Summary
Hier wordt een eenvoudig protocol gepresenteerd voor het produceren van mRNA-nanodeeltjes op basis van poly (bèta-aminoester) polymeren, eenvoudig op maat te maken door het ingekapselde mRNA te veranderen. De workflow voor het synthetiseren van de polymeren, de nanodeeltjes en hun in vitro essentiële karakterisering worden ook beschreven. Een proof-of-concept met betrekking tot immunisatie wordt ook toegevoegd.
Abstract
Vaccinatie is een van de grootste successen van de moderne samenleving en is onmisbaar bij het beheersen en voorkomen van ziekten. Traditionele vaccins waren samengesteld uit hele of fracties van het infectieuze agens. Er blijven echter uitdagingen en nieuwe vaccintechnologieën zijn verplicht. In deze context heeft het gebruik van mRNA voor immuniserende doeleinden een verbeterde prestatie laten zien, zoals blijkt uit de snelle goedkeuring van twee mRNA-vaccins die SARS-CoV-2-infectie voorkomen. Naast succes bij het voorkomen van virale infecties, kunnen mRNA-vaccins ook worden gebruikt voor therapeutische kankertoepassingen.
Niettemin maakt de instabiliteit van mRNA en de snelle klaring uit het lichaam als gevolg van de aanwezigheid van nucleasen de naakte afgifte ervan niet mogelijk. In deze context zijn nanogeneesmiddelen, en specifiek polymere nanodeeltjes, kritieke mRNA-afgiftesystemen. Het doel van dit artikel is dus om het protocol te beschrijven voor de formulering en test van een kandidaat-mRNA-vaccin op basis van de gepatenteerde polymere nanodeeltjes. De synthese en chemische karakterisering van de gebruikte poly(bèta-aminoesters)polymeren, hun complexatie met mRNA om nanodeeltjes te vormen en hun lyofilisatiemethodologie zullen hier worden besproken. Dit is een cruciale stap voor het verlagen van opslag- en distributiekosten. Ten slotte zullen de vereiste tests worden aangegeven om hun vermogen aan te tonen om in vitro transfecterende en volwassen modelleer dendritische cellen te modelleren. Dit protocol zal de wetenschappelijke gemeenschap die aan vaccinatie werkt ten goede komen vanwege de hoge veelzijdigheid die deze vaccins in staat stelt een breed scala aan ziekten te voorkomen of te genezen.
Introduction
Infectieziekten vormen een ernstige bedreiging voor miljoenen mensen over de hele wereld en zijn nog steeds een van de belangrijkste doodsoorzaken in sommige ontwikkelingslanden. Profylactische vaccinatie is een van de meest effectieve interventies van de moderne samenleving om infectieziekten te voorkomen en te beheersen1,2. Deze kritieke mijlpalen van de wetenschap in de relevantie van de20eeeuw zijn opgemerkt door de recente wereldwijde Covid-19-pandemie veroorzaakt door het SARS-CoV-2-virus3. Erkennend het belang van het hebben van efficiënte vaccins om de verspreiding van de ziekte te beperken, hebben coöperatieve inspanningen van alle biomedische gemeenschappen met succes geresulteerd in veel profylactische vaccins op de markt in minder dan een jaar4.
Traditioneel werden vaccins samengesteld uit verzwakte (levende, verminderde virulentie) of geïnactiveerde (doodsdeeltjes) virussen. Voor sommige ziekten zonder marge voor veiligheidsfouten zijn virale deeltjes echter niet mogelijk en worden in plaats daarvan eiwitsubeenheden gebruikt. Niettemin maken subeenheden meestal de combinatie van meer dan één epitoop / antigeen niet mogelijk en zijn adjuvantia nodig om de vaccinatiepotentie te verbeteren5,6. Daarom is de behoefte aan nieuwe vaccintypen duidelijk.
Zoals aangetoond tijdens de huidige pandemie, kunnen nieuwe vaccinkandidaten op basis van nucleïnezuren voordelig zijn in termen van het vermijden van lange ontwikkelingsprocessen en het bieden van een hoge veelzijdigheid terwijl tegelijkertijd een vitale patiëntimmunisatie wordt geproduceerd. Dit is het geval met mRNA-vaccins, die aanvankelijk werden ontworpen als experimentele kankervaccins. Dankzij hun natuurlijke vermogen om antigeenspecifieke T-celresponsen3,5,6,7te produceren. Omdat mRNA het molecuul is dat codeert voor het antigene eiwit en alleen hetzelfde verandert, kan het vaccin snel worden aangepast om andere varianten van hetzelfde micro-organisme, verschillende stammen, andere infectieuze micro-organismen te immuniseren of zelfs een immunotherapeutische behandeling voor kanker te worden. Bovendien zijn ze voordelig in termen van grootschalige productiekosten. MRNA heeft echter een belangrijke hindernis die hun naakte toediening belemmert: de stabiliteit en integriteit ervan worden aangetast in fysiologische media, vol met nucleasen. Om deze reden is het gebruik van een nanometrische drager die het beschermt en mRNA vectoriseert naar de antigeen-presenterende cellen vereist2,8.
In deze context zijn poly (bèta-aminoesters) (pBAE) een klasse van biocompatibele en biologisch afbreekbare polymeren die een opmerkelijk vermogen hebben aangetoond om mRNA in nanometrische deeltjes te complexeren, dankzij hun kationische ladingen9,10,11. Deze polymeren zijn samengesteld uit esterbindingen, waardoor hun afbraak door esterasen in fysiologische omstandigheden gemakkelijk wordt. Onder de pBAE-bibliotheekkandidaten vertoonden degenen die gefunctionaliseerd waren met end kationische oligopeptiden een hoger vermogen om kleine nanodeeltjes te vormen om cellen efficiënt binnen te dringen via endocytose en het ingekapselde genmateriaal te transfecteren. Bovendien maakt de verzuring van het endosoomcompartiment dankzij hun buffercapaciteit endosomale ontsnapping12,13mogelijk. Namelijk, een specifiek soort pBAE, inclusief hydrofobe moieties op hun ruggengraat (de zogenaamde C6 pBAE) om hun stabiliteit en eind-oligopeptide combinatie te verbeteren (60% van het polymeer gemodificeerd met een tri-lysine en 40% van het polymeer met een tri-histidine) die selectief antigeen-presenterende cellen transfecteert na parenterale toediening en de mRNA-gecodeerde antigeenpresentatie produceert gevolgd door muizenimmunisatie is onlangs gepubliceerd14 . Bovendien is ook aangetoond dat deze formuleringen een van de belangrijkste knelpuntstappen van nanogeneeskundeformuleringen kunnen omzeilen: de mogelijkheid om ze te vriesdrogen zonder hun functionaliteit te verliezen, wat langdurige stabiliteit in zachte droge omgevingen mogelijk maakt15.
In deze context is het doel van het huidige protocol om de procedure voor de vorming van de mRNA-nanodeeltjes beschikbaar te maken voor de wetenschappelijke gemeenschap door een beschrijving te geven van de kritieke stappen in het protocol en de productie van efficiënte vaccins voor infectieziektenpreventie en tumorbehandelingstoepassingen mogelijk te maken.
Het volgende protocol beschrijft de volledige training om oligopeptide end-modified poly (beta aminoesters) - OM-pBAE polymeren te synthetiseren die verder zullen worden gebruikt voor nanodeeltjessynthese. In het protocol is ook de formulering van nanodeeltjes opgenomen. Bovendien worden ook kritieke stappen voor het succes van de procedure en representatieve resultaten gegeven om ervoor te zorgen dat de resulterende formuleringen voldoen aan de vereiste karakteriseringskenmerken voor kwaliteitscontrole om een positief of negatief resultaat te definiëren. Dit protocol is samengevat in figuur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Synthese van pBAE-polymeer met eind oligopeptiden (OM-pBAE)
- Polymerisatie van C6-pBAE
- Voeg 5-amino-1-pentanol (38 mmol; MW = 103,16 Da) 1-hexylamine (38 mmol; MW = 101,19 Da) in een glazen kolf met ronde bodem (100 ml). Voeg vervolgens 1,4-butaandilmagalacrylaat (82 mmol; MW = 198,22 Da).
