Summary
L’utilisation combinée de la technologie des réseaux de microélectrodes et de la stimulation chimique induite par la 4-aminopyridine pour étudier l’activité nociceptive au niveau du réseau dans la corne dorsale de la moelle épinière est décrite.
Abstract
Les rôles et la connectivité de types spécifiques de neurones dans la corne dorsale de la moelle épinière (DH) sont délimités à un rythme rapide pour fournir une vue de plus en plus détaillée des circuits qui sous-tendent le traitement de la douleur vertébrale. Cependant, les effets de ces connexions sur l’activité plus large du réseau dans la DH restent moins bien compris car la plupart des études se concentrent sur l’activité de neurones uniques et de petits microcircuits. Alternativement, l’utilisation de réseaux de microélectrodes (MEA), qui peuvent surveiller l’activité électrique à travers de nombreuses cellules, fournit une résolution spatiale et temporelle élevée de l’activité neuronale. Ici, l’utilisation d’AME avec des tranches de moelle épinière de souris pour étudier l’activité de la DH induite par la stimulation chimique des circuits de DH avec la 4-aminopyridine (4-AP) est décrite. L’activité rythmique résultante est limitée à la DH superficielle, stable dans le temps, bloquée par la tétrodotoxine, et peut être étudiée dans différentes orientations de tranches. Ensemble, cette préparation fournit une plate-forme pour étudier l’activité du circuit DH dans les tissus d’animaux naïfs, de modèles animaux de douleur chronique et de souris ayant une fonction nociceptive génétiquement modifiée. En outre, les enregistrements MEA dans les tranches de moelle épinière stimulées par 4-AP peuvent être utilisés comme outil de dépistage rapide pour évaluer la capacité de nouveaux composés antinociceptifs à perturber l’activité dans la moelle épinière DH.
Introduction
Les rôles de types spécifiques d’interneurones inhibiteurs et excitateurs dans la moelle épinière DH sont découverts à un rythme rapide 1,2,3,4. Ensemble, les interneurones représentent plus de 95% des neurones de la DH et sont impliqués dans le traitement sensoriel, y compris la nociception. De plus, ces circuits interneurones sont importants pour déterminer si les signaux périphériques montent dans l’axe du neuroaxe pour atteindre le cerveau et contribuer à la perception de la douleur 5,6,7. À ce jour, la plupart des études ont étudié le rôle des neurones DH au niveau de l’analyse unicellulaire ou de l’organisme entier en utilisant des combinaisons d’électrophysiologie intracellulaire in vitro, de marquage neuroanatomique et d’analyse comportementale in vivo 1,3,8,9,10,11,12,13,14 . Ces approches ont considérablement fait progresser la compréhension du rôle de populations de neurones spécifiques dans le traitement de la douleur. Cependant, une lacune subsiste dans la compréhension de la façon dont des types cellulaires spécifiques et de petits macro-circuits influencent de grandes populations de neurones au niveau des microcircuits pour façonner ensuite la sortie de la DH, les réponses comportementales et l’expérience de la douleur.
Une technologie qui peut étudier la fonction de macro-circuit ou multicellulaire est le réseau de microélectrodes (MEA)15,16. Les MEA sont utilisés pour étudier le fonctionnement du système nerveux depuis plusieurs décennies17,18. Dans le cerveau, ils ont facilité l’étude du développement neuronal, de la plasticité synaptique, du dépistage pharmacologique et des tests de toxicité17,18. Ils peuvent être utilisés pour des applications in vitro et in vivo, selon le type de MEA. En outre, le développement des MEA a évolué rapidement, avec différents nombres et configurations d’électrodes désormais disponibles19. L’un des principaux avantages des MEA est leur capacité à évaluer simultanément l’activité électrique dans de nombreux neurones avec une grande précision spatiale et temporelle via plusieurs électrodes15,16. Cela fournit une lecture plus large de la façon dont les neurones interagissent dans les circuits et les réseaux, dans des conditions de contrôle et en présence de composés appliqués localement.
L’un des défis des préparations in vitro de DH est que les niveaux d’activité continue sont généralement faibles. Ici, ce défi est abordé dans les circuits DH de la moelle épinière en utilisant le bloqueur de canal K + voltage-dépendant, la 4-aminopryidine (4-AP), pour stimuler chimiquement les circuits DH. Ce médicament a déjà été utilisé pour établir une activité électrique synchrone rythmique dans la DH des tranches aiguës de la moelle épinière et dans des conditions aiguës in vivo 20,21,22,23,24. Ces expériences ont utilisé un patch unicellulaire et un enregistrement extracellulaire ou l’imagerie calcique pour caractériser l’activitéinduite par le 4-AP 20,21,22,23,24,25. Ensemble, ces travaux ont démontré l’exigence d’une transmission synaptique excitatrice et inhibitrice et de synapses électriques pour une activité rythmique induite par le 4-AP. Ainsi, la réponse 4-AP a été considérée comme une approche qui démasque les circuits DH polysynaptiques natifs ayant une pertinence biologique plutôt que comme un épiphénomène induit par un médicament. En outre, l’activité induite par le 4-AP présente un profil de réponse similaire aux analgésiques et aux antiépileptiques que les affections douloureuses neuropathiques et a été utilisée pour proposer de nouvelles cibles médicamenteuses analgésiques à base rachidienne telles que les connexines 20,21,22.
Ici, une préparation qui combine les MEA et l’activation chimique de la DH spinale avec le 4-AP pour étudier ce circuit nociceptif au niveau du macro-circuit, ou réseau d’analyse, est décrite. Cette approche fournit une plate-forme stable et reproductible pour étudier les circuits nociceptifs dans des conditions naïves et neuropathiques « semblables à la douleur ». Cette préparation est également facilement applicable pour tester l’action au niveau du circuit des analgésiques connus et pour dépister de nouveaux analgésiques dans la moelle épinière hyperactive.
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Protocol
Des études ont été réalisées sur des souris mâles et femelles c57Bl/6 âgées de 3 à 12 mois. Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées conformément au comité de soins et d’éthique des animaux de l’Université de Newcastle (protocoles A-2013-312 et A-2020-002).
1. Électrophysiologie in vitro
- Préparation de solutions pour la préparation et l’enregistrement de tranches de moelle épinière
- Liquide céphalo-rachidien artificiel
REMARQUE: Le liquide céphalo-rachidien artificiel (CSPa) est utilisé dans une chambre d’incubation d’interface, où les tranches sont stockées jusqu’au début de l’enregistrement et pendant les expériences sous forme de perfusat et de diluant pour les médicaments. Voir le tableau 1 pour la composition détaillée.
- Liquide céphalo-rachidien artificiel
| Chimique | aCSF (mM) | aCSF (g/100 mL) | CSF substitué par le saccharose (mM) | CSAf substitué par le saccharose (g/100 mL) | ACSF à haute teneur en potassium (mM) | ACSF à haute teneur en potassium (g/100 mL) |
| Chlorure de sodium (NaCl) | 118 | 0.690 | - | - | 118 | 0.690 |
| Hydrogénocarbonate de sodium (NaHCO3) | 25 | 0.210 | 25 | 0.210 | 25 | 0.210 |
| Glucose | 10 | 0.180 | 10 | 0.180 | 10 | 0.180 |
| Chlorure de potasium (KCl) | 2.5 | 0.019 | 2.5 | 0.019 | 4.5 | 0.034 |
| Dihydrogénophosphate de sodium (NaH2PO4) | 1 | 0.012 | 1 | 0.012 | 1 | 0.012 |
| Cloride de magnésium (MgCl2) | 1 | 0.01 | 1 | 0.01 | 1 | 0.01 |
| Chlorure de calcium (CaCl2) | 2.5 | 0.028 | 2.5 | 0.028 | 2.5 | 0.028 |
| Saccharose | - | - | 250 | 8.558 | - | - |
Tableau 1 : Compositions du liquide céphalo-rachidien artificiel. Abréviation : aCSF = liquide céphalo-rachidien artificiel.
