Summary
Den kombinerede anvendelse af mikroelektrode array-teknologi og 4-aminopyridininduceret kemisk stimulering til undersøgelse af nociceptiv aktivitet på netværksniveau i rygmarvsdorsalhornet er skitseret.
Abstract
Rollerne og forbindelsen mellem specifikke typer neuroner i rygmarvsdorsalhornet (DH) afgrænses hurtigt for at give et stadig mere detaljeret billede af de kredsløb, der understøtter spinal smertebehandling. Imidlertid forbliver virkningerne af disse forbindelser for bredere netværksaktivitet i DH mindre godt forstået, fordi de fleste undersøgelser fokuserer på aktiviteten af enkelte neuroner og små mikrokredsløb. Alternativt giver brugen af mikroelektrodearrays (MEA'er), som kan overvåge elektrisk aktivitet på tværs af mange celler, høj rumlig og tidsmæssig opløsning af neural aktivitet. Her beskrives brugen af MEA'er med rygmarvsskiver til at studere DH-aktivitet induceret af kemisk stimulerende DH-kredsløb med 4-aminopyridin (4-AP). Den resulterende rytmiske aktivitet er begrænset til den overfladiske DH, stabil over tid, blokeret af tetrodotoxin og kan undersøges i forskellige skiveretninger. Sammen giver dette præparat en platform til at undersøge DH-kredsløbsaktivitet i væv fra naive dyr, dyremodeller af kronisk smerte og mus med genetisk ændret nociceptiv funktion. Desuden kan MEA-optagelser i 4-AP-stimulerede rygmarvsskiver bruges som et hurtigt screeningsværktøj til at vurdere kapaciteten af nye antinociceptive forbindelser til at forstyrre aktiviteten i rygmarven DH.
Introduction
Rollerne af specifikke typer hæmmende og excitatoriske interneuroner i rygmarven DH afdækkes med en hurtig hastighed 1,2,3,4. Sammen udgør interneuroner over 95% af neuronerne i DH og er involveret i sensorisk behandling, herunder nociception. Desuden er disse interneuronkredsløb vigtige for at bestemme, om perifere signaler stiger op i neuroaxisen for at nå hjernen og bidrage til opfattelsen af smerte 5,6,7. Til dato har de fleste undersøgelser undersøgt DH-neuronernes rolle på enten enkeltcelle- eller helorganismeniveau ved hjælp af kombinationer af in vitro intracellulær elektrofysiologi, neuroanatomisk mærkning og in vivo adfærdsmæssig analyse 1,3,8,9,10,11,12,13,14 . Disse tilgange har signifikant fremmet forståelsen af specifikke neuronpopulationers rolle i smertebehandling. Imidlertid forbliver et hul i forståelsen af, hvordan specifikke celletyper og små makrokredsløb påvirker store populationer af neuroner på mikrokredsløbsniveau for efterfølgende at forme dh-output, adfærdsmæssige reaktioner og smerteoplevelsen.
En teknologi, der kan undersøge makrokredsløb eller multicellulær niveaufunktion, er mikroelektrodearrayet (MEA)15,16. MEA'er er blevet brugt til at undersøge nervesystemets funktion i flere årtier17,18. I hjernen har de lettet undersøgelsen af neuronal udvikling, synaptisk plasticitet, farmakologisk screening og toksicitetstest17,18. De kan bruges til både in vitro- og in vivo-applikationer, afhængigt af typen af MEA. Desuden har udviklingen af MEA'er udviklet sig hurtigt, med forskellige elektrodenumre og konfigurationer nu tilgængelige19. En vigtig fordel ved MEA'er er deres evne til samtidig at vurdere elektrisk aktivitet i mange neuroner med høj rumlig og tidsmæssig nøjagtighed via flere elektroder15,16. Dette giver en bredere aflæsning af, hvordan neuroner interagerer i kredsløb og netværk, under kontrolforhold og i nærværelse af lokalt anvendte forbindelser.
