Summary
O objetivo deste protocolo é desenvolver um sistema modelo para o efeito da hiperoxia nas comunidades microbianas da fibrose cística. O meio de escarro artificial emula a composição da escarro, e as condições de cultura hiperóxica modelam os efeitos do oxigênio suplementar nas comunidades microbianas pulmonares.
Abstract
Acredita-se que as comunidades microbianas das vias aéreas desempenham um papel importante na progressão da fibrose cística (CF) e outras doenças pulmonares crônicas. Micróbios têm sido tradicionalmente classificados com base em sua capacidade de usar ou tolerar oxigênio. O oxigênio suplementar é uma terapia médica comum administrada a pessoas com fibrose cística (pwCF); no entanto, estudos existentes sobre oxigênio e microbioma das vias aéreas têm se concentrado em como a hipóxia (baixo oxigênio) em vez de hiperoxia (alto oxigênio) afeta as comunidades microbianas pulmonares aeróbicas e facultativas predominantemente aeróbicas e facultativas. Para resolver essa lacuna de conhecimento crítico, este protocolo foi desenvolvido utilizando um meio de escarro artificial que imita a composição da escarro da pwCF. O uso da esterilização do filtro, que produz um meio transparente, permite que métodos ópticos acompanhem o crescimento de micróbios unicelulares em culturas de suspensão. Para criar condições hiperóxiicas, esse sistema modelo aproveita técnicas de cultivo anaeróbicas estabelecidas para estudar condições hiperóxiis; em vez de remover oxigênio, o oxigênio é adicionado às culturas por meio de uma mistura diária de garrafas de soro com uma mistura de oxigênio comprimido e ar. A sputum de 50 pwCF passou por uma sparging diária por um período de 72h para verificar a capacidade deste modelo de manter condições diferenciais de oxigênio. O sequenciamento metagenômico da espingarda foi realizado em amostras de escarro cultivadas e não cultivadas de 11 pwCF para verificar a capacidade deste meio de suportar o crescimento de micróbios commensais e patogênicos comumente encontrados em escarro de fibrose cística. As curvas de crescimento foram obtidas a partir de 112 isolados obtidos da PwCF para verificar a capacidade deste meio de escarro artificial para apoiar o crescimento de patógenos comuns de fibrose cística. Descobrimos que este modelo pode cultivar uma grande variedade de patógenos e commensais na escória CF, recupera uma comunidade altamente semelhante à escória não cultivada sob condições normóxias, e cria diferentes fenótipos de cultura em condições variadas de oxigênio. Essa nova abordagem pode levar a uma melhor compreensão dos efeitos imprevistos induzidos pelo uso de oxigênio em pwCF em comunidades microbianas das vias aéreas e patógenos respiratórios comuns.
Introduction
A fibrose cística (CF) é uma doença genética caracterizada pela incapacidade de limpar muco espesso dos pulmões, levando a infecções repetidas e declínio da função pulmonar progressiva que muitas vezes resulta na necessidade de transplante de pulmão ou morte. O microbioma das vias aéreas de pessoas com fibrose cística (pwCF) parece acompanhar a atividade da doença1, com redução da diversidade microbiana associada a desfechos adversos a longo prazo2,3. Em estudos clínicos da PWCF, a oxigenoterapia suplementar tem sido associada a uma doença mais avançada4,5, embora tradicionalmente, o uso de oxigenoterapia tenha sido visto como simplesmente um marcador para a gravidade da doença6. Estudos recentes de um estudo clínico de pacientes com insuficiência respiratória mostraram que níveis mais altos de oxigênio do paciente estão paradoxalmente associados a um aumento de infecções bacterianas graves e maior mortalidade7,sugerindo que o oxigênio suplementar pode contribuir para a patogênese da doença. O efeito do oxigênio suplementar no microbioma pulmonar da fibrose cística e nas comunidades microbianas pulmonares e aéreas associadas não tem sido bem estudado.
Estudos mecanicistas muitas vezes não podem ser realizados diretamente em seres humanos devido a dificuldades logísticas e potenciais questões éticas associadas a intervenções de benefício ou dano médico desconhecido. Abordagens translacionais que integram bioespégios humanos em sistemas de modelos podem oferecer importantes insights biológicos nesses casos. Embora a capacidade de usar ou tolerar oxigênio tenha sido tradicionalmente um componente importante da classificação microbiana, pouco se sabe sobre como a introdução terapêutica de oxigênio suplementar ao meio ambiente pode perturbar as comunidades microbianas das vias aéreas. Para lançar luz sobre os efeitos desconhecidos do oxigênio suplementar nos microbiomas das vias aéreas da PWCF, precisávamos enfrentar dois grandes desafios; primeiro, a criação de um meio de cultura que se aproxima fisiologicamente da composição do escarro CF; segundo, a criação de um sistema modelo que permita a manutenção de concentrações elevadas de oxigênio na cultura por longos períodos de tempo.
Asm (Artificial sputum media, mídia artificial) são amplamente utilizados para emular escarro pulmonar ex vivo8,9,10, mas não há um consenso claro sobre uma receita específica. Este protocolo descreve uma receita média de escarro artificial e estratégia de preparação cuidadosamente projetada para se aproximar fisiologicamente da pwCF. A Tabela 1 descreve os valores da receita escolhida com base na literatura publicada. Componentes químicos básicos e pH foram combinados com valores identificados por estudos de espiato de CF humano11,12,13. Foram adicionados nutrientes fisiológicos de baixa concentração utilizando-se gema de ovo, que foi incluída em 0,25% do volume final10,bem como misturas de vitamina e metal trace14,15. A mucina, o componente-chave da escarro16,foi incluída em 1% c/v14. Embora mais trabalhosa, a esterilização do filtro foi escolhida sobre a prática mais convencional de esterilização térmica para reduzir problemas potenciais da desnaturação induzida pelo calor dos componentes essenciais da mídia10. Um benefício adicional da esterilização do filtro é que ele gera mídia transparente (a esterilização de calor pode criar mídia turva devido à precipitação e coagulação de sais e proteínas), permitindo que essa mídia artificial de escarro seja usada para acompanhar o crescimento microbiano com base no aumento da turbidez.