- Préparer un CSF contenant (en mM) 118 NaCl, 25 NaHCO3, 10 glucose, 2,5 KCl, 1 NaH2PO4, 1 MgCl2 et 2,5 CaCl2 en ajoutant les quantités requises de ce qui précède, à l’exclusion du CaCl2, à 2 L d’eau distillée.
- Faire bouillonner la solution ci-dessus avec du carbogène (95% O2, 5% CO2) pendant 5 min et ajouter CaCl2.
REMARQUE: Cette étape empêche les précipitations de CaCl2 , c’est-à-dire que la solution ne doit pas devenir trouble. Pour l’application de médicaments pendant les expériences, diluer les solutions mères de médicaments dans l’aCSF aux concentrations finales souhaitées.
- Liquide céphalo-rachidien artificiel substitué au saccharose
REMARQUE: Le LSCa substitué par le saccharose est utilisé pendant la dissection et le tranchage de la moelle épinière. Comme son nom l’indique, le saccharose est substitué au NaCl pour réduire l’excitation neuronale au cours de ces procédures tout en maintenant l’osmolarité. Voir le tableau 1 pour la composition détaillée.- Préparer le CSAf substitué au saccharose contenant (en mM) 250 saccharose, 25 NaHCO3, 10 glucose, 2,5 KCl, 1 NaH2PO4, 1 MgCl2 et 2,5 CaCl2 en ajoutant les quantités requises de tout ce qui précède, à l’exclusion du CaCl2, à 300 mL d’eau distillée.
- Faire bouillonner la solution avec du carbogène pendant 5 min, puis ajouter caCl2.
- Conserver la solution dans un congélateur à -80 °C pendant environ 40 min ou jusqu’à ce que la solution forme une boue. Évitez de congeler solide et utilisez-le en consistance de boue.
- Préparation du réseau de microélectrodes
REMARQUE: La surface de contact de l’AEM nécessite un prétraitement pour la rendre hydrophile.- Avant l’expérience, remplissez bien le MEA avec du sérum fœtal bovin (FBS) ou du sérum de cheval (HS) pendant 30 min.
- Retirez le FBS ou le SH et rincez soigneusement le MEA avec environ cinq lavages d’eau distillée jusqu’à ce que l’eau distillée ne soit plus mousseuse. Remplissez le puits avec aCSF, prêt à l’emploi.
- Préparation aiguë de tranches de moelle épinière
REMARQUE: La préparation de tranches de moelle épinière de souris est comme décrit précédemment par Smith et al.2. Idéalement, l’élimination de l’élargissement lombo-sacré ne devrait pas prendre plus de 8 à 10 minutes (étapes 1.3.2 à 1.3.11 ci-dessous).- Anesthésiez profondément la souris avec 100 mg / kg de kétamine (i.p.), puis décapitez-la à l’aide de gros ciseaux chirurgicaux.
- Enlevez la peau sur la région abdominale en faisant une petite coupure dans la peau au niveau des hanches. Tirez la peau de chaque côté de la coupe de manière rostrale jusqu’à ce que toute la peau soit enlevée, c’est-à-dire du haut de la cage thoracique au sommet du bassin (ventrale et dorsale).
- Placez le corps sur la glace et utilisez une approche ventrale pour exposer la colonne vertébrale en enlevant tous les viscères et en coupant à travers les côtes latérales au sternum.
- Retirez la cage thoracique ventrale, les deux omoplates (coupées à environ T2) et les membres inférieurs et le bassin (coupés approximativement au sommet du sacrum).
- Transférer la colonne vertébrale et la préparation des côtes dans un bain de dissection contenant du saccharose glacé aCSF. Épinglez les quatre coins de la préparation (surface ventrale vers le haut) en plaçant des épingles à travers les muscles du bas du dos et les côtes supérieures attachées.
- Enlevez tous les muscles et le tissu conjonctif recouvrant la surface ventrale des vertèbres de rongeurs et identifiez la région vertébrale au-dessus de l’élargissement lombo-sacré, qui se trouve approximativement sous les corps vertébraux T12 à L2.
- Enlevez un corps vertébral qui est caudal à la région d’élargissement lombo-sacré pour donner accès à la moelle épinière car elle se trouve dans le canal vertébral.
- À l’aide de ciseaux à ressort incurvés, coupez les pédicules vertébraux bilatéralement tout en soulevant et en tirant le corps vertébral de manière rostrale pour séparer les aspects ventral et dorsal des vertèbres et exposer la moelle épinière.
- Une fois que les corps vertébraux sont retirés pour révéler l’élargissement lombo-sacré, dégagez soigneusement les racines restantes qui ancrent la moelle épinière avec des ciseaux à ressort jusqu’à ce que la moelle flotte librement.
- Isolez la moelle épinière avec des coupes rostrales et caudales bien au-dessus et au-dessous de l’élargissement lombo-sacré, permettant à la région cible de la moelle osseuse de « flotter librement ».
REMARQUE : L’orientation de tranche préférée déterminera la façon dont le cordon est ensuite monté pour le sectionnement (Figure 1). - Pour les tranches transversales, soulevez le segment lombo-sacré par une racine attachée et placez-le sur un bloc de polystyrène prédécoupé (polystyrène) (1 cm x 1 cm x 1 cm) avec un canal peu profond coupé au centre. Utilisez un adhésif cyanoacrylate (voir la Table des matériaux) pour fixer le bloc et le cordon à la plate-forme de sectionnement et placez-les dans le bain de coupe contenant du saccharose glacé aCSF (boue).
REMARQUE: Le canal peu profond aide à sécuriser et à orienter la moelle épinière, avec la face dorsale exposée et l’extrémité thoracique de la moelle au bas du bloc. - Pour les tranches sagittales, posez une fine ligne d’adhésif cyanoacrylate sur la plate-forme de sectionnement, soulevez l’élargissement lombo-sacré par une racine attachée et placez le cordon le long de la ligne de colle, en veillant à ce qu’une surface latérale soit dans l’adhésif et que l’autre soit orientée vers le haut. Placez-le dans le bain de coupe contenant du saccharose glacé aCSF (boue).
- Pour les tranches horizontales, placez une fine ligne d’adhésif cyanoacrylate sur la plate-forme de sectionnement. Soulevez l’élargissement lombo-sacré par une racine attachée et placez l’élargissement lombo-sacré le long de la ligne d’adhésif, en vous assurant que la surface ventrale est dans l’adhésif et que la surface dorsale est orientée vers le haut. Utilisez des racines attachées pour positionner le cordon. Placez-le dans le bain de coupe contenant du saccharose glacé aCSF (boue).
Figure 1 : Orientations des tranches de moelle épinière, méthodes de montage et de coupe. (A) Les tranches transversales nécessitent un bloc de coupe en polystyrène avec une rainure de support coupée dedans. La moelle épinière est posée contre le bloc dans la rainure de support, la face dorsale de la moelle faisant face au bloc. Le bloc et le cordon sont collés sur une étape de coupe avec de l’adhésif cyanoacrylate. (B) Les tranches sagittales sont préparées en plaçant une fine ligne d’adhésif cyanoacrylate sur l’étape de coupe, puis en positionnant la moelle épinière sur son côté sur la colle. (C) Les tranches horizontales sont préparées en plaçant une fine ligne d’adhésif cyanoacrylate sur la scène de coupe, puis en positionnant la face ventrale de la moelle épinière vers le bas sur la colle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
- Obtenez des tranches de 300 μm d’épaisseur (L1-L5, même épaisseur quelle que soit l’orientation) à l’aide d’un microtome vibrant avec les réglages suivants : vitesse 0,06 mm/s, amplitude 2,50 mm et calibré à ±0,02 degré de déviation d’amplitude de hauteur.
- Transférer les tranches dans une chambre d’incubation d’interface d’air contenant de l’aCSF oxygéné.