- Verwarm het siliconenoliebad voor op 90 °C, plaats de kolf met ronde bodem in het oliebad en roer het mengsel met behulp van een magnetische roerstaaf een nacht (~ 18 uur). Neem vervolgens het product uit de kolf met ronde bodem en plaats het in de vriezer bij -20 °C.
OPMERKING: Het product heeft de vorm van een kleverig poeder en wordt met behulp van een spatel uit de kolf gehaald. Het is essentieel om de structuur van het verkregen polymeer te valideren door middel van 1H-NMR. NMR-spectra werden geregistreerd in een 400 MHz-instrument (zie Materiaaltabel)met chloroform-d en D2O als oplosmiddelen. Ongeveer 10 mg van elke poly(β-aminoester) werd ingenomen en opgelost in 1 ml van het gedeutereerde oplosmiddel.
- Reactie met peptiden om OM-pBAE te verkrijgen
- Voeg 25 ml 0,1 M HCl toe aan geselecteerde peptiden, bijvoorbeeld peptide Cys-His-His-His met trifluorazijnzuur (TFA, 200 mg), in een eerder gewogen centrifugebuis van 50 ml die vriesdrogend kan weerstaan en een nacht handmatig roeren om een heldere oplossing te verkrijgen.
- Vries de oplossing gedurende 1 uur in bij -80 °C en vries het resulterende peptidehydrochloride af.
OPMERKING: Controleer of het uiteindelijke gewicht overeenkomt met de theoretische waarde. - Maak een oplossing van C6-pBAE (0,031 mmol) in dimethylsulfoxide. Maak ook een oplossing van het peptidehydrochloride (0,078 mmol) in dimethylsulfoxide.
- Meng de twee oplossingen in een schroefdopbuis en schroef de dop vast. Roer de mengseloplossing in een waterbad met een gecontroleerde temperatuur van 25 °C gedurende 20 uur met een magnetische roerstaaf.
- Voeg het mengsel toe aan 7:3 (v/v) diethylether/aceton. Centrifugeer de resulterende suspensie bij 25.000 x g bij 4 °C om het oplosmiddel te verwijderen. Was vervolgens de vaste stof tweemaal met 7:3 (v/v) diethylether/aceton. Droog het product vervolgens onder een vacuüm (<0,2 atm).
- Maak een oplossing van 100 mg/ml van het product in dimethylsulfoxide. Het resulterende product heet C6-peptide-pBAE. Het is essentieel om de structuur van het verkregen polymeer te valideren door middel van 1H-NMR om het verdwijnen van de olefinesignalen geassocieerd met terminale acrylaten te bevestigen. Indien niet gebruikt, kan het polymeer worden ingevroren bij -20 °C.
2. Vorming van polyplexen
OPMERKING: Alle procedures moeten worden uitgevoerd in een geconditioneerde ruimte om een constante temperatuur te behouden.
- Ontdooi de polymeren C6-peptide-pBAE en vortex de oplossing.
- Pipetteer het polymeermengsel op en neer en bereid een oplossing van 12,5 mM (V1) in natriumacetaat (NaAc). Draai vervolgens het mengsel en wacht 10 minuten.
- Bereid het mRNA met 0,5 mg/ml en meng door pipetteren (V2).
OPMERKING: Het is cruciaal om vortexing van het mRNA te voorkomen. - Vortex het polymeermengsel bij de eindconcentratie om een homogene oplossing te bereiken tussen de polymeervoorraad in DMSO en de acetaatbuffer.
OPMERKING: De uiteindelijke polymeerconcentratie is afhankelijk van de gekozen N/P-verhouding (stikstof/fosfaatgroepen). De N/P-verhouding is afhankelijk van elk specifiek te gebruiken mRNA. Voor eGFP-inkapseling werd bijvoorbeeld een verhouding van 25:1 gebruikt, zoals eerder gemeld14. - Meng de genetische materiaaloplossing en C6-peptidepBAE-oplossing (25x van de mRNA-concentratie) in een verhouding van 1:1 (Vi = V1 + V2).
OPMERKING: C6-peptide-pBAE wordt geladen in een microcentrifugebuis waar het mRNA wordt toegevoegd door op en neer te pipetteren voor menging. Eenmaal bereid, zijn de polyplex-, het nucleïnezuur- en C6-peptide-pBAE-concentraties half verdund. - Incubeer bij 25 °C gedurende 30 min in een thermoblok. Precipiteer met 1:2 RNase-vrij water door het monster toe te voegen aan een vooraf geladen microcentrifugebuis met water.
- Neem de hulpstoffen op. Voeg hetzelfde volume toe als het mengsel van mRNA en pBAE (Vi) in HEPES 20 mM en sucrose 4% door op en neer te pipetteren. Op dit punt is het monster 3x verdund.
3. Polyplexen lyofilisatie
- Onmiddellijk invriezen bij -80 °C vriezer van de vorige polyplex oplossing gedurende 1 uur.
- Voer de primaire droging uit door de stappen te volgen: (1) 1 uur bij -60 °C en 0,001 hPa; (2) 1 uur bij -40 °C en 0,0001 hPa; (3) 4 uur bij -20 °C en 0,0001 hPa; (4) 12 uur bij 5 °C en 0,0001 hPa.
- Onmiddellijk bewaren bij -20 °C om rehydratatie tot gebruik te voorkomen.
4. Polyplex resuspensie
OPMERKING: Dit protocol beschrijft het proces dat wordt gebruikt om de gelyofiliseerde C6-peptide-pBAE nanodeeltjes te reconstrueren voor hun verdere gebruik voor karakterisering, in vitro of in vivo analyse.
- Neem de gelyofiliseerde nanodeeltjes van -20 °C net op het moment van gebruik en voeg snel de overeenkomstige hoeveelheid gedepyrogeneerd (DEPC) water toe om de vaste stof opnieuw te verdelen om de gewenste concentratie te bereiken.
OPMERKING: Het volume zal hetzelfde zijn als het oorspronkelijke volume van de nanodeeltjes als dezelfde concentratie wordt beoogd, maar dit zal voor elk experiment worden aangegeven. - Pipetteer voorzichtig tot volledige resuspensie en begeleid de vloeistof met de pipet.
OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen materiaal achterblijft op de wand van de injectieflacon. - Eenmaal opgelost, pipetteer krachtig op en neer, vermijd bubbels.
OPMERKING: Het monster moet een transparant tot doorschijnend aspect hebben, dat duidelijker is bij hogere concentraties - Bewaar de monsters op ijs of bij 4 °C gedurende ten hoogste 24 uur na reconstitutie. Voorkom bevriezing.
5. Polyplex karakterisering
- Dynamische lichtverstrooiing
OPMERKING: Hydrodynamische diameter (nm), polydispersiteitsindex (PDI) en oppervlaktelading van nanodeeltjes werden gemeten bij 25 °C, 633 nm lasergolflengte en 173 ° signaaldetector, met behulp van een Zeta-potentiaalanalysator (zie Tabel met materialen).- Hydrodynamische diameter (nm)
- Bereid de nanodeeltjes die mRNA en pBAE mengen grondig voor door het genmateriaal naar de polymeerfractie te pipetteren tot een uiteindelijke mRNAconcentratie van 0,25 mg/ml zoals hierboven beschreven (stap 2).
- Spoel een microcuvette voor met gefilterde verdunningsmedia om deze volledig te reinigen van onzuiverheden. Vul vervolgens de cuvette met ten minste 50 μL van de monsteroplossing en dop deze. Introduceer vervolgens het monster in het DLS-instrument en zorg ervoor dat de cel correct is ingebracht.