Este sistema modelo para a cultura hiperóxica é baseado em técnicas de cultivo anaeróbica onde o oxigênio é adicionado em vez de removido, criando um modelo para o efeito do uso de oxigênio suplementar para pwCF. A Figura 1 e o protocolo de sparging de oxigênio associados descrevem os componentes de um sistema de sparging de oxigênio, que pode ser obtido a baixo custo de fornecedores gerais de laboratórios e hospitais. Este sistema permite a mistura de oxigênio comprimido e ar para concentrações fixas que variam de 21%a 100% de oxigênio. A integração de um sensor de oxigênio permite a verificação da concentração da mistura de gás de saída, bem como verificar a composição do gás de saída de garrafas de soro previamente espaçadas para verificar se as condições de oxigênio foram mantidas dentro da faixa desejada.
Este protocolo descreve procedimentos para criar um meio de escarro artificial, a construção e o uso de um sistema de sparging de oxigênio, e a aplicação de ambos para cultura de escarro CF em condições diferenciais de oxigênio.
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Protocol
Este estudo recebeu aprovação do Conselho de Revisão Institucional de Parceiros (Protocolo nº 2018P002934). O critério de inclusão incluiu pacientes adultos com fibrose cística que forneceram consentimento por escrito informado para o estudo. Não houve critério de exclusão. De acordo com as diretrizes do protocolo, todas as amostras de escarro foram coletadas de pacientes com fibrose cística durante uma visita ambulatorial agendada com seu provedor clínico.
1. Preparação média artificial de escarro
NOTA: As quantidades listadas aqui são para a produção de 1 L de meio de escarro artificial final, e assumem os reagentes específicos listados na Tabela de Materiais. Os números devem ser ajustados para outros volumes ou para o uso de reagentes diferentes para garantir o mesmo produto final. Consulte a Tabela 1 para concentrações de alvos.
- Mistura química de escarro artificial (ASCM)
NOTA: O ASCM representa 25% do volume médio final. É estante estável e pode ser preparado a granel ou com antecedência. Se estiver sendo preparado para uso posterior, autoclave a mistura química e armazene-a com segurança à temperatura ambiente.- Misture as soluções de estoque químico constituinte.
- Prepare 1 M NaCl stock: Adicione 58,44 g de NaCl por litro de água estéril.
- Prepare 1 M KCl estoque: Adicione 74,55 g de KCl por litro de água estéril.
- Prepare 1 M MgSO4 estoque: Adicione 246,47 g de MgSO4·7H2O por litro de água estéril, ou 120,37 g de MgSO4 anidro por litro de água estéril.
- Prepare 1 M de glicose: Adicione 180,16 g de glicose por litro de água estéril.
- Autoclave esterilizar as soluções de estoque químico, bem como uma garrafa vazia de 250 mL. Realize as etapas de autoclavagem a valores pelo menos padrão de 121 °C e 15 PSI por 30 min.
- Adicione 80,59 mL de água estéril à garrafa vazia de 250 mL.
- Adicione 152,30 mL de 1 M NaCl à mistura.
- Adicione 15,8 mL de 1 M KCl de estoque à mistura.
- Adicione 610 μL de 1 M MgSO4 à mistura.
- Adicione 700 μL de 1 M de glicose à mistura.
- Misture as soluções de estoque químico constituinte.
- Mistura de mucina de escarro artificial (ASMM)
NOTA: A ASMM representa 50% do volume médio final. Certifique-se de que ele está preparado no mesmo dia do lote médio final.- Adicione 450 mL de água estéril a uma garrafa 1 L vazia.
- Adicione 50 mL de Salina Tamponada de Fosfato de 10x (PBS) à garrafa.
- Adicione uma barra de mexiça magnética descartável à garrafa.
- Autoclave a garrafa contendo PBS e a barra de mexida.
- Meça 10 g de mucina em pó e adicione-o ao PBS.
- Agite a garrafa vigorosamente para misturar preliminarmente.
- Coloque a garrafa em uma placa quente com um agitador magnético. Defina o calor para o alvo médio-alto de 50 °C e a velocidade de agitação a 1100 rpm. Aumente a velocidade gradualmente para que a barra não voe para fora do ímã.
- Deixe aquecer e mexa por 15 minutos.
- Pegue a garrafa com luvas resistentes ao calor. Observe para verificar se o pó de mucina se instala fora da solução.
- Se o pó de mucina não estiver totalmente dissolvido, devolva a garrafa ao aquecedor/agitador por intervalos de 5 minutos até que esteja completamente dissolvida.
- Deixe a mistura de mucina esfriar à temperatura ambiente.
- Mistura biológica de escarro artificial (ASBM)
NOTA: ASBM é 25% do volume médio final. Prepare-o no mesmo dia do lote médio final, e ao contrário das outras misturas, não exponha seus componentes a nenhum calor.- Descongele o estoque de vitaminas de 100x em uma geladeira de 4 °C ou no gelo.
NOTA: Pré-porção do estoque de vitaminas em alíquotas de 10 mL para minimizar o número de ciclos de congelamento/degelo. - Adicione 124,24 mL de água estéril à garrafa vazia autoclaved de 250 mL.
- Adicione 25,76 mL de 50x de estoque essencial de aminoácidos à mistura.
- Adicione 80,14 mL de 100x de aminoácidos não essenciais à mistura.
- Adicione 10 mL de (descongelado) 100x de vitaminas à mistura.
- Adicione 1 mL de 1000x de material de metais de traço à mistura.
