Summary
Här presenteras ett enkelt protokoll för att producera mRNA-nanopartiklar baserade på poly(beta aminoester) polymerer, lätta att skräddarsy genom att ändra det inkapslade mRNA. Arbetsflödet för att syntetisera polymererna, nanopartiklarna och deras in vitro-väsentliga karakterisering beskrivs också. Ett konceptbevis för immunisering läggs också till.
Abstract
Vaccinering har varit en av de stora framgångarna i det moderna samhället och är oumbärlig för att kontrollera och förebygga sjukdomar. Traditionella vacciner bestod av hela eller delar av smittämnet. Det finns dock fortfarande utmaningar och ny vaccinteknik är obligatorisk. I detta sammanhang har användningen av mRNA för immuniseringsändamål visat en förbättrad prestanda, vilket framgår av det snabba godkännandet av två mRNA-vacciner som förhindrar SARS-CoV-2-infektion. Förutom framgång med att förebygga virusinfektioner kan mRNA-vacciner också användas för terapeutiska cancerapplikationer.
Ändå gör instabiliteten i mRNA och dess snabba clearance från kroppen på grund av närvaron av nukleaser dess nakna leverans inte möjlig. I detta sammanhang är nanomediciner, och särskilt polymera nanopartiklar, kritiska mRNA-leveranssystem. Syftet med denna artikel är således att beskriva protokollet för formulering och test av en mRNA-vaccinkandidat baserat på de proprietära polymera nanopartiklarna. Syntesen och den kemiska karakteriseringen av de poly(beta aminoesters) polymerer som används, deras hymering med mRNA för att bilda nanopartiklar och deras lyofiliseringsmetodik kommer att diskuteras här. Detta är ett avgörande steg för att minska lagrings- och distributionskostnaderna. Slutligen kommer de tester som krävs för att visa deras förmåga att in vitrotransfektera och mogna modell dendritiska celler att anges. Detta protokoll kommer att gynna det vetenskapliga samfundet som arbetar med vaccinering på grund av dess stora mångsidighet som gör det möjligt för dessa vacciner att förebygga eller bota en mängd olika sjukdomar.
Introduction
Infektionssjukdomar har utgör ett allvarligt hot mot miljontals människor runt om i världen och är fortfarande en av de främsta dödsorsakerna i vissa utvecklingsländer. Profylaktisk vaccination har varit en av de mest effektiva interventionerna i det moderna samhället för att förebygga och kontrollera infektionssjukdomar1,2. Dessa kritiska milstolpar i vetenskapenunder 1900-talet har kommenterats av den senaste globala Covid-19-pandemin orsakad av SARS-CoV-2-viruset3. Med tanke på vikten av att ha effektiva vacciner för att begränsa spridningen av sjukdomen har samarbete från alla biomedicinska samhällen framgångsrikt resulterat i många profylaktiska vacciner på marknaden på mindre än ett år4.
Traditionellt bestod vacciner av dämpade (levande, minskad virulens) eller inaktiverade (dödspartiklar) virus. Men för vissa sjukdomar utan marginal för säkerhetsfel är viruspartiklar inte möjliga, och proteinunderenheter används istället. Subunits möjliggör dock vanligtvis inte kombinationen av mer än ett epitop/antigen, och adjuvanser krävs för att förbättra vaccinationspotensen 5,6. Därför står behovet av nya vaccintyper tydligt.
Som visats under den nuvarande pandemin kan nya vaccinkandidater baserade på nukleinsyror vara fördelaktiga när det gäller att undvika långa utvecklingsprocesser och ge hög mångsidighet samtidigt som de producerar en vital patientimmunisering. Detta är fallet med mRNA-vacciner, som ursprungligen utformades som experimentella cancervacciner. Tack vare deras naturliga förmåga att producera antigenspecifika T-cellssvar3,5,6,7. Att vara mRNA molekylen som kodar det antigena proteinet, bara ändra samma, vaccinet kan snabbt skräddarsys för att immunisera andra varianter av samma mikroorganism, olika stammar, andra infektiösa mikroorganismer, eller till och med bli en cancer immunoterapeutisk behandling. Dessutom är de fördelaktiga när det gäller storskaliga produktionskostnader. MRNA har dock ett betydande hinder som hindrar deras nakna administration: dess stabilitet och integritet äventyras i fysiologiska medier, fulla av nukleaser. Av denna anledning krävs användningen av en nanometrisk bärare som skyddar den och vektoriserar mRNA till de antigenpresenterande cellerna2,8.
I detta sammanhang är poly (beta aminoesters) (pBAE) en klass av biokompatibla och biologiskt nedbrytbara polymerer som visade en anmärkningsvärd förmåga att komplex mRNA i nanometriska partiklar, tack vare deras katjoniska laddningar9,10,11. Dessa polymerer består av esterbindningar, vilket gör nedbrytningen lätt av esteraser under fysiologiska förhållanden. Bland pBAE bibliotek kandidater, de functionaliserade med slutet katjoniska oligopeptides visade en högre kapacitet att bilda små nanopartiklar att effektivt penetrera celler genom endocytosis och transfect det inkapslade genmaterialet. Dessutom, tack vare deras buffringskapacitet, tillåter försurningen av endosomfacket endosomal flykt12,13. Nämligen en specifik typ av pBAE, inklusive hydrofoba moieties på ryggraden (den så kallade C6 pBAE) för att förbättra deras stabilitet och end-oligopeptide kombination (60% av polymer modifierad med en tri-lysin och 40% av polymeren med en tri-histidin) som selektivt transfekterar antigen-presenterande celler efter parenteral administrering och producerar mRNA-kodad antigenpresentation följt av möss immunisering har nyligen publicerats1 . Dessutom har det också visats att dessa formuleringar skulle kunna kringgå ett av de viktigaste flaskhalsstegen i nanomedicinska formuleringar: möjligheten att frysa dem utan att förlora sin funktionalitet, vilket möjliggör långsiktig stabilitet i mjuka torra miljöer15.
I detta sammanhang är syftet med det nuvarande protokollet att göra förfarandet för bildandet av mRNA-nanopartiklar tillgängliga för forskarsamhället genom att ge en beskrivning av de kritiska stegen i protokollet och möjliggöra produktion av effektiva vacciner för förebyggande av infektionssjukdomar och tumörbehandlingstillämpningar.
Följande protokoll beskriver den kompletta träningen för att syntetisera oligopeptid end-modified poly (beta aminoesters) - OM-pBAE polymerer som ytterligare kommer att användas för nanopartikelsyntes. I protokollet ingår också nanopartiklar formulering. Dessutom tillhandahålls kritiska steg för att förfarandet och representativa resultat också tillhandahålls för att säkerställa att de resulterande formuleringarna utför de nödvändiga kvalitetskontrollkarakteriseringsfunktionerna för att definiera ett positivt eller negativt resultat. Detta protokoll sammanfattas i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Syntes av pBAE-polymer med änd oligopeptider (OM-pBAE)
- Polymerisation av C6-pBAE
- Tillsätt 5-amino-1-pentanol (38 mmol; MW = 103,16 Da) 1-hexylamin (38 mmol; MW = 101,19 Da) i en rundbottenglaskolv (100 ml). Tillsätt sedan 1,4-butandiol diacrylate (82 mmol; MW = 198,22 da).