OPMERKING: Het verdunningsmedium wordt gefilterd met een spuitfilter van 0,22 μm. - Open het SOP-bestand (Standard Operation Procedure) dat is gemaakt en voer de gewenste voorbeeldnaam in. Selecteer Maatmeting.
OPMERKING: Alle parameters voor het maken van een SOP voor maatmetingen zijn opgenomen in tabel 1. - Voer de deeltjesgroottemeting uit met DLS door op Playte klikken.
OPMERKING: Nadat de drievoudige pieptoon klinkt, is de analyse voltooid. - Selecteer de resultaten die overeenkomen met het monster op het meetblad om de gemiddelde deeltjesgrootte, gemiddelde PDI, standaardafwijking en afbeeldingen te verkrijgen. Als u klaar bent, verwijdert u de cel uit DLS-apparatuur.
- Verwijder het monster, bewaar het voor zeta-potentiaalanalyse en reinig en spoel de cel met gedeïoniseerd water. Droog ten slotte de gereinigde cuvette onder een persluchtgasstroom.
- Oppervlaktelading (mV)
- Bereid de nanodeeltjes die mRNA en pBAE mengen grondig voor door het genmateriaal naar de polymeerfractie te pipetteren tot een uiteindelijke concentratie mRNA van 0,25 mg / ml zoals hierboven beschreven (stap 2, Polyplex-vorming). Vries vervolgens de oplossing in en droog deze.
OPMERKING: In dit geval wordt voor de meting van de oppervlaktelading het vriesdrogen van het monster sterk aanbevolen voordat de maatregelen worden uitgevoerd om het monster opnieuw in de juiste buffer te verdelen, waarbij de lichaamscondities van pH- en elektrolytconcentratie worden gesimuleerd. - Resuspend het gelyofiliseerde monster met behulp van water. Verdun het monster 1/10 in water (eindconcentratie 0,025 mg/ml).
- Spoel een wegwerp gevouwen capillaire cel (zeta potentiaal cuvette) voor met gefilterde verdunningsmedia om deze volledig te reinigen van onzuiverheden. Vul vervolgens de cuvette met verdunde nanodeeltjes met een spuit van 1 ml en dop beide zijden van de vulstoffen.
OPMERKING: De nanodeeltjesdispersie moet het beschikbare volume in de cuvette (~ 1 ml) vullen, met speciale aandacht voor de vorming van de bel, die de metingen zou kunnen verstoren. - Introduceer het monster in DLS; zorg ervoor dat de cel correct is ingebracht.
- Open het SOP-bestand dat is gemaakt voor zeta-potentiaalanalyse en introduceer de gewenste voorbeeldnaam. Selecteer Zeta-potentiaalmeting.
OPMERKING: Parameters voor het maken van een SOP voor zeta potentiaalmetingen zijn weergegeven in tabel 2. - Voer zeta-potentiaalmeting uit met DLS door op Playte klikken.
OPMERKING: Na het drievoudige piepgeluid is de analyse voltooid. - Selecteer de resultaten die overeenkomen met het monster op het meetblad om de gemiddelde zeta-potentiaal, standaarddeviatie en afbeeldingen te verkrijgen. Als u klaar bent, verwijdert u de cel uit de DLS-apparatuur.
- Verwijder het monster en bewaar het indien nodig. Reinig en spoel vervolgens de cuvettecel met gedeïoniseerd water, gevolgd door ethanol en opnieuw water. Droog ten slotte de gereinigde cuvette onder een persluchtgasstroom.
OPMERKING: Gebruik de aanbevolen software om de gegevens te analyseren.
- Bereid de nanodeeltjes die mRNA en pBAE mengen grondig voor door het genmateriaal naar de polymeerfractie te pipetteren tot een uiteindelijke concentratie mRNA van 0,25 mg / ml zoals hierboven beschreven (stap 2, Polyplex-vorming). Vries vervolgens de oplossing in en droog deze.
- Hydrodynamische diameter (nm)
- Nanoparticle Tracking Analyse (NTA)
OPMERKING: Hydrodynamische diameter (nm) en concentratie van nanodeeltjes werden gemeten bij 25 °C, 488 nm lasergolflengte met behulp van een Nanoparticle Tracking Analyzer (zie Tabel met materialen).- NTA en monstervoorbereiding
- Schakel de computer en de apparatuur in. Controleer eerst of alle componenten correct zijn aangesloten. Open vervolgens de aanbevolen software. De software controleert of alle accessoires correct zijn aangesloten.
- Sluit de bovenste plaat, hier, de O-ringcel, aan op de lasermodule.
OPMERKING: Schroef dit onderdeel niet te veel. - Laad de kamer eerst met buffer en/of gedeïoniseerd water met een spuit van 1 ml. Herhaal de procedure minstens twee keer. Vermijd het introduceren van bubbels in de kamer.
- Bereid het monster voor door 1/1000 in gedeïoniseerd water te verdunnen uit de concentratie die wordt gebruikt bij de DLS-maatmeting. Bereid ten minste 1 ml voor en laad het in een spuit van 1 ml, vermijd het inbrengen van bubbels.
- Laad de monsters in de kamer met behulp van een spuit. Sluit vervolgens de lasermodule aan op de grote NTA-kamer.
OPMERKING: Grote kamer geeft de ruimte aan waar de kamer is geplaatst voor de meting.
- Beeldoptimalisatie
- Controleer eerst in de Hardwareof de camera en de juiste laser zijn geselecteerd.
OPMERKING: Hier is er slechts één camera en de Blue Laser 488 nm. - Begin met het cameraniveau op 0 en druk op Camera starten in het venster Vastleggen.
OPMERKING: Pas op dit punt de volgende parameters aan. Balkpositie (deze kan op en neer worden bewogen op het scherm). Cameraniveau:vermijd oververzadigde pixels. Focus (lateraal wiel): probeer zo goed mogelijk scherp te stellen. Het is beter om deeltjes met een halo te hebben in plaats van ongerichte deeltjes. Concentratie: Pas de concentratie aan om tussen de 10 en 100 deeltjes per veld te hebben.
- Controleer eerst in de Hardwareof de camera en de juiste laser zijn geselecteerd.
- Video-opname
- Ga in de software naar het venster Metingsselectie- SOP (linksonder) en selecteer Standaardmeting.
OPMERKING: Programma om drie metingen van elk 30 s uit te voeren (om de software in staat te stellen gemiddelde en standaarddeviatieberekeningen uit te voeren). Geef een naam en een mappad op (op Basisbestandsnaam) om de records van het voorbeeld op te slaan. Wanneer de SOP-parameters correct zijn ingesteld, drukt u op Script maken en uitvoeren. Zodra de eerste replicatie is gemeten, zal het programma vragen om een nieuw monster toe te voegen. Vervolgens moet een ander deel van het monster in de kamer worden gebracht door op de zuiger van de spuit te drukken. Herhaal ten slotte een derde keer om de derde replicatie te analyseren.
- Ga in de software naar het venster Metingsselectie- SOP (linksonder) en selecteer Standaardmeting.
- Videoverwerking
- Pas de schermversterking en detectiedrempel aan zodra de drie metingen zijn voltooid om de gemeten deeltjes te analyseren. Op dit moment moeten er ongeveer 100 deeltjes in elk frame verschijnen om de analyse uit te voeren (hoge rode kruisen en lage blauwe kruisen worden verwacht).
- Exporteer de resultaten in een pdf-bestand nadat de analyse is voltooid. Daarnaast is het mogelijk om te exporteren als video's en Excel-bestanden.
- Schoonmaken van de NTA
OPMERKING: Sluit alle geopende metingen voordat u het volgende monster bestudeert; omdat de gegenereerde bestanden enorm zijn en afhankelijk van de computer, is het niet eenvoudig om er meer dan één open te houden.- Reinig de NTA-kamer door herhaaldelijk water te spoelen voordat u de volgende meting uitvoert totdat er geen deeltjes worden waargenomen; spoel vervolgens de gebruikte buffer (PBS) door om door te gaan met de maatregelen.