- Adicione 8,33 mL de 30% de emulsão de gema de ovo à mistura.
- Adicione 400 μL de 10 g/L de ferritina à mistura.
- Misture bem a solução através de agitação manual.
- Descongele o estoque de vitaminas de 100x em uma geladeira de 4 °C ou no gelo.
- Meio de escarro artificial (ASM)
- Adicione 250 mL de ASCM à garrafa de 1 L contendo ASMM.
- Adicione 250 mL de ASBM à garrafa média.
- Titula o meio com tampão MOPS básico (1 M) para atingir um pH de 6,3 em um papel pH de faixa estreita. Antes da titulação, a mistura média será muito ácida.
- Leve à geladeira o meio de escarro artificial resultante a 4 °C até estar pronto para filtragem.
- Para iniciar o processo de filtragem, transfira 200 mL de meio de escarro artificial não filtrado para um sistema de filtragem de vácuo com um filtro de tamanho de poros de 0,22 μm.
- Conecte o sistema de filtragem à bomba de vácuo, ligue a bomba de vácuo, coloque-a em 70 mbar e, em seguida, coloque a câmara em um agitador orbital tremendo a 90 rpm em uma sala fria a 4 °C.
- Cubra com um adicional de 150 mL do meio como uma quantidade considerável é filtrada. Leva de 1 a 2 dias para filtrar 1 L de meio completamente.
- Repita com câmaras adicionais até que toda a mídia seja filtrada.
NOTA: Tente não filtrar mais de 350 mL do meio através do mesmo filtro de 0,22 μm, pois a mucina irá conectar o filtro ao longo do tempo.
- Leve à geladeira meio de escarro artificial filtrado a 4 °C até estar pronto para uso. Use o ASM dentro de um mês de preparação para obter melhores resultados.
2. Sparging de oxigênio
- Configuração da estação de sparging
NOTA: Este protocolo só deve ser feito na íntegra uma vez, após esse ponto a configuração pode ser mantida através de uma simples manutenção, conforme necessário. Consulte a Figura 1 para obter um esquema visual do sistema de espanamento de oxigênio.- Obtenha e proteja adequadamente os tanques de ar comprimido e oxigênio.
ATENÇÃO: A alta pressão torna os tanques extremamente perigosos quando mal tratados. Certifique-se de que os tanques estão completamente selados e protegidos, não há vazamentos quando o tanque está fechado, e que todo o pessoal de manuseio é totalmente treinado em seu uso. - Conecte um regulador de ar ao tanque de ar comprimido com uma chave inglesa. Para uma leitura de fluxo ideal no regulador, conecte o regulador o mais próximo possível de uma posição vertical.
- Conecte um regulador de oxigênio ao tanque de oxigênio comprimido, prendendo o mais próximo possível a uma posição vertical. Dependendo do tanque de oxigênio, pode-se precisar inverter a direção para apertar.
- Conecte a tubulação dos reguladores a um conector Y para combinar o fluxo de gás dos dois tanques.
- Conecte a saída do conector Y à válvula central de junção T.
- Conecte um lado da válvula central de junção T a um medidor de pressão de gás.
- Conecte o outro lado do medidor de pressão do gás a um filtro de seringa estéril de 25 mm de diâmetro com um tamanho de poro de 0,22 μm.
- Conecte um segundo filtro de seringa de 25 mm de diâmetro a uma seringa sem um êmbolo para ser usado como liberação de gás durante a escore.
- Conecte o lado final da válvula central de junção T a uma segunda válvula de junção T para o monitor de oxigênio.
- Conecte um filtro de seringa de 25 mm de diâmetro a um lado desta segunda válvula de junção T, juntamente com tubos para fixar agulhas de 18 G.
- Conecte o lado final da segunda válvula de junção T ao aparelho de monitoramento de oxigênio.
- Conecte um tubo de corte ao outro lado do aparelho de monitoramento de oxigênio para ser usado como liberação de gás durante o monitoramento.
ATENÇÃO: Ao testar/usar o sistema de sparging de oxigênio, tome cuidado com a posição das junções T e certifique-se de que ele corresponde ao caminho pretendido através do sistema. Se não o fizer, o acúmulo de pressão dentro do sistema fará com que os componentes falhem e se desfaçam. - Para a manutenção do sistema e para mantê-lo funcionando com o desempenho ideal, as seguintes práticas são benéficas.
- Reforçar as conexões com quantidades liberais de fita Teflon para melhorar muito seu selo e reduzir a chance de componentes se afastarem da pressão interna.
- Mantenha a taxa de fluxo combinada abaixo de 10 L/min para mitigar a pressão máxima e evitar falhas.
- Se houver suspeita de vazamento, use uma solução de detergente, como detectores de vazamentos líquidos disponíveis comercialmente para identificar sua localização facilmente, pois ele irá borbulhar acima de qualquer vazamento de gás. Patch vaza usando uma fita de Politetrafluoroetileno (por exemplo, Teflon).
- Substitua os filtros de seringa de 25 mm de diâmetro no sistema de sparging de oxigênio quinzenalmente, mas isso varia com a frequência de uso. Com o tempo, partículas capturadas no filtro reduzem a vazão do gás e causam acúmulos de pressão.
- Calibrar o monitor de oxigênio para 21% de oxigênio comprimido de ar antes de realizar medições.
- Após a conclusão do uso do sistema, desligue os tanques e sangre o excesso de gás dos reguladores até que o fluxo pare completamente.
- Obtenha e proteja adequadamente os tanques de ar comprimido e oxigênio.
- Cultura de garrafas de soro sparging
- Rotule garrafas de soro autoclaved de 500 mL com identificadores de amostras, data/hora da inoculação e porcentagem de oxigênio alvo.
- Em um capô biológico, adicione 24 mL do meio de escarro artificial a cada garrafa de soro que está sendo configurada.