- Avant d’enregistrer, laissez les tranches s’équilibrer pendant 1 h à température ambiante (20-24 °C).
- Enregistrements en réseau de microélectrodes
REMARQUE: Les étapes suivantes détaillent comment utiliser les données d’enregistrement d’expériences MEA sur des tranches de moelle épinière. Plusieurs conceptions MEA peuvent être utilisées en fonction de l’expérience. Les détails de conception des MEA utilisés dans ces expériences sont présentés dans Tableau 2 et Graphique 2. Des informations détaillées sur la conception ont été publiées par Egert et al.26 et Thiebaud et coll.27 pour les MEA planaires et 3 dimensions (3D), respectivement. Les deux types MEA sont composés de 60 électrodes en nitrure de titane, avec une couche isolante en nitrure de silicium et des pistes et des coussinets de contact en nitrure de titane.- Configuration expérimentale
- Allumez l’ordinateur et la carte d’interface, puis démarrez le logiciel d’enregistrement.
- Chargez le modèle d’enregistrement pré-assemblé (Figure 3A). Nommez les fichiers de la journée dans l’onglet enregistreur.
- Bulle continue d’aCSF avec du carbogène (5% CO2, 95% O2) pendant toute la durée de l’expérience.
- Allumez le système de perfusion, qui est contrôlé par une pompe péristaltique. Placez la ligne d’entrée dans aCSF et l’extrémité d’entrée dans un bécher à déchets. Amorcer les lignes de perfusion avec aCSF.
- Préparer le 4-AP et toute autre solution médicamenteuse en diluant les bouillons dans 50 mL d’aCSF à la concentration finale requise (p. ex., 200 μM pour le 4-AP).
- Placez les solutions médicamenteuses dans des pots de médicaments et faites-les bouillonner de carbogène.
- Activité 4-AP
- Après l’incubation, transférer une seule tranche de l’incubateur à l’aide d’une pipette Pasteur à grande pointe remplie d’aCSF.
- Placez la tranche dans le puits MEA et ajoutez un aCSF supplémentaire.
- Placez la tranche sur le réseau d’enregistrement à 60 électrodes à l’aide d’un pinceau fin à cheveux courts. Évitez de contacter les électrodes avec le pinceau ou de faire glisser le tissu à travers les électrodes, surtout si vous utilisez des réseaux 3D.
REMARQUE: Selon la disposition MEA, cela peut être fait avec ou sans l’aide d’un microscope pour un positionnement précis. - Après avoir positionné la tranche, placez un filet lesté sur le tissu pour le maintenir en place et favoriser un bon contact avec les électrodes MEA.
REMARQUE : La tranche peut nécessiter un repositionnement après le placement net. - Placez le MEA dans la salle de tête d’enregistrement (Figure 2A,B).
- Vérifiez la position du tissu sur les électrodes à l’aide d’un microscope inversé (grossissement 2x) pour confirmer que le plus grand nombre possible d’électrodes sont sous le DH superficiel (SDH). Assurez-vous qu’au moins 2 à 6 électrodes n’entrent pas en contact avec la tranche, car ces électrodes sont importantes pour soustraire le bruit et enregistrer les artefacts pendant l’analyse (Figure 2E).
- Allumez l’appareil photo, connectez-le à l’appareil et prenez une image de référence de la tranche par rapport à l’AEM pour l’utiliser pendant l’analyse.
- Appuyez sur Démarrer le DAQ dans le logiciel d’enregistrement et vérifiez que toutes les électrodes reçoivent un signal clair.
REMARQUE: Si le signal est bruyant, déclipsez la scène de tête et nettoyez les coussinets de contact MEA et les contacts à ressort en or avec de l’éthanol à 70% (utilisez une lingette de laboratoire pour vous assurer que les tampons et les contacts sont secs après le nettoyage). Si le signal est toujours bruyant, éteignez les électrodes défectueuses dans le logiciel d’enregistrement ou notez l’exclusion plus tard pendant l’analyse. - Fixez les conduites d’entrée et de sortie de perfusion au puits MEA (précédemment rempli d’aCSF) et allumez le système de perfusion. Vérifiez le débit, idéalement 4 à 6 volumes de bain par minute, et assurez-vous que l’écoulement est suffisant pour éviter le débordement du superfusat.
- Laissez le tissu s’équilibrer pendant 5 minutes, puis enregistrez 5 minutes de données de base brutes et non filtrées.
- Déplacez la ligne d’entrée de perfusion de l’aCSF vers une solution 4-AP et attendez 12 min pour que l’activité rythmique induite par le 4-AP atteigne l’état d’équilibre (2 min pour que les médicaments atteignent le bain et 10 min pour que l’activité atteigne son pic puis plafonne).
- Enregistrez 5 min d’activité induite par 4-AP. Préparez-vous à des enregistrements ultérieurs pour tester les médicaments ou pour vérifier la stabilité du 4-AP.
- Configuration expérimentale
| Dispositions des réseaux de microélectrodes | ||||
| Modèle de réseau de microélectrodes | 60MEA 200/30iR-Ti | 60-3DMEA 100/12/40iR-Ti | 60-3DMEA 200/12/50iR-Ti | 60MEA 500/30iR-Ti |
| Planaire ou 3 dimensions (3D) | Planaire | 3D | 3D | Planaire |
| Grille d’électrodes | 8 x 8 | 8 x 8 | 8 x 8 | 6 x 10 |
| Espacement des électrodes | 200 μm | 100 μm | 200 μm | 500 μm |
| Diamètre de l’électrode | 30 μm | 12 μm | 12 μm | 30 μm |
| Hauteur de l’électrode (3D) | N/a | 40 μm | 50 μm | N/a |
| Expériences | Tranche transversale | Tranche transversale | Sagittal + Horizontal | Sagittal + Horizontal |
Tableau 2 : Dispositions des réseaux de microélectrodes.
Figure 2 : Positionnement des tissus sur le réseau de microélectrodes. (A) L’image montre une salle de tête MEA ouverte avec un MEA placé en position. (B) Identique à A avec la scène de tête MEA fermée pour les enregistrements et le système de perfusion tissulaire en place. (C) L’image montre un MEA tel que fourni par le fabricant. Les coussinets de contact, qui interagissent avec les ressorts dorés de la scène de tête, et le bain de tissu MEA qui contient la solution de bain de tissu et la tranche de tissu sont montrés. La zone mise en évidence par le carré rouge au centre est l’emplacement du réseau d’électrodes. (D) Les schémas montrent les deux configurations d’électrodes MEA utilisées dans cette étude, avec plus de détails présentés dans le tableau 2. L’électrode de référence est désignée par le trapèze bleu. La disposition gauche des électrodes MEA montre une configuration carrée à 60 électrodes, utilisée le plus souvent dans les modèles de travail présentés 60MEA200/30iR-Ti avec des électrodes de 30 μm de diamètre espacées de 200 μm, ou des MEAs en 3 dimensions espacées de 200 μm et espacées de 100 μm (60MEA200/12/50iR-Ti et 60MEA100/12/40iR-Ti) avec des électrodes de 12 μm de diamètre et de 50 μm ou 40 μm de haut, respectivement. La disposition gauche de l’électrode MEA montre une disposition rectangulaire de 6 x 10 électrodes -60MEA500/30iR-Ti. (E) Image à fort grossissement d’un MEA carré 60MEA100/12/40iR-Ti avec tranche transversale de la moelle épinière positionnée pour l’enregistrement. La tranche se trouve sur les rangées d’électrodes 3-8. La rangée supérieure d’électrodes, qui n’entre en contact avec aucun tissu, sert d’électrodes de référence. La zone SDH apparaît comme une bande semi-transparente. Dans ce cas, le SDH recouvre les électrodes des lignes 4, 5 et 6 et des colonnes 2, 3, 4, 5 et 7 de l’AEM. Barre d’échelle = 200 μm. Abréviations : MEA = réseau de microélectrodes; SDH = corne dorsale superficielle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
- Modification des tranches
- Après chaque session d’enregistrement, rincez les lignes avec aCSF.