- Spoel lucht in de kamer en droog het met papier van microscopische kwaliteit zodra de laatste meting van de dag is voltooid.
- Karakteriseer de grootte en vorm door Transmission Electronic Microscopy (TEM). Bereid de monsters voor. 30 μL van het uiteindelijke volume is voldoende voor TEM-karakterisering.
OPMERKING: Zowel verse als gelyofiliseerde - na resuspensie - nanodeeltjes kunnen worden gemeten. - Laat 10 μL monster vallen op een met koolstof gecoat koperen rooster. Laat het 10 min drogen. Verwijder de overtollige vloeistof, indien nodig, door zachtjes op filterpapier te tikken.
- Laat 10 μL uranylacetaat (2% w/v) oplossing vallen voor negatieve kleuring. Laat het 1 min drogen. Verwijder het overtollige vocht, indien nodig, door zachtjes op filterpapier te tikken.
- Introduceer het monster in de microscoop en scan (spanningswerking 80 kV).
OPMERKING: Geschikte software kan worden gebruikt voor verdere analyse van de afbeeldingen.
- NTA en monstervoorbereiding
- Inkapselingsefficiëntie
- Monstervoorbereiding
- Bereid de nanodeeltjes voor op de gewenste concentratie en vries ze in en droog ze. Resuspend de nanodeeltjes vervolgens en verdun ze tot een eindconcentratie van 6 μg / ml.
- Bereid 1x TE buffer uit de 20x stock oplossing.
OPMERKING: Vt (Totaal volume) = (aantal monsters x 100 μL x 4) (aantal monsters x 290 μL) + 2 ml. - Bereid de TE-buffer met 3 μg/μL heparine uit de voorraad van 100 μg/μl.
OPMERKING: Vt = Aantal monsters x 50 μL x 2. - Bereid de normen voor
- Bereid een RNA-standaard voor variërend van 0,2 μg/ml tot 0,025 μg/ml in 1x Tris-EDTA (TE) buffer(tabel S1A).
OPMERKING: Gebruik mRNA in de RNA-standaard voor het geval dat verschilt van het ribosomale RNA. - Bereid RNA:pBAE standaard voor met Heparine(tabel S1B). Bereid heparine standaard (tabel S1C).
- Bereid een bord met 96 putten als volgt voor.
- Laad 295 μL TE-buffer in de eerste rijstrook van een 96-well plaat (evenals veel putten en monsters om te analyseren). Laad vervolgens 50 μL van 1x TE-buffer in de rijstroken B en C (duplicaten voor elk monster).
- Laad 50 μL 1x TBE-buffer met 3 μg/μL heparine in de rijstroken D en E (duplicaten voor elk monster). Laad vervolgens 100 μL van elke standaard in de rijstroken F, G en H (duplicaten voor elke standaard).
- Belasting 5 μL van elk monster in rijstrook A (concentratie in elke put is 0,1 μg/ml). Meng goed door te pipetteren en laad 50 μL van elk monster op de vier onderstaande putjes (twee met 50 μL buffer 1x TE en nog twee met 1x TE buffer met 3 μg/μL heparine).
- Incubeer het monster gedurende 30 minuten bij 37 °C. Bereid RiboGreen-reagens volgens het protocol van de fabrikant (zie Tabel met materialen)in 1x TE-buffer.
OPMERKING: Verdun 1:200 en vortex. Bescherm tegen licht. Vt = Aantal volle putten x 100 μL. - Laad 100 μL RiboGreen-oplossing in elke put. Detecteer fluorescentie met behulp van de microplaatlezer met een excitatiegolflengte van 500 nm en een emissiegolflengte van 525 nm.
- Resultaten analyse
- De drie kalibratiecurven voorbereiden
OPMERKING: Ten eerste, Ribosomale RNA-standaard. Interpoleer in deze kalibratiecurve de monsters die geen heparine bevatten. Ten tweede, mRNA:pBAE met Heparine. Interpoleer in deze kalibratiecurve het monster met heparine. Ten derde, Heparine. Wordt gebruikt om ervoor te zorgen dat de werkconcentratie in het lineaire bereik ligt. - Bereken de inkapselingsefficiëntie (EE%) als volgt:
- De drie kalibratiecurven voorbereiden
- Monstervoorbereiding
6. In vitro karakterisering
- Fluorescentiemicroscopie voor kwalitatieve beoordeling
- Plaats de 96-well plaat op de microscoop na 24 uur transfectie. Begin met het visualiseren van cellen met het 10x-doel.
OPMERKING: HeLa-cellen worden in dit geval gebruikt. Cellen worden gelokaliseerd met behulp van de transmissiemodus (helder veld) en de focus moet op dit moment worden aangepast.- Pas eerst een witbalans toe om te verwijzen naar de software over de achtergrond van de voorbeelden. Verkrijg vervolgens een afbeelding om deze tijdens de analyse te bedekken met het fluorescentiebeeld.
- Verander de microscoopmodus in reflectiemodus (fluorescentie) en verplaats het filterwiel naar de blauwe laser (488 nm) om eGFP te visualiseren.
OPMERKING: Op dit punt moeten de belichtingstijd en winst worden aangepast. Versterking moet worden aangepast in waarden tussen 3 en 5 om artefacten en overmaat aan achtergrondsignaal te voorkomen. De aanpassing van de belichtingstijd is afhankelijk van de transfectie-efficiëntie (van ms tot 1 s). - Verkrijg afbeeldingen voor alle omstandigheden of putten met dezelfde belichtingstijd om alle monsters te vergelijken.
- Plaats de 96-well plaat op de microscoop na 24 uur transfectie. Begin met het visualiseren van cellen met het 10x-doel.
- Flowcytometrie (FC) voor kwantitatieve beoordeling
- Gebruik een meerkanaalspipet om de 96-putplaat voor te bereiden op het flowcytometrie-experiment.
OPMERKING: Wanneer u met semi-adherente cellen werkt, zoals in de JAWSII-cellijn, herstelt u al het mediavolume en slaat u het op in een andere 96-well-plaat. Streef niet naar dit medium, omdat het een aanzienlijk aantal getransfecteerde cellen kan bevatten. - Reinig de cellen (HeLa-cellen worden hier gebruikt) met 100 μL /put van 1x PBS en streef ernaar. Voeg vervolgens 25 μL/put trypsine toe en incubeer het bij 37 °C gedurende 5 minuten.
- Zodra de cellen zijn losgemaakt, voegt u eerder herstelde media toe om de trypsine-actie te stoppen en de cellen te fixeren, waarbij 31,25 μL / put formaline 10% gedurende 20 minuten wordt toegevoegd (eindconcentratie 2,5%).
OPMERKING: Op dit punt is het cruciaal om de toestand van de cellen te visualiseren door middel van microscopie om de loslating van de cellen te garanderen. Het wordt ten zeerste aanbevolen om meerdere keren op en neer te pipetten om de cellen te helpen los te maken en hun agglomeratie te vermijden. Dit levert een betrouwbaar resultaat op. - Schakel de flowcytometer en de software in. Stel in de software de juiste omstandigheden in voor het experiment (type plaat, monstervolume en andere parameters zoals schudden, spoelen tussen monsters.
OPMERKING: Voor stap 6.2.5 moet het debiet 120 μL/min zijn. Meng elke 1 minuut een cyclus en spoel elke cyclus goed af. Mengen is essentieel om de cellen gedispergeerd te houden in de media en een betere analyse van individuele cellen mogelijk te maken. Bovendien is spoelen noodzakelijk om de microfluïdica van de cytometer tussen de monsters te reinigen. Controleer tot slot of er voldoende buffers zijn en of alle componenten correct zijn aangesloten. - Stel de juiste parameters in om het percentage positief getransfecteerde cellen te kwantificeren.