- Adicione 1 mL da escarro do paciente homogeneizada com uma agulha de 18 G (diluída com soro estéril, se necessário, para obter volume suficiente de amostra para cada condição de cultura) a cada garrafa de soro.
- Usando pinças estéreis, coloque as rolhas de borracha autoclaved na parte superior de cada garrafa de soro.
- Pressione as rolhas de borracha, tome cuidado para não tocar na parte inferior da rolha com as mãos.
- Retire as garrafas do capô, aplique e amasse as vedações de alumínio. Remova a peça central das vedações.
- Limpe o topo das garrafas com um lenço de álcool e passe-as através de uma chama de bico bunsen.
- Fixar uma agulha estéril de 18 G a uma seringa sem êmbolos com um filtro. Insira esta liberação de gás na garrafa primeiro.
- Fixar uma agulha estéril de 18 G na saída de gás do sistema e inserir a agulha de saída de gás no frasco também.
- Encaminhe as junções T dos tanques através do monitor de oxigênio. Verifique se a concentração de oxigênio alvo está fluindo através do sistema. Alvo aproximadamente 5 L/min de fluxo de gás.
- Redirecione as junções T dos tanques até a saída de gás. O gás começa a fluir através da garrafa de soro.
ATENÇÃO: Preste muita atenção ao medidor de pressão durante a espansagem de oxigênio. Se a pressão aumentar inesperadamente, desligue o sistema imediatamente. - Passe o oxigênio pela garrafa de soro por 1 min. A 5 L/min, isso permite 10 trocas de ar e garante que a atmosfera interna atinja a pressão parcial desejada.
- Remova a liberação de gás agulha de 18 G.
- Deixe a pressão na garrafa de soro para construir para +1 atmosfera (2 atmosferas ao nível do mar) e, em seguida, remova imediatamente a agulha de saída de gás.
NOTA: A manutenção da pressão auxilia a retenção de condições hiperóxias ao longo do tempo. - Coloque a garrafa de soro em um agitador de incubadora de 37 °C a 150 RPM. Incubar as amostras para três intervalos de 24h. Em cada intervalo de 24h, pegue uma alíquota para análise a jusante, ressurrea as amostras e devolva-as à incubação por um tempo total de incubação de 72 h.
- Medição de oxigênio de saída
- Calibrar o medidor de oxigênio para 21% de ar comprimido e, em seguida, desligue o tanque.
- Encaminhe a entrada da garrafa de soro através do monitor de oxigênio e afixe uma agulha estéril até o fim.
- Insira a agulha através da rolha de borracha na garrafa de soro.
- Aguarde que a leitura do fluxo se estabilize. Uma baixa taxa de fluxo fora das garrafas de soro significa que isso pode levar até 2 minutos. Relatar a diferença de pico do ar do quarto (número mais distante de 21%).
- Se realizar múltiplas leituras, lave o sistema com ar comprimido entre as leituras.
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Representative Results
Esses protocolos foram aplicados a 50 amostras de escarro esperados da PWCF apresentando cuidados de rotina para uma clínica de fibrose cística ambulatorial no Massachusetts General Hospital em Boston, Massachusetts. A escarro de cada paciente foi cultivada abaixo de 21%, 50% e 100% de oxigênio usando o meio de escarro artificial, com alíquotas de 0,5 mL tiradas de cada cultura às 24h, 48h e 72h de tempo de cultura para testes. As culturas foram fotografadas quando foram feitas extrações para acompanhar as mudanças visuais. Além disso, foi colhida uma alíquota de 0,5 mL de cada amostra primária de escarro antes da cultura. Isso resultou em 10 amostras discretas por paciente e um N final de 500 amostras. Destes, escarro de 11 pacientes (11 sputa não cultivada, 11 sputa cultivada de 21% de oxigênio a 48 h de incubação) foram submetidas à extração de ácido nucleico17, bibliotecas de sequenciamento foram geradas usando um kit de preparação de biblioteca de DNA comercial, e sequenciamento metagenômico foi realizado em toda uma plataforma de sequenciamento de genomas visando ~ 5 Gb de sequência por amostra com 150 base, par pares-end lê. As leituras brutas foram processadas utilizando-se o conjunto bioBakery de ferramentas18,que inclui controle de qualidade e remoção de sequências humanas de "contaminantes" e perfil taxonômico com o perfil MetaPhlAn319. Na época da extração de ácido nucleico, 10 milhões de células de halotoleranos Imtechella, uma espécie halotolerante normalmente encontrada em ecossistemas de estuários e não em comunidades microbianas humanas, foram cravadas em cada amostra, permitindo a quantificação da carga microbiana absoluta para cada amostra20.
A Figura 2 mostra medições individuais e médias de oxigênio de saída e níveis de pH ao longo do processo de cultura para 50 amostras de escarro cultivadas sob cada condição de oxigênio e um exemplo de fenótipo de cultura diferencial visual. As culturas foram mantidas a 37 °C, exceto durante breves períodos em que foi realizada a coleta e remoção de alíquotas amostrais. Com intervalos de 12h e 24 horas, foram mantidas concentrações elevadas de oxigênio, embora tenha sido observada uma queda ao longo do tempo para todas as três condições de oxigênio, com 100% de oxigênio caindo para aproximadamente 85%, 50% de oxigênio caindo para 40%, e 21% de oxigênio caindo para 18%. As condições de oxigênio permaneceram distintas e, importante, concentrações elevadas de oxigênio foram mantidas durante todo o processo para amostras hiperóxicos. as medições de pH mostraram maior grau de variabilidade, mas permaneceram bem dentro de uma faixa fisiologicamente normal, sem alterações estatisticamente significativas ao longo do tempo. Essas medidas indicam que esses métodos mantêm discretas condições diferenciais de oxigênio durante todo o processo de cultura. Por fim, um exemplo de um dos muitos fenótipos da cultura visual que se diferenciava na concentração de oxigênio é mostrado. Esta amostra marcou diferenças de turbidez após 72 h de cultura, com maior oxigênio associado à menor turbidez visual. Fenótipos de cultura diferencial apoiam a presença de efeitos induzidos por hiperoxia nas comunidades culturais.
