Summary
Den kombinerade användningen av mikroelektrodmatristeknologi och 4-aminopyridininducerad kemisk stimulering för att undersöka nociceptiv aktivitet på nätverksnivå i ryggmärgens ryggmärgsdorsala horn beskrivs.
Abstract
Rollerna och anslutningen av specifika typer av nervceller i ryggmärgens ryggmärgs ryggmärgsdår (DH) avgränsas i snabb takt för att ge en alltmer detaljerad bild av de kretsar som ligger till grund för behandling av ryggmärgssmärta. Effekterna av dessa anslutningar för bredare nätverksaktivitet i DH förblir dock mindre väl förstådda eftersom de flesta studier fokuserar på aktiviteten hos enskilda neuroner och små mikrokretsar. Alternativt ger användningen av mikroelektrodmatriser (MEA), som kan övervaka elektrisk aktivitet över många celler, hög rumslig och tidsmässig upplösning av neural aktivitet. Här beskrivs användningen av MEA med ryggmärgsskivor i musen för att studera DH-aktivitet inducerad av kemiskt stimulerande DH-kretsar med 4-aminopyridin (4-AP). Den resulterande rytmiska aktiviteten är begränsad till den ytliga DH, stabil över tiden, blockerad av tetrodotoxin och kan undersökas i olika skivorienteringar. Tillsammans ger detta preparat en plattform för att undersöka DH-kretsaktivitet i vävnad från naiva djur, djurmodeller av kronisk smärta och möss med genetiskt förändrad nociceptiv funktion. Dessutom kan MEA-inspelningar i 4-AP-stimulerade ryggmärgsskivor användas som ett snabbt screeningverktyg för att bedöma förmågan hos nya antinociceptiva föreningar att störa aktiviteten i ryggmärgen DH.
Introduction
Rollerna för specifika typer av hämmande och excitatoriska interneuroner i ryggmärgen DH avslöjas i snabb takt 1,2,3,4. Tillsammans utgör interneuroner över 95% av neuronerna i DH och är involverade i sensorisk bearbetning, inklusive nociception. Dessutom är dessa interneuronkretsar viktiga för att avgöra om perifera signaler stiger upp i neuroaxen för att nå hjärnan och bidra till uppfattningen av smärta 5,6,7. Hittills har de flesta studier undersökt DH-neurons roll på antingen encells- eller hela organismnivå för analys med hjälp av kombinationer av in vitro intracellulär elektrofysiologi, neuroanatomisk märkning och in vivo beteendeanalys 1,3,8,9,10,11,12,13,14 . Dessa tillvägagångssätt har avsevärt förbättrat förståelsen för rollen hos specifika neuronpopulationer i smärtbehandling. Emellertid kvarstår ett gap i att förstå hur specifika celltyper och små makrokretsar påverkar stora populationer av neuroner på mikrokretsnivå för att därefter forma utmatningen av DH, beteendemässiga svar och smärtupplevelsen.
En teknik som kan undersöka makrokrets- eller flercellig nivåfunktion är mikroelektrodmatrisen (MEA)15,16. MEA har använts för att undersöka nervsystemets funktion i flera decennier 17,18. I hjärnan har de underlättat studier av neuronal utveckling, synaptisk plasticitet, farmakologisk screening och toxicitetstestning17,18. De kan användas för både in vitro- och in vivo-applikationer, beroende på typen av MONOA. Dessutom har utvecklingen av MEA utvecklats snabbt, med olika elektrodnummer och konfigurationer nu tillgängliga19. En viktig fördel med MEA är deras förmåga att samtidigt bedöma elektrisk aktivitet i många nervceller med hög rumslig och tidsmässig noggrannhet via flera elektroder 15,16. Detta ger en bredare avläsning av hur nervceller interagerar i kretsar och nätverk, under kontrollförhållanden och i närvaro av lokalt applicerade föreningar.
En utmaning med in vitro DH preparat är att pågående aktivitetsnivåer är vanligtvis låga. Här behandlas denna utmaning i ryggmärgs DH-kretsar med hjälp av den spänningsstyrda K + -kanalblockeraren, 4-aminopryidin (4-AP), för att kemiskt stimulera DH-kretsar. Detta läkemedel har tidigare använts för att etablera rytmisk synkron elektrisk aktivitet i DH i akuta ryggmärgsskivor och under akuta in vivo-förhållanden 20,21,22,23,24. Dessa experiment har använt encellsplåster och extracellulär inspelning eller kalciumavbildning för att karakterisera 4-AP-inducerad aktivitet 20,21,22,23,24,25. Tillsammans har detta arbete visat på kravet på excitatorisk och hämmande synaptisk transmission och elektriska synapser för rytmisk 4-AP-inducerad aktivitet. Således har 4-AP-svaret setts som ett tillvägagångssätt som avmaskerar inhemska polysynaptiska DH-kretsar med biologisk relevans snarare än som ett läkemedelsinducerat epifenomen. Dessutom uppvisar 4-AP-inducerad aktivitet en liknande svarsprofil som smärtstillande och antiepileptika som neuropatiska smärttillstånd och har använts för att föreslå nya ryggradsbaserade smärtstillande läkemedelsmål såsom connexiner 20,21,22.
Här beskrivs ett preparat som kombinerar MEA och kemisk aktivering av spinal DH med 4-AP för att studera denna nociceptiva krets på makrokretsen eller nätverksnivå för analys. Detta tillvägagångssätt ger en stabil och reproducerbar plattform för att undersöka nociceptiva kretsar under naiva och neuropatiska "smärtliknande" tillstånd. Denna beredning är också lätt att tillämpa för att testa kretsnivåverkan hos kända analgetika och för att screena nya analgetika i den hyperaktiva ryggmärgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studier utfördes på manliga och kvinnliga c57Bl/6 möss i åldern 3-12 månader. Alla experimentella procedurer utfördes i enlighet med University of Newcastles djurvårds- och etikkommitté (protokoll A-2013-312 och A-2020-002).
1. Elektrofysiologi in vitro
- Beredning av lösningar för beredning och registrering av ryggmärgsskivor
- Konstgjord cerebrospinalvätska
OBS: Artificiell cerebrospinalvätska (aCSF) används i en gränssnittsinkubationskammare, där skivor lagras tills inspelningen påbörjas och under experiment som både perfusat och spädningsvätska för läkemedel. Se tabell 1 för den detaljerade sammansättningen.
- Konstgjord cerebrospinalvätska
| Kemisk | aCSF (mM) | aCSF (g/100 ml) | Sackaros-substituerad aCSF (mM) | Sackarossubstituerad aCSF (g/100 ml) | ACSF med högt kaliuminnehåll (mM) | ACSF med hög kaliumhalt (g/100 ml) |
| Natriumklorid (NaCl) | 118 | 0.690 | - | - | 118 | 0.690 |
| Natriumvätekarbonat (NaHCO3) | 25 | 0.210 | 25 | 0.210 | 25 | 0.210 |
| Glukos | 10 | 0.180 | 10 | 0.180 | 10 | 0.180 |
| Potasiumklorid (KCl) | 2.5 | 0.019 | 2.5 | 0.019 | 4.5 | 0.034 |
| Natriumdivätefosfat (NaH2PO4) | 1 | 0.012 | 1 | 0.012 | 1 | 0.012 |
| Magnesiumklorid (MgCl2) | 1 | 0.01 | 1 | 0.01 | 1 | 0.01 |
| Kalciumklorid (CaCl2) | 2.5 | 0.028 | 2.5 | 0.028 | 2.5 | 0.028 |
| Sackaros | - | - | 250 | 8.558 | - | - |
Tabell 1: Konstgjorda cerebrospinalvätskekompositioner. Förkortning: aCSF = konstgjord cerebrospinalvätska.
- Bered aCSF innehållande (i mM) 118 NaCl, 25 NaHCO3, 10 glukos, 2,5 KCl, 1 NaH2PO4, 1MgCl2 och 2,5CaCl2 genom tillsats av de erforderliga mängderna av ovanstående, exklusiveCaCl2, till 2 liter destillerat vatten.
- Bubbla ovanstående lösning med karbogen (95%O2, 5%CO2) i 5 min och tillsätt CaCl2.