- Förvärm silikonoljebadet vid 90 °C, placera kolven med rund botten i oljebadet och rör om blandningen med hjälp av en magnetrörstång över natten (~18 h). Ta sedan produkten från kolven med rund botten och placera den i frysen vid -20 °C.
OBS: Produkten är i form av ett klibbigt pulver och tas ut från kolven med hjälp av en spatel. Det är viktigt att validera strukturen hos den erhållna polymeren genom 1H-NMR. NMR-spektra registrerades i ett 400 MHz-instrument (se Tabell över material)med kloroform-d och D2O som lösningsmedel. Cirka 10 mg av varje poly(β-amino ester) togs och upplöstes i 1 ml av det deutererade lösningsmedlet.
- Reaktion med peptider för att erhålla OM-pBAE
- Tillsätt 25 ml 0,1 M HCl till utvalda peptider, t.ex. peptid Cys-His-His-His-His med trifluoreetsyra (TFA, 200 mg), i ett tidigare vägt 50 ml centrifugrör som tål frystorkning och manuellt omröras över natten för att få en tydlig lösning.
- Frys lösningen vid -80 °C i 1 tim och frystorka den resulterande peptidhydrokloriden.
OBS: Kontrollera om den slutliga vikten motsvarar det teoretiska värdet. - Gör en lösning av C6-pBAE (0,031 mmol) i dimetylsulfoxid. Gör också en lösning av peptidhydroklorid (0,078 mmol) i dimetylsulfoxid.
- Blanda de två lösningarna i ett skruvlocksrör och skruva fast locket. Rör om blandningslösningen i ett vattenbad med en kontrollerad temperatur på 25 °C i 20 timmar med en magnetisk omrörning.
- Tillsätt blandningen till 7:3 (v/v) dietyleter/aceton. Centrifugera den resulterande suspensionen vid 25 000 x g vid 4 °C för att avlägsna lösningsmedlet. Tvätta sedan fastan med 7:3 (v/v) dietyleter/aceton två gånger. Torka sedan produkten under ett vakuum (<0,2 atm).
- Gör en lösning på 100 mg/ml av produkten i dimetylsulfoxid. Den resulterande produkten heter C6-peptid-pBAE. Det är viktigt att validera strukturen hos den erhållna polymeren genom 1H-NMR för att bekräfta försvinnandet av de olefinsignaler som är associerade med terminala akrylater. Om polymeren inte används kan den frysas vid -20 °C.
2. Polyplexbildning
OBS: Alla procedurer bör utföras i ett konditionerat rum för att upprätthålla en konstant temperatur.
- Tina polymererna C6-peptid-pBAE och virvla lösningen.
- Pipettera polymeren blanda upp och ner och förbered en lösning på 12,5 mM (V1)i natriumacetat (NaAc). Virvla sedan blandningen och vänta i 10 min.
- Förbered mRNA vid 0,5 mg/ml och blanda genom pipettering (V2).
OBS: Det är viktigt att undvika att virvla på mRNA. - Virvel polymerblandningen vid den slutliga koncentrationen för att uppnå en homogen lösning mellan polymerlagret i DMSO och acetatbufferten.
OBS: Den slutliga polymerkoncentrationen beror på det valda förhållandet mellan N/P (kväve och fosfatgrupper). N/P-förhållandet beror på varje specifikt mRNA som ska användas. För eGFP-inkapsling användes till exempel ett 25:1-förhållande, som tidigare rapporterats14. - Blanda den genetiska materiallösningen och C6-peptidepBAE-lösningen (25x av mRNA-koncentrationen) i ett förhållande av 1:1 (Vi = V1 + V2).
OBS: C6-peptid-pBAE laddas i ett mikrocentrifugerör där mRNA tillsätts genom pipettering upp och ner för blandning. När polyplex, nukleinsyra och C6-peptid-pBAE är beredda är de halvt utspädda. - Inkubera vid 25 °C i 30 minuter i en termoblock. Fäll ut med 1:2 RNase fritt vatten genom att tillsätta provet i ett förinstallerat mikrocentrifugerör med vatten.
- Inkludera hjälpämnena. Tillsätt samma volym som blandningen av mRNA och pBAE (Vi)i HEPES 20 mM och sackaros 4% genom pipettering upp och ner. Vid denna tidpunkt har provet spädts ut 3x.
3. Polyplex lyofilisering
- Frys omedelbart vid -80 °C frys av den tidigare polyplexlösningen i 1 h.
- Utför den primära torkningen genom att följa stegen: (1) 1 h vid -60 °C och 0,001 hPa; 2. 1 h vid -40 °C och 0,0001 hPa, 3. 4 timmar vid -20 °C och 0,0001 hPa. (4) 12 timmar vid 5 °C och 0,0001 hPa.
- Förvara vid -20 °C omedelbart för att undvika rehydrering fram till användning.
4. Polyplex resuspension
OBS: Detta protokoll beskriver processen som används för att rekonstruera lyofiliserade C6-peptid-pBAE nanopartiklar för deras vidare användning antingen för karakterisering, in vitro eller in vivo analys.
- Ta de frystorkade nanopartiklarna från -20 °C precis vid användningsögonblicket och tillsätt snabbt motsvarande mängd depyrogent (DEPC) vatten för att omdefiniera det fasta för att uppnå önskad koncentration.
OBS: Volymen kommer att vara densamma som nanopartiklarnas ursprungliga volym om samma koncentration planeras, men den kommer att anges för varje experiment. - Pipettera försiktigt tills total resuspension, åtfölj vätskan med pipetten.
OBS: Försäkra dig om att inget material finns kvar på injektionsflaskans vägg. - När pipetten har lösts upp och ner kraftigt och undviker bubblor.
OBS: Provet bör ha en genomskinlig till genomskinlig aspekt, vilket är tydligare vid högre koncentrationer - Förvara proverna på is eller vid 4 °C under högst 24 timmar när de har rekonstruerats. Undvik att frysa.
5. Polyplex karakterisering
- Dynamisk ljusspridning
OBS: Hydrodynamisk diameter (nm), polydispersitetsindex (PDI) och ytladdning av nanopartiklar mättes vid 25 °C, 633 nm laservåglängd och 173° signaldetektor med hjälp av en Zeta-potentiell analysator (se Materialtabell).- Hydrodynamisk diameter (nm)
- Förbered nanopartiklarna som blandar mRNA och pBAE noggrant genom att leda genmaterialet till polymerfraktionen till en slutlig koncentration av mRNA på 0,25 mg/ml enligt ovan (steg 2).
- Förskölj en mikrokuvette med filtrerat utspädningsmedium för att helt rengöra den från föroreningar. Fyll sedan cuvettet med minst 50 μL av provlösningen och kapsejsa den. Introducera sedan provet inuti DLS-instrumentet, se till att cellen är korrekt insatt.
OBS: Utspädningsmediet filtreras med ett sprutfilter på 0,22 μm. - Öppna filen SO (Standard Operation Procedure) som skapats och introducera önskat exempelnamn. Välj Storleksmätning.