A Figura 3 compara a carga microbiana, a diversidade microbiana e a composição da comunidade microbiana entre escarro não cultivado e escarro cultivado (condição de oxigênio de 21% para um período de 48 h). As medidas revelam que a única grande diferença introduzida pelo ato de cultivo é um aumento de aproximadamente 20 vezes na carga microbiana em comparação com a escarro não culturada. O sistema imunológico e os mecanismos típicos de desembaraço mecânico, como a tosse, normalmente servem como um processo regulatório que limita a carga microbiana no pulmão, mesmo em casos de disfunção e infecção como os observados na PwCF. A cultura ex vivo não tem tais mecanismos regulatórios, e as comunidades microbianas são livres para prosseguir em direção à saturação celular. As métricas de diversidade alfa e beta indicam que, apesar dessa diferença na carga microbiana, a composição da comunidade subjacente permanece bem preservada, com diferenças globais mínimas introduzidas pelo processo cultural.
A Figura 4 expande-se na comparação entre amostras de escarro não cultivadas e cultivadas, olhando para a presença/ausência binária das 120 espécies microbianas conclusivamente identificadas por metagenômicas de espingarda sequenciamento de esputo cultivado e não cultivado obtido de 11 pacientes. Micróbios são agrupados com base em semelhanças filogenéticas. 46 (38,3%) dessas espécies foram identificadas em amostras não cultivadas e cultivadas (cor ciano), enquanto 35 (29,2%) foram identificadas exclusivamente em amostras não cultivadas (amarelas) e 39 (32,5%) foram identificadas exclusivamente em amostras cultivadas (azul). É provável que haja maior paridade do que o que identificamos usando sequenciamento em termos do que está presente e do que está ausente, mas alguns impostos ficam abaixo do limiar de detecção de sequenciamento em alguns casos. As diferenças indicam que o processo cultural introduz algum viés na cultura em comparação com a escória não cultivada. Mais notavelmente, a cultura aumenta a presença de fungos como Candida e Aspergillus,bem como membros enterobacterales, incluindo escherichia, Serratiae membros do Streptococcus. Por outro lado, membros bacteroidetes como Prevotella e Clostridiales, que são anaerobes, estavam presentes em amostras não cultivadas, mas não presentes em amostras cultivadas. Isso pode ser atribuído à falta de uma condição anaeróbica em nosso modelo experimental.
A Figura 5 mostra curvas de crescimento baseadas em absorvência de patógenos pulmonares cf comuns isolados da escarro obtidas de 50 pwCF diferentes. Estes isolados representam isolados clínicos fenotipicamente diferentes obtidos utilizando procedimentos de cultura de enriquecimento do Laboratório Geral de Microbiologia Clínica do Hospital Geral de Massachusetts, e incluem Pseudomonas aeruginosa (N = 53), Staphylococcus aureus (N = 37), Stenotrophomonas maltophilia (N = 12), Klebsiella pneumoniae (N = 3) e Achromobacter spmobacter (N = 7). As curvas de crescimento foram obtidas por meio de escarro artificial a 37 °C no escuro, com a inoculação bacteriana ASM sans servindo como um controle negativo. A qualidade transparente do ASM (que se deve ao filtro em vez de esterilização térmica) permite a realização de medidas ópticas para estimar curvas de crescimento. Leituras ópticas a 600 nm (OD600) foram tiradas a cada 10 minutos, e as primeiras 24 horas de cada curva são mostradas. A ausência de alterações nas leituras ópticas no controle negativo somente ASM indica culturas livres de contaminação. As curvas demonstrativas mostradas aqui seguem padrões típicos de curva de crescimento indicando a viabilidade desta receita ASM como um meio para a geração baseada em absorvência de curvas de crescimento.
| Coluna 1 | Coluna 2 | Coluna 3 | Coluna 4 | Coluna 5 | Coluna 6 | Coluna 7 | Coluna 8 | Coluna 9 | |
| Valor | Comstock | Kirchner | Sriramulu | Palmer | Flynn | Gallagher | Lai | Fonte | |
| Mucina | 2% c/v | 0,5% c/v | 0,5% c/v | - | 1% c/v | 2% c/v | 1% c/v | Flynn | |
| Cloreto de sódio | 85,5 mM | 85,5 mM | 85,5 mM | 66,6 mM | 89,8 mM | 85,5 mM | 152,3 mM | Lapierre | |
| Cloreto de potássio | 29,5 mM | 29,5 mM | 29,5 mM | 15,8 mM | - | 2,95 mM | 15,8 mM | Palmer | |
| Sulfato de magnésio | - | - | - | 0,6 mM | 1 mM | 1 mM | 0,61 mM | Palmer | |
| Sulfato de Ferro | - | - | - | 0,0036 mM | - | - | - | - | |
| Cloreto de amônio | - | - | - | 2,3 mM | 60 mM | - | - | - | |
| Fosfato monopotássio | - | - | - | 2,5 mM | 60 mM | - | - | - | |
| Glicose | - | - | - | 3,2 mM | 13 mM | 40 mM | 0,7 mM | Sambeek | |
| Lactato | - | - | - | 9 mM | - | - | - | - | |
| Aminoácidos essenciais | 14.45x | 0,25 g/L | 0,25 g/L | Por Ácido | 0,5x | 0,375x | 1.29x | Palmer | |
| Aminoácidos não essenciais | 28.9x | 0,25 g/L | 0,25 g/L | Por Ácido | 0,25x | 0,5x | 8.01x | Palmer | |
| Vitaminas | - | - | - | - | - | 1x | 1x | Gallagher | |
| Trace Metais | - | - | - | - | 1x | 1x | 1x | Flynn | |
| Gema | 0.25% | 0.25% | 0.25% | - | - | 0.25% | 0.25% | Kirchner | |
| Ferritina | 0,0003 g/L | - | - | - | - | 0,0004 g/L | 0,0004 g/L | Gallagher | |
| DNA de esperma de salmão | 1,4 g/L | 4 g/L | 4 g/L | - | - | 1,4 g/L | - | - | |
| DPTA | - | - | 0,0059 g/L | - | - | - | - | - | |
| ph | - | 6.9 | - | 6.8 | - | - | 6.3 | Lapierre | |
| Armazenamento | 0 | 4° | - | - | 4° | 4° | 4° | Kirchner | |
| Esterilização | Autoclave | Filtro | Autoclave | - | Autoclave | Autoclave | Filtro | Kirchner | |
Tabela 1: Receita média de escarro artificial derivada da revisão da literatura. (Coluna 1) Reagentes e valores-chave na formulação do meio de escarro artificial. (Colunas 2-7) Comparação de receitas da literatura já brasileira8,9,10,12,14,15. (Colunas 8-9) Receita média de escarro artificial detalhada neste protocolo e as fontes correspondentes que informaram cada valor selecionado10,11,12,13,14,15.