OBS: Detta steg förhindrar CaCl2-nederbörd , dvs lösningen ska inte bli grumlig. För läkemedelsapplikation under experiment, späd läkemedelsbeståndslösningarna i aCSF till önskade slutliga koncentrationer.
- Sackaros-substituerad konstgjord cerebrospinalvätska
OBS: Sackaros-substituerad aCSF används vid dissektion och ryggmärgsskivning. Som indikeras av namnet ersätts sackaros med NaCl för att minska neuronal excitation under dessa procedurer samtidigt som osmolariteten bibehålls. Se tabell 1 för den detaljerade sammansättningen.- Bered sackarossubstituerad aCSF-substans innehållande (i mM) 250 sackaros, 25 NaHCO3, 10 glukos, 2,5 KCl, 1 NaH2PO4, 1 MgCl2 och 2,5CaCl2 genom tillsats av de erforderliga mängderna av alla ovanstående, med undantag avCaCl2, till 300 ml destillerat vatten.
- Bubbla lösningen med karbogen i 5 min och tillsätt sedan CaCl2.
- Förvara lösningen i en frys på -80 °C i cirka 40 minuter eller tills lösningen bildar en flytgödsel. Undvik att frysa fast och använd i flytgödselkonsistens.
- Förberedelse av mikroelektrodmatris
OBS: Kontaktytan på MEA kräver en förbehandling för att göra den hydrofil.- Innan experimentet, fyll MEA väl med antingen fetal bovint serum (FBS) eller hästserum (HS) i 30 min.
- Ta bort FBS eller HS och skölj noggrant MEA med cirka fem tvättar destillerat vatten tills det destillerade vattnet inte längre är skummigt. Fyll brunnen med aCSF, redo att användas.
- Akut ryggmärgsskiva förberedelse
OBS: Musens ryggmärgsskiva är som tidigare beskrivits av Smith et al.2. Helst bör avlägsnandet av lumbosakralförstoringen inte ta mer än 8-10 minuter (steg 1.3.2-1.3.11 nedan).- Bedöva musen djupt med 100 mg/kg ketamin (i.p.) och halshugg den sedan med en stor kirurgisk sax.
- Ta bort huden över bukregionen genom att göra ett litet snitt i huden vid höfternas nivå. Dra huden på vardera sidan av snittet rostralt tills all hud har tagits bort, dvs från toppen av bröstkorgen till toppen av bäckenet (både ventralt och dorsalt).
- Placera kroppen på is och använd ett ventralt tillvägagångssätt för att exponera ryggraden genom att ta bort alla inälvor och skära genom revbenen i sidled till bröstbenet.
- Ta bort den ventrala bröstkorgen, både scapulae (avskuren vid ungefär T2) och underbenen och bäckenet (avskuren vid ungefär toppen av sakrummet).
- Överför ryggraden och revbensberedningen till ett dissekeringsbad som innehåller iskall sackaros aCSF. Fäst alla fyra hörnen av preparatet (ventral yta uppåt) genom att placera stift genom nedre ryggmusklerna och de bifogade övre revbenen.
- Ta bort all muskel- och bindväv som ligger över ryggkotornas ventrala yta med rongeurs och identifiera ryggradsregionen över lumbosakralförstoringen, som ligger ungefär under T12 till L2 ryggradskroppar.
- Ta bort en ryggradskropp som är kaudal mot lumbosakral utvidgningsregionen för att ge tillgång till ryggmärgen när den sitter i ryggradskanalen.
- Med hjälp av böjd fjädersax skär du igenom ryggkotorna bilateralt medan du lyfter och drar i ryggkroppen rostralt för att separera de ventrala och dorsala aspekterna av ryggkotorna och exponera ryggmärgen.
- När ryggkropparna har tagits bort för att avslöja den lumbosakrala utvidgningen, rensa försiktigt de återstående rötterna som förankrar ryggmärgen med fjädersax tills sladden flyter fri.
- Isolera ryggmärgen med rostrala och kaudala snitt långt över och under den lumbosakrala utvidgningen, så att målregionen på sladden kan "flyta fritt".
OBS: Den föredragna segmentorienteringen avgör hur sladden sedan monteras för sektionering (figur 1). - För tvärgående skivor, lyft lumbosakralsegmentet med en fäst rot och placera den på ett förskuret polystyrenblock (styrofoam) (1 cm x 1 cm x 1 cm) med en grund kanalskärning i mitten. Använd cyanoakrylatlim (se materialförteckningen) för att fästa blocket och sladden på sektionsplattformen och placera den i skärbadet som innehåller iskall sackaros aCSF (uppslamning).
OBS: Den grunda kanalen hjälper till att säkra och orientera ryggmärgen, med ryggsidan exponerad och bröstkorgsänden på sladden längst ner på blocket. - För sagittala skivor, lägg en tunn linje av cyanoakrylatlim på sektionsplattformen, lyft lumbosakralförstoringen med en fäst rot och placera sladden längs limlinjen, så att en sidoyta är i limet och den andra vetter uppåt. Placera den i skärbadet som innehåller iskall sackaros aCSF (uppslamning).
- För horisontella skivor, lägg en tunn linje av cyanoakrylatlim på sektionsplattformen. Lyft lumbosakralförstoringen med en fäst rot och placera lumbosakralförstoringen längs limlinjen, så att den ventrala ytan är i limet och ryggytan vetter uppåt. Använd bifogade rötter för att placera sladden. Placera den i skärbadet som innehåller iskall sackaros aCSF (uppslamning).
Figur 1: Ryggmärgsskivans orienteringar, monterings- och skärmetoder. (A) Tvärgående skivor kräver ett skärblock av frigolit med ett stödspår skuren i det. Ryggmärgen vilar mot blocket i stödspåret, den dorsala sidan av sladden vänd bort från blocket. Blocket och sladden limmas på ett skärsteg med cyanoakrylatlim. (B) Sagittalskivor framställs genom att placera en tunn linje av cyanoakrylatlim på skärsteget och sedan placera ryggmärgen på sidan på limet. (C) Horisontella skivor framställs genom att placera en tunn linje av cyanoakrylatlim på skärsteget och sedan placera ryggmärgens ventrala sida nedåt på limet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Få 300 μm tjocka skivor (L1-L5, samma tjocklek oavsett orientering) med hjälp av en vibrerande mikrotom med följande inställningar: hastighet 0,06 mm / s, amplitud 2,50 mm och kalibrerad till inom ±0,02 höjdamplitudavvikelse.
- Överför skivorna till en inkubationskammare för luftgränssnitt som innehåller syresatt aCSF.
- Låt skivorna balanseras i 1 timme vid rumstemperatur (20–24 °C) före inspelningen.
- Inspelningar av mikroelektrodmatriser
OBS: Följande steg beskriver hur man använder postdata från MEA-baserade experiment på ryggmärgsskivor. Flera MEA-mönster kan användas beroende på experimentet. Designdetaljer för MEA som används i dessa experiment visas i Tabell 2 och Figur 2. Detaljerad designinformation har publicerats av Egert et al.26 och Thiebaud et al.27 för plana respektive 3-dimensionella (3D) MEA. Båda MEA-typerna består av 60 titannitridelektroder, med ett kiselnitridisolerande skikt och titannitridspår och kontaktdynor.- Experimentellt upplägg
- Slå på datorn och gränssnittskortet och starta inspelningsprogramvaran.
- Läs in den förmonterade inspelningsmallen (bild 3A). Namnge filerna för dagen på inspelningsfliken.
- Bubbla kontinuerligt aCSF med karbogen (5%CO2, 95%O2) under experimentets varaktighet.
- Slå på perfusionssystemet, som styrs av en peristaltisk pump. Placera inloppslinjen i enCSF och inloppsänden i en avfallsbägare. Fyll perfusionslinjerna med aCSF.
- Förbered 4-AP och andra läkemedelslösningar genom att späda ut lager i 50 ml aCSF till önskad slutkoncentration (t.ex. 200 μM för 4-AP).
- Placera läkemedelslösningarna i läkemedelskrukor och bubbla dem med karbogen.
- 4-AP-aktivitet
- Efter inkubation, överför en enda skiva från inkubatorn med en pasteurpipett med stor spets fylld med aCSF.
- Lägg skivan i MEA-brunnen och tillsätt ytterligare aCSF.