OBS: Alla parametrar för att skapa en SOP för storleksmätningar finns i tabell 1. - Kör partikelstorleksmätningen med DLS genom att klicka på Spelaupp .
OBS: När trippelsignalen har ljudt är analysen klar. - Välj de resultat som motsvarar provet på mätbladet för att få den genomsnittliga partikelstorleken, den genomsnittliga PDI,standardavvikelsen och grafiken. När du är klar tar du bort cellen från DLS-utrustningen.
- Ta bort provet, behåll det för zetapotentialanalys och rengör och skölj cellen med avjoniserat vatten. Torka slutligen den rengjorda cuvettet under en tryckluftsgasström.
- Ytladdning (mV)
- Förbered nanopartiklarna som blandar mRNA och pBAE noggrant genom att leda genmaterialet till polymerfraktionen till en slutlig koncentration av mRNA på 0,25 mg/ml enligt tidigare beskrivet ovan (steg 2, Polyplexbildning). Frys sedan och torka lösningen.
OBS: För mätning av ytladdning rekommenderas i detta fall starkt att provet frystorkas innan du utför åtgärderna för att omfördela provet i lämplig buffert, vilket simulerar kroppens förhållanden med pH- och elektrolytkoncentration. - Återanvänd det frystorkade provet med vatten. Späd ut provet 1/10 i vatten (slutlig koncentration 0,025 mg/ml).
- Förskölj en engångsvikt kapillärcell (zeta potentiell cuvette) med filtrerat utspädningsmedium för att helt rengöra den från föroreningar. Fyll sedan cuvette med utspädda nanopartiklar, med en 1 ml spruta, och kapa båda sidorna av fyllmedel.
OBS: Nanopartikeldispersionen måste fylla den tillgängliga volymen i cuvettet (~ 1 mL), med särskild uppmärksamhet på bubblans bildande, vilket kan störa åtgärder. - Introducera provet inuti DLS; se till att cellen är korrekt insatt.
- Öppna SOP-filen som skapats för zeta-potentiell analys och introducera önskat exempelnamn. Välj Zeta-Potentiell mätning.
OBS: Parametrar för att skapa en SOP för zeta potentiella mätningar anges i tabell 2. - Kör zetapotentialmätning med DLS genom att klicka på Spela.
OBS: Efter trippelsignalljudet är analysen klar. - Välj de resultat som motsvarar exemplet på mätbladet för att få den genomsnittliga zetapotentialen, standardavvikelsen och grafiken. När du är klar tar du bort cellen från DLS-utrustningen.
- Ta bort provet och behåll det om det behövs. Rengör och skölj sedan cuvettecellen med avjoniserat vatten, följt av etanol och vatten igen. Torka slutligen den rengjorda cuvettet under en tryckluftsgasström.
Obs: Om du vill analysera data använder du den rekommenderade programvaran.
- Förbered nanopartiklarna som blandar mRNA och pBAE noggrant genom att leda genmaterialet till polymerfraktionen till en slutlig koncentration av mRNA på 0,25 mg/ml enligt tidigare beskrivet ovan (steg 2, Polyplexbildning). Frys sedan och torka lösningen.
- Hydrodynamisk diameter (nm)
- Nanopartikelspårningsanalys (NTA)
OBS: Hydrodynamisk diameter (nm) och koncentration av nanopartiklar mättes vid 25 °C, 488 nm laservåglängd med hjälp av en nanopartikelspårningsanalysator (se Tabell över material).- NTA och provberedning
- Slå på datorn och utrustningen. Kontrollera först om alla komponenter är korrekt anslutna. Öppna sedan den rekommenderade programvaran. Programvaran kommer att kontrollera om alla tillbehör är korrekt anslutna.
- Anslut toppplattan, här, O-ringcellen, till lasermodulen.
OBS: Överskruva inte den här delen. - Ladda först kammaren med buffert och/eller avjoniserat vatten med en 1 ml spruta. Upprepa proceduren minst två gånger. Undvik att införa bubblor i kammaren.
- Förbered provet genom att späda ut 1/1000 i avjoniserat vatten från den koncentration som används vid DLS-storleksmätning. Förbered minst 1 ml och ladda den i en 1 ml spruta, så att bubblor inte införs.
- Ladda proverna i kammaren med en spruta. Anslut sedan lasermodulen till NTA:s stora kammare.
OBS: Stor kammare betecknar utrymmet där kammaren placeras för mätningen.
- Bildoptimering
- Kontrollera först om kameran och rätt laser är valda i maskinvaran.
OBS: Här finns det bara en kamera och Blue Laser 488 nm. - Börja med kameranivån vid 0 och tryck på Startkameran i capture-fönstret.
OBS: Justera följande parametrar nu. Strålläge (det kan flyttas upp och ner på skärmen). Kameranivå: undvik övermättade pixlar. Fokus (sidohjul):försök att fokusera så bättre som möjligt. Det är bättre att ha partiklar med en halo istället för ofokuserade partiklar. Koncentration: Justera koncentrationen så att den har mellan 10 och 100 partiklar per fält.
- Kontrollera först om kameran och rätt laser är valda i maskinvaran.
- Videoinspelning
- I programvaran går du till fönstret Mätningsval- SOP (ned till vänster) och väljer Standardmätning.
OBS: Program för att utföra tre mått på 30 s vardera (för att göra det möjligt för programvaran att utföra medelvärdes- och standardavvikelseberäkningar). Ange ett namn och en mappsökväg (på Basfilnamn) för att spara posterna i exemplet. När SOP-parametrarna är korrekt inställda trycker du på Skapa och kör skript. När den första replikt har mätts kommer programmet att be om att lägga till ett nytt exempel. Därefter måste ytterligare en bråkdel av provet föras in i kammaren genom att skjuta sprutans kolv. Upprepa slutligen en tredje gång för att analysera den tredje replikatorn.
- I programvaran går du till fönstret Mätningsval- SOP (ned till vänster) och väljer Standardmätning.
- Videobehandling
- Justera tröskelvärdet för skärmökning och detektering när de tre måtten är klara för att analysera de uppmätta partiklarna. För närvarande bör cirka 100 partiklar visas i varje bildruta för att utföra analysen (höga röda kors och låga blå kors förväntas).
- Exportera resultaten i en pdf-fil när analysen är klar. Dessutom är det möjligt att exportera som videor och excel-filer.
- Rengöring av NTA
OBS: Stäng alla öppnade mätningar innan du studerar följande prov; eftersom de genererade filerna är enorma och beroende på datorn är det inte lätt att upprätthålla mer än en öppen.- Rengör NTA-kammaren genom att upprepade gånger spola vatten innan den efterföljande mätningen utförs tills inga partiklar observeras. därefter spola den använda bufferten (PBS) för att fortsätta med åtgärderna.
- Spola in luft i kammaren och torka den med mikroskopiskt papper när dagens sista mätning är klar.
- Karakterisera storlek och form genom Transmission Electronic Microscopy (TEM). Förbered proverna. 30 μL av den slutliga volymen räcker för TEM-karakterisering.