- Bekijk eerst de stroomgegevens op (Forward scattered light) FSC versus SCC (Side scattered light) scatter plot om de cellen van het puin te onderscheiden. Vervolgens wordt een andere spreidingsgrafiek uitgezet waarin de amplitude (FSC-A) versus hoogte (FSC-H) wordt vergeleken om individuele cellen te gaten en te onderscheiden.
OPMERKING: De onbehandelde populatie maakt het mogelijk om de populaties te gaten die overeenkomen met positief getransfecteerde cellen. Vervolgens wordt kwantificering van de positief getransfecteerde cellen uitgevoerd op het juiste kanaal op een histogramplot. Daarom moeten de positief getransfecteerde cellen worden weergegeven als een continuüm van gebeurtenissen op het histogram.
- Bekijk eerst de stroomgegevens op (Forward scattered light) FSC versus SCC (Side scattered light) scatter plot om de cellen van het puin te onderscheiden. Vervolgens wordt een andere spreidingsgrafiek uitgezet waarin de amplitude (FSC-A) versus hoogte (FSC-H) wordt vergeleken om individuele cellen te gaten en te onderscheiden.
- Gebruik een meerkanaalspipet om de 96-putplaat voor te bereiden op het flowcytometrie-experiment.
7. In vitro functionaliteitstests: capaciteit om modelimmuuncellen te activeren door ovalbumine (OVA) te gebruiken als antigeen modelmRNA
- Plaat 10.000 cellen/put (JAWSII cellen worden hier gebruikt) in een 96-put plaat de dag voor transfectie.
OPMERKING: Plaat zoveel putten als nodig is om drievoud te hebben voor elke aandoening. Laat de cellen zich minstens 12 uur aan de plaat hechten (een nachtelijke incubatie wordt aanbevolen). - Bereid pBAEs NP's voor zoals beschreven in de onderstaande OPMERKING om 0,6 μg mRNA per put te transfecteren.
OPMERKING: Als een positieve controle, transfecteer de cellen met behulp van een transfectie reagens. Hier gebruikten we 0,1 μg mRNA per put en 0,25 μL van het transfectiereagens per put. mRNA-codificatie voor OVA werd gekocht (zie Tabel met materialen). Het is gepolyadenyleerd, gemodificeerd met 5-methoxyuridine en geoptimaliseerd voor zoogdiersystemen, en wordt beschermd door een end-capping met Cap1-structuur, een gepatenteerde methode van de leverancier. - Incubeer de 96-well plaat gedurende 24 uur in een droge luchtincubator bij 37 °C en 5% CO2.
OPMERKING: Streef na deze tijd niet naar de media, omdat deze een bepaald aantal cellen kunnen bevatten. Herstel de cellen en bewaar ze in een andere put of plaat. - Was de cellen die op de put achterblijven met 25 μL 1x PBS. Streef het vervolgens en voeg 25 μL trypsine toe en incubeer de plaat gedurende 5 minuten bij 37 °C om de cellen los te maken. Stop de trypsinereactie door de eerder herstelde media toe te voegen aan de correspondentput.
- Centrifugeer de plaat bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Streef naar de media. Voeg 50 μL/putje van een 1x PBS en 2,5% formaline toe. Incubeer het bij 4 °C gedurende 20 minuten om cellen te fixeren.
- Herhaal stap 7.5 en 7.5.1. Voeg vervolgens 50 μL/put van 1x PBS en 3% BSA (Blocking buffer) toe en incubeer gedurende 30 min bij 4 °C. Herhaal nogmaals stap 7.5 en 7.5.1 en voeg vervolgens 50 μL/put van het primaire antilichaam (muis α-OVA) toe in 1x PBS en 3% BSA en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C.
- Herhaal stap 7.5 en 7.5.1 en was de cellen vervolgens met 50 μL/putje van 1x PBS. Aspire media, en voeg vervolgens secundaire antilichamen oplossing (α-muis-AlexaFluor488/PerCP en Cy5.5-CD11b/APC-CD86) toe in 1x PBS en 3% BSA. Incubeer het gedurende 1 uur bij 4 °C.
- Centrifugeer de plaat gedurende 5 minuten bij 400 x g. Was vervolgens de cellen met 50 μL/putje van 1x PBS. Vervolgens centrifugeren (400 x g gedurende 5 minuten), streven en vervolgens resuspend de cellen in 100 μL / put van 1x PBS en 2,5% formaline.
- Analyseer het door flowcytometrie, zoals hierboven beschreven (stap 6.2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Polymeersynthese en karakterisering
De OM-pBAE syntheseprocedure is weergegeven in figuur 2. Zoals figuur 2A laat zien, is de eerste stap om de OM-pBAE te verkrijgen het synthetiseren van de C6-pBAE door de amines (1-hexylamine en 5-amino-1-pentanol, verhouding 1:1) toe te voegen aan het diacrylaat (1,4-butaandioldilacrylaat). Deze reactie wordt uitgevoerd bij 90 °C gedurende 20 uur en met constant roeren. Daarna wordt een oplossing van oligopeptiden toegevoegd aan een oplossing van C6-polymeer verkregen uit de vorige reactie (Figuur 2B). Ten slotte wordt de synthese uitgevoerd met DMSO als oplosmiddel bij 25 °C met continu roeren gedurende 20 uur. Figuur 2C toont de structuur van de OM-pBAE, het resulterende product van polymerisatie. De resulterende polymeren worden gekenmerkt door 1H-NMR (zie aanvullende figuur S2). In de karakterisering is een positief resultaat het resultaat met verschillende monomeereenheden (n + m in de cijfers) bestaande uit 7-10; verdeelde de helft van het ene eenheidstype en de helft van het andere; terwijl elk ander getal buiten dit bereik een negatief resultaat is.
Synthese van nanodeeltjes en fysisch-chemische karakterisering
Tabel 3 toont de resultaten van de fysicochemische karakterisering van het GFP-mRNA dat nanodeeltjes inkapselt als proof of concept. Eerder werd aangetoond dat grootte en oppervlaktelading geen significante verschillen vertonen, ongeacht het mRNA-type ingekapseld14. Karakterisering is uitgevoerd in zowel vers bereide als gelyofiliseerde nanodeeltjes om de stabiliteit van hun fysisch-chemische eigenschappen te bewijzen en om aan te tonen dat, zoals eerder gepubliceerd, het vriesdroogproces werd aangepast aan deze formuleringen15. De hydrodynamische straal van de polyplexen wordt als correct beschouwd wanneer deze rond 150-220 nm ligt. Bovendien moet de PDI constant zijn, ongeveer 0,2, maar deze wordt geaccepteerd tot 0,3. Daarom vertoonden noch de grootte noch de PDI significante verschillen voor en na lyofilisatie, zoals hier weergegeven met behulp van representatieve resultaten. Ook werd nanodeeltjesgrootte uitgevoerd met NTA, om de eerder verkregen resultaten te bevestigen. Elke waarde buiten de hierboven gespecificeerde bereiken wordt als een negatief resultaat beschouwd en deeltjes moeten worden weggegooid voor verder gebruik.