- Retirez le MEA de la scène de tête.
- Retirez bien le filet et le tissu du MEA, rincez-les bien avec de l’aCSF et répétez les étapes ci-dessus avec une nouvelle tranche.
2. Traitement et analyse des données
REMARQUE: Les étapes suivantes détaillent comment utiliser le logiciel d’analyse pour les expériences MEA sur les tranches de moelle épinière. L’une des 60 électrodes sert de référence interne (marquée par un trapèze sur la figure 2 C,D), tandis qu’entre quatre et vingt-cinq des 59 électrodes restantes sont positionnées sous la SDH dans une tranche de moelle épinière de souris adulte. Une analyse ultérieure détecte les formes d’onde du potentiel d’action extracellulaire (EAP) et du potentiel de champ local (LFP) (voir la figure 3B pour des exemples) à partir du signal brut dans cette région.
- Traitement des données brutes
- Ouvrez le logiciel d’analyse et chargez la mise en page d’analyse prédéfinie (Figure 3B).
- Ouvrez le fichier d’intérêt et désélectionnez l’électrode de référence (électrode 15 en 8 x 8 MEA ou électrode E1 en configuration 6 x 10 MEA) et toutes les électrodes jugées excessivement bruyantes.
- Définissez la fenêtre de temps pour l’analyse (0:00 → 5:00 min).
- Accédez à l’onglet Filtre multicouche . Sélectionnez Référence complexe et sélectionnez les électrodes de référence en fonction de l’image prise et des notes prises pendant l’expérience (c.-à-d. les électrodes qui ne se trouvent pas sous les tissus). Pour appliquer et vérifier cela, appuyez sur Explorer avant de continuer.
- Accédez à l’onglet Filtre EAP et appliquez un filtre Butterworth passe-hautde 2 e ordre (coupure de 200 Hz) pour supprimer l’activité LFP.
- Accédez à l’onglet Filtre LFP et appliquez un filtre Butterworth passe-banded’ordre 2 e (fréquences delta de 0,5 à 4 Hz) pour supprimer l’activité EAP.
- Accédez à l’onglet Détecteur EAP et sélectionnez Seuil automatique. Cochez les cases de bord Montant et Descendant et réglez le temps mort sur 0,5 ms.
- Définissez des seuils positifs et négatifs en fonction des données. Inspectez les données en revenant à l’écran de l’analyseur de données brutes, en déplaçant le marqueur temporel, puis en revenant à l’onglet Détecteur EAP et en appuyant sur Explorer. Répétez l’opération jusqu’à ce que vous soyez convaincu que le seuil de détection défini capture les PAE sans capturer le bruit ou l’activité non physiologique. Utilisez les électrodes de référence pour identifier le bruit ou l’activité non physiologique.
REMARQUE: Il est nécessaire de s’assurer qu’un nombre minimal de PAE sont détectés dans les électrodes de référence où l’activité physiologique ne se produira pas. Cependant, de légers écarts dans le niveau de référence pourraient être faussement détectés comme des PAE. Ceci tout en visant à maximiser le nombre d’événements réels détectés dans les électrodes actives. - Accédez à l’onglet Détecteur LFP , sélectionnez le seuil manuel, cochez les cases Bord montant et Descendant et réglez le temps mort sur 3 ms.
- Répétez l’étape 2.1.8 pour une électrode en sélectionnant une électrode avec une activité LFP. Une fois satisfait, sélectionnez Appliquer à tous car les seuils ne seront appliqués qu’à une seule électrode lors de la réalisation d’un seuillage manuel.
- Lors de l’examen des données LFP dans l’onglet Détecteur , notez le nombre maximal de franchissements de seuil pour la forme d’onde LFP et la séparation temporelle maximale des franchissements de seuil pour la forme d’onde LFP unique à utiliser dans une analyse ultérieure.
- Appuyez sur Démarrer l’analyse.
- Une fois l’analyse terminée, accédez à l’onglet Analyseur EAP et exportez les données. Faites de même sous l’onglet Analyseur LFP .
- Répétez ce processus pour tous les autres fichiers de la même tranche.
- Après l’exportation des données, convertissez les fichiers au format xlsx afin qu’ils puissent être lus par le script de programmation utilisé. Nommez les fichiers selon la convention suivante pour que le script fourni puisse les lire : nom de l’expérience (par exemple, données d’échantillon) - numéro de tranche (par exemple, S1) - numéro d’enregistrement (par exemple, R1) - type d’activité (par exemple, pics ou SP, correspondant respectivement aux EAP ou aux LFP).
REMARQUE: L’analyse EAP décrite ici traite le pic de canaux individuels comme une seule population, même si cette activité proviendrait généralement de plusieurs neurones à proximité de l’électrode d’enregistrement. Si le nombre de neurones contribuant aux PAE dans un canal est souhaité, les techniques de tri multipike décrites ailleurs peuvent être appliquées pour distinguer des populations distinctes de pics en fonction des caractéristiques de forme d’onde28.
Figure 3: Dispositions d’outils d’enregistrement et d’analyse de données et exemples d’enregistrements de réseaux de microélectrodes montrant le potentiel d’action extracellulaire et les formes d’onde potentielles du champ local. (A) Schéma montre un modèle d’enregistrement préconfiguré utilisé pour l’acquisition de données MEA. La liaison du MEA2100 et de l’outil d’enregistrement (headstage/amplificateur) permet de nommer et d’enregistrer les données. Quatre exemples de traces de données brutes (à droite, époques de 5 minutes) ont été collectés par un canal MEA montrant l’activité au départ, 12 min après l’application 4-AP, 15 minutes supplémentaires après l’activité 4-AP établie et après l’application de TTX (1 μM). Notez que l’ajout de 4-AP (deuxième trace) produit une nette augmentation du bruit de fond et de l’activité EAP/LFP. Il est important de noter que l’activité reste relativement stable pendant au moins 15 minutes après l’établissement de l’activité induite par le 4-AP (troisième trace). L’ajout de TTX (1 μM) supprime toute activité (trace inférieure). (B) Schéma (à gauche) montre la configuration du logiciel de l’analyseur pour l’analyse des données. L’outil d’exploration de données brutes est utilisé pour importer des enregistrements collectés par un logiciel d’enregistrement. Ces données sont ensuite transmises à un outil de filtrage cross-canal qui soustrait le ou les signaux d’électrodes de référence sélectionnés d’autres électrodes pour éliminer le bruit de fond. Les données passent par le filtre EAP et les outils de filtrage LFP pour optimiser les relations signal-bruit pour chaque forme d’onde. Après cette étape, les données de chemin EAP entrent dans l’outil de détection EAP, où les seuils sont définis. Les PAE sont détectés, puis envoyés à l’outil d’analyse EAP où les latences de chaque événement sont enregistrées et exportées sous forme de txt. lime. Un flux de travail identique se produit pour les données LFP à l’aide d’une boîte à outils LFP correspondante. Les traces droites montrent les données d’un seul canal MEA contenant diverses formes d’onde extracellulaires. L’emplacement des signaux EAP et LFP est mis en évidence dans les « rasters de comptage » ci-dessus. Les traces inférieures sont des époques de l’enregistrement supérieur (désignées par des barres rouges) montrant des formes d’onde sur une échelle de temps étendue, y compris divers signaux LFP (notez la variété des apparences) et des EAP extracellulaires individuels (cercles rouges). Notez que la forme d’onde et la polarité LFP/EAP varient en fonction du nombre de neurones produisant ces signaux, de leur proximité avec l’électrode d’enregistrement et de leur emplacement par rapport à la ou aux électrodes voisines. Abréviations : MEA = réseau de microélectrodes; EAP = potentiel d’action extracellulaire; LFP = potentiel de champ local; 4-AP = 4-aminopyridine; TTX = tétrodotoxine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
- Analyse de synchronicité
NOTE: La synchronicité, ou le nombre d’événements « coïncidents » entre deux électrodes, a été déterminée en utilisant le critère de coïncidence dans la méthode de synchronisation A-SPIKE décrite par Satuvuori et al. 29. Le script utilisé ici ne compare que les électrodes adjacentes les unes aux autres pour l’efficacité (c.-à-d. les voisins horizontaux, verticaux et diagonals); cependant, le script pourrait être réécrit pour comparer toutes les électrodes si nécessaire.- Effectuez une analyse des données à l’aide d’un script de programmation personnalisé, qui extrait les horodatages de latence pour chaque électrode des fichiers .xlsx.