OBS: Både färska och frystorkade - efter att resuspension- nanopartiklar kan mätas. - Droppa 10 μL prov på ett kolbelagt kopparnät. Låt det torka i 10 min. Ta bort överskottsvätskan, om nödvändigt, genom att trycka mjukt på filterpapper.
- Släpp 10 μL uranylacetatlösning (2% w/v) för negativ färgning. Låt det torka i 1 min. Ta bort vätskeöverskottet om det behövs genom att trycka mjukt på filterpapper.
- Introducera provet i mikroskopet och skanna (spänningsdrift 80 kV).
OBS: Lämplig programvara kan användas för vidare analys av bilderna.
- NTA och provberedning
- Inkapslingseffektivitet
- Provberedning
- Förbered nanopartiklarna vid önskad koncentration och frys och torka dem. Späd sedan nanopartiklarna och späd dem vid en slutlig koncentration av 6 μg/ml.
- Förbered 1x TE-buffert från 20x lagerlösningen.
OBS: Vt (Total volym) = (antal prover x 100 μL x 4) (antal prover x 290 μL) + 2 ml. - Förbered TE-bufferten med 3 μg/μL Heparin från beståndet på 100 μg/μL.
OBS: Vt = Antal prover x 50 μL x 2. - Förbered standarderna
- Förbered en RNA-standard som sträcker sig från 0,2 μg/ml till 0,025 μg/ml i 1x Tris-EDTA (TE) buffert(tabell S1A).
OBS: Använd mRNA i RNA-standarden om det skiljer sig från Ribosomal RNA. - Förbered RNA:pBAE-standard med Heparin(Tabell S1B). Förbered Heparin standard (tabell S1C).
- Förbered en 96-brunnsplatta enligt följande.
- Ladda 295 μL TE-buffert i det första körfältet på en 96-brunnsplatta (så många brunnar som prover att analysera). Lasta sedan 50 μL 1x TE-buffert i körfälten B och C (dubbletter för varje prov).
- Lasta 50 μL 1x TBE-buffert med 3 μg/μL Heparin i körfälten D och E (dubbletter för varje prov). Lasta sedan 100 μL av varje standard i körfälten F, G och H (dubbletter för varje standard).
- Last 5 μL av varje prov i bana A (koncentrationen i varje brunn är 0,1 μg/ml). Blanda ordentligt genom pipettering och lasta 50 μL av varje prov på de fyra brunnarna nedan (två av dem innehållande 50 μL buffert 1x TE och ytterligare två innehållande 1x TE-buffert med 3 μg/μL Heparin).
- Inkubera provet i 30 min vid 37 °C. Förbered RiboGreen-reagens enligt tillverkarens protokoll (se Tabell över material)i 1x TE-buffert.
OBS: Späd 1:200 och virvel. Skydda mot ljus. Vt = Antal fulla brunnar x 100 μL. - Lasta 100 μL RiboGreen-lösning i varje brunn. Detektera fluorescens med hjälp av mikroplattavläsaren med en excitationsvåglängd på 500 nm och en emissionsvåglängd på 525 nm.
- Resultatanalys
- Förbered de tre kalibreringskurvorna
OBS: Först Ribosomal RNA-standard. Interpolera i denna kalibreringskurva de prover som inte innehåller Heparin. För det andra, mRNA:pBAE med Heparin. Interpolera i denna kalibreringskurva provet som har Heparin. För det tredje, Heparin. Används för att säkerställa att arbetskoncentrationen ligger i det linjära intervallet. - Beräkna inkapslingseffektivitet (EE%) enligt följande:
- Förbered de tre kalibreringskurvorna
- Provberedning
6. In vitro-karakterisering
- Fluorescensmikroskopi för kvalitativ bedömning
- Placera 96-brunnsplattan på mikroskopet efter 24 timmars transfektion. Börja visualisera celler med 10x-målet.
OBS: HeLa-celler används i det här fallet. Cellerna lokaliseras med överföringsläget (ljust fält) och fokus måste justeras just nu.- Använd först en vitbalans för att referera till programvaran om provernas bakgrund. Skaffa sedan en bild för att överlagra den med fluorescensbilden under analysen.
- Ändra mikroskopläget till reflektionsläge (fluorescens) och flytta filterhjulet till den blå lasern (488 nm) för att visualisera eGFP.
OBS: Vid denna tidpunkt måste exponeringstiden och förstärkningen justeras. Förstärkning måste justeras i värden mellan 3 och 5 för att undvika artefakter och överskott på bakgrundssignal. Justeringen av exponeringstiden beror på transfekteringseffektiviteten (från ms till 1 s). - Skaffa bilder för alla förhållanden eller brunnar som använder samma exponeringstid för att jämföra alla prover.
- Placera 96-brunnsplattan på mikroskopet efter 24 timmars transfektion. Börja visualisera celler med 10x-målet.
- Flödescytometri (FC) för kvantitativ bedömning
- Använd en flerkanalspipett för att förbereda 96-brunnsplattan för flödescytometriexperimentet.
OBS: När du arbetar med halvföljande celler, till exempel i JAWSII-cellinjen, återställer du all medievolym och lagrar den i en annan 96-brunnsplatta. Sträva inte efter detta medium eftersom det kan innehålla ett betydande antal transfekterade celler. - Rengör cellerna (HeLa-celler används här) med 100 μL/brunn av 1x PBS och aspirera på det. Tillsätt sedan 25 μL/brunn trypsin och inkubera det vid 37 °C i 5 minuter.
- När cellerna har lossnat, lägg till tidigare återvunna medier för att stoppa trypsin-åtgärden och fixera cellerna och tillsätt 31,25 μL/brunn formalin 10% i 20 min (slutlig koncentration 2,5%).
OBS: Vid denna tidpunkt är det viktigt att visualisera cellernas tillstånd genom mikroskopi för att säkerställa cellernas avlossning. Det rekommenderas starkt att pipett upp och ner flera gånger för att hjälpa cellerna att lossna och undvika deras tätbebyggelse. Detta kommer att ge ett tillförlitligt resultat. - Slå på flödescytometern och programvaran. I programvaran ställer du in de rätta villkoren för experimentet (typ av platta, provvolym och andra parametrar som skakning, sköljning mellan prover.
OBS: För steg 6.2.5 bör flödet vara 120 μL/min. Blanda en cykel var 1 minut och skölj en cykel var och en väl. Blandning är avgörande för att upprätthålla de celler som sprids i media och möjliggöra en bättre analys av enskilda celler. Dessutom är sköljning nödvändig för att rengöra cytometerns mikrofluidik mellan proverna. Kontrollera slutligen om det finns tillräckligt med buffertar och om alla komponenter är korrekt anslutna. - Ställ in lämpliga parametrar för att kvantifiera procentandelen positivt transfekterade celler.
- Visa först flödesdata på (Framåt spritt ljus) FSC kontra SCC (Side scattered light) spridningsdiagram för att skilja cellerna från skräpet. Sedan ritas en annan punkt som jämför amplituden (FSC-A) kontra höjden (FSC-H) för att gate och diskriminera enskilda celler.