Tijdens de fysicochemische karakterisering van dit type monster is het handig om de resultaten verkregen door DLS te vergelijken met de resultaten verkregen door NTA. Beide technieken bepalen de hydrodynamische straal van de deeltjes door de diffusiecoëfficiënt te meten. Het aantal nanodeeltjes dat per frame in NTA wordt geteld, ligt tussen de 80 en 100 om de deeltjes nauwkeurig te volgen. Oppervlaktelading werd ook gekarakteriseerd om de positieve lading van de nanodeeltjes te garanderen, waardoor elektrostatische interactie met het celmembraan werd vergemakkelijkt. Ten slotte werd de morfologie van de polyplexen gekenmerkt door Transmission Electronic Microscopy (TEM). Figuur 3 bevestigt de vorming van bolvormige en monodisperse nanodeeltjes met een geschatte grootte van 50 nm diameter. Kleinere diameters werden verkregen door TEM-beelden te analyseren, omdat zowel NTA als DLS de hydrodynamische diameters meten. Hoewel een kleinere omvang altijd wordt verwacht bij het uitvoeren van elektronenmicroscopiemetingen16,17, in vergelijking met verstrooiingsmetingen, is het essentieel om hier te benadrukken dat het verschil bijna 100 nm is, wat meestal niet wordt verwacht. Dit wordt toegeschreven aan het hoge hygroscopische karakter van deze nanodeeltjes, gegeven door zowel het ingekapselde mRNA als de eindterminale oligopeptiden waaruit het polymeer bestaat.
bepaling van de efficiëntie van mRNA-inkapseling
Een andere kritische parameter om te meten is het vermogen van de nanodeeltjes om het mRNA in te kapselen, dat het actieve principe is en moet worden ingekapseld om de bescherming tegen nucelasen18,19,20te bereiken . Het protocol is ontwikkeld om de inkapselingsefficiëntie (EE; in %) van nucleïnezuurbeknelling te analyseren volgens de instructies van de leverancier. De verkregen waarde geeft een idee over het nucleïnezuurpercentage dat met succes in de nanodeeltjes is ingesloten. RiboGreen kleurstof, een fluorescerende nucleïnezuurkleuring, wordt voor dit doel gebruikt. Het protocol bestaat uit het kwantificeren van elk RNA dat toegankelijk blijft voor de fluorescerende kleurstof. Om het totale RNA te kwantificeren, moeten de nanodeeltjes worden gedemonteerd en heparine wordt voor dit doel gebruikt.
Tabel 4 toont de inkapselingsefficiëntie (EE%) van de OM-pBAE-polyplexen die zowel GFP als OVA-mRNA inkapselen, als proof of concept. RiboGreen fluorescentietest maakt het mogelijk om de hoeveelheid mRNA te berekenen die in de nanodeeltjes is opgesloten na demontage door heparine-toevoeging om hun inhoud vrij te geven. De verkregen efficiëntiewaarden moeten hoger zijn dan 80% en, zoals hier aangetoond, geen significante verschillen vertonen afhankelijk van het type mRNA. Lagere inkapselingsefficiëntiewaarden vertegenwoordigen een negatief resultaat en vormen een signaal voor het weggooien van deze formuleringen. Deze resultaten bevestigen de hoge inkapselingscapaciteit van het mRNA van OM-pBAE, de veelzijdigheid ervan en de veelbelovende toepassing ervan in genafgifte.
In vitro representatieve resultaten
Het is essentieel om de capaciteit van pBAEs-polyplexen te bepalen. Ten eerste om te transfecteren en ten tweede om immuuncellen te activeren14. Transfectie-efficiëntie wordt beoordeeld door twee verschillende technieken, met behulp van eGFP als de reporter mRNA: fluorescentiemicroscopie om het reporter-eiwit visueel te bepalen en flowcytometrie-expressie om de transfectie-efficiëntie te kwantificeren. Een fluorescerende microscoop uitgerust met een CCD-camera, 5x, 10x, 20x en 40x objectieven en UV, blauwe en groene filterlasers werden gebruikt om de expressie van eGFP-eiwit in JAWSII-cellijn, een murine dendritische cellijn, kwalitatief te bepalen. eGFP-eiwit heeft een excitatiemaximum bij 488 nm, overeenkomend met blauwe laser, en een emissiemaximum rond 510 nm, overeenkomend met groene kleur. Om de transfectie-efficiëntie-expressie van het doeleiwit te kwantificeren, wordt flowcytometrie-analyse van de getransfecteerde cellen uitgevoerd na 24 uur van de transfectie met pBAEs-polyplexen met eGFP-mRNA. Een fixatiestap is nuttig wanneer cellen zijn getransfecteerd met fluorescerende reporters zoals GFP of RFP.
Figuur 4 toont de kwalitatieve analyse van de eGFP-expressie na 24 uur transfectie in jawsii-cellijn. Nogmaals, in vergelijking met de negatieve controle is het eGFP-reportersignaal aanzienlijk hoger. Tabel 5 toont ook de transfectie-efficiëntie die wordt weergegeven door OM-pBAE-nanodeeltjes in jawsii-cellijn. Nogmaals, de efficiëntiewaarden zijn vergelijkbaar met positieve controle uitgevoerd met een klassiek transfectiereagens.
De capaciteit van pBAEs NP's geladen met OVA-mRNA om modelimmuuncellen te activeren, is beoordeeld op transfecterende JAWSII-cellijn, een muizen onrijpe dendritische cellijn. Om de activatie van de immuuncellen te bepalen, werden twee verschillende markers gebruikt: CD11b en CD86. Selecteer eerst de juiste fluoroforen voor de configuratie van de flowcytometer. Hier worden PerCP-Cy5.5 (CD11b) en PE (CD86) gebruikt. Onrijpe en niet-geactiveerde cellijnen moeten een CD11b-/CD86-profiel vertonen, terwijl geactiveerde cellen een CD11b+/CD86+ profiel moeten vertonen. De blauwe laser bij 488 nm wordt gebruikt om de doeleiwitexpressie te bepalen en een anti-OVA-antilichaam plus een secundair anti-muis-Alexa488-antilichaam werd gebruikt. Tabel 6 toont het eindpaneel dat in dit experiment is gebruikt. Figuur 5 toont de capaciteit van OVA mRNA-geladen OM-pBAE nanodeeltjes om DC's te activeren, wat indicatief is voor de activering van de cellulaire immuunrespons. Niet-getransfecteerde cellen vertonen een laag aantal cellen dat de CD11b- en CD86-membraanmarkers tot expressie brengt, terwijl de met mRNA OVA OM-pBAEs behandelde cellen een significant verhoogde expressie van de CD11b- en CD86-markers vertonen. Dit resultaat suggereert dat OM-pBAE nanodeeltjes de rijping bevorderen. Al met al bevestigen deze resultaten het vermogen van OM-pBAEs nanodeeltjes om dendritische cellen efficiënt te transfecteren en de activering van de immuunrespons te bemiddelen die de rijping van onrijpe DC's bevordert.
Figuur 1: Schematische weergave van het gehele synthetische protocol. In deze figuur worden de synthesestappen van het mRNA-vaccin gedetailleerd, inclusief de kritische karakteriseringsparameters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Synthese van C6-pBAE oligopeptide end-modified (OM-pBAE). (A) Ruwe chemicaliën om de Michael-toevoeging uit te voeren. (B) pBAE + oligopeptide. (C) OM-pBAE. R kan Histidine (H) of Lysine (K) zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: TEM-beelden van vers GFP-mRNA dat OM-pBAE-nanodeeltjes inkapselt. Polyplexen werden negatief gekleurd voor elektronische microscopiekarakterisering. Monodisperse deeltjes van ongeveer 60 nm diameter worden getoond. (A) en (B) afbeeldingen vertegenwoordigen twee verschillende microscopieën van hetzelfde monster. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Fluorescentiemicroscopie beeldvorming van JAWSII getransfecteerde cellen met OM-pBAE/eGFP mRNA nanodeeltjes. (A) Helder veldbeeld. (B) GFP-fluorescentie (in het groen). (C) Samenstelling van de vorige twee afbeeldingen. Schaalbalken = 100 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Activering van JAWSII na transfectie met OM-pBAE/OVA mRNA nanodeeltjes. Negatieve controlewaarden (CN) komen overeen met het zwarte label. Getransfecteerde cellen komen overeen met het grijze label. Staven komen overeen met de standaarddeviatie (SD) van drie replicaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Materiaal | Materiaal | Microvesicles |
| Brekingsindex | 1.4 | |
| Absorptie | 0.01 | |
| Dispergeermiddel | Dispergeermiddel | Water |
| Temperatuur (°C) | 25 | |
| Viscositeit (cP) | 0.8872 | |
| Brekingsindex | 1.33 | |
| Temperatuur | Temperatuur (°C) | 25 |
| Evenwichtstijd(en) | 10 | |
| Cel | Celtype | Zen0040 |
Tabel 1: Parameters voor het maken van een SOP voor maatmetingen.