- Placera skivan över inspelningsuppsättningen med 60 elektroder med en fin kort hårfärg. Undvik att kontakta elektroderna med penseln eller dra vävnaden över elektroderna, särskilt om du använder 3D-matriser.
OBS: Beroende på MEA-layouten kan detta göras med eller utan hjälp av ett mikroskop för exakt positionering. - Efter att ha placerat skivan, placera ett viktat nät över vävnaden för att hålla den på plats och främja god kontakt med MEA-elektroder.
OBS: Segmentet kan behöva flyttas efter nettoplacering. - Placera MONO I inspelningens huvudtage (figur 2A,B).
- Kontrollera vävnadens position över elektroderna med ett inverterat mikroskop (2x förstoring) för att bekräfta att så många elektroder som möjligt ligger under den ytliga DH (SDH). Se till att minst 2-6 elektroder inte kommer i kontakt med skivan eftersom dessa elektroder är viktiga för att subtrahera brus och registrera artefakter under analysen (figur 2E).
- Slå på kameran, anslut den till enheten och ta en referensbild av segmentet i förhållande till MEA för användning under analysen.
- Tryck på Start DAQ i inspelningsprogramvaran och bekräfta att alla elektroder får en tydlig signal.
OBS: Om signalen är bullrig, lossa huvudstycket och rengör både MEA-kontaktkuddarna och guldfjäderkontakterna med 70% etanol (använd en laboratorietork för att säkerställa att dynorna och kontakterna är torra efter rengöring). Om signalen fortfarande är bullrig, stäng av de felaktiga elektroderna i inspelningsprogramvaran eller notera för uteslutning senare under analysen. - Fäst perfusionsinlopps- och utloppsledningarna på MEA-brunnen (tidigare fylld med aCSF) och slå på perfusionssystemet. Kontrollera flödeshastigheten, helst 4-6 badvolymer per minut, och se till att utflödet är tillräckligt för att förhindra överflöde av superfusatet.
- Låt vävnaden balansera i 5 minuter och registrera sedan 5 minuter råa, ofiltrerade baslinjedata.
- Flytta perfusionsinloppslinjen från aCSF till en 4-AP-lösning och vänta i 12 minuter tills den 4-AP-inducerade rytmiska aktiviteten når steady state (2 min för att läkemedel ska nå badet och 10 min för att aktiviteten ska toppa och sedan platå).
- Spela in 5 min 4-AP-inducerad aktivitet. Var beredd på efterföljande inspelningar för att testa drogerna eller för att kontrollera stabiliteten hos 4-AP.
- Experimentellt upplägg
| Layouter för mikroelektrodmatriser | ||||
| Mikroelektrod Array-modell | 60MEA 200/30iR-Ti | 60-3DMEA 100/12/40iR-Ti | 60-3DMEA 200/12/50iR-Ti | 60MEA 500/30iR-Ti |
| Plan eller 3-dimensionell (3D) | Planar | 3D | 3D | Planar |
| Elektrodgaller | 8 x 8 | 8 x 8 | 8 x 8 | 6 x 10 |
| Elektrodavstånd | 200 μm | 100 μm | 200 μm | 500 μm |
| Elektrodens diameter | 30 μm | 12 μm | 12 μm | 30 μm |
| Elektrodhöjd (3D) | Ej tillämpligt | 40 μm | 50 μm | Ej tillämpligt |
| Experiment | Tvärgående skiva | Tvärgående skiva | Sagittal + Horisontell | Sagittal + Horisontell |
Tabell 2: Mikroelektrodmatrislayouter.
Figur 2: Vävnadspositionering på mikroelektroduppsättningen. (B) Samma som A med MEA-huvudstycket stängt för registreringar och vävnadsperfusionssystem på plats. (C) Bilden visar ett monoetanolamin som tillhandahålls av tillverkaren. Kontaktkuddar, som samverkar med guldfjädrarna i huvudstycket, och MEA-vävnadsbadet som håller vävnadsbadlösningen och vävnadsskivan visas. Området som markeras av den röda fyrkanten i mitten är platsen för elektroduppsättningen. (D) Scheman visar de två MEA-elektrodkonfigurationer som används i denna studie, med ytterligare detaljer i tabell 2. Referenselektroden betecknas med den blå trapezformen. Den vänstra MEA-elektrodlayouten visar en fyrkantig konfiguration med 60 elektroder, som används mest i de presenterade arbetsmodellerna 60MEA200/30iR-Ti med elektroder med en diameter på 30 μm med 200 μm mellanrum, eller 200 μm åtskilda och 100 μm åtskilda 3-dimensionella MEA (60MEA200/12/50iR-Ti och 60MEA100/12/40iR-Ti) med elektroder 12 μm i diameter och antingen 50 μm eller 40 μm höga, respektive. Den vänstra MEA-elektrodlayouten visar en 6 x 10 elektrod rektangulär layout-60MEA500 / 30iR-Ti. (E) Bild med hög förstoring av en 60MEA100/12/40iR-Ti kvadratisk MEA med tvärgående ryggmärgsskiva placerad för inspelning. Skivan sitter på elektrodraderna 3-8. Den övre raden av elektroder, som inte kommer i kontakt med någon vävnad, fungerar som referenselektroder. SDH-området visas som ett halvtransparent band. I detta fall ligger SDH över elektroderna i raderna 4, 5 och 6 och kolumnerna 2, 3, 4, 5 och 7 i MEA. Skalstreck = 200 μm. Förkortningar: MEA = mikroelektrodmatris; SDH = ytligt rygghorn. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Ändra segment
- Skölj linjerna med aCSF efter varje inspelningssession.
- Ta bort MEA från huvudsteget.
- Ta bort nätet och vävnaden från MEA-brunnen, skölj dem väl med aCSF och upprepa ovanstående steg med en ny skiva.
2. Databehandling och analys
OBS: Följande steg beskriver hur man använder analysprogramvaran för MEA-experiment på ryggmärgsskivor. En av de 60 elektroderna fungerar som en intern referens (markerad med en trapets i figur 2 C,D), medan mellan fyra och tjugofem av de återstående 59 är placerade under SDH i en ryggmärgsskiva för vuxna möss. Efterföljande analys detekterar extracellulär åtgärdspotential (EAP) och lokala fältpotential (LFP) vågformer (se figur 3B för exempel) från råsignalen i denna region.
- Bearbetning av rådata
- Öppna analysprogramvaran och ladda den färdiga analyslayouten (figur 3B).
- Öppna filen av intresse och avmarkera referenselektroden (elektrod 15 i 8 x 8 MEA- eller elektrod E1 i 6 x 10 MEA-konfiguration) och eventuella elektroder som anses vara alltför bullriga.
- Ställ in tidsfönstret för analys (0:00 → 5:00 min).
- Gå till filterfliken Över flera kanaler. Välj Komplex referens och välj referenselektroder baserat på bilden som tagits och anteckningar som gjorts under experimentet (dvs. de elektroder som inte finns under vävnad). För att ansöka och kontrollera detta, tryck på Utforska innan du fortsätter.
- Flytta till fliken EAP-filter och använd ett 2: a ordningens Butterworth-filter med högt pass (200 Hz avskuret) för att ta bort LFP-aktivitet.
- Gå till fliken LFP-filter och använd ett Butterworth-filter med 2:a ordningens bandpass (deltafrekvenser på 0,5–4 Hz) för att ta bort EAP-aktivitet.
- Gå till fliken EAP-detektor och välj Automatisk tröskel. Markera rutorna Rising and Falling edge och ställ in Död tid på 0,5 ms.
- Ange positiva och negativa tröskelvärden baserat på data. Kontrollera data genom att gå tillbaka till skärmen Rådataanalysator , flytta tidsmarkören och sedan återgå till fliken EAP-detektor och trycka på Utforska. Upprepa tills det är övertygat om att den inställda detektionströskeln fångar upp EAP:er utan att fånga upp brus/icke-fysiologisk aktivitet. Använd referenselektroderna för att identifiera brus/icke-fysiologisk aktivitet.
ANMÄRKNING: Det är nödvändigt att säkerställa att ett minimalt antal EAP detekteras i referenselektroder där fysiologisk aktivitet inte kommer att inträffa. Ganska små avvikelser i baslinjen kan dock felaktigt upptäckas som EAP: er. Detta samtidigt som man fortfarande syftar till att maximera antalet verkliga händelser som detekteras i de aktiva elektroderna. - Gå till fliken LFP-detektor , välj manuell tröskel, markera rutorna Stigande och fallande kant och ställ in dödtiden till 3 ms.