REMARQUE: Cela peut être fait manuellement. - À l’étape 2.1.11, consignez le nombre maximal de franchissements de seuil et la séparation temporelle maximale des franchissements de seuil pour la forme d’onde LFP unique. Modifiez le script d’entrée de ces paramètres définissant LFP pour chaque tranche avant d’exécuter le script.
REMARQUE : Le seuil précédemment effectué dans un logiciel d’analyse capture clairement les PAE comme un événement unique. Cependant, les LFP sont composés d’un nombre variable de pics en fonction de la forme d’onde et du nombre ultérieur de franchissements de seuil par un événement. - Modifiez le script pour saisir les électrodes d’intérêt avant l’analyse.
- Pour déterminer la synchronicité (définie dans le script par des délais modifiables pour que l’activité synchrone se produise à l’intérieur), séparez et analysez les latences extraites pour détecter les événements coïncidents.
REMARQUE : Le script permet de définir la durée maximale entre les événements coïncidents. Ceux-ci sont fixés à 20 ms pour les PAE et à 200 ms pour les PFL. - Exécutez le script pour extraire les horodatages de latence.
REMARQUE : Le fichier de sortie .xlsx contient les interprétations des données de latence, qui sont les comptes EAP et LFP, les fréquences et les comptes d’événements coïncidents pour des électrodes individuelles et des tranches entières. Ces données sont utilisées pour évaluer la fréquence, le nombre d’EAP/LFP, le nombre d’électrodes actives, le nombre d’événements coïncidents, le nombre d’électrodes liées et la force moyenne de ces liaisons.
- Effectuez une analyse des données à l’aide d’un script de programmation personnalisé, qui extrait les horodatages de latence pour chaque électrode des fichiers .xlsx.
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Representative Results
Modèle d’activité du réseau dans la corne dorsale de la moelle épinière
L’application de 4-AP induit de manière fiable une activité rythmique synchrone dans la moelle épinière DH. Cette activité se traduit par une augmentation des PAE et des PFL. Le dernier signal est une forme d’onde à basse fréquence, qui a déjà été décrite dans les enregistrements MEA30. Les changements dans l’activité du PAE et/ou de la LFP après l’application du médicament reflètent une activité neuronale altérée. Des exemples de PAE et de PFL sont présentés à la figure 3B et à la figure 4. L’accent est mis ici sur les paramètres ou caractéristiques suivants des données EAP/LFP : fréquence, nombre total, nombre d’électrodes actives, synchronicité caractérisée par le nombre d’événements coïncidents détectés sur plusieurs électrodes, nombre d’électrodes adjacentes liées et force des liaisons entre les électrodes adjacentes. Les résultats représentatifs sont présentés dans le tableau 3 et la figure 3, la figure 4, la figure 5, la figure 6, la figure 7 et la figure 8. Ils montrent une augmentation significative de tous les paramètres mesurés (tous les p<0,001 par test t apparié ou le test équivalent non paramétrique Wilcoxon Signed-Rank) pour les PAE (Figure 5 et Figure 6) et les LFP (Figure 7 et Figure 8) après une stimulation 4-AP, puis une stabilité relative pour le reste des enregistrements. La normalité des données a été testée avant l’analyse statistique. En résumé, le 4-AP induit une activité EAP et LFP dans la moelle épinière DH, et diverses caractéristiques des données peuvent être extraites des enregistrements MEA. L’activité est reproductible et une grande partie de l’activité, en particulier pour les LFP, est rythmée et synchrone.
| Fonctionnalité d’activité | Ligne de base | 4-Aminopyridine | Différence significative |
| Potentiels d’action extracellulaires (PAE) | |||
| Fréquence | 0,07 ± 0,01 | 0,88 ± 0,09 | p<0,001 |
| Nombre total de pics | 261,41 ± 70,62 | 3289. 57 ± 484,38 | p<0,001 |
| Nombre d’électrodes actives | 2,36 ± 0,34 | 8,95 ± 0,68 | p<0,001 |
| Nombre de pics coïncidents | 9,26 ± 4,01 | 966,94 ± 189,21 | p<0,001 |
| Nombre d’électrodes liées | 2,03 ± 0,42 | 24,06 ± 1,96 | p<0,001 |
| Force des liaisons entre les électrodes | 1,97 ± 0,58 | 29,13 ± 4,60 | p<0,001 |
| Potentiels de terrain locaux (LFP) | |||
| Fréquence | 0,00 ± 0,00 | 0,28 ± 0,03 | p<0,001 |
| Nombre total de pics | 4,79 ± 0,82 | 688,47 ± 121,16 | p<0,001 |
| Nombre d’électrodes actives | 0,41 ± 0,16 | 7,64 ± 0,73 | p<0,001 |
| Nombre de pics coïncidents | 0,43 ± 0,23 | 108,06 ± 278,22 | p<0,001 |
| Nombre d’électrodes liées | 0,24 ± 0,15 | 22,91 ± 2,46 | p<0,001 |
| Force des liaisons entre les électrodes | 0,34 ± 0,19 | 29,20 ± 3,59 | p<0,001 |
Tableau 3 : Activité induite par la 4-aminopyridine. Tous présentés comme des moyens ± SEM.
Figure 4 : Exemple d’activité potentielle d’action extracellulaire de base. Les panneaux montrent l’activité EAP (les enregistrements proviennent de différentes tranches). La plupart des électrodes d’un enregistrement en tranche donnée ne montraient pas l’activité EAP de base (panneau supérieur). Des PAE sporadiques à basse fréquence ont parfois été observés au départ, contenant potentiellement plusieurs formes d’onde de pointe (panneau central). L’activité EAP à haute fréquence a rarement été observée dans les enregistrements au départ (panel inférieur). Les encadrés montrent les PAE individuels des enregistrements correspondants sur une échelle de temps étendue. Abréviation : EAP = potentiel d’action extracellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Orientation de la tranche
Le circuit DH activé par 4-AP est connecté dans les trois dimensions. Ainsi, l’orientation des tranches est une considération importante pour les préparations in vitro . Le tranchage sagittal ou horizontal peut être préférentiel pour observer la signalisation intersegmentaire, tandis que les tranches transversales préservent mieux la connectivité médiolatérale et dorsoventrale. Compte tenu de ces considérations, on peut voir que la stimulation 4-AP induit une activité rythmique similaire dans la SDH, quelle que soit l’orientation de la tranche (voir la figure 9).