OBS: Den obehandlade populationen gör det möjligt att gate de populationer som motsvarar positivt transfekterade celler. Därefter utförs kvantifiering av de positivt transfekterade cellerna på rätt kanal på ett histogramdiagram. Därför måste de positivt transfected cellerna representeras som ett kontinuum av händelser på histogrammet.
- Visa först flödesdata på (Framåt spritt ljus) FSC kontra SCC (Side scattered light) spridningsdiagram för att skilja cellerna från skräpet. Sedan ritas en annan punkt som jämför amplituden (FSC-A) kontra höjden (FSC-H) för att gate och diskriminera enskilda celler.
- Använd en flerkanalspipett för att förbereda 96-brunnsplattan för flödescytometriexperimentet.
7. In vitro-funktionstester: kapacitet att aktivera modell immunceller genom att använda ovalbumin (OVA) som antigen modell mRNA
- Platta 10 000 celler/brunn (JAWSII-celler används här) i en 96-brunnsplatta dagen före transfektion.
OBS: Plätera så många brunnar som krävs för att ha tre exemplar för varje tillstånd. Låt cellerna fästas på plattan minst i 12 timmar (en inkubation över natten rekommenderas). - Förbered pBAEs NPs enligt beskrivningen i NOTE nedan för att transfektera 0,6 μg mRNA per brunn.
OBS: Som en positiv kontroll, transfect cellerna med hjälp av en transfection reagens. Här använde vi 0,1 μg mRNA per brunn och 0,25 μL av transfektreagenset per brunn. mRNA-kodifiering för OVA köptes (se Tabell över material). Den är polyadenylerad, modifierad med 5-methoxyuridin och optimerad för däggdjurssystem, och skyddas genom en end-capping med Cap1 struktur, en proprietär metod från leverantören. - Inkubera 96-brunnsplattan i 24 timmar i en torrluftsinkubator vid 37 °C och 5% CO2.
OBS: Efter denna tid, aspirera inte på media eftersom det kan innehålla ett visst antal celler. Återställ cellerna och spara dem i en annan brunn eller tallrik. - Tvätta cellerna kvar på brunnen med 25 μL 1x PBS. Därefter aspirera det och tillsätt 25 μL trypsin och inkubera plattan i 5 min vid 37 °C för att lossa cellerna. Stoppa trypsinreaktionen genom att lägga till det tidigare återvunna mediet på korrespondentbrunn.
- Centrifugera plattan vid 400 x g i 5 min vid 4 °C. Aspirera på media. Tillsätt 50 μL/brunn av en 1x PBS och 2,5% formalin. Inkubera den vid 4 °C i 20 minuter för att fixera celler.
- Upprepa steg 7.5 och 7.5.1. Tillsätt sedan 50 μL/brunn på 1x PBS och 3% BSA (Blocking buffer) och inkubera i 30 min vid 4 °C. Upprepa återigen steg 7,5 och 7,5,1 och tillsätt sedan 50 μL/brunn av den primära antikroppen (mus α-OVA) i 1x PBS och 3% BSA och inkubera i 30 min vid 4 °C.
- Upprepa steg 7.5 och 7.5.1 och tvätta sedan cellerna med 50 μL/brunn på 1x PBS. Sträva efter media och tillsätt sedan sekundär antikroppar lösning (α-mus-AlexaFluor488/ PerCP och Cy5.5-CD11b /APC-CD86) i 1x PBS och 3% BSA. Inkubera den i 1 h vid 4 °C.
- Centrifugera plattan vid 400 x g i 5 min. Tvätta sedan cellerna med 50 μL/brunn av 1x PBS. Därefter aspirerar centrifugen (400 x g i 5 min), och återanvänder sedan cellerna i 100 μL/brunn på 1x PBS och 2,5% Formalin.
- Analysera det efter flödescytometri, som beskrivits ovan (steg 6.2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Polymersyntes och karakterisering
Om-pBAE-syntesproceduren anges i figur 2. Som figur 2A visar är det första steget för att erhålla OM-pBAE att syntetisera C6-pBAE genom att tillsätta aminer (1-hexylamin och 5-amino-1-pentanol, förhållande 1:1) till diacrylate (1,4-butanediol diacrylate). Denna reaktion utförs vid 90 °C i 20 timmar och med konstant omrörning. Därefter tillsätts en lösning av oligopeptider till en lösning av C6-polymer som erhållits från den tidigare reaktionen (figur 2B). Slutligen utförs syntesen med DMSO som lösningsmedel vid 25 °C med kontinuerlig omrörning i 20 timmar. De resulterande polymererna kännetecknas av 1H-NMR (se kompletterande figur S2). I karakteriseringen är ett positivt resultat det med flera monomerenheter (n + m i siffrorna) som består av mellan 7-10; fördelad halv enhet och hälften den andra; medan alla andra tal utanför detta intervall är ett negativt resultat.
Nanopartikelsyntes och fysikalisk-kemiska karakterisering
Tabell 3 visar resultaten av den fysikalisk-kemiska karakteriseringen av GFP mRNA som kapslar in nanopartiklar som ett konceptbevis. Det har tidigare visats att storlek och ytladdning inte visar signifikanta skillnader oavsett mRNA-typ inkapslad14. Karakterisering har utförts både i nyberedda och frystorkade nanopartiklar för att bevisa stabiliteten i deras fysikalisk-kemiska egenskaper och för att visa att frystorkande processen, som tidigare publicerats, justerats till dessa formuleringar15. Polyplexens hydrodynamiska radie anses vara korrekt när den sträcker sig runt 150-220 nm. Dessutom måste PDI vara konstant, ungefär 0,2, men det accepteras upp till 0,3. Därför visade varken storlek eller PDI signifikanta skillnader före och efter lyofilisering, vilket visas här med representativa resultat. Nanopartikelstorlek utfördes också med NTA, för att bekräfta de tidigare erhållna resultaten. Alla värden utanför de områden som anges ovan betraktas som ett negativt resultat, och partiklar bör kasseras för vidare användning.
Under den fysikalisk-kemiska karakteriseringen av denna typ av prov är det bekvämt att jämföra de resultat som erhållits av DLS med de resultat som erhålls av NTA. Båda teknikerna bestämmer partiklarnas hydrodynamiska radie genom att mäta diffusionskoefficienten. Antalet nanopartiklar som räknas per ram i NTA är mellan 80 och 100 för att noggrant spåra partiklarna. Ytladdning karaktäriserades också för att säkerställa nanopartiklarnas positiva laddning, vilket underlättade elektrostatisk interaktion med cellmembranet. Slutligen kännetecknades morfologin av polyplexes av transmission elektroniska mikroskopi (TEM). Figur 3 bekräftar bildandet av sfäriska och monodispersa nanopartiklar med en ungefärlig storlek på 50 nm diameter. Mindre diametrar erhölls genom att analysera TEM-bilder eftersom både NTA och DLS mäter de hydrodynamiska diametrar. Även om en mindre storlek alltid förväntas vid mätningar av elektronmikroskopi16,17, jämfört med spridningsmätningar, är det viktigt att betona här att skillnaden är nästan 100 nm, vilket vanligtvis inte förväntas. Detta tillskrivs den höga hygroskopiska karaktären hos dessa nanopartiklar, som ges av både inkapslade mRNA och ändterminalen oligopeptider som komponerar polymeren.
mRNA-inkapsling effektivitet bestämning
En annan kritisk parameter att mäta är nanopartiklarnas förmåga att kapsla in mRNA, som är den aktiva principen och måste kapslas in för att uppnå sitt skydd mot nucelaser18,19,20. Protokollet har utvecklats för att analysera inkapslingseffektiviteten (EE; i %) av nukleinsyrainfångning enligt leverantörens instruktioner. Det erhållna värdet ger en uppfattning om nukleinsyraprocenten som framgångsrikt fångas in i nanopartiklarna. RiboGreen färgämne, en fluorescerande nukleinsyra fläck, används för detta ändamål. Protokollet består av att kvantifiera alla RNA som förblir tillgängliga för det fluorescerande färgämnet. För att kvantifiera det totala RNA måste nanopartiklarna demonteras, och Heparin används för detta ändamål.
