testing paper for the range of 4.0–9.0. |
| Hydrion pH Paper (6.0–8.0) | Micro Essential Laboratory | 345 | pH testing paper for the range of 6.0–8.0. |
| Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G | Smiths Medical | 401815 | 18 G needles with safety caps. |
| In-Line Pressure Gauge | MilliporeSigma | 20469 | Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure. |
| Innova 42 Incubated Shaker | Eppendorf | 2231000756 | Combination incubator/orbital shaker. |
| Luer-Lok Syringe with Attached Needle | Becton Dickinson | 309580 | Combination 3 mL syringe and 18 G needle. |
| Luer Valve Assortment | World Precision Instruments | 14011 | Valves for gas flow tubing. |
| LSE Orbital Shaker | ThermoFisher Scientific | 6780-NP | Orbital shaker to agitate media during filtration. |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | MilliporeSigma | M2773 | Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate). |
| Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-346-15FM | Air flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| MEM Amino Acids (50x) Solution | MilliporeSigma | M5550 | Concentrated solution of essential amino acids. |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution | MilliporeSigma | M7145 | Concentrated solution of non-essential amino acids. |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | MilliporeSigma | SLMP25SS | 0.22 µm polyethersulfone membrane sterile syringe filter. |
| Milli-Q Academic | MilliporeSigma | ZMQS60E01 | Milli-Q sterile water filtration system. |
| MiniOX 3000 Oxygen Monitor | MSA | 814365 | Gas flow oxygen percentage monitor. |
| MOPS Buffer (1 M, pH 9.0) | Boston BioProducts | BBM-90 | MOPS buffer for adjusting media pH. |
| Mucin from Porcine Stomach | MilliporeSigma | M2378 | Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder. |
| Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit | Harvard Apparatus | 72-1413 | Connectors for gas flow tubing. |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Library preparation for identification during sequencing. |
| NovaSeq 6000 Sequencing System | Illumina | 770-2016-025-N | Shotgun sequencing platform for generating sample reads. |
| Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-540-15FM | Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors | SunMed | 2001-01 | Tubing for connecting gas system components. |
| Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 | Molecular Biologicals International | MRGF-6235 | Concentrated phosphate-buffered saline solution. |
| PC 420 Hot Plate/Stirrer | Marshall Scientific | CO-PC420 | Combination hot plate/stirrer. |
| Potassium Chloride | MilliporeSigma | P9541 | Solid potassium chloride salt. |
| PTFE Disposable Stir Bars | ThermoFisher Scientific | 14-513-95 | Disposable magnetic stir bars. |
| PTFE Thread Seal Teflon Tape | VWR | 470042-938 | Teflon tape for reinforcing gas system connections. |
| Q-Gard 2 Purification Cartridge | MilliporeSigma | QGARD00D2 | Purification cartridge for Milli-Q system. |
| Reusable Media Storage Bottles | ThermoFisher Scientific | 06-423A | Bottles for mixing and storing culture media. |
| Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl | DWK Life Sciences | 224100-331 | Rubber stoppers for serum bottles. |
| Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL | DWK Life Sciences | 223952 | Glass serum bottles for sealed culturing. |
| Small Bore Extension Set | Braun Medical | 471960 | Tubing extension with luer lock connectors. |
| Sodium Chloride | MilliporeSigma | S3014 | Solid sodium chloride salt. |
| Spike-in Control I (High Microbial Load) | ZymoBIOMICS | D6320 | Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations |
| Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System | MilliporeSigma | S2GPU02RE | 250 mL 0.22 µm vacuum filtration chamber. |
| Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes | Professional Disposables International | H04082 | Disposable germicidal wipes for sterilization. |
| Trace Metals Mixture, 1000x | ThermoFisher Scientific | NC0112668 | Concentrated solution of physiological trace metals. |
| Unlined Aluminum Seal, 30 mm | DWK Life Sciences | 224187-01 | Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers. |
| USP Medical Grade Air Tank | Airgas | AI USP200 | Compressed air tank for input to sparging system. |
| USP Medical Grade Oxygen Tank | Airgas | OX USP200 | Compressed oxygen tank for input to sparging system. |
References
- Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLoS One. 13 (3), 0194060 (2018).