- Upprepa steg 2.1.8 för en elektrod genom att välja en elektrod med LFP-aktivitet. När du är nöjd väljer du Använd på alla eftersom tröskelvärden endast kommer att tillämpas på en enda elektrod när du utför manuell tröskel.
- När du undersöker LFP-data på fliken Detektor , notera det maximala antalet tröskelkorsningar för en LFP-vågform och maximal tidsseparation av tröskelkorsningar för en LFP-vågform för användning i senare analys.
- Tryck på Starta analys.
- När analysen är klar går du till fliken EAP-analysator och exporterar data. Gör samma sak på fliken LFP-analysator .
- Upprepa den här processen för alla andra filer från samma segment.
- Efter dataexport konverterar du filerna till xlsx-format så att de kan läsas av programmeringsskriptet som används. Namnge filerna enligt följande konvention för att det tillhandahållna skriptet ska kunna läsa dem: experimentnamn (t.ex. exempeldata) - segmentnummer (t.ex. S1) - inspelningsnummer (t.ex. R1) - aktivitetstyp (t.ex. spikar eller SPs, motsvarande EAP: er respektive LFP).
OBS: EAP-analysen som beskrivs här behandlar spikning från enskilda kanaler som en enda population, även om denna aktivitet vanligtvis skulle uppstå från flera neuroner i närheten av inspelningselektroden. Om antalet neuroner som bidrar till EAPs i en kanal önskas, kan multispike sorteringstekniker som beskrivs någon annanstans tillämpas för att skilja distinkta populationer av spikar baserat på vågformsegenskaper28.
Figur 3: Layouter för datainspelnings- och analysverktyg och exempel på mikroelektrodmatrisinspelningar som visar extracellulär åtgärdspotential och lokala fältpotentialvågformer. Genom att länka MEA2100 och inspelningsverktyget (huvudsteg/förstärkare) kan data namnges och sparas. Fyra exempelspår av rådata (höger, 5-minuters epoker) samlades in av en MEA-kanal som visade aktivitet vid baslinjen, 12 min efter 4-AP-applikation, ytterligare 15 minuter efter etablerad 4-AP-aktivitet och efter badapplikation av TTX (1 μM). Observera att tillägget av 4-AP (andra spår) ger en tydlig ökning av bakgrundsbrus och EAP / LFP-aktivitet. Viktigt är att aktiviteten förblir relativt stabil i minst 15 minuter efter att 4-AP-inducerad aktivitet har etablerats (tredje spåret). Tillsats av TTX (1 μM) avskaffar all aktivitet (bottenspår). (B) Schematisk (vänster) visar analysatorprogramvarukonfiguration för dataanalys. Rådatautforskarverktyget används för att importera inspelningar som samlats in av inspelningsprogramvara. Dessa data körs sedan genom ett tvärkanalsfilterverktyg som subtraherar de valda referenselektrodernas signal (er) från andra elektroder för att ta bort bakgrundsbrus. Data passerar genom EAP-filtret och LFP-filterverktygen för att optimera signal-brusrelationer för varje vågform. Efter det här steget anger EAP-sökvägsdata EAP-detektorverktyget, där tröskelvärden anges. EAP:er identifieras och skickas sedan till EAP-analysverktyget där svarstiderna för varje händelse registreras och exporteras som en txt. fil. Ett identiskt arbetsflöde sker för LFP-data med hjälp av en motsvarande LFP-verktygslåda. Höger spår visar data från en enda MEA-kanal som innehåller olika extracellulära vågformer. Placeringen av EAP- och LFP-signaler markeras i ovanstående "räkna raster". Nedre spår är epoker från övre inspelning (betecknad med röda staplar) som visar vågformer på en utökad tidsskala, inklusive olika LFP-signaler (notera olika utseenden) och enskilda extracellulära EAPs (röda cirklar). Observera att LFP/EAP-vågform och polaritet varierar i förhållande till antalet neuroner som producerar dessa signaler, deras närhet till inspelningselektroden och deras placering i förhållande till de närliggande elektroderna. Förkortningar: MEA = mikroelektrodmatris; EAP = extracellulär åtgärdspotential; LFP = lokal fältpotential; 4-AP = 4-aminopyridin; TTX = tetrodotoxin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Synkronicitetsanalys
OBS: Synkronicitet, eller antalet "sammanfallande" händelser mellan två elektroder, bestämdes med hjälp av slumpkriteriet inom A-SPIKE-synkroniseringsmetoden som beskrivs av Satuvuori et al. 29. Skriptet som används här jämför endast elektroder intill varandra för effektivitet (dvs horisontella, vertikala och diagonala grannar); skriptet kan dock skrivas om för att jämföra alla elektroder om det behövs.- Utför dataanalys med hjälp av ett anpassat programmeringsskript som extraherar latenstidsstämplar för varje elektrod från .xlsx-filerna.
OBS: Detta kan göras manuellt. - I steg 2.1.11 registrerar du det maximala antalet tröskelövergångar och maximal tidsseparation för tröskelkorsningar för en LFP-vågform. Ändra skriptet för att mata in dessa LFP-definierande parametrar för varje segment innan du kör skriptet.
Tröskelvärde som tidigare utförts i analysprogramvara fångar tydligt EAPs som en enda händelse. LFP består emellertid av ett varierande antal toppar beroende på vågformens form och det efterföljande antalet tröskelövergångar av en händelse. - Ändra skriptet för att mata in elektroderna av intresse före analys.
- För att bestämma synkronicitet (definieras i skriptet av modifierbara tidsramar för synkron aktivitet som ska ske inom), separera och analysera de extraherade latenserna för att identifiera sammanfallande händelser.
OBS: Skriptet tillåter att den maximala tiden mellan sammanfallande händelser ställs in. Dessa är inställda på 20 ms för EAP och 200 ms för LFP. - Kör skriptet för att extrahera svarstidsstämplar.
OBS: den .xlsx utdatafilen innehåller tolkningar av latensdata, som är EAP- och LFP-räkningar, frekvenser och sammanfallande händelseantal för enskilda elektroder och hela skivor. Dessa data används för att bedöma frekvensen, EAP / LFP-antal, antal aktiva elektroder, antal sammanfallande händelser, antal länkade elektroder och den genomsnittliga styrkan hos dessa kopplingar.
- Utför dataanalys med hjälp av ett anpassat programmeringsskript som extraherar latenstidsstämplar för varje elektrod från .xlsx-filerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Modell av nätverksaktivitet i ryggmärgens ryggmärgs rygghorn
Applicering av 4-AP inducerar pålitligt synkron rytmisk aktivitet i ryggmärgen DH. Sådan verksamhet framstår som ökade EAP och LFP. Den senare signalen är en lågfrekvent vågform, som tidigare har beskrivits i MEA-inspelningar30. Förändringar i EAP och/eller LFP-aktivitet efter läkemedelsapplikation återspeglar förändrad neural aktivitet. Exempel på EAP och LFP visas i figur 3B och figur 4. Fokus här ligger på följande parametrar eller funktioner i EAP / LFP-data: frekvens, totalt antal, aktiva elektrodantal, synkronicitet som kännetecknas av antalet sammanfallande händelser som detekteras över flera elektroder, antal länkade intilliggande elektroder och styrkan hos kopplingar mellan intilliggande elektroder. Representativa resultat visas i tabell 3 och figur 3, figur 4, figur 5, figur 6, figur 7 och figur 8. De visar en signifikant ökning av alla parametrar som mäts (alla p<0,001 genom parat t-test eller Wilcoxon Signed-Rank icke-parametriskt ekvivalent test) för både EAP (figur 5 och figur 6) och LFP (figur 7 och figur 8) efter 4-AP-stimulering och sedan relativ stabilitet för resten av inspelningarna. Data testades för normalitet före statistisk analys. Sammanfattningsvis inducerar 4-AP EAP- och LFP-aktivitet i ryggmärgen DH, och olika funktioner i data kan extraheras från MEA-inspelningarna. Aktiviteten är reproducerbar, och mycket av aktiviteten, särskilt för LFP, är rytmisk och synkron.