Tabell 4 visar inkapslingseffektiviteten (EE%) hos OM-pBAE-polyplexerna som kapslar in både GFP och OVA mRNA, som konceptbevis. RiboGreen fluorescensanalys gör det möjligt att beräkna mängden mRNA som fångas i nanopartiklarna efter demontering av heparin tillägg för att släppa deras innehåll. De uppnåeliga effektivitetsvärdena måste vara högre än 80% och, som visas här, visar inte signifikanta skillnader beroende på typen av mRNA. Lägre inkapslingseffektivitetsvärden utgör ett negativt resultat och utgör en signal för att kassera dessa formuleringar. Dessa resultat bekräftar den höga inkapslingskapaciteten hos mRNA av OM-pBAE, dess mångsidighet och dess lovande tillämpning i genleverans.
Representativa in vitro-resultat
Det är viktigt att bestämma kapaciteten hos pBAEs polyplexer. För det första att transfektera och för det andra aktivera immunceller14. Transfektionens effektivitet bedöms med två olika tekniker, med eGFP som reporter mRNA: fluorescensmikroskopi för att visuellt bestämma reporterprotein- och flödescytometriuttrycket för att kvantifiera transfekteringseffektiviteten. Ett fluorescerande mikroskop utrustat med en CCD-kamera, 5x, 10x, 20x och 40x mål och UV, blå och gröna filterlasrar användes för att kvalitativt bestämma uttrycket av eGFP-protein i JAWSII-cellinjen, en murin dendritisk cellinje. eGFP-protein har ett excitations maximum vid 488 nm, motsvarande blå laser, och ett utsläpp högst cirka 510 nm, motsvarande grön färg. För att kvantifiera transfektionens effektivitetsuttryck av målproteinet utförs flödescytometrianalys av de transfekterade cellerna efter 24 timmar av transfektionen med pBAEs polyplexer med eGFP mRNA. Ett fixeringssteg är användbart när celler har transfected med fluorescerande reportrar som GFP eller RFP.
Figur 4 visar den kvalitativa analysen av eGFP-uttrycket efter 24 timmar transfektion i JAWSII-cellinjen. Återigen, jämfört med den negativa kontrollen, är eGFP-reportersignalen significativt högre. Tabell 5 visar också den transfekteringseffektivitet som visas av OM-pBAE-nanopartiklar i JAWSII-cellinjen. Återigen är effektivitetsvärdena jämförbara med positiv kontroll som utförs med ett klassiskt transfekt reagens.
Kapaciteten hos pBAEs NPs laddade med OVA mRNA för att aktivera modell immunceller har bedömts transfecting JAWSII cellinje, en murin omogna dendritiska cellinje. För att bestämma aktiveringen av immuncellerna användes två olika markörer: CD11b och CD86. Välj först rätt fluoroforer för flödescytometerkonfigurationen. Här används PerCP-Cy5.5 (CD11b) och PE (CD86). Omogna och icke-aktiverade cellinjer måste visa en CD11b-/CD86-profil, medan aktiverade celler måste uppvisa en CD11b+/CD86+-profil. Den blå lasern vid 488 nm används för att bestämma målproteinuttrycket, och en anti-OVA-antikropp plus en sekundär antimus-Alexa488-antikropp användes. Tabell 6 visar den slutliga panel som används i detta experiment. Figur 5 visar kapaciteten hos OVA mRNA-laddade OM-pBAE nanopartiklar att aktivera DCs, vilket tyder på aktiveringen av cellulärt immunsvar. Icke-transfekterade celler visar ett lågt antal celler som uttrycker CD11b- och CD86-membranmarkörerna, medan mRNA OVA OM-pBAEs behandlade celler visar ett significerativt ökat uttryck för CD11b- och CD86-markörerna. Detta resultat tyder på att OM-pBAE nanopartiklar främjar mognad. Sammantaget bekräftar dessa resultat kapaciteten hos OM-pBAEs nanopartiklar att effektivt transfektera dendritiska celler och medla aktiveringen av immunsvaret som främjar mognad av omogna DCs.
Figur 1: Schematisk representation av hela det syntetiska protokollet. I denna figur beskrivs mRNA-vaccinsyntesstegen, inklusive de kritiska karakteriseringsparametrarna. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Syntes av C6-pBAE oligopeptid slutmodifierad (OM-pBAE). (A) Råkemikalier för att utföra Michael-tillägget. b)pBAE + oligopeptide. C)OM-pBAE. R kan vara Histidin (H) eller Lysin (K). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: TEM-bilder av färska GFP mRNA kapslar in OM-pBAE nanopartiklar. Polyplexes var negativt färgade för elektroniska mikroskopi karakterisering. Monodisperspartiklar med en diameter på cirka 60 nm visas. ( A) och (B)bilder representerar två olika mikroskopior av samma prov. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Fluorescensmikroskopiavbildning av JAWSII-transfekterade celler med OM-pBAE/eGFP mRNA nanopartiklar. (A) Ljus fältbild. b)GFP fluorescens (i grönt). c)Sammansatta av de två föregående bilderna. Skalningsstaplar = 100 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Aktivering av JAWSII efter transfektion med NANOPARTIKLARNA OM-pBAE/OVA mRNA. Negativa kontrollvärden (CN) motsvarar den svarta etiketten. Transfekterade celler motsvarar den grå etiketten. Staplar motsvarar standardavvikelsen (SD) för tre replikat. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Material | Material | Mikrovesicles |
| Brytningsindex | 1.4 | |
| Absorption | 0.01 | |
| Dispergeringsmedel | Dispergeringsmedel | Vatten |
| Temperatur (°C) | 25 | |
| Viskositet (cP) | 0.8872 | |
| Brytningsindex | 1.33 | |
| Temperatur | Temperatur (°C) | 25 |
| Jämviktstid (er) | 10 | |
| Cell | Celltyp | ZEN0040 |
Tabell 1: Parametrar för att skapa en SOP för storleksmätningar.
| Material | Material | Mikrovesicles |
| Brytningsindex | 1.4 | |
| Absortion | 0.01 | |
| Dispergeringsmedel | Dispergeringsmedel | Vatten |
| Temperatur (°C) | 25 | |
| Viskositet (cP) | 0.8872 | |
| Brytningsindex | 1.33 | |
| Temperatur | Temperatur (°C) | 25 |
| Jämviktstid | 10 | |
| Cell | Celltyp | DTS1070 |
Tabell 2: Parametrar för att skapa en SOP för zeta-potentiella mätningar.