En udfordring ved in vitro DH præparater er, at de igangværende aktivitetsniveauer typisk er lave. Her løses denne udfordring i rygmarvs DH-kredsløb ved hjælp af den spændingsstyrede K + kanalblokker, 4-aminopryidin (4-AP), for kemisk at stimulere DH-kredsløb. Dette lægemiddel er tidligere blevet brugt til at etablere rytmisk synkron elektrisk aktivitet i DH af akutte rygmarvsskiver og under akutte in vivo-forhold 20,21,22,23,24. Disse eksperimenter har brugt enkeltcelleplaster og ekstracellulær optagelse eller calciumbilleddannelse til at karakterisere 4-AP-induceret aktivitet 20,21,22,23,24,25. Sammen har dette arbejde demonstreret kravet om excitatorisk og hæmmende synaptisk transmission og elektriske synapser til rytmisk 4-AP-induceret aktivitet. Således er 4-AP-responsen blevet betragtet som en tilgang, der afslører indfødte polysynaptiske DH-kredsløb med biologisk relevans snarere end som et lægemiddelinduceret epifænomen. Desuden udviser 4-AP-induceret aktivitet en lignende responsprofil for smertestillende og antiepileptika som neuropatiske smertetilstande og er blevet brugt til at foreslå nye spinalbaserede analgetiske lægemiddelmål såsom connexiner 20,21,22.
Her beskrives et præparat, der kombinerer MEA'er og kemisk aktivering af spinal DH med 4-AP for at studere dette nociceptive kredsløb på makrokredsløbet eller netværksniveau for analyse. Denne tilgang giver en stabil og reproducerbar platform til undersøgelse af nociceptive kredsløb under naive og neuropatiske 'smertelignende' forhold. Dette præparat er også let anvendeligt til at teste virkningen på kredsløbsniveau af kendte analgetika og til at screene nye analgetika i den hyperaktive rygmarv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Der blev udført undersøgelser på c57Bl/6-mus fra han- og hunmus i alderen 3-12 måneder. Alle eksperimentelle procedurer blev udført i overensstemmelse med University of Newcastles animal care and ethics committee (protokol A-2013-312 og A-2020-002).
1. In vitro elektrofysiologi
- Fremstilling af opløsninger til forberedelse og registrering af rygmarvsskiver
- Kunstig cerebrospinalvæske
BEMÆRK: Kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) anvendes i et grænsefladeinkubationskammer, hvor skiver opbevares, indtil optagelsen påbegyndes og under forsøg som både perfusat og fortyndingsmiddel til lægemidler. Se tabel 1 for den detaljerede sammensætning.
- Kunstig cerebrospinalvæske
| Kemisk | aCSF (mM) | aCSF (g/100 ml) | Saccharose-substitueret aCSF (mM) | Saccharose-substitueret aCSF (g/ 100 ml) | Højt kalium aCSF (mM) | Højt kalium aCSF (g / 100 ml) |
| Natriumchlorid (NaCl) | 118 | 0.690 | - | - | 118 | 0.690 |
| Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) | 25 | 0.210 | 25 | 0.210 | 25 | 0.210 |
| Glukose | 10 | 0.180 | 10 | 0.180 | 10 | 0.180 |
| Potasiumchlorid (KCl) | 2.5 | 0.019 | 2.5 | 0.019 | 4.5 | 0.034 |
| Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4) | 1 | 0.012 | 1 | 0.012 | 1 | 0.012 |
| Magnesium clorid (MgCl2) | 1 | 0.01 | 1 | 0.01 | 1 | 0.01 |
| Calciumchlorid (CaCl2) | 2.5 | 0.028 | 2.5 | 0.028 | 2.5 | 0.028 |
| Saccharose | - | - | 250 | 8.558 | - | - |
Tabel 1: Kunstige sammensætninger af cerebrospinalvæske. Forkortelse: aCSF = kunstig cerebrospinalvæske.
- Der fremstilles aCSF indeholdende (i mM) 118 NaCl, 25 NaHCO3, 10 glucose, 2,5 KCl, 1 NaH2PO4, 1 MgCl2 og 2,5 CaCl2 ved tilsætning af de krævede mængder af ovenstående, undtagen CaCl2, til 2 liter destilleret vand.
- Bobler ovenstående opløsning med carbogen (95% O2, 5% CO2) i 5 min og tilsæt CaCl2.
BEMÆRK: Dette trin forhindrer CaCl2 nedbør, dvs. opløsningen bør ikke blive overskyet. Til lægemiddelanvendelse under forsøg fortyndes lægemiddelbestandopløsningerne i aCSF til ønskede slutkoncentrationer.