| Aktivitetsfunktion | Baslinje | 4-Aminopyridin | Betydande skillnad |
| Extracellulära åtgärdspotentialer (EAPs) | |||
| Frekvens | 0,07 ± 0,01 | 0,88 ± 0,09 | s<0.001 |
| Totalt antal spikar | 261,41 ± 70,62 | 3289. 57 ± 484,38 | s<0.001 |
| Antal aktiva elektroder | 2,36 ± 0,34 | 8,95 ± 0,68 | s<0.001 |
| Antal sammanfallande spikar | 9.26 ± 4.01 | 966,94 ± 189,21 | s<0.001 |
| Antal länkade elektroder | 2,03 ± 0,42 | 24.06 ± 1.96 | s<0.001 |
| Styrka av kopplingar mellan elektroder | 1,97 ± 0,58 | 29.13 ± 4.60 | s<0.001 |
| Lokala fältpotentialer (LFP) | |||
| Frekvens | 0,00 ± 0,00 | 0,28 ± 0,03 | s<0.001 |
| Totalt antal spikar | 4,79 ± 0,82 | 688,47 ± 121,16 | s<0.001 |
| Antal aktiva elektroder | 0,41 ± 0,16 | 7,64 ± 0,73 | s<0.001 |
| Antal sammanfallande spikar | 0,43 ± 0,23 | 108.06 ± 278.22 | s<0.001 |
| Antal länkade elektroder | 0,24 ± 0,15 | 22.91 ± 2.46 | s<0.001 |
| Styrka av kopplingar mellan elektroder | 0,34 ± 0,19 | Kl. 29.20 ± 3.59 | s<0.001 |
Tabell 3: 4-Aminopyridininducerad aktivitet. Allt presenterat som medel ± SEM.
Figur 4: Exempel på extracellulär åtgärdspotentialaktivitet vid baslinjen. Paneler visar EAP-aktivitet (inspelningar kommer från olika segment). De flesta elektroder i en viss skivinspelning visade inte baslinje EAP-aktivitet (övre panelen). Lågfrekventa sporadiska EAPs observerades ibland vid baslinjen, potentiellt innehållande flera spikvågformer (mittpanel). Högfrekvent EAP-aktivitet observerades sällan i inspelningar vid baslinjen (nedre panelen). Indrag visar enskilda EAP:er från motsvarande inspelningar på en utökad tidsskala. Förkortning: EAP = extracellulär åtgärdspotential. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Segmentorientering
DH-kretsarna som aktiveras av 4-AP är anslutna i alla tre dimensionerna. Således är skivorientering en viktig faktor för in vitro-preparat . Sagittal eller horisontell skivning kan vara att föredra för att observera intersegmental signalering, medan tvärgående skivor bättre bevarar mediolateral och dorsoventral anslutning. Med tanke på dessa överväganden kan man se att 4-AP-stimulering inducerar liknande rytmisk aktivitet i SDH, oavsett segmentorientering (se figur 9).
Långsiktig stabilitet för 4-AP-inducerad aktivitet
Stabiliteten hos 4-AP-inducerad aktivitet är uppenbarligen avgörande när man studerar effekterna av applicerade läkemedel. Därför karakteriserades stabiliteten hos 4-AP-inducerade aktivitetsparametrar, och detta presenteras i figur 5, figur 6, figur 7 och figur 8 och tabell 4. Alla aktivitetsegenskaper, plus sammanträffandet av aktivitet för LFP: er, var stabila baserat på likheten mellan 4-AP-inducerad aktivitet vid 12 min efter 4-AP-applicering och 15 min senare (p>0.05). Andra LFP-synkronicitetsegenskaper, antalet länkade intilliggande elektroder och länkningsstyrkan mellan intilliggande elektroder minskade under 15 minuter (p = 0,016 respektive p = 0,033), även om skillnaden var blygsam. Denna gradvisa förändring kan lätt särskiljas från de mer omedelbara åtgärderna hos ett testläkemedel under farmakologiska studier (se nedan). Data testades för normalfördelning före statistiska jämförelser och bedömdes sedan med hjälp av parade t-tester eller icke-parametriska Wilcoxon Signed-Rank-tester efter behov.
| Aktivitetsfunktion | 4-Aminopyridin | 4-Aminopyridin (15 min) | Betydande skillnad |
| Extracellulära åtgärdspotentialer (EAPs) | |||
| Frekvens | 0,8 ± 0,13 | 0,85 ± 0,10 | s>0.05 (ingen dif.) |
| Totalt antal spikar | 2706,36 ± 510,96 | 2838,09 ± 447,73 | s>0.05 (ingen dif.) |
| Antal aktiva elektroder | 9,32 ± 0,70 | 10.09 ± 0.56 | s>0.05 (ingen dif.) |
| Antal sammanfallande spikar | 1037,63 ± 306,84 | 1013,09 ± 269,80 | s>0.05 (ingen dif.) |
| Antal länkade elektroder | 22.00 ± 3.37 | 22.41 ± 2.56 | s>0.05 (ingen dif.) |
| Styrka av kopplingar mellan elektroder | 30.44 ± 6.27 | 31,88 ± 7,68 | s>0.05 (ingen dif.) |
| Lokala fältpotentialer (LFP) | |||
| Frekvens | 0,25 ± 0,03 | 0,17 ± 0,03 | s>0.05 (ingen dif.) |
| Totalt antal spikar | 792,32 ± 155,83 | 546,32 ± 120,93 | s>0.05 (ingen dif.) |
| Antal aktiva elektroder | 9.50 ± 1.11 | 7.86 ± 1.00 | s>0.05 (ingen dif.) |
| Antal sammanfallande spikar | 1631,27 ± 734,77 | 1073,00 ± 490,85 | s>0.05 (ingen dif.) |
| Antal länkade elektroder | 26,68 ± 4,58 | 20,95 ± 3,68 | s<0.05 |
| Styrka av kopplingar mellan elektroder | 33.35 ± 6.19 | 24,81 ± 5,41 | s<0.05 |
Tabell 4: 4-Aminopyridinaktivitetsstabilitet. Allt presenterat som medel ± SEM.
Farmakologisk undersökning av aktivitetsegenskaper
För att visa att MEA-inspelad 4-AP-inducerad aktivitet är lätt mottaglig för farmakologiska manipulationer, betonades beroendet av dessa signaler på handlingspotential urladdning. Badapplikation av den spänningsstyrda natriumkanalantagonisten, tetrodotoxin (TTX, 1 μM), avskaffade både EAP- och LFP-aktivitet, vilket bekräftar spikberoendet av dessa signaler. Exempelspår visas i figur 3A. Detta resultat ger också ett exempel på nyttan av preparatet för framtida farmakologiska undersökningar, där nya föreningar och etablerade analgetika kan bedömas för deras verkan i aktiverade spinalA DH-kretsar. Slutligen, för att belysa relevansen av 4-AP-aktivering av DH-nätverken, testades ett alternativt tillvägagångssätt för att uppnå blygsam depolarisering av DH-nätverket. I detta tillvägagångssätt badapplicerades en förhöjd kalium (4,5 mM) aCSF-lösning (tabell 1) och visade sig framkalla ett liknande DH-svar på 4-AP-stimulering. Denna manipulation framkallade LFP-aktivitet som innehöll samma synkrona egenskaper som 4-AP-inducerade svar (figur 10), vilket tyder på en liknande mekanism och underliggande kretsar.