| GFP mRNA/OM-pBAE | T (oC) | Hydrodinamic diameter (nm) | PDI | Ytladdning (mV) | |
| NTA | DLS | ||||
| Färsk | 25 | 124 ± 32 | 134 ± 8 | 0,2 ± 0,04 | 32 ± 0,7 |
| Frystorkade | 25 | 135 ± 35 | 138 ± 2 | 0.17 ± 0.02 | 34 ± 0,7 |
Tabell 3: Fysikalisk-kemiska karakterisering av mRNA inkapsling av OM-pBAE nanopartiklar. GFP mRNA kapslar in OM-pBAE polyplexes karaktäriserades omedelbart efter beredning - färsk- och efter lyofiliseringsprocessen för att säkerställa partiklarnas stabilitet. DLS- och NTA-storleksändring och ytladdningsdata visas.
| EE% | |
| GFP mRNA/OM-pBAE | 82.3 ± 1.5 |
| OVA mRNA/OM-pBAE | 83.1 ± 1.5 |
Tabell 4: Inkapslingseffektivitet (EE%) data för mRNA som kapslar in OM-pBAE nanopartiklar. Inkapslingseffektivitetsprocent av GFP och OVA mRNA kapslar in OM-pBAE nanopartiklar. RiboGreenfluorescence analys utfördes på frystorkade prover för att bedöma mängden mRNA fångas i polyplexes.
| Prov | % GFP-positiva celler | SD |
| Negativ kontroll | 1.85% | 0.21% |
| OM-pBAE/eGFP mRNA transfected celler | 57.79% | 5.28% |
Tabell 5: Transfekteringseffektivitet hos OM-pBAE/eGFP mRNA-nanopartiklar i JAWSII-cellinjen. Transfection effektivitet spårades av flöde cytometry.
| Antikropp | Celler färgade | Fluorescerande etikett |
| CD11b | Aktiverade DCs | PerCP-Cy 5,5 |
| CD86 | Aktiverade DCs | PE |
| α mus AlexaFluor488 | OVA-positiva celler | AlexaFluor 488 |
Tabell 6: Flödescytometripanel. Denna panel användes för flöde cytometri studier för att bestämma in vitro funktionaliteten hos mRNA vaccin.
Kompletterande information: Se tilläggsfilen med all kompletterande information som ingår. Klicka här för att ladda ner nedan Filer.
Tabell S1A: Ribosomal RNA-standard.
Tabell S1B: RNA:pBAE med heparinstandard.
Tabell S1C: Heparin standard.
Figur S2: 1H-NMR protonspektra av C6-pBAE och OM-pBAE. a)1H-NMR från C6-pBAE. Kloroform-d användes som lösningsmedel (δ = 7,25 ppm). b)1H-NMR från C6CH3. D2O användes som lösningsmedel (δ = 4,64 ppm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Efter utbrottet av Covid-19-pandemin förra året har vikten av vacciner när det gäller infektionssjukdomskontroll manifesterats som en kritisk komponent8. Ansträngningar från forskare över hela världen har gjort det möjligt att släppa ut många vacciner på marknaden. För första gången i historien har mRNA-vacciner visat sin tidigare hypotetiska framgång, tack vare deras snabba design på grund av deras förmåga att anpassa sig till något nytt antigen inom några månader5,6,21. mRNA, eller messenger ribonukleinsyra, avser de nukleinsyror som driver proteinsyntesen från kodad information i DNA. Här, för vaccinationsändamål, kodifierar mRNA för ett antigent protein som tillhör den infektiösa mikroorganismen (eller till ett tumörantigen vid terapeutisk tumörvaccination)8,22. I detta sammanhang är det viktigt att forskarsamhället har tydliga protokoll för att syntetisera mRNA-vacciner.
Med denna idé i åtanke syftade ett enkelt förfarande för att syntetisera mRNA-vacciner baserade på de proprietära polymera nanopartiklarna till att beskrivas24. Som beskrivs i protokollavsnittet syntetiseras polymererna med hjälp av ett tvåstegsförfarande baserat på en Michael-tillsats av primära aminer till akrylatgrupper för att syntetisera polymers stamnät, följt av tillsats av terminala oligopeptider för att ge den förbättrade katjoniska karaktären och kapaciteten att fly från endomer till de resulterande polymererna12,13,14 . Sedan, i ytterligare ett steg, framställs nanopartiklar genom att blanda polymererna med mRNA för att uppnå sin elektrostatiska interaktion för att bilda små nanometriska partiklar.
Även om syntesen av polymererna är ett enkelt protokoll, kan detsamma inte sägas om nanopartikelformuleringen. Många kollaboratörer över hela världen har använt dessa polymerer och har funnit vanliga kritiska steg när det gäller beredning och användning av partiklarna. Med tanke på att syntesen är genom manuell blandning spelar användarförmågorna en avgörande roll. Det svåraste steget är att blanda polymeren och mRNA, som måste ske på ett kontrollerat sätt, som det måste göras för blandningens ytterligare utfällningssteg till vattnet och bufferttillägget. Varje modifiering av mekaniken för blandning av de två komponenterna kommer att resultera i mikropartiklar (istället för nanopartiklar), som inte kan användas för människor. Därför är blandning ett av felsökningsstegen som behöver viss övning för att uppnås korrekt.
En annan slående punkt är frystorkande. Som det är allmänt känt representerar det ett av flaskhalsstegen i nanoformulationer. I det här specifika fallet tog det några år att justera alla parametrar och beskriva ett protokoll som lyckades15. Även om detta justeras är ett annat kritiskt steg i protokollet omformuleringen, som, om de inte utförs korrekt, ger nanopartiklars aggregering och de förlorar sin funktionalitet. I detta fall är det ett måste att snabbt placera formuleringarna i en torr, något kall miljö för att undvika deras okontrollerade rehydrering. På grund av deras höga hygroskopiska natur måste särskild uppmärksamhet ägnas åt att rehydrera dem på ett kontrollerat sätt genom att försiktigt pipettera upp och ner allt klibbigt pulver som bildas av frysofilisering. Om proverna återfuktar på ett icke-kontrollerat sätt, kommer de omedelbart att aggregera bildar en genomskinlig till ogenomskinlig spridning.
Även om de kritiska stegen nämns här, är protokollet för att syntetisera pBAE polyplexer enkelt och snabbt, vilket är fördelaktigt bland andra syntesmetoder för genleveranssystemen. Här har den specifika tillämpningen av mRNA-vaccination tillhandahållits i detalj. Det representerar dock en mångsidig metod som också kan tillämpas för att kapsla in andra typer av nukleinsyror och icke-vaccinanvändning, såsom i onkologi och kardiovaskulära områden, som publicerats tidigare13,23,24.