| Materiaal | Materiaal | Microvesicles |
| Brekingsindex | 1.4 | |
| Absorptie | 0.01 | |
| Dispergeermiddel | Dispergeermiddel | Water |
| Temperatuur (°C) | 25 | |
| Viscositeit (cP) | 0.8872 | |
| Brekingsindex | 1.33 | |
| Temperatuur | Temperatuur (°C) | 25 |
| Evenwichtstijd | 10 | |
| Cel | Celtype | DTS1070 |
Tabel 2: Parameters om een SOP te maken voor zeta potentiaalmetingen.
| GFP mRNA/OM-pBAE | T (oC) | Hydrodinamische diameter (nm) | PDI | Oppervlaktelading (mV) | |
| NTA | DLS | ||||
| Vers | 25 | 124 ± 32 | 134 ± 8 | 0,2 ± 0,04 | 32 ± 0,7 |
| Gelyofiliseerd | 25 | 135 ± 35 | 138 ± 2 | 0,17 ± 0,02 | 34 ± 0,7 |
Tabel 3: Fysisch-chemische karakterisering van mRNA dat OM-pBAE nanodeeltjes inkapselt. GFP-mRNA dat OM-pBAE-polyplexen inkapselt, werd onmiddellijk na de bereiding - vers- en na het lyofilisatieproces - gekarakteriseerd om de stabiliteit van de deeltjes te waarborgen. DLS- en NTA-dimensionering en oppervlakteladingsgegevens worden weergegeven.
| EE% | |
| GFP mRNA/OM-pBAE | 82,3 ± 1,5 |
| OVA mRNA/OM-pBAE | 83,1 ± 1,5 |
Tabel 4: Encapsulation efficiency (EE%)-gegevens van mRNA dat OM-pBAE-nanodeeltjes inkapselt. Encapsulatie-efficiëntiepercentages van GFP- en OVA-mRNA die OM-pBAE-nanodeeltjes inkapselen. RiboGreenfluorescentietest werd uitgevoerd op gelyofiliseerde monsters om de hoeveelheid mRNA in de polyplexen te beoordelen.
| Monster | % GFP-positieve cellen | SD |
| Negatieve controle | 1.85% | 0.21% |
| OM-pBAE/eGFP mRNA getransfecteerde cellen | 57.79% | 5.28% |
Tabel 5: Transfectie-efficiëntie van OM-pBAE/eGFP mRNA nanodeeltjes in JAWSII cellijn. Transfectie-efficiëntie werd gevolgd door flowcytometrie.
| Antistof | Cellen gekleurd | Fluorescerend label |
| cd11b | Geactiveerde DC's | PerCP-Cy 5,5 |
| cd86 | Geactiveerde DC's | PE |
| AlexaFluor488 met α muis | OVA positieve cellen | AlexaFluor 488 |
Tabel 6: Flowcytometriepaneel. Dit panel werd gebruikt voor flowcytometriestudies om de in vitro functionaliteit van het mRNA-vaccin te bepalen.
Aanvullende informatie: Zie het aanvullend bestand met alle aanvullende informatie inbegrepen. Klik hier om onderstaande bestanden te downloaden.
Tabel S1A: Ribosomale RNA-standaard.
Tabel S1B: RNA:pBAE met heparinestandaard.
Tabel S1C: Heparine standaard.
Figuur S2: 1H-NMR protonspectra van C6-pBAE en OM-pBAE. (A) 1H-NMR van de C6-pBAE. Chloroform-d werd gebruikt als oplosmiddel (δ = 7,25 ppm). (B) 1H-NMR van de C6CH3. D2O werd gebruikt als oplosmiddel (δ = 4,64 ppm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Na de uitbraak van de Covid-19-pandemie vorig jaar heeft het belang van vaccins in termen van infectieziektebestrijding zich gemanifesteerd als een cruciaal onderdeel8. Inspanningen van wetenschappers over de hele wereld hebben de introductie op de markt van veel vaccins mogelijk gemaakt. Voor het eerst in de geschiedenis hebben mRNA-vaccins hun eerder veronderstelde succes aangetoond, dankzij hun snelle ontwerp vanwege hun vermogen om zich binnen enkele maanden aan te passen aan elk nieuw antigeen5,6,21. mRNA, of boodschapper ribonucleïnezuur, verwijst naar de nucleïnezuren die de eiwitsynthese aansturen uit gecodeerde informatie in het DNA. Hier, voor vaccinatiedoeleinden, codificeert het mRNA voor een antigeen eiwit dat behoort tot het infectieuze micro-organisme (of tot een tumorantigeen in geval van therapeutische tumorvaccinatie)8,22. In deze context is het van cruciaal belang voor de wetenschappelijke gemeenschap om duidelijke protocollen te hebben voor het synthetiseren van mRNA-vaccins.
Met dit idee in gedachten was het de bedoeling dat een eenvoudige procedure voor het synthetiseren van mRNA-vaccins op basis van de gepatenteerde polymere nanodeeltjes werd beschreven24. Zoals beschreven in de protocolsectie, worden de polymeren eerst gesynthetiseerd met behulp van een procedure in twee stappen op basis van een Michael-toevoeging van primaire amines aan acrylaatgroepen om polymeerbackbones te synthetiseren, gevolgd door de toevoeging van terminale oligopeptiden om het verbeterde kationische karakter en vermogen om te ontsnappen uit endosomen aan de resulterende polymeren12,13,14 . Vervolgens worden in een volgende stap nanodeeltjes bereid door de polymeren met het mRNA te mengen om hun elektrostatische interactie te bereiken om kleine nanometrische deeltjes te vormen.
Hoewel de synthese van de polymeren een eenvoudig protocol is, kan hetzelfde niet worden gezegd van de nanodeeltjesformulering. Veel medewerkers over de hele wereld hebben deze polymeren gebruikt en hebben gemeenschappelijke kritieke stappen gevonden bij het verwijzen naar de voorbereiding en het gebruik van de deeltjes. Rekening houdend met het feit dat de synthese gebeurt door handmatig mengen, spelen de gebruikersvaardigheden een cruciale rol. De lastigste stap is het mengen van het polymeer en het mRNA, wat op een gecontroleerde manier moet gebeuren, omdat het moet worden gedaan voor de verdere precipitatiestap van het mengsel naar het water en de buffertoevoeging. Elke wijziging in de mechanica van het mengen van de twee componenten zal resulteren in microdeeltjes (in plaats van nanodeeltjes), die niet voor mensen kunnen worden gebruikt. Daarom is mengen een van de stappen voor probleemoplossing die enige oefening vereist om correct te worden bereikt.
Een ander opvallend punt is vriesdrogen. Zoals algemeen bekend, vertegenwoordigt het een van de knelpuntstappen van nanoformulaties. In dit specifieke geval duurde het enkele jaren om alle parameters aan te passen en een protocol te beschrijven dat slaagde15. Zelfs als dat is aangepast, is een andere kritieke stap van het protocol de herdispersie van de formuleringen, die, als ze niet correct worden uitgevoerd, de aggregatie van nanodeeltjes met zich meebrengen en hun functionaliteit verliezen. In dit geval is het een must om de formuleringen snel in een droge, enigszins koude omgeving te plaatsen om hun ongecontroleerde rehydratatie te voorkomen. Vanwege hun hoge hygroscopische aard moet speciale aandacht worden besteed aan het op een gecontroleerde manier rehydrateren door zorgvuldig al het kleverige poeder dat door lyofilisatie wordt gevormd, op en neer te pipetteren. Als de monsters op een niet-gecontroleerde manier rehydrateren, zullen ze onmiddellijk aggregeren en een doorschijnende tot ondoorzichtige dispersie vormen.