- Saccharose-substitueret kunstig cerebrospinalvæske
BEMÆRK: Saccharose-substitueret aCSF anvendes under dissektion og rygmarvsskæring. Som angivet med navnet erstattes saccharose med NaCl for at reducere neuronal excitation under disse procedurer, samtidig med at osmolariteten opretholdes. Se tabel 1 for den detaljerede sammensætning.- Der fremstilles saccharosesubstitueret aCSF indeholdende (i mM) 250 saccharose, 25 NaHCO3, 10 glucose, 2,5 KCl, 1 NaH2PO4, 1 MgCl2 og 2,5 CaCl2 ved tilsætning af de krævede mængder af alle ovennævnte, undtagen CaCl2, til 300 ml destilleret vand.
- Boble opløsningen med carbogen i 5 min og tilsæt derefter CaCl2.
- Opløsningen opbevares i en -80 °C fryser i ca. 40 min., eller indtil opløsningen danner en opslæmning. Undgå at fryse fast og brug det, mens det er i gyllekonsistens.
- Forberedelse af mikroelektrode array
BEMÆRK: MEA's kontaktflade kræver en forbehandling for at gøre den hydrofil.- Før forsøget fyldes MEA-brønden med enten føtalt bovint serum (FBS) eller hesteserum (HS) i 30 minutter.
- Fjern FBS eller HS, og skyl MEA grundigt med ca. fem vaske destilleret vand, indtil det destillerede vand ikke længere er skummende. Fyld brønden med aCSF, klar til brug.
- Akut forberedelse af rygmarvsskive
BEMÆRK: Muses rygmarvsskivepræparat er som tidligere beskrevet af Smith et al.2. Ideelt set bør fjernelse af lumbosakral udvidelsen ikke tage mere end 8-10 minutter (trin 1.3.2-1.3.11 nedenfor).- Bedøv musen dybt med 100 mg/kg ketamin (i.p.) og halshug den derefter ved hjælp af store kirurgiske sakse.
- Fjern huden over maveregionen ved at lave et lille snit i huden på hofteniveau. Træk huden på hver side af snittet rostralt, indtil hele huden er fjernet, dvs. fra toppen af brystkassen til toppen af bækkenet (både ventralt og dorsalt).
- Placer kroppen på is og brug en ventral tilgang til at udsætte rygsøjlen ved at fjerne alle indvolde og skære gennem ribbenene lateralt til brystbenet.
- Fjern den ventrale brystkasse, både scapulae (afskåret ved ca. T2) og underekstremiteterne og bækkenet (afskåret ca. øverst på korsbenet).
- Hvirvelsøjlen og ribbenpræparatet overføres til et dissekeringsbad indeholdende iskold saccharose aCSF. Fastgør alle fire hjørner af præparatet (ventral overflade opad) ved at placere stifter gennem nedre rygmuskler og de vedhæftede øvre ribben.
- Fjern alt muskel- og bindevæv, der ligger over hvirvlernes ventrale overflade med rongeurs, og identificer hvirvelområdet over lumbosakralforstørrelsen, som ligger omtrent under T12 til L2 hvirvellegemer.
- Fjern en hvirvellegeme, der er kaudal til lumbosakralforstørrelsesområdet for at give adgang til rygmarven, da den sidder i hvirvelkanalen.
- Brug buet fjedersaks til at skære gennem hvirvelpediklerne bilateralt, mens du løfter og trækker hvirvellegemet rostralt for at adskille de ventrale og dorsale aspekter af hvirvlerne og udsætte rygmarven.
- Når hvirvellegemerne er fjernet for at afsløre lumbosakralforstørrelsen, skal du forsigtigt fjerne de resterende rødder, der forankrer rygmarven med fjedersaks, indtil ledningen flyder fri.
- Isoler rygmarven med rostrale og kaudale snit langt over og under lumbosakralforstørrelsen, så målområdet af ledningen kan 'flyde frit'.
BEMÆRK: Den foretrukne udsnitsretning bestemmer, hvordan ledningen efterfølgende monteres til sektionering (figur 1). - For tværgående skiver løftes lumbosakralsegmentet med en vedhæftet rod og placeres på en forskåret polystyrenblok (styrofoam) (1 cm x 1 cm x 1 cm) med en lav kanal skåret i midten. Brug cyanoacrylatklæbemiddel (se materialetabellen) til at fastgøre blokken og ledningen til sektionsplatformen og placere den i skærebadet, der indeholder iskold saccharose aCSF (gylle).