Sammanfattningsvis kommer detta protokoll att göra det möjligt för dessa proprietära polymerer att vara tillgängliga för forskarsamhället för att utforma nya mRNA-vacciner samtidigt som man undviker all denna felsökning. Dessa polymerer är fördelaktiga jämfört med andra mRNA lipid formuleringar när det gäller möjligheten till frystorka, långsiktig stabilitet, och minskning av lagrings- och distributionskostnader genom att inte kräva ultra-kalla temperaturer. Därför förväntas OM-pBAE-vacciner spela en viktig roll inom vaccinationsområdet för profylaktiska och terapeutiska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författare har inget att avslöja eller några intressekonflikter.
Acknowledgments
Ekonomiskt stöd från MINECO/FEDER (bidrag SAF2015-64927-C2-2-R, RTI2018-094734-B-C22 och COV20/01100) bekräftas. CGF erkände sin IQS PhD Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-butanediol diacrylate | Sigma Aldrich | 123048 | |
| 1-hexylamine | Sigma Aldrich | 219703 | |
| 5-amino-1-pentanol | Sigma Aldrich | 411744 | |
| Acetone | Panreac | 141007 | |
| CD11b antibody | BD | 550993 | |
| CD86 antibody | Bioligend | 105007 | |
| Chlor hydroxhyde | Panreac | 181023 | |
| Chloroform-d | Sigma Aldrich | 151823 | |
| Cys-His-His-His peptide | Ontores | Custom | |
| Cys-Lys-Lys-Lys peptide | Ontores | Custom | |
| D2O | Sigma Aldrich | 151882 | |
| DEPC reagent for Rnase free water | Sigma Aldrich | D5758 | This reagent is important to treat MilliQ water to remove any RNases of the buffers |
| Diethyl eter | Panreac | 212770 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| mRNA EGFP | TriLink Technologies | L-7601 | |
| mRNA OVA | TriLink Technologies | L-7610 | |
| RiboGreen kit | ThermoFisher | R11490 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | 71196 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 302031 | |
| Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 11570626 | |
| α-mouse AlexaFluor488 antibody | Abcam | Ab450105 | |
| Equipment | |||
| Nanoparticle Tracking Analyzer | Malvern Panalytical | NanoSight NS300 | |
| Nuclear Magnetic Ressonance Spectrometer | Varian | 400 MHz | |
| ZetaSizer | Malvern Panalytical | Nano ZS | For zeta potential and hydrodynamic size determination |
| Software | |||
| NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | MAN0515-02-EN-00 | |
| NovoExpress Software | Agilent | Not specified | |
| ZetaSizer software | Malvern Panalytical | DTS Application | To analyze surface charge and hydrodynamic sizes |
References
- Chumakov, K., Benn, C. S., Aaby, P., Kottilil, S., Gallo, R. Can existing live vaccines prevent COVID-19. Science. 368 (6496), 1187-1188 (2020).
- Zhang, C., Maruggi, G., Shan, H., Li, J. Advances in mRNA vaccines for infectious diseases. Frontiers in Immunology. 10, 1-13 (2019).
- Wherry, E. J., Jaffee, E. M., Warren, N., D'Souza, G., Ribas, A. How did we get a COVID-19 vaccine in less than 1 year. Clinical Cancer Research. 27 (8), 2136-2138 (2021).
- Folegatti, P. M., et al. Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial. The Lancet. 396 (10249), 467-478 (2020).
- Geall, A. J., Mandl, C. W., Ulmer, J. B. RNA: The new revolution in nucleic acid vaccines. Seminars in Immunology. 25 (2), 152-159 (2013).
- Ulmer, J. B., Geall, A. J.
- Kranz, L. M., et al. Systemic RNA delivery to dendritic cells exploits antiviral defence for cancer immunotherapy. Nature. 534 (7607), 396-401 (2016).
- Milane, L., Amiji, M. Clinical approval of nanotechnology-based SARS-CoV-2 mRNA vaccines: impact on translational nanomedicine. Drug Delivery and Translational Research. 1 (4), 3 (2020).
- Green, J. J., Langer, R., Anderson, D. G. A combinatorial polymer library approach yields insight into nonviral gene delivery. Accounts of Chemical Research. 41 (6), 749-759 (2008).
- Guerrero-Cázares, H., et al. Biodegradable polymeric nanoparticles show high efficacy and specificity at DNA delivery to human glioblastoma in vitro and in vivo. ACS Nano. 8 (5), 5141-5153 (2014).
- Kozielski, K. L., Tzeng, S. Y., Hurtado De Mendoza, B. A., Green, J. J. Bioreducible cationic polymer-based nanoparticles for efficient and environmentally triggered cytoplasmic siRNA delivery to primary human brain cancer cells. ACS Nano. 8 (4), 3232-3241 (2014).
- Segovia, N., Dosta, P., Cascante, A., Ramos, V., Borrós, S. Oligopeptide-terminated poly(β-amino ester)s for highly efficient gene delivery and intracellular localization. Acta Biomaterialia. 10 (5), 2147-2158 (2014).
- Dosta, P., Segovia, N., Cascante, A., Ramos, V., Borrós, S. Surface charge tunability as a powerful strategy to control electrostatic interaction for high efficiency silencing, using tailored oligopeptide- modified poly (beta-amino ester)s (PBAEs). Acta Biomaterialia. 20, 82-93 (2015).
- Fornaguera, C., et al. mRNA delivery system for targeting antigen-presenting cells in vivo. Advanced Healthcare Materials. 7 (17), 180033 (2018).
- Fornaguera, C., Castells-Sala, C., Lázaro, M. Á, Cascante, A., Borrós, S. Development of an optimized freeze-drying protocol for OM-PBAE nucleic acid polyplexes. International Journal Pharmaceutics. 569, (2019).
- Fornaguera, C., Solans, C. Analytical methods to characterize and purify polymeric nanoparticles. International Journal of Polymer Science. , (2018).
- Fornaguera, C., Solans, C. Characterization of polymeric nanoparticle dispersions for biomedical applications: size, surface charge and stability. Pharmaceutical Nanotechnology. 6 (3), 147-164 (2018).
- Sahin, U., Karikó, K., Türeci, Ö MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).
- Fan, Y. N., et al. Cationic lipid-assisted nanoparticles for delivery of mRNA cancer vaccine. Biomaterials Science. 6 (11), 3009-3018 (2018).
- Le Moignic, A., et al. Preclinical evaluation of mRNA trimannosylated lipopolyplexes as therapeutic cancer vaccines targeting dendritic cells. Journal of Controlled Release. 278, 110-121 (2018).
- Banerji, A., et al. mRNA vaccines to prevent COVID-19 disease and reported allergic reactions: Current evidence and approach. Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 9 (4), 1423-1437 (2021).
- Kaczmarek, J. C., Kowalski, P. S., Anderson, D. G. Advances in the delivery of RNA therapeutics: from concept to clinical reality. Genome Medicine. 9 (1), 1-16 (2017).
- Dosta, P., et al. Delivery of anti-microRNA-712 to inflamed endothelial cells using poly(β-amino ester) nanoparticles conjugated with VCAM-1 targeting peptide. Advanced Healthcare Materials. , 1-11 (2021).
- Segovia, N., et al. Hydrogel doped with nanoparticles for local sustained release of siRNA in breast cancer. Advanced Healthcare Materials. 4 (2), 271-280 (2015).