Hoewel de kritieke stappen hier worden genoemd, is het protocol voor het synthetiseren van pBAE-polyplexen eenvoudig en snel, wat voordelig is naast andere synthesemethoden van de genafgiftesystemen. Hier is de specifieke toepassing van mRNA-vaccinatie in detail beschreven. Het vertegenwoordigt echter een veelzijdige methodologie die ook kan worden toegepast om andere soorten nucleïnezuren en niet-vaccingebruik in te kapselen, zoals in oncologie en cardiovasculaire velden, zoals eerder gepubliceerd13,23,24.
Kortom, dit protocol zal deze gepatenteerde polymeren in staat stellen om beschikbaar te zijn voor de wetenschappelijke gemeenschap om nieuwe mRNA-vaccins te ontwerpen en tegelijkertijd al deze probleemoplossing te vermijden. Deze polymeren zijn voordelig in vergelijking met andere mRNA-lipideformuleringen met betrekking tot de mogelijkheid van vriesdrogen, stabiliteit op lange termijn en verlaging van opslag- en distributiekosten door geen ultrakoude temperaturen te vereisen. Daarom wordt verwacht dat OM-pBAE-vaccins een vitale rol spelen op het gebied van vaccinatie voor profylactische en therapeutische toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs hebben niets te onthullen of belangenconflicten.
Acknowledgments
Financiële steun van MINECO/FEDER (subsidies SAF2015-64927-C2-2-R, RTI2018-094734-B-C22 en COV20/01100) wordt erkend. CGF erkende haar IQS PhD Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-butanediol diacrylate | Sigma Aldrich | 123048 | |
| 1-hexylamine | Sigma Aldrich | 219703 | |
| 5-amino-1-pentanol | Sigma Aldrich | 411744 | |
| Acetone | Panreac | 141007 | |
| CD11b antibody | BD | 550993 | |
| CD86 antibody | Bioligend | 105007 | |
| Chlor hydroxhyde | Panreac | 181023 | |
| Chloroform-d | Sigma Aldrich | 151823 | |
| Cys-His-His-His peptide | Ontores | Custom | |
| Cys-Lys-Lys-Lys peptide | Ontores | Custom | |
| D2O | Sigma Aldrich | 151882 | |
| DEPC reagent for Rnase free water | Sigma Aldrich | D5758 | This reagent is important to treat MilliQ water to remove any RNases of the buffers |
| Diethyl eter | Panreac | 212770 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| mRNA EGFP | TriLink Technologies | L-7601 | |
| mRNA OVA | TriLink Technologies | L-7610 | |
| RiboGreen kit | ThermoFisher | R11490 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | 71196 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 302031 | |
| Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 11570626 | |
| α-mouse AlexaFluor488 antibody | Abcam | Ab450105 | |
| Equipment | |||
| Nanoparticle Tracking Analyzer | Malvern Panalytical | NanoSight NS300 | |
| Nuclear Magnetic Ressonance Spectrometer | Varian | 400 MHz | |
| ZetaSizer | Malvern Panalytical | Nano ZS | For zeta potential and hydrodynamic size determination |
| Software | |||
| NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | MAN0515-02-EN-00 | |
| NovoExpress Software | Agilent | Not specified | |
| ZetaSizer software | Malvern Panalytical | DTS Application | To analyze surface charge and hydrodynamic sizes |
References
- Chumakov, K., Benn, C. S., Aaby, P., Kottilil, S., Gallo, R. Can existing live vaccines prevent COVID-19. Science. 368 (6496), 1187-1188 (2020).
- Zhang, C., Maruggi, G., Shan, H., Li, J. Advances in mRNA vaccines for infectious diseases. Frontiers in Immunology. 10, 1-13 (2019).
- Wherry, E. J., Jaffee, E. M., Warren, N., D'Souza, G., Ribas, A. How did we get a COVID-19 vaccine in less than 1 year. Clinical Cancer Research. 27 (8), 2136-2138 (2021).
- Folegatti, P. M., et al. Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial. The Lancet. 396 (10249), 467-478 (2020).
- Geall, A. J., Mandl, C. W., Ulmer, J. B. RNA: The new revolution in nucleic acid vaccines. Seminars in Immunology. 25 (2), 152-159 (2013).
- Ulmer, J. B., Geall, A. J.
- Kranz, L. M., et al. Systemic RNA delivery to dendritic cells exploits antiviral defence for cancer immunotherapy. Nature. 534 (7607), 396-401 (2016).
- Milane, L., Amiji, M. Clinical approval of nanotechnology-based SARS-CoV-2 mRNA vaccines: impact on translational nanomedicine. Drug Delivery and Translational Research. 1 (4), 3 (2020).
- Green, J. J., Langer, R., Anderson, D. G. A combinatorial polymer library approach yields insight into nonviral gene delivery. Accounts of Chemical Research. 41 (6), 749-759 (2008).
- Guerrero-Cázares, H., et al. Biodegradable polymeric nanoparticles show high efficacy and specificity at DNA delivery to human glioblastoma in vitro and in vivo. ACS Nano. 8 (5), 5141-5153 (2014).
- Kozielski, K. L., Tzeng, S. Y., Hurtado De Mendoza, B. A., Green, J. J. Bioreducible cationic polymer-based nanoparticles for efficient and environmentally triggered cytoplasmic siRNA delivery to primary human brain cancer cells. ACS Nano. 8 (4), 3232-3241 (2014).
- Segovia, N., Dosta, P., Cascante, A., Ramos, V., Borrós, S. Oligopeptide-terminated poly(β-amino ester)s for highly efficient gene delivery and intracellular localization. Acta Biomaterialia. 10 (5), 2147-2158 (2014).
- Dosta, P., Segovia, N., Cascante, A., Ramos, V., Borrós, S. Surface charge tunability as a powerful strategy to control electrostatic interaction for high efficiency silencing, using tailored oligopeptide- modified poly (beta-amino ester)s (PBAEs). Acta Biomaterialia. 20, 82-93 (2015).
- Fornaguera, C., et al. mRNA delivery system for targeting antigen-presenting cells in vivo. Advanced Healthcare Materials. 7 (17), 180033 (2018).
- Fornaguera, C., Castells-Sala, C., Lázaro, M. Á, Cascante, A., Borrós, S. Development of an optimized freeze-drying protocol for OM-PBAE nucleic acid polyplexes. International Journal Pharmaceutics. 569, (2019).
- Fornaguera, C., Solans, C. Analytical methods to characterize and purify polymeric nanoparticles. International Journal of Polymer Science. , (2018).
- Fornaguera, C., Solans, C. Characterization of polymeric nanoparticle dispersions for biomedical applications: size, surface charge and stability. Pharmaceutical Nanotechnology. 6 (3), 147-164 (2018).
- Sahin, U., Karikó, K., Türeci, Ö MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
- Fan, Y. N., et al. Cationic lipid-assisted nanoparticles for delivery of mRNA cancer vaccine. Biomaterials Science. 6 (11), 3009-3018 (2018).
- Le Moignic, A., et al. Preclinical evaluation of mRNA trimannosylated lipopolyplexes as therapeutic cancer vaccines targeting dendritic cells. Journal of Controlled Release. 278, 110-121 (2018).
- Banerji, A., et al. mRNA vaccines to prevent COVID-19 disease and reported allergic reactions: Current evidence and approach. Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 9 (4), 1423-1437 (2021).
- Kaczmarek, J. C., Kowalski, P. S., Anderson, D. G. Advances in the delivery of RNA therapeutics: from concept to clinical reality. Genome Medicine. 9 (1), 1-16 (2017).
- Dosta, P., et al. Delivery of anti-microRNA-712 to inflamed endothelial cells using poly(β-amino ester) nanoparticles conjugated with VCAM-1 targeting peptide. Advanced Healthcare Materials. , 1-11 (2021).
- Segovia, N., et al. Hydrogel doped with nanoparticles for local sustained release of siRNA in breast cancer. Advanced Healthcare Materials. 4 (2), 271-280 (2015).