Figur 5: Exempel 4-aminopyridininducerad extracellulär åtgärdspotentialaktivitet. (A) Rasterdiagram visar EAP-aktivitet från aktiva kanaler, detekterad vid baslinjen (övre) och två tidpunkter (12 min - etablerad och 27 min) efter badtillägg av 4-AP (mitten och nedre). Vertikala blå fönster markerar perioder med synkron (nära latens) aktivitet i mer än 5 inspelningselektroder. (B) Paneler sammanfattar EAP-aktivitetskartanalys av MEA-data. Vänster schematisk visar orienteringen av ryggmärgsskivan i förhållande till elektroduppsättningen. Den mellersta vänstra panelen sammanfattar aktiviteten vid baslinjen (aktiva elektroder färgade röda) och EAP-frekvensen indikeras av vit skuggning runt aktiva elektroder (skuggningsintensitet betecknar ökad aktivitet). Den mellersta högra panelen visar aktivitet i samma segment efter 12 minuters exponering med 4 AP. Observera att antalet aktiva elektroder (röd) ökade tillsammans med EAP-frekvensen. Dessutom indikeras synkronisering mellan intilliggande elektroder med röda anslutningslinjer, vilket ger en nätverkskarta över aktivitet (linjetjocklek anger graden av EAP-likhet mellan elektroder). Den högra panelen visar aktivitet i samma segment efter ytterligare 15 minuters 4-AP-exponering. Observera att antalet aktiva elektroder (röd), graden av EAP-aktivitet (vit) och nätverksstrukturen (röda linjer) har varit stabila under denna period. Förkortningar: 4-AP = 4-aminopyridin; EAP = extracellulär åtgärdspotential; MEA = mikroelektrodmatris. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Gruppdatasammanfattning av 4-aminopyridininducerad extracellulär åtgärdspotentialaktivitet. EAP-frekvensen (A), antalet (B), sammanfallande händelser (C), aktiva elektroder (D), länkade elektroder (E) och den genomsnittliga länkstyrkan (F) steg efter badapplicering av 4-AP och var sedan stabila i 15 minuter efter upprättandet av 4-AP-inducerad aktivitet. Data är från 11 experiment (data i rött är från experimentet i figur 5). Förkortningar: 4-AP = 4-aminopyridin; EAP = extracellulär åtgärdspotential. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: 4-Aminopyridininducerad lokal fältpotentialaktivitet. Data presenteras som i figur 5 med undantag för LFP-data. (A) Rasterdiagram visar LFP-aktivitet från flera kanaler, detekterad vid baslinjen (övre) och två tidpunkter (12 min - etablerad och 27 min) efter badtillägg av 4-AP (mitten och nedre). Vertikala blå fönster markerar perioder med synkron (nära latens) aktivitet i mer än 5 inspelningselektroder. (B) Paneler sammanfattar LFP-aktivitetskartanalys av MEA-data. Vänster schematisk visar orienteringen av ryggmärgsskivan i förhållande till elektroduppsättningen. Den mellersta vänstra panelen sammanfattar aktiviteten vid baslinjen (aktiva elektroder färgade röda), med minimal LFP-frekvens indikerad av vit skuggning runt aktiva elektroder (skuggningsintensitet betecknar ökad aktivitet). Den mellersta högra panelen visar aktivitet i samma segment efter 12 minuters exponering med 4 AP. Antalet aktiva elektroder (röd) och LFP-frekvens ökar avsevärt. Dessutom visar synkronisering mellan intilliggande elektroder (röda anslutningslinjer) en stark nätverkskarta över LFP-aktivitet (linjetjocklek betecknar graden av likhet mellan elektroder). Den högra panelen visar LFP-aktivitet i samma segment efter ytterligare 15 minuters 4-AP-exponering. Observera att antalet aktiva elektroder (röd), graden av LFP-aktivitet (vit) och nätverksstrukturen (röda linjer) är relativt stabila under denna period. Förkortningar: 4-AP = 4-aminopyridin; MEA = mikroelektrodmatris; LFP = lokal fältpotential. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: Gruppdatasammanfattning av 4-aminopyridininducerad lokal fältpotentialaktivitet. LFP-frekvens (A), antal (B), sammanfallande händelser (C) och aktiva elektroder (D) var stabila i 15 minuter efter att 4-AP-effekten nådde sin topp (data i rött är från experimentet i figur 7). Länkade elektroder (E) och den genomsnittliga LFP-länkstyrkan (F) minskade dock med tiden (båda p<0,05). Data är från 11 experiment (data i rött är från experimentet i figur 7). Förkortningar: 4-AP = 4-aminopyridin; LFP = lokal fältpotential. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: 4-Aminopyridininducerad extracellulär åtgärdspotential och lokal fältpotentialaktivitet i sagittala och horisontella skivor. Paneler sammanfattar EAP- och LFP-aktivitet i MEA-nätverkskartanalys av 4-AP-inducerad signalering i sagittala (A) och horisontella (B) ryggmärgsskivor. Scheman (längst till vänster) visar orienteringen av ryggmärgsskivor i förhållande till rektangulära elektrodmatriser. Vänstra nätverkskartor visar baslinje EAP- och LFP-aktivitet i sagittala (A) och horisontella (B) ryggmärgsskivor (aktiva elektroder är röda, frekvens indikeras av vit skuggningsintensitet och synkronisering mellan intilliggande elektroder med röda anslutningslinjer med tjocklek som anger graden av synkronisering). Högra nätverkskartor visar EAP- och LFP-aktivitet i samma skiva efter 12 minuters 4-AP-exponering i sagittala (A) och horisontella (B) ryggmärgsskivor. Observera den betydande ökningen av antalet aktiva elektroder, aktivitetsfrekvens och synkronisering av dessa signaler efter 4-AP-exponering, avmaskering av nätverk i båda skivorienteringarna. Förkortningar: MEA = mikroelektrodmatris; EAP = extracellulär åtgärdspotential; LFP = lokal fältpotential; 4-AP = 4-aminopyridin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10: Förhöjd kalium (hög K+)-inducerad lokal fältpotentialaktivitet. Paneler sammanfattar hög K + (4,5 mM) aCSF-inducerad LFP-aktivitet. (A) Exempelspår från en MEA-kanal vid baslinjen och efter badtillägg av hög K + aCSF (5-minuters epoker). Förhöjning av K+- koncentrationen gav tydlig LFP-aktivitet som saknades vid baslinjen, liknande den som sågs med 4-AP-applicering (figur 3). Infällt visar en LFP-vågform på en utökad tidsskala. (B) Paneler sammanfattar LFP-nätverksaktivitet inducerad av hög K + aCSF. Vänster schematisk visar orientering av ryggmärgsskivor i förhållande till fyrkantiga elektrodmatriser. Nätverkskartor jämför baslinje och hög K +-framkallad LFP-aktivitet (aktiva elektroder röd, frekvens indikerad av vit skuggningsintensitet och synkronisering mellan intilliggande elektroder med röda anslutningslinjer med tjocklek som anger graden av synkronisering). Observera den betydande ökningen av antalet aktiva elektroder, aktivitetsfrekvens och synkronisering av dessa signaler efter hög K + aCSF-exponering, avmaskering av det underliggande nätverket på ett liknande sätt som 4-AP. MEA = mikroelektrodmatris; EAP = extracellulär åtgärdspotential; LFP = lokal fältpotential; 4-AP = 4-aminopyridin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trots vikten av spinal DH i nociceptiv signalering, bearbetning och de resulterande beteendemässiga och känslomässiga reaktionerna som karakteriserar smärta, förblir kretsarna inom denna region dåligt förstådda. En viktig utmaning för att undersöka denna fråga har varit mångfalden av neuronpopulationer som utgör dessa kretsar 6,31,32. De senaste framstegen inom transgen teknik, ledd av optogenetik och kemiogenetik, börjar riva upp dessa viktiga anslutningar och definiera mikrokretsarna som bearbetar sensorisk information 1,2,3,4,8,9,10,11,12,13,14 . Att förena hur dessa mikrokretsar samlas för att forma aktivitet i större nätverk av DH-neuroner är fortfarande utmanande, särskilt för att utveckla nya och effektivare smärtbehandlingar. Här beskrivs en funktionell modell av DH-aktivitet övervakad på MEA och med hjälp av 4-AP-stimulerad rytmisk aktivitet för att studera bredare nätverksanslutning. Den här modellen avslöjar lokal extracellulär spikning (EAPs) och större nätverksbaserade LFP: er, som beror på åtgärdspotential urladdning och kan användas för att kartlägga förändringar i nätverksegenskaper. Genom att kombinera användningen av MEA för att underlätta kretsundersökning och 4-AP för att avslöja de underliggande kretsarna, gör denna beredning att DH-kretsfunktionen kan studeras på regional eller "makroskopisk" nivå.