| Coluna 1 | Coluna 2 | Coluna 3 |
| CF Sputum | ASM | |
| Aminoácidos totais | 10,25 mM | 10,76 mM |
| Alanina | 0,96 mM | 0,80 mM |
| Arginina | 0,17 mM | 0,94 mM |
| Asparagina | 0,91 mM | |
| Ácido aspártico | 0,45 mM | 0,80 mM |
| Cisteína | 0,09 mM | 0,33 mM |
| Ácido glutâmico | 0,84 mM | 0,80 mM |
| Glicina | 0,65 mM | 0,80 mM |
| Histidina | 0,28 mM | 0,35 mM |
| Isoleucina | 0,60 mM | 0,52 mM |
| Leucina | 0,87 mM | 0,52 mM |
| Lisina | 1,15 mM | 0,64 mM |
| Metionina | 0,34 mM | 0,13 mM |
| Ornitina | 0,36 mM | |
| Fenilalanina | 0,29 mM | 0,26 mM |
| Prolina | 0,90 mM | 0,80 mM |
| Serina | 0,78 mM | 0,80 mM |
| Treonina | 0,58 mM | 0,52 mM |
| Triptofano | 0,07 mM | 0,06 mM |
| Tirosina | 0,43 mM | 0,26 mM |
| Valina | 0,60 mM | 0,52 mM |
Tabela 2: Concentrações de aminoácidos previamente descritas em escarro de fibrose cística e em receita média de escarro artificial detalhada neste protocolo. (Coluna 1) Aminoácidos-chave. (Coluna 2) Concentrações de aminoácidos de escarro de pessoas com fibrose cística12. (Coluna 3) Concentrações de aminoácidos em meio de escarro artificial detalhadas neste protocolo
Figura 1: Esquema de conexão dos componentes do sistema de espaçamento de oxigênio. Diagrama de fluxo das conexões entre componentes do sistema usado para sparge garrafas de soro para concentrações de oxigênio desejadas entre 21% e 100%. O sistema tem 3 modos de uso determinados pela posição das duas válvulas de junção T. O sistema pode direcionar o gás dos tanques através da saída de gás ou através do monitor de porcentagem de oxigênio, bem como o gás de saída de rotas de garrafas de soro previamente espaçadas através do monitor para verificar a concentração após o tempo ter transcorrido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: As concentrações de oxigênio alvo são aproximadamente mantidas com intervalos de 12 h e 24 h, e o pH permanece na faixa fisiológica durante a cultura. (A) Leituras de oxigênio de saída a partir de intervalos de 12 h e 24 h de oxigênio durante um período de 72 h. (B) leituras de pH para amostras medidas a cada 24 h. (C) Uma imagem de exemplo da amostra cultivada CFB010 após 72 h, exibindo turbidez diferencial entre as concentrações de oxigênio. A cor indica porcentagem de oxigênio alvo; barras de erro denotam intervalos de confiança de 95%. Os limiares críticos são enfatizados com linhas tracejadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: A colheita aumenta a carga microbiana, mas a composição da comunidade subjacente é preservada. Escarro não cultivado (amarelo) e escarro cultivado (azul) usando meio de escarro artificial a 21% de oxigênio por 48 h. As alíquotas foram submetidas à extração nucleico de ácido e sequenciamento de metagenômica de espingarda para detectar possíveis viés introduzidos a partir de condições culturais. (A) Carga microbiana absoluta (determinada por controles de pico) e métricas de diversidade alfa. Usando modelos de efeitos mistos lineares, a escarro não cultivada previu a carga microbiana, mas não a diversidade alfa. (B) Ordenação dos dois primeiros componentes das métricas de diversidade beta, controlando a diferença na carga microbiana. Não há diferença significativa em nenhuma das métricas depois da PERMANOVA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: A maioria dos impostos identificados estão presentes tanto na espisa de origem quanto na cultura, enquanto outras aparecem apenas na fonte ou na cultura. Sequenciamento de metagenômica de espingarda usado para comparar diferenças na composição da comunidade microbiana entre amostras de escarro não cultivadas e cultivadas. Árvore filogenética de todas as espécies microbianas identificadas em amostras sequenciadas (N = 120). Espécies marcadas com amarelo (N = 35, 29,2%) só foram vistas em amostras de escarro não culturadas. Espécies marcadas com azul (N = 39, 32,5%) só foram vistas em amostras de cultura média de escarro artificial. Espécies marcadas com ciano (N = 46, 38,3%) foram observadas em amostras não cultivadas e cultivadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: O meio de escarro artificial é suficientemente transparente para ser usado como meio de curva de crescimento para isolados clínicos de cultivo. Leituras de densidade ideal a 600 nm foram tomadas a cada 10 minutos, e as primeiras 24 horas de cada curva são mostradas. As linhas cinzentas representam leituras individuais, e as linhas laranjas representam a absorção média para cada imposto. O meio de escarro artificial em branco incluído como controle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste estudo, desenvolveu-se um modelo in vitro para estudar o efeito da hiperoxia nas comunidades microbianas pulmonares. Este modelo, baseado na escarro artificial média e diária de garrafas de soro, mantém concentrações elevadas de oxigênio e suporta o crescimento de micróbios identificados em escarro da pwCF.