Stabilité à long terme de l’activité induite par le 4-AP
La stabilité de l’activité induite par le 4-AP est évidemment cruciale lors de l’étude des effets des médicaments appliqués. Par conséquent, la stabilité des paramètres d’activité induits par le 4-AP a été caractérisée, et cela est présenté à la figure 5, à la figure 6, à la figure 7, à la figure 8 et au tableau 4. Toutes les caractéristiques d’activité, plus la coïncidence de l’activité pour les PFL, étaient stables en fonction de la similitude de l’activité induite par le 4-AP à 12 min après l’application du 4-AP et 15 min plus tard (p>0,05). Les autres caractéristiques de synchronicité LFP, le nombre d’électrodes adjacentes liées et la force de liaison entre les électrodes adjacentes ont diminué en 15 minutes (p = 0,016 et p = 0,033, respectivement), bien que la différence soit modeste. Ce changement progressif pourrait facilement être distingué des actions plus immédiates d’un médicament test au cours des études pharmacologiques (voir ci-dessous). Les données ont été testées pour la distribution normale avant les comparaisons statistiques, puis évaluées à l’aide de tests t appariés ou de tests wilcoxon Signed-Rank non paramétriques, selon le cas.
| Fonctionnalité d’activité | 4-Aminopyridine | 4-Aminopyridine (15 min) | Différence significative |
| Potentiels d’action extracellulaires (PAE) | |||
| Fréquence | 0,8 ± 0,13 | 0,85 ± 0,10 | p>0,05 (pas de dif.) |
| Nombre total de pics | 2706,36 ± 510,96 | 2838,09 ± 447,73 | p>0,05 (pas de dif.) |
| Nombre d’électrodes actives | 9,32 ± 0,70 | 10,09 ± 0,56 | p>0,05 (pas de dif.) |
| Nombre de pics coïncidents | 1037,63 ± 306,84 | 1013,09 ± 269,80 | p>0,05 (pas de dif.) |
| Nombre d’électrodes liées | 22.00 ± 3.37 | 22,41 ± 2,56 | p>0,05 (pas de dif.) |
| Force des liaisons entre les électrodes | 30,44 ± 6,27 | 31,88 ± 7,68 | p>0,05 (pas de dif.) |
| Potentiels de terrain locaux (LFP) | |||
| Fréquence | 0,25 ± 0,03 | 0,17 ± 0,03 | p>0,05 (pas de dif.) |
| Nombre total de pics | 792,32 ± 155,83 | 546,32 ± 120,93 | p>0,05 (pas de dif.) |
| Nombre d’électrodes actives | 9,50 ± 1,11 | 7,86 ± 1,00 | p>0,05 (pas de dif.) |
| Nombre de pics coïncidents | 1631,27 ± 734,77 | 1073,00 ± 490,85 | p>0,05 (pas de dif.) |
| Nombre d’électrodes liées | 26,68 ± 4,58 | 20,95 ± 3,68 | p<005 |
| Force des liaisons entre les électrodes | 33 h 35 ± 6 h 19 | 24,81 ± 5,41 | p<005 |
Tableau 4 : Stabilité de l’activité de la 4-aminopyridine. Tous présentés comme des moyens ± SEM.
Étude pharmacologique des caractéristiques d’activité
Pour démontrer que l’activité induite par le 4-AP enregistrée dans la MEA se prête facilement à des manipulations pharmacologiques, la dépendance de ces signaux à la décharge potentielle d’action a été mise en évidence. L’application en bain de l’antagoniste des canaux sodiques voltage-dépendants, la tétrodotoxine (TTX, 1 μM), a aboli l’activité EAP et LFP, confirmant la dépendance à ces signaux. Des exemples de traces sont illustrés à la figure 3A. Ce résultat fournit également un exemple de l’utilité de la préparation pour de futures investigations pharmacologiques, où de nouveaux composés et des analgésiques établis peuvent être évalués pour leur action dans les circuits DH rachidiens activés. Enfin, pour mieux comprendre la pertinence de l’activation 4-AP des réseaux DH, une approche alternative a été testée pour parvenir à une dépolarisation modeste du réseau DH. Dans cette approche, une solution de FSCa à teneur élevée en potassium (4,5 mM) (tableau 1) a été appliquée par bain et il a été démontré qu’elle évoquait une réponse similaire de la DH à la stimulation du 4-AP. Cette manipulation évoquait une activité LFP qui présentait les mêmes caractéristiques synchrones que les réponses induites par 4-AP (Figure 10), suggérant un mécanisme et des circuits sous-jacents similaires.
Figure 5 : Exemple d’activité potentielle d’action extracellulaire induite par la 4-aminopyridine. (A) Les diagrammes raster montrent l’activité EAP des canaux actifs, détectée à la ligne de base (en haut) et à deux points temporels (12 min - établis et 27 min) après l’ajout de 4-AP (milieu et bas). Les fenêtres bleues verticales mettent en évidence les périodes d’activité synchrone (latence proche) dans plus de 5 électrodes d’enregistrement. (B) Les groupes d’experts résument l’analyse des cartes d’activité du PAE des données de l’AEM. Le schéma de gauche montre l’orientation de la tranche de moelle épinière par rapport au réseau d’électrodes. Le panneau du milieu gauche résume l’activité à la ligne de base (électrodes actives colorées en rouge) et la fréquence EAP indiquée par un ombrage blanc autour des électrodes actives (l’intensité de l’ombrage indique une activité accrue). Le panneau du milieu droit montre l’activité dans la même tranche après 12 minutes d’exposition à 4 points d’accès. Notez que le nombre d’électrodes actives (rouge) a augmenté avec la fréquence EAP. De plus, la synchronisation entre les électrodes adjacentes est indiquée par des lignes de connexion rouges, produisant une carte d’activité du réseau (l’épaisseur de la ligne indique le degré de similitude EAP entre les électrodes). Le panneau de droite montre l’activité dans la même tranche après 15 minutes supplémentaires d’exposition 4-AP. Notez que le nombre d’électrodes actives (rouge), le degré d’activité EAP (blanc) et la structure du réseau (lignes rouges) sont restés stables au cours de cette période. Abréviations : 4-AP = 4-aminopyridine ; EAP = potentiel d’action extracellulaire; MEA = réseau de microélectrodes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Résumé des données de groupe de l’activité potentielle d’action extracellulaire induite par la 4-aminopyridine. (A-F) Graphiques de données de groupe résumant les propriétés du PAE de plusieurs expériences identiques aux données du PAE présentées à la figure 4 (données également résumées dans les tableaux 3 et 4). La fréquence EAP (A), le nombre (B), les événements coïncidents (C), les électrodes actives (D), les électrodes liées (E) et la force de liaison moyenne (F) ont augmenté après l’application de 4-AP dans le bain et ont ensuite été stables pendant 15 minutes après l’établissement de l’activité induite par le 4-AP. Les données proviennent de 11 expériences (les données en rouge proviennent de l’expérience de la figure 5). Abréviations : 4-AP = 4-aminopyridine ; EAP = potentiel d’action extracellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Activité potentielle locale du champ induite par la 4-aminopyridine. Les données sont présentées comme à la figure 5, à l’exception des données LFP. (A) Les diagrammes raster montrent l’activité LFP de plusieurs canaux, détectée à la ligne de base (en haut) et à deux points temporels (12 min - établi et 27 min) après l’ajout de 4-AP (milieu et bas). Les fenêtres bleues verticales mettent en évidence les périodes d’activité synchrone (latence proche) dans plus de 5 électrodes d’enregistrement. (B) Les panels résument l’analyse de la carte d’activité LFP des données de l’AEM. Le schéma de gauche montre l’orientation de la tranche de moelle épinière par rapport au réseau d’électrodes. Le panneau du milieu gauche résume l’activité au niveau de base (électrodes actives de couleur rouge), avec une fréquence LFP minimale indiquée par un ombrage blanc autour des électrodes actives (l’intensité de l’ombrage indique une activité accrue). Le panneau du milieu droit montre l’activité dans la même tranche après 12 minutes d’exposition à 4 points d’accès. Le nombre d’électrodes actives (rouge) et la fréquence LFP sont considérablement augmentés. En outre, la synchronisation entre les électrodes adjacentes (lignes de connexion rouges) montre une carte de réseau forte de l’activité LFP (l’épaisseur de la ligne indique le degré de similitude entre les électrodes). Le panneau de droite montre l’activité LFP dans la même tranche après 15 minutes supplémentaires d’exposition 4-AP. Notez que le nombre d’électrodes actives (rouge), le degré d’activité LFP (blanc) et la structure du réseau (lignes rouges) sont relativement stables au cours de cette période. Abréviations : 4-AP = 4-aminopyridine ; MEA = réseau de microélectrodes; LFP = potentiel de champ local. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Résumé des données de groupe de l’activité potentielle locale du champ induite par la 4-aminopyridine. (A-F) Diagrammes de données de groupe résumant les propriétés de la LFP de plusieurs expériences identiques aux données du PAE présentées à la figure 7 (données également résumées dans les tableaux 3 et 4). La fréquence LFP (A), le nombre (B), les événements coïncidents (C) et les électrodes actives (D) étaient stables pendant 15 minutes après le pic de l’effet 4-AP (les données en rouge proviennent de l’expérience de la figure 7). Cependant, les électrodes liées (E) et la force moyenne de liaison LFP (F) ont diminué au fil du temps (p<0,05). Les données proviennent de 11 expériences (les données en rouge proviennent de l’expérience de la figure 7). Abréviations : 4-AP = 4-aminopyridine ; LFP = potentiel de champ local. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 9 : Potentiel d’action extracellulaire induit par la 4-aminopyridine et activité potentielle de champ local dans les tranches sagittales et horizontales. Les panels résument l’activité EAP et LFP dans l’analyse cartographique du réseau MEA de la signalisation induite par le 4-AP dans les tranches sagittales (A) et horizontales (B) de la moelle épinière. Les schémas (à l’extrême gauche) montrent l’orientation des tranches de moelle épinière par rapport aux réseaux d’électrodes rectangulaires. Les cartes du réseau de gauche montrent l’activité EAP et LFP de base dans les tranches de moelle épinière sagittale (A) et horizontale (B) (les électrodes actives sont rouges, la fréquence indiquée par l’intensité de l’ombrage blanc et la synchronisation entre les électrodes adjacentes par des lignes de connexion rouges avec une épaisseur indiquant le degré de synchronisation). Les cartes du réseau de droite montrent l’activité EAP et LFP dans la même tranche après 12 minutes d’exposition 4-AP dans les tranches sagittales (A) et horizontales (B) de la moelle épinière. Notez l’augmentation substantielle du nombre d’électrodes actives, de la fréquence d’activité et de la synchronisation de ces signaux après une exposition à 4 points d’accès, démasquant les réseaux dans les deux orientations de tranche. Abréviations : MEA = réseau de microélectrodes; EAP = potentiel d’action extracellulaire; LFP = potentiel de champ local; 4-AP = 4-aminopyridine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 10 : Activité potentielle locale élevée induite par le potassium (K+) induite par le potassium. Les panels résument une activité LFP élevée induite par K+ (4,5 mM) induite par l’aCSF. (A) Exemple de traces d’un canal MEA au départ et après l’ajout en bain d’un K+ aCSF élevé (époques de 5 minutes). L’élévation de la concentration de K+ a produit une activité LFP claire qui était absente au départ, semblable à celle observée avec l’application de 4-AP (figure 3). L’encart montre une forme d’onde LFP sur une échelle de temps étendue. (B) Les panels résument l’activité du réseau LFP induite par un K+ aCSF élevé. Le schéma de gauche montre l’orientation des tranches de moelle épinière par rapport aux réseaux d’électrodes carrées. Les cartes réseau comparent l’activité LFP évoquée par K+ de base et élevée (électrodes actives rouges, fréquence indiquée par intensité d’ombrage blanc et synchronisation entre électrodes adjacentes par lignes de connexion rouges avec une épaisseur indiquant un degré de synchronisation). Notez l’augmentation substantielle du nombre d’électrodes actives, de la fréquence d’activité et de la synchronisation de ces signaux après une exposition élevée au K+ aCSF, démasquant le réseau sous-jacent de la même manière que 4-AP. Abréviations: aCSF = liquide céphalo-rachidien artificiel; MEA = réseau de microélectrodes; EAP = potentiel d’action extracellulaire; LFP = potentiel de champ local; 4-AP = 4-aminopyridine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Malgré l’importance de la DH spinale dans la signalisation nociceptive, le traitement et les réponses comportementales et émotionnelles qui en résultent qui caractérisent la douleur, les circuits de cette région restent mal compris. L’un des principaux défis dans l’étude de cette question a été la diversité des populations de neurones qui composent ces circuits 6,31,32. Les progrès récents des technologies transgéniques, menés par l’optogénétique et la chimiogénétique, commencent à démêler ces connexions importantes et à définir les microcircuits qui traitent l’information sensorielle 1,2,3,4,8,9,10,11,12,13,14 . Concilier la façon dont ces microcircuits se réunissent pour façonner l’activité dans de plus grands réseaux de neurones DH reste difficile, en particulier pour développer de nouveaux traitements de la douleur plus efficaces. Ici, un modèle fonctionnel de l’activité DH surveillé sur les MEA et utilisant l’activité rythmique stimulée par 4-AP pour étudier la connectivité réseau plus large est décrit. Ce modèle révèle des pics extracellulaires locaux (PAE) et des LFP plus importants basés sur le réseau, qui dépendent de la décharge potentielle d’action et peuvent être utilisés pour cartographier les changements dans les propriétés du réseau. En combinant l’utilisation des MEA pour faciliter l’étude des circuits et du 4-AP pour découvrir les circuits sous-jacents, cette préparation permet d’étudier la fonction du circuit DH à un niveau régional ou « macroscopique ».
Les avantages du modèle de tranche de moelle épinière MEA/4-AP comprennent un contrôle expérimental strict d’une préparation in vitro , qui se prête à une étude pharmacologique détaillée et fournit une résolution spatiale et temporelle élevée de l’activité neuronale individuelle, c’est-à-dire des EAP et des LFP dans une grande région tissulaire et des données multicanaux qui peuvent évaluer la signalisation à travers les réseaux et les régions. Il est important de noter que l’activité rythmique induite par le 4-AP est fiable, reproductible et peut être étudiée dans différentes orientations de tranches de moelle épinière. Cette préparation aide à combler le fossé entre les investigations sur une seule cellule et les études sur des animaux entiers et peut révéler des changements dans ces circuits dans des conditions normales et pathologiques. Les effets de divers médicaments sur l’activité du réseau peuvent également être déterminés. Ainsi, cette plateforme pourrait servir d’outil de dépistage pour étudier les actions des analgésiques existants et nouveaux sur les circuits DH.
Ce protocole comporte plusieurs étapes critiques. Tout d’abord, une préparation minutieuse des tissus est essentielle pour produire des tranches viables pour les expériences et sensibles au 4-AP, quelle que soit l’orientation de la tranche. Un certain nombre de ressources sont mises en évidence ici qui fournissent des informations détaillées et des conseils de dépannage. En bref, la précision dans la fabrication des solutions, la dissection rapide mais méticuleuse de la moelle épinière, les paramètres de tranchage optimisés pour minimiser la compression et les dommages tissulaires et le soin lors du transfert des tranches en tout point sont tous des facteurs importants dans la phase de préparation. Une manipulation prudente des MEA, en particulier lorsqu’ils sont à proximité des électrodes, est essentielle pour maintenir la fonction de ces composants. La position optimale du DH sur le nombre maximal d’électrodes MEA est importante pour augmenter le rendement d’enregistrement de chaque expérience. Lors de l’utilisation de MEA 3D, plus de soin et de pratique sont nécessaires, en particulier lors du positionnement et du retrait des tranches. Il est facile de faire glisser le tissu à travers des électrodes MEA saillantes et de compromettre l’utilisation future.
Il y a quelques mises en garde à l’approche décrite ici. Contrairement aux enregistrements unicellulaires, où l’identité des neurones étudiés peut être déterminée à l’aide d’un marquage génétique ou d’un immunomarquage post-hoc, la source exacte des signaux électriques détectés par les MEA ne peut pas être déterminée. Un autre défi est le niveau d’activité de base dans les tranches de moelle épinière. Bien que certains rapports décrivent des neurones DH toniquement actifs au départ, les travaux les plus récents concernent le tissu néonatal jeune33,34. De plus, l’activité tonique rapportée dans les tissus adultes est généralement enregistrée à l’aide d’une stratégie de recherche où les électrodes sont avancées pour d’abord identifier puis étudier cette activité35. Lorsqu’une approche d’échantillonnage non biaisée est utilisée, établissant un enregistrement avant d’évaluer l’activité, moins de 20% des neurones DH adultes présentent un pic continu (enregistrements 28/150), et une décharge régulière n’a été observée que dans 2% de ces cellules (3/150)36.