Fördelarna med MEA / 4-AP ryggmärgsskiva-modellen inkluderar tät experimentell kontroll av ett in vitro-preparat , vilket är mottagligt för detaljerad farmakologisk undersökning och ger hög rumslig och tidsmässig upplösning av neural aktivitetsindivid, dvs. EAPs och LFP över en stor vävnadsregion och flerkanalsdata som kan bedöma signalering över nätverk och regioner. Viktigt är att 4-AP-inducerad rytmisk aktivitet är tillförlitlig, reproducerbar och kan studeras i olika ryggmärgssegmentorienteringar. Denna beredning hjälper till att överbrygga klyftan mellan encells- och heldjursundersökningar och kan avslöja förändringar inom dessa kretsar under både normala och patologiska förhållanden. Effekterna av olika läkemedel på nätverksaktivitet kan också bestämmas. Således kan denna plattform fungera som ett screeningverktyg för att undersöka verkan av befintliga och nya analgetika på DH-kretsar.
Det finns flera kritiska steg i detta protokoll. För det första är noggrann vävnadsberedning nyckeln till att producera skivor som är livskraftiga för experiment och känsliga för 4-AP, oavsett skivorientering. Ett antal resurser markeras här som ger detaljerad information och felsökningsråd. Kortfattat är noggrannhet vid tillverkning av lösningar, snabb men noggrann dissektion av ryggmärgen, optimerade skivparametrar för att minimera vävnadskompression och skada och vård vid överföring av skivor när som helst viktiga faktorer i beredningsfasen. Noggrann hantering av MEA, särskilt när de är i närheten av elektroderna, är nyckeln till att upprätthålla funktionen hos dessa komponenter. DH: s optimala position över det maximala antalet MEA-elektroder är viktigt för att öka inspelningsutbytet för varje experiment. När du använder 3D MEA krävs mer omsorg och övning, särskilt vid positionering och borttagning av skivor. Det är lätt att dra vävnaden över utskjutande MEA-elektroder och äventyra framtida användning.
Det finns några försiktighetsåtgärder för det tillvägagångssätt som beskrivs här. Till skillnad från i encellsinspelningar, där identiteten hos neuroner som studeras kan bestämmas med antingen genetisk märkning eller post hoc-immunmärkning, kan den exakta källan till de elektriska signaler som detekteras av MEA inte bestämmas. En annan utmaning är nivån på baslinjeaktiviteten i ryggmärgsskivor. Även om vissa rapporter beskriver toniskt aktiva DH-nervceller vid baslinjen, är det senaste arbetet i ung neonatal vävnad33,34. Dessutom registreras tonisk aktivitet som rapporteras i vuxen vävnad vanligtvis med hjälp av en sökstrategi där elektroder avanceras för att först identifiera och sedan studera denna aktivitet35. När en opartisk provtagningsmetod används, upprättar inspelning före bedömning av aktivitet, uppvisar mindre än 20% av vuxna DH-neuroner pågående spikning (28/150 inspelningar), och regelbunden urladdning observerades endast i 2% av dessa celler (3/150)36.
Med tanke på detta förhållande och elektrodernas fasta natur i förhållande till en vävnadsskiva är det inte förvånande att få MEA-elektroder (~ 2 elektroder / skiva i dessa MEA) uppvisar aktivitet vid baslinjen. Denna brist på aktivitet är den främsta anledningen till att metoden som beskrivs här innebär att stimulera skivor med 4-AP för att förbättra EAPs och framkallad LFP-aktivitet. Detta tillvägagångssätt är baserat på användningen av 4-AP för att aktivera rytmisk kretsaktivitet i många in vitro-preparat, från att studera epileptiforma mekanismer i cortex och hippocampus till fiktiv lokomotorisk aktivitet i ryggmärgens ventrala horn 37,38,39. En omfattande litteratur belyser också att 4-AP inducerar aktivitet begränsad till ytliga DH-kretsar i ryggradsskivor och beror på excitatorisk och hämmande synaptisk överföring samt elektriska synapser 20,21,22. Dessutom ger in vivo 4-AP-administrering en dosberoende ökning av DH-neuronreceptiva fält utan att ändra svar på graderad stimulering i den centrala mottagliga zonen eller orsaka degenererade svar24. Slutligen kan man se att en blygsam depolarisering av dessa kretsar genom att höja extracellulär kaliumjonkoncentration också ger jämförbar LFP-aktivitet. Tillsammans stöder dessa observationer uppfattningen att 4-AP avmaskerar funktionellt relevanta nätverk inom den ytliga DH som kan studeras med MEA. Slutligen är den exakta källan till LFP-aktivitet oklar, även om dessa vågformer tros representera en summering av aktivitet som detekteras från flera neuroner som omger en elektrod. De kan relatera till eller bero på sprängaktivitet i nervceller eller motsvara synaptiska potentialer30. Oavsett ursprung kan egenskaperna hos LFP jämföras inom och mellan skivor (flera inspelningar/läkemedelsapplikationer), vilket ger en värdefull avläsning av krets- och nätverksfunktion.
Arten av in vitro-skivpreparat motiverar också övervägande, med potentiell störning av neuronala kretsar och skador på celler på skivytan. Trots detta ger skivning av vävnaden mer direkt elektrisk tillgång till relevanta DH-kretsar och oavbruten farmakologisk åtkomst. Dessa experimentella fördelar och nackdelar bör övervägas noggrant, med betoning på vikten av att överväga segmentorientering för att maximalt bevara anslutningen i de intressanta nätverken. För de allra flesta data som presenteras i detta dokument presenteras medialt-lateral spridning av aktivitet inom dorsalhornet och den inneboende anslutningen av neuronerna i denna region. För att undersöka rostro-kaudal aktivitetsspridning upprätthåller användningen av sagittala eller horisontella skivor företrädesvis anslutning mellan ryggradssegment, vilket markeras i figur 9.
Dessutom är det oundvikligt att sektionering av ryggmärgen kommer att resultera i en viss grad av skada vid skivornas yta. Att minimera denna skada kommer tillbaka till noggrann beredning av vävnad, skivparametrar - inklusive långsam förskottshastighet och högfrekventa bladoscillationer - och lösningar och tillstånd som är neuroprotektiva under denna process. En detaljerad bedömning av nyttan av olika tillstånd för ryggmärgshälsa har publicerats tidigare40. Trots den potentiella effekten av segmenthälsa på MEA-inspelningar säkerställer intern konsekvens i segmentförberedelseprocedurer att den här faktorn påverkar resultaten i en datauppsättning lika mycket. Det bör också noteras att mea-elektroderna tros fånga upp signaler som kommer ungefär 30-100 μm från aktivitetskällan. Eftersom den skadade skivytan sannolikt kommer att sträcka sig över det övre cellskiktet, cirka 15-30 μm, kan effekterna av skivningsrelaterad skada på MEA-inspelningar hanteras och mildras för att fortfarande ge värdefulla datamängder och insikter om DH-nätverksaktivitet15,41.