Há várias etapas críticas dessa abordagem. Primeiro é a escolha de usar a esterilização do filtro em vez da esterilização térmica do meio de escarro artificial. A esterilização do filtro previne a desnaturação da mucina e outros componentes sensíveis ao calor do meio e produz um meio claro que pode ser usado para medidas ópticas de crescimento microbiano. Embora a esterilização do filtro tenha sido proposta em outros protocolos10,descobrimos que a adição de agitação orbital durante o processo de filtragem foi essencial para evitar o entupimento do filtro que ocorreu de outra forma quando uma quantidade mínima do meio preparado havia sido filtrada. Embora o meio de escarro artificial filtrado possa ter uma concentração final de mucina inferior à pretendida devido à impacto da mucina no filtro, a escarro da pwCF tem mostrado ter concentrações de mucina mais baixas do que a escarro de pessoas sem fibrose cística21. A concentração inicial de mucina de 1% utilizada neste protocolo é maior do que em outras abordagens que utilizaram a esterilização de filtros, com um grupo utilizando uma concentração inicial de mucina de 0,5%10, enquanto receitas típicas utilizam concentrações de mucina variando de 0,5%-2%(Tabela 1). Assim, mesmo com a perda de mucina no processo de esterilização do filtro, o meio final preparado usando este protocolo provavelmente terá concentrações de mucina dentro da faixa fisiológica22.
A segunda é a composição do meio de escarro artificial. A receita para o meio de escarro artificial foi escolhida com base em estudos fisiológicos existentes de escarro da pwCF (Tabela 1). Utilizando sequenciamento de metagenômica de espingarda, pudemos verificar que a escarro cultivada com este meio de escarro artificial recapitula amplamente a composição comunitária microbiana de escarro não cultivado(Figura 3). Em condições normóxicas, esse meio também apoiou o crescimento de 112 isolados clínicos diferentes representando patógenos comuns isolados do escarro de pacientes com fibrose cística. Assim, esses dados demonstram que essa formulação do meio de escarro artificial suporta o crescimento da microbiota das vias aéreas da PWCF. O DNA do esperma de salmão, uma adição comum às receitas existentes(Tabela 1),foi omitido. Uma aplicação pretendida deste modelo é o sequenciamento da metagenômica, e, portanto, o DNA do esperma de salmão não foi incluído a fim de reduzir a adição de ácidos nucleicos não microbianos, pois essas leituras seriam filtradas após o sequenciamento, diminuindo assim nossa profundidade de sequenciamento eficaz. Embora a escarro da pwCF tenha altas concentrações de DNA extracelular23, uma proporção significativa dela é de origem microbiana24, e não está claro se a adição de DNA de espermatozoides de salmão ao meio de escarro artificial torna-o mais fisiológico ou se a abordagem cultural descrita neste protocolo leva a altos níveis de DNA extracelular microbianamente derivado; não distinguimos entre concentrações extra e intracelulares de DNA em nossos estudos. Estudos futuros podem querer verificar a concentração de DNA extracelular gerado por este método de cultivo.
Em terceiro lugar, até onde sabemos, nenhum estudo publicado sobre as comunidades microbianas pulmonares de fibrose cística abordou condições hiperóxiis. Este modelo utiliza equipamentos baratos e comumente disponíveis de fornecedores de laboratórios ou hospitais gerais para construir um sistema de sparging de oxigênio. Considerações importantes para a manutenção de condições hiperóxicos incluem o volume do meio de cultura em relação ao espaço para cabeça disponível nas garrafas de soro. Nas tentativas iniciais durante o desenvolvimento do protocolo, foram utilizadas garrafas de soro de 125 mL. No entanto, o uso de garrafas de soro de 500 mL (permitindo uma relação de cultura de 475 mL para 25 mL) permitiu a manutenção da concentração desejada por até 24 horas, reduzindo assim a frequência de sparging de oxigênio. Essa abordagem gera condições discretas de oxigênio, permitindo assim a cultura simultânea de diferentes amostras de pacientes em múltiplas condições de oxigênio. Outras ferramentas da cultura anaeróbica podem ser aproveitadas para a cultura hiperóxica, incluindo o uso de frascos anaeróbicos ou tubos do tipo Balch com oxigênio. Análises de comunidades microbianas pulmonares usando sequenciamento metagenômico indicam que a diversidade alfa e beta globais são comparáveis entre esputo cultivado e não cultivado. Ao avaliar a abundância diferencial no nível da espécie, culminando com 21% de oxigênio, enriquecido para o crescimento de aerobes e anaeróbios facultativos, incluindo Enterobacterale, Streptococcus e fungos. Isso é provável devido à exclusão de uma condição anaeróbica que tem sido observada nas vias aéreas da PWCF25,26. Estudos futuros poderiam considerar a inclusão de gás nitrogênio neste modelo para estudar uma série de condições anoxilicas e oxigênicas e microbiota aeróbica e anaeróbica correspondente encontrada em comunidades microbianas das vias aéreas.