- Acosta, N., et al. Sputum microbiota is predictive of long-term clinical outcomes in young adults with cystic fibrosis. Thorax. 73 (11), 1016-1025 (2018).
- Muhlebach, M. S., et al. Initial acquisition and succession of the cystic fibrosis lung microbiome is associated with disease progression in infants and preschool children. PLoS Pathogens. 14 (1), 1006798 (2018).
- Zolin, A., Bossi, A., Cirilli, N., Kashirskaya, N., Padoan, R. Cystic fibrosis mortality in childhood. Data from European cystic fibrosis society patient registry. International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (9), (2018).
- Ramos, K. J., et al. Heterogeneity in survival in adult patients with cystic fibrosis with FEV1 30% of predicted in the United States. Chest. 30 (6), 1320-1328 (2017).
- Ramos, K. J., et al. Predictors of non-referral of patients with cystic fibrosis for lung transplant evaluation in the United States. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (2), 196-203 (2016).
- Girardis, M., et al. Effect of conservative vs conventional oxygen therapy on mortality among patients in an intensive care unit: The Oxygen-ICU randomized clinical trial. JAMA. 316 (15), 1583-1589 (2016).
- Comstock, W. J., et al. The WinCF model - An inexpensive and tractable microcosm of a mucus plugged bronchiole to study the microbiology of lung infections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55532 (2017).
- Diraviam Dinesh, S.
- Kirchner, S., et al. Use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against Pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3857 (2012).
- Grandjean Lapierre, S., et al. Cystic fibrosis respiratory tract salt concentration: An Exploratory Cohort Study. Medicine. 96 (47), Baltimore. 8423 (2017).
- Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
- Van Sambeek, L., Cowley, E. S., Newman, D. K., Kato, R. Sputum glucose and glycemic control in cystic fibrosis-related diabetes: a cross-sectional study. PLoS One. 10 (3), 0119938 (2015).
- Flynn, J. M., Niccum, D., Dunitz, J. M., Hunter, R. C. Evidence and role for bacterial mucin degradation in cystic fibrosis airway disease. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005846 (2016).
- Gallagher, T., et al. Liquid chromatography mass spectrometry detection of antibiotic agents in sputum from persons with cystic fibrosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 65 (2), (2021).
- Voynow, J. A., Rubin, B. K.
- Sui, H. Y., et al. Impact of DNA extraction method on variation in human and built environment microbial community and functional profiles assessed by shotgun metagenomics sequencing. Frontiers in Microbiology. 11, 953 (2020).
- McIver, L. J., et al. bioBakery: a meta'omic analysis environment. Bioinformatics. 34 (7), 1235-1237 (2018).
- Truong, D. T., et al. MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling. Nature Methods. 12 (10), 902-903 (2015).
- Stammler, F., et al. Adjusting microbiome profiles for differences in microbial load by spike-in bacteria. Microbiome. 4 (1), 28 (2016).
- Henke, M. O., Renner, A., Huber, R. M., Seeds, M. C., Rubin, B. K. MUC5AC and MUC5B mucins are decreased in cystic fibrosis airway secretions. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 86-91 (2004).
- Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyper concentration and increased osmotic pressure. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3047-3060 (2014).
- Matthews, L. W., Spector, S., Lemm, J., Potter, J. L. Studies on pulmonary secretions. I. The over-all chemical composition of pulmonary secretions from patients with cystic fibrosis, bronchiectasis, and laryngectomy. American Review of Respiratory Disease. 88, 199-204 (1963).
- Ibanez de Aldecoa, A. L., Zafra, O., Gonzalez-Pastor, J. E. Mechanisms and regulation of extracellular DNA release and its biological roles in microbial communities. Frontiers in Microbiology. 8, 1390 (2017).
- Tunney, M. M., et al. Detection of anaerobic bacteria in high numbers in sputum from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (9), 995-1001 (2008).
- Worlitzsch, D., et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Investigation. 109 (3), 317-325 (2002).