Sammanfattningsvis ger MEA / 4-AP ryggmärgsskiva-metoden som beskrivs här en plattform för att förstå anslutningen av DH-kretsar och hur nätverken de bildar driver ryggmärgssmärtabehandling. Det finns också potential för ytterligare metodologisk expansion när det gäller analysparametrar, nätverksstimuleringskälla och dess kapacitet att användas som en plattform för farmakologisk screening eller användning med modeller av patologisk smärta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av National Health and Medical Research Council (NHMRC) i Australien (bidrag 631000, 1043933, 1144638 och 1184974 till B.A.G. och R.J.C.) och Hunter Medical Research Institute (bidrag till B.A.G. och R.J.C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-aminopyridine | Sigma-Aldrich | 275875-5G | |
| 100% ethanol | Thermo Fisher | AJA214-2.5LPL | |
| CaCl2 1M | Banksia Scientific | 0430/1L | |
| Carbonox (Carbogen - 95% O2, 5% CO2) | Coregas | 219122 | |
| Curved long handle spring scissors | Fine Science Tools | 15015-11 | |
| Custom made air interface incubation chamber | |||
| Foetal bovine serum | Thermo Fisher | 10091130 | |
| Forceps Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Glucose | Thermo Fisher | AJA783-500G | |
| Horse serum | Thermo Fisher | 16050130 | |
| Inverted microscope | Zeiss | Axiovert10 | |
| KCl | Thermo Fisher | AJA383-500G | |
| Ketamine | Ceva | KETALAB04 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14007-14 | |
| Loctite 454 Instant Adhesive | Bolts and Industrial Supplies | L4543G | |
| MATLAB | MathWorks | R2018b | |
| MEAs, 3-Dimensional | Multichannel Systems | 60-3DMEA100/12/40iR-Ti, 60-3DMEA200/12/50iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in an 8x8 square grid. Electrodes are 12 µm in diameter, 40 µm (100/12/40) or 50 µm (200/12/50) high and equidistantly spaced 100 µm (100/12/40) or 200 µm (200/12/50) apart. |
| MEA headstage | Multichannel Systems | MEA2100-HS60 | |
| MEA interface board | Multichannel Systems | MCS-IFB 3.0 Multiboot | |
| MEA net | Multichannel Systems | ALA HSG-MEA-5BD | |
| MEA perfusion system | Multichannel Systems | PPS2 | |
| MEAs, Planar | Multichannel Systems | 60MEA200/30iR-Ti, 60MEA500/30iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in either a 8x8 square grid (200/30) or a 6x10 rectangular grid (500/30). Electrodes are 30 µm in diameter and equidistantly spaced 200 µm (200/30) or 500 µm (500/30) apart. |
| MgCl2 | Thermo Fisher | AJA296-500G | |
| Microscope camera | Motic | Moticam X Wi-Fi | |
| Multi Channel Analyser software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
| Multi Channel Experimenter software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
| NaCl | Thermo Fisher | AJA465-500G | |
| NaHCO3 | Thermo Fisher | AJA475-500G | |
| NaH2PO4 | Thermo Fisher | ACR207805000 | |
| Rongeurs | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Small spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Sucrose | Thermo Fisher | AJA530-500G | |
| Superglue | cyanoacrylate adhesive | ||
| Tetrodotoxin | Abcam | AB120055 | |
| Vibration isolation table | Newport | VH3048W-OPT | |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 S |
References
- Smith, K. M., et al. Calretinin positive neurons form an excitatory amplifier network in the spinal cord dorsal horn. eLife. 8, 49190 (2019).
- Smith, K. M., et al. Functional heterogeneity of calretinin-expressing neurons in the mouse superficial dorsal horn: implications for spinal pain processing. The Journal of physiology. 593 (19), 4319-4339 (2015).
- Boyle, K. A., et al. Defining a spinal microcircuit that gates myelinated afferent input: Implications for tactile allodynia. Cell Reports. 28 (2), 526-540 (2019).
- Browne, T. J., et al. Transgenic cross-referencing of inhibitory and excitatory interneuron populations to dissect neuronal heterogeneity in the dorsal horn. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 32 (2020).
- Graham, B. A., Hughes, D. I. Rewards, perils and pitfalls of untangling spinal pain circuits. Current Opinion in Physiology. 11, 35-41 (2019).
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).
- Hughes, D. I., Todd, A. J. Central nervous system targets: inhibitory interneurons in the spinal cord. Neurotherapeutics. 17 (3), 874-885 (2020).
- Duan, B., et al. Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain. Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).
- Hachisuka, J., Chiang, M. C., Ross, S. E.
- Foster, E., et al. Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch. Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).
- Bourane, S., et al. Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control. Cell. 160 (3), 503-515 (2015).
- Cheng, L., et al. Identification of spinal circuits involved in touch-evoked dynamic mechanical pain. Nature neuroscience. 20 (6), 804-814 (2017).
- Peirs, C., et al. Mechanical allodynia circuitry in the dorsal horn is defined by the nature of the injury. Neuron. 109 (1), 73-90 (2021).
- Huang, J., et al. Circuit dissection of the role of somatostatin in itch and pain. Nature Neuroscience. 21 (5), 707-716 (2018).
- Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2015).
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
- Johnstone, A. F., et al. Microelectrode arrays: a physiologically based neurotoxicity testing platform for the 21st century. Neurotoxicology. 31 (4), 331-350 (2010).
- Stett, A., et al. Biological application of microelectrode arrays in drug discovery and basic research. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 377 (3), 486-495 (2003).
- Xu, L., et al. Trends and recent development of the microelectrode arrays (MEAs). Biosensors and Bioelectronics. 175 (1), 112854 (2020).
- Chapman, R. J., Cilia La Corte, P. F., Asghar, A. U. R., King, A. E. Network-based activity induced by 4-aminopyridine in rat dorsal horn in vitro is mediated by both chemical and electrical synapses. The Journal of Physiology. 587, Pt 11 2499-2510 (2009).
- Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. Epileptiform activity in rat spinal dorsal horn in vitro has common features with neuropathic pain. Pain. 105 (1-2), 327-338 (2003).
- Kay, C. W., Ursu, D., Sher, E., King, A. E. The role of Cx36 and Cx43 in 4-aminopyridine-induced rhythmic activity in the spinal nociceptive dorsal horn: an electrophysiological study in vitro. Physiological Reports. 4 (14), 12852 (2016).
- Jankowska, E., Lundberg, A., Rudomin, P., Sykova, E. Effects of 4-aminopyridine on synaptic transmission in the cat spinal cord. Brain Research. 240 (1), 117-129 (1982).
- Semba, K., Geller, H. M., Egger, M. D. 4-Aminopyridine induces expansion of cutaneous receptive fields of dorsal horn cells. Brain Research. 343 (2), 398-402 (1985).
- Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. Long-range oscillatory Ca2+ waves in rat spinal dorsal horn. European Journal of Neuroscience. 22 (8), 1967-1976 (2005).
- Egert, U., et al. A novel organotypic long-term culture of the rat hippocampus on substrate-integrated multielectrode arrays. Brain Research Protocols. 2 (4), 229-242 (1998).
- Thiebaud, P., De Rooij, N., Koudelka-Hep, M., Stoppini, L. Microelectrode arrays for electrophysiological monitoring of hippocampal organotypic slice cultures. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 44 (11), 1159-1163 (1997).
- Rey, H. G., Pedreira, C., Quiroga, R. Q. Past, present and future of spike sorting techniques. Brain Research Bulletin. 119, 106-117 (2015).
- Satuvuori, E., et al. Measures of spike train synchrony for data with multiple time scales. Journal of Neuroscience Methods. 287, 25-38 (2017).
- Mendis, G. D. C., Morrisroe, E., Reid, C. A., Halgamuge, S. K., Petrou, S. Use of local field potentials of dissociated cultures grown on multi-electrode arrays for pharmacological assays. 38th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 952-956 (2016).
- Hughes, D. I., et al. Morphological, neurochemical and electrophysiological features of parvalbumin-expressing cells: a likely source of axo-axonic inputs in the mouse spinal dorsal horn. The Journal of Physiology. 590 (16), 3927-3951 (2012).
- Peirs, C., Seal, R. P. Neural circuits for pain: recent advances and current views. Science. 354 (6312), 578-584 (2016).
- Li, J., Baccei, M. L. Developmental regulation of membrane excitability in rat spinal lamina I projection neurons. Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2604-2614 (2012).
- Li, J., Baccei, M. L. Pacemaker neurons within newborn spinal pain circuits. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9010-9022 (2011).
- Sandkühler, J., Eblen-Zajjur, A. Identification and characterization of rhythmic nociceptive and non-nociceptive spinal dorsal horn neurons in the rat. Neuroscience. 61 (4), 991-1006 (1994).
- Lucas-Romero, J., Rivera-Arconada, I., Roza, C., Lopez-Garcia, J. A. Origin and classification of spontaneous discharges in mouse superficial dorsal horn neurons. Scientific Reports. 8 (1), 9735-9735 (2018).
- Antonio, L., et al. L. al. In vitro seizure like events and changes in ionic concentration. Journal of Neuroscience Methods. 260, 33-44 (2016).
- Avoli, M., Jefferys, J. G. Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 260, 26-32 (2016).
- Taccola, G., Nistri, A. Low micromolar concentrations of 4-aminopyridine facilitate fictive locomotion expressed by the rat spinal cord in vitro. Neuroscience. 126 (2), 511-520 (2004).
- Mitra, P., Brownstone, R. M. An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse. Journal of Neurophysiology. 107 (2), 728-741 (2012).
- Egert, U., Heck, D., Aertsen, A. Two-dimensional monitoring of spiking networks in acute brain slices. Experimental Brain Research. 142 (2), 268-274 (2002).