Os princípios-chave descritos nesses protocolos podem ser instrutivos para a realização de estudos semelhantes relacionados à influência do oxigênio em comunidades microbianas complexas ou patógenos pulmonares comuns. O oxigênio é a terapia mais comum usada no tratamento de todas as doenças pulmonares avançadas, e uma melhor compreensão de como pode levar a efeitos colaterais não previstos nas comunidades microbianas das vias aéreas e patógenos respiratórios comuns será importante para o cuidado da PwCF e outras doenças pulmonares crônicas.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Parte deste trabalho foi realizado no Laboratório Biológico Marinho com apoio do Laboratório Biológico Marinho, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (número de subvenção 5600373) e um presente da Fundação Simons.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BME Vitamins (100x) Solution | MilliporeSigma | B6891 | Concentrated solution of supplemental vitamins. |
| Crimper, 30 mm | DWK Life Sciences | 224307 | Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles. |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | Solid glucose powder (dextrorotatory isomer). |
| Diaphragm Pump ME 2 NT | VACUUBRAND | 20730003 | Vacuum pump for vacuum filtration. |
| Egg Yolk Emulsion | HiMedia | FD045 | Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline. |
| Ferritin, Cationized from Horse Spleen | MilliporeSigma | F7879 | Ferritin (iron-storage protein) solution. |
| FIREBOY plus Safety Bunsen Burner | Integra Biosciences | 144000 | Bunsen burner with user interface and safety features. |
| Hydrion pH Paper (1.0–14.0) | Micro Essential Laboratory | 94 | pH testing paper for the range of 1.0–14.0. |
| Hydrion pH Paper (4.0–9.0) | Micro Essential Laboratory | 55 | pH testing paper for the range of 4.0–9.0. |
| Hydrion pH Paper (6.0–8.0) | Micro Essential Laboratory | 345 | pH testing paper for the range of 6.0–8.0. |
| Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G | Smiths Medical | 401815 | 18 G needles with safety caps. |
| In-Line Pressure Gauge | MilliporeSigma | 20469 | Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure. |
| Innova 42 Incubated Shaker | Eppendorf | 2231000756 | Combination incubator/orbital shaker. |
| Luer-Lok Syringe with Attached Needle | Becton Dickinson | 309580 | Combination 3 mL syringe and 18 G needle. |
| Luer Valve Assortment | World Precision Instruments | 14011 | Valves for gas flow tubing. |
| LSE Orbital Shaker | ThermoFisher Scientific | 6780-NP | Orbital shaker to agitate media during filtration. |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | MilliporeSigma | M2773 | Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate). |
| Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-346-15FM | Air flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| MEM Amino Acids (50x) Solution | MilliporeSigma | M5550 | Concentrated solution of essential amino acids. |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution | MilliporeSigma | M7145 | Concentrated solution of non-essential amino acids. |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | MilliporeSigma | SLMP25SS | 0.22 µm polyethersulfone membrane sterile syringe filter. |
| Milli-Q Academic | MilliporeSigma | ZMQS60E01 | Milli-Q sterile water filtration system. |
| MiniOX 3000 Oxygen Monitor | MSA | 814365 | Gas flow oxygen percentage monitor. |
| MOPS Buffer (1 M, pH 9.0) | Boston BioProducts | BBM-90 | MOPS buffer for adjusting media pH. |
| Mucin from Porcine Stomach | MilliporeSigma | M2378 | Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder. |
| Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit | Harvard Apparatus | 72-1413 | Connectors for gas flow tubing. |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Library preparation for identification during sequencing. |
| NovaSeq 6000 Sequencing System | Illumina | 770-2016-025-N | Shotgun sequencing platform for generating sample reads. |
| Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter | Western Enterprises | M1-540-15FM | Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter. |
| Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors | SunMed | 2001-01 | Tubing for connecting gas system components. |
| Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 | Molecular Biologicals International | MRGF-6235 | Concentrated phosphate-buffered saline solution. |
| PC 420 Hot Plate/Stirrer | Marshall Scientific | CO-PC420 | Combination hot plate/stirrer. |
| Potassium Chloride | MilliporeSigma | P9541 | Solid potassium chloride salt. |
| PTFE Disposable Stir Bars | ThermoFisher Scientific | 14-513-95 | Disposable magnetic stir bars. |
| PTFE Thread Seal Teflon Tape | VWR | 470042-938 | Teflon tape for reinforcing gas system connections. |
| Q-Gard 2 Purification Cartridge | MilliporeSigma | QGARD00D2 | Purification cartridge for Milli-Q system. |
| Reusable Media Storage Bottles | ThermoFisher Scientific | 06-423A | Bottles for mixing and storing culture media. |
| Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl | DWK Life Sciences | 224100-331 | Rubber stoppers for serum bottles. |
| Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL | DWK Life Sciences | 223952 | Glass serum bottles for sealed culturing. |
| Small Bore Extension Set | Braun Medical | 471960 | Tubing extension with luer lock connectors. |
| Sodium Chloride | MilliporeSigma | S3014 | Solid sodium chloride salt. |
| Spike-in Control I (High Microbial Load) | ZymoBIOMICS | D6320 | Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations |
| Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System | MilliporeSigma | S2GPU02RE | 250 mL 0.22 µm vacuum filtration chamber. |
| Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes | Professional Disposables International | H04082 | Disposable germicidal wipes for sterilization. |
| Trace Metals Mixture, 1000x | ThermoFisher Scientific | NC0112668 | Concentrated solution of physiological trace metals. |
| Unlined Aluminum Seal, 30 mm | DWK Life Sciences | 224187-01 | Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers. |
| USP Medical Grade Air Tank | Airgas | AI USP200 | Compressed air tank for input to sparging system. |
| USP Medical Grade Oxygen Tank | Airgas | OX USP200 | Compressed oxygen tank for input to sparging system. |
References
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