BEMÆRK: Den lave kanal hjælper med at sikre og orientere rygmarven, med den dorsale side udsat og thoraxenden af ledningen i bunden af blokken. - Til sagittale skiver skal du lægge en tynd linje cyanoacrylatklæbemiddel på sektionsplatformen, løfte lumbosakralforstørrelsen med en vedhæftet rod og placere ledningen langs limlinjen og sikre, at den ene laterale overflade er i klæbemidlet og den anden vender opad. Anbring det i skærebadet indeholdende iskold saccharose aCSF (gylle).
- Til vandrette skiver skal du lægge en tynd linje cyanoacrylatklæbemiddel på sektionsplatformen. Løft lumbosakralforstørrelsen med en vedhæftet rod, og placer lumbosakralforstørrelsen langs klæbemiddellinjen, så du sikrer, at den ventrale overflade er i klæbemidlet, og den dorsale overflade vender opad. Brug vedhæftede rødder til at placere ledningen. Anbring det i skærebadet indeholdende iskold saccharose aCSF (gylle).
Figur 1: Rygmarvsskiveretninger, monterings- og skæremetoder. (A) Tværgående skiver kræver en styrofoam skæreblok med en understøttende rille skåret ind i den. Rygmarven hviler mod blokken i støttesporet, den dorsale side af ledningen vender væk fra blokken. Blokken og ledningen limes på et skæretrin med cyanoacrylatklæbemiddel. (B) Sagittale skiver fremstilles ved at placere en tynd linje cyanoacrylatklæbemiddel på skæretrinnet og derefter placere rygmarven på siden på limen. (C) Vandrette skiver fremstilles ved at placere en tynd linje af cyanoacrylatklæbemiddel på skæretrinnet og derefter placere rygmarvens ventrale side nedad på limen. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Opnå 300 μm tykke skiver (L1-L5, samme tykkelse uanset retning) ved hjælp af en vibrerende mikrotom med følgende indstillinger: hastighed 0,06 mm / s, amplitude 2,50 mm og kalibreret til inden for ± 0,02 højdeamplitudeafvigelse.
- Overfør skiverne til et inkubationskammer med luftgrænseflade indeholdende iltet aCSF.
- Før optagelse lades skiverne balancere i 1 time ved stuetemperatur (20-24 °C).
- Mikroelektrode array optagelser
BEMÆRK: Følgende trin beskriver, hvordan du bruger registreringsdata fra MEA-baserede eksperimenter på rygmarvsskiver. Flere MEA-designs kan bruges afhængigt af eksperimentet. Designdetaljer for MEA'er, der anvendes i disse eksperimenter, er vist i Tabel 2 og Figur 2. Detaljerede designoplysninger er blevet offentliggjort af Egert et al.26 og Thiebaud et al.27 for henholdsvis plane og 3-dimensionelle (3D) MEA'er. Begge MEA-typer består af 60 titannitridelektroder med et siliciumnitridisolerende lag og titaniumnitridspor og kontaktpuder.- Eksperimentel opsætning
- Tænd computeren og interfacekortet, og start optagelsessoftwaren.
- Indlæs den færdigmonterede optagelsesskabelon (figur 3A). Navngiv filerne for dagen på optagerfanen.
- Bobler kontinuerligt aCSF med carbogen (5% CO2, 95% O2) i løbet af eksperimentet.
- Tænd perfusionssystemet, som styres af en peristaltisk pumpe. Anbring indløbsledningen i aCSF, og indløbsenden i et affaldsbægerglas. Prime perfusionslinjerne med aCSF.
- Forbered 4-AP og andre lægemiddelopløsninger ved at fortynde lagre i 50 ml aCSF til den krævede endelige koncentration (f.eks. 200 μM for 4-AP).
- Anbring lægemiddelopløsningerne i lægemiddelpotter og boble dem med carbogen.
- 4-AP aktivitet
- Efter inkubation overføres en enkelt skive fra inkubatoren ved hjælp af en Pasteur-pipette med stor spids fyldt med aCSF.
- Placer skiven i MEA-brønden, og tilsæt yderligere aCSF.
- Placer skiven over optagelsesarrayet med 60 elektroder ved hjælp af en fin pensel med kort hår. Undgå at kontakte elektroderne med penslen eller trække vævet hen over elektroderne, især hvis du bruger 3D-arrays.
BEMÆRK: Afhængigt af MEA-layoutet kan dette gøres med eller uden hjælp fra et mikroskop for nøjagtig positionering. - Efter placering af skiven skal du placere et vægtet net over vævet for at holde det på plads og fremme god kontakt med MEA-elektroder.
BEMÆRK: Skiven skal muligvis flyttes efter nettoplacering. - Anbring MEA i optagelseshovedscenen (figur 2A,B).
- Kontroller vævets position over elektroderne ved hjælp af et omvendt mikroskop (2x forstørrelse) for at bekræfte, at så mange elektroder som muligt er under den overfladiske DH (SDH). Sørg for, at mindst 2-6 elektroder ikke kommer i kontakt med skiven, da disse elektroder er vigtige for at trække støj og registrere artefakter under analysen (figur 2E).
- Tænd kameraet, tilslut det til enheden, og tag et referencebillede af udsnittet i forhold til MEA til brug under analysen.
- Tryk på Start DAQ i optagelsessoftwaren, og bekræft, at alle elektroder modtager et klart signal.
BEMÆRK: Hvis signalet er støjende, skal du fjerne hovedscenen og rengøre både MEA-kontaktpuderne og guldfjederkontakterne med 70% ethanol (brug en laboratoriereterviet for at sikre, at puderne og kontakterne er tørre efter rengøring). Hvis signalet stadig er støjende, skal du slukke for de defekte elektroder i optagelsessoftwaren eller notere for udelukkelse senere under analysen. - Fastgør perfusionsindløbs- og udløbsledningerne til MEA-brønden (tidligere fyldt med aCSF), og tænd perfusionssystemet. Kontroller strømningshastigheden, ideelt 4-6 badvolumener i minuttet, og sørg for, at udstrømningen er tilstrækkelig til at forhindre overløb af superfusatet.
- Lad vævet balancere i 5 minutter, og registrer derefter 5 minutters rå, ufiltrerede basisdata.
- Flyt perfusionsindløbslinjen fra aCSF til en 4-AP-opløsning, og vent i 12 minutter på, at den 4-AP-inducerede rytmiske aktivitet når stabil tilstand (2 minutter for lægemidler at nå badet og 10 minutter for aktiviteten at toppe og derefter plateau).
- Optag 5 minutters 4-AP-induceret aktivitet. Vær forberedt på efterfølgende optagelser for at teste stofferne eller for at kontrollere stabiliteten af 4-AP.
- Eksperimentel opsætning
| Layout af mikroelektrode arrays | ||||
| Mikroelektrode array model | 60MEA 200/30iR-Ti | 60-3DMEA 100/12/40iR-Ti | 60-3DMEA 200/12/50iR-Ti | 60MEA 500/30iR-Ti |
| Plan eller 3-dimensionel (3D) | Planar | 3D | 3D | Planar |
| Elektrode gitter | 8 x 8 | 8 x 8 | 8 x 8 | 6 x 10 |
| Elektrodeafstand | 200 μm | 100 μm | 200 μm | 500 μm |
| Elektrode diameter | 30 μm | 12 μm | 12 μm | 30 μm |
| Elektrodehøjde (3D) | Nielsen | 40 μm | 50 μm | Nielsen |
| Eksperimenter | Tværgående udsnit | Tværgående udsnit | Sagittal + vandret | Sagittal + vandret |
Tabel 2: Mikroelektrode array layouts.
Figur 2: Vævspositionering på mikroelektrodearrayet. (A) Billedet viser et åbent MEA-hovedsæt med en MEA placeret på plads. (B) Samme som A med MEA-hovedsæt lukket for optagelser og vævsperfusionssystem på plads. (C) Billedet viser en MEA som leveret af producenten. Kontaktpuder, der interfacer med hovedtagets guldfjedre, og MEA-vævsbadet, der holder vævsbadeopløsningen og vævsskiven, vises. Området fremhævet af den røde firkant i midten er placeringen af elektrodearrayet. (D) Skemaer viser de to MEA-elektrodekonfigurationer, der er anvendt i denne undersøgelse, med yderligere detaljer præsenteret i tabel 2. Referenceelektroden betegnes med den blå trapez. Det