Compte tenu de ce rapport et de la nature fixe des électrodes par rapport à une tranche de tissu, il n’est pas surprenant que peu d’électrodes MEA (~ 2 électrodes / tranche dans ces MEA) présentent une activité au départ. Ce manque d’activité est la principale raison pour laquelle la méthode décrite ici consiste à stimuler des tranches avec 4-AP pour améliorer les PAE et évoquer l’activité LFP. Cette approche est basée sur l’utilisation du 4-AP pour activer l’activité du circuit rythmique dans de nombreuses préparations in vitro, de l’étude des mécanismes épileptiformes dans le cortex et l’hippocampe à l’activité locomotrice fictive dans la corne ventrale de la moelle épinière 37,38,39. Une vaste littérature souligne également que le 4-AP induit une activité confinée aux circuits superficiels de DH dans les tranches de la colonne vertébrale et dépend de la transmission synaptique excitatrice et inhibitrice ainsi que des synapses électriques 20,21,22. De plus, l’administration in vivo de 4-AP produit une augmentation dose-dépendante des champs réceptifs des neurones DH sans altérer les réponses à la stimulation graduée dans la zone réceptive centrale ou provoquer des réponses dégénérées24. Enfin, on peut voir qu’une dépolarisation modeste de ces circuits en élevant la concentration extracellulaire d’ions potassium produit également une activité LFP comparable. Ensemble, ces observations soutiennent l’idée que le 4-AP démasque les réseaux fonctionnellement pertinents au sein de la DH superficielle qui peut être étudiée avec les MEA. Enfin, la source exacte de l’activité LFP n’est pas claire, bien que ces formes d’onde soient censées représenter une somme de l’activité détectée à partir de plusieurs neurones entourant une électrode. Ils peuvent se rapporter ou résulter d’une activité d’éclatement dans les neurones ou correspondre à des potentiels synaptiques30. Quelle que soit leur origine, les caractéristiques des LFP peuvent être comparées à l’intérieur et entre les tranches (enregistrements multiples / applications de médicaments), fournissant une lecture précieuse de la fonction de circuit et de réseau.
La nature des préparations de tranches in vitro mérite également d’être prise en compte, avec la perturbation potentielle des circuits neuronaux et des dommages aux cellules à la surface de la tranche. Malgré cela, le tranchage du tissu fournit un accès électrique plus direct aux circuits DH pertinents et un accès pharmacologique ininterrompu. Ces avantages et inconvénients expérimentaux doivent être soigneusement examinés, en mettant l’accent sur l’importance de considérer l’orientation des tranches pour préserver au maximum la connectivité dans les réseaux d’intérêt. Pour la grande majorité des données présentées dans cet article, la propagation médiale-latérale de l’activité dans la corne dorsale et la connectivité intrinsèque des neurones dans cette région sont présentées. Pour étudier la propagation de l’activité rostro-caudale, l’utilisation de tranches sagittales ou horizontales maintient préférentiellement la connectivité entre les segments de la colonne vertébrale, comme le montre la figure 9.
De plus, il est inévitable que la section de la moelle épinière entraîne un certain degré de dommages à la surface des tranches. Minimiser ces dommages revient à la préparation minutieuse des tissus, au tranchage des paramètres - y compris la vitesse d’avancement lente et les oscillations de pales à haute fréquence - et aux solutions et conditions neuroprotectrices au cours de ce processus. Une évaluation détaillée des avantages de différentes conditions pour la santé des tranches de moelle épinière a été publiée précédemment40. Malgré l’impact potentiel de l’intégrité des tranches sur les enregistrements MEA, la cohérence interne des procédures de préparation des tranches garantit que ce facteur a un impact égal sur les résultats d’un ensemble de données. Il convient également de noter que les électrodes MEA sont censées capter les signaux provenant d’environ 30 à 100 μm de la source d’activité. Comme la surface de tranche endommagée est susceptible de couvrir la couche cellulaire supérieure, environ 15-30 μm, les effets des dommages liés au découpage sur les enregistrements MEA peuvent être gérés et atténués pour toujours produire des ensembles de données et des informations précieux sur l’activité du réseau DH15,41.
En résumé, l’approche de tranche de moelle épinière MEA/4-AP décrite ici fournit une plate-forme pour comprendre la connectivité des circuits DH et comment les réseaux qu’ils forment conduisent au traitement de la douleur vertébrale. Il existe également un potentiel d’expansion méthodologique supplémentaire en termes de paramètres d’analyse, de source de stimulation du réseau et de sa capacité à être utilisée comme plate-forme de dépistage pharmacologique ou d’utilisation avec des modèles de douleur pathologique.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par le National Health and Medical Research Council (NHMRC) d’Australie (subventions 631000, 1043933, 1144638 et 1184974 à B.A.G. et R.J.C.) et le Hunter Medical Research Institute (subvention à B.A.G. et R.J.C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-aminopyridine | Sigma-Aldrich | 275875-5G | |
| 100% ethanol | Thermo Fisher | AJA214-2.5LPL | |
| CaCl2 1M | Banksia Scientific | 0430/1L | |
| Carbonox (Carbogen - 95% O2, 5% CO2) | Coregas | 219122 | |
| Curved long handle spring scissors | Fine Science Tools | 15015-11 | |
| Custom made air interface incubation chamber | |||
| Foetal bovine serum | Thermo Fisher | 10091130 | |
| Forceps Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Glucose | Thermo Fisher | AJA783-500G | |
| Horse serum | Thermo Fisher | 16050130 | |
| Inverted microscope | Zeiss | Axiovert10 | |
| KCl | Thermo Fisher | AJA383-500G | |
| Ketamine | Ceva | KETALAB04 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14007-14 | |
| Loctite 454 Instant Adhesive | Bolts and Industrial Supplies | L4543G | |
| MATLAB | MathWorks | R2018b | |
| MEAs, 3-Dimensional | Multichannel Systems | 60-3DMEA100/12/40iR-Ti, 60-3DMEA200/12/50iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in an 8x8 square grid. Electrodes are 12 µm in diameter, 40 µm (100/12/40) or 50 µm (200/12/50) high and equidistantly spaced 100 µm (100/12/40) or 200 µm (200/12/50) apart. |
| MEA headstage | Multichannel Systems | MEA2100-HS60 | |
| MEA interface board | Multichannel Systems | MCS-IFB 3.0 Multiboot | |
| MEA net | Multichannel Systems | ALA HSG-MEA-5BD | |
| MEA perfusion system | Multichannel Systems | PPS2 | |
| MEAs, Planar | Multichannel Systems | 60MEA200/30iR-Ti, 60MEA500/30iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in either a 8x8 square grid (200/30) or a 6x10 rectangular grid (500/30). Electrodes are 30 µm in diameter and equidistantly spaced 200 µm (200/30) or 500 µm (500/30) apart. |
| MgCl2 | Thermo Fisher | AJA296-500G | |
| Microscope camera | Motic | Moticam X Wi-Fi | |
| Multi Channel Analyser software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
| Multi Channel Experimenter software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
| NaCl | Thermo Fisher | AJA465-500G | |
| NaHCO3 | Thermo Fisher | AJA475-500G | |
| NaH2PO4 | Thermo Fisher | ACR207805000 | |
| Rongeurs | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Small spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Sucrose | Thermo Fisher | AJA530-500G | |
| Superglue | cyanoacrylate adhesive | ||
| Tetrodotoxin | Abcam | AB120055 | |
| Vibration isolation table | Newport | VH3048W-OPT | |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 S |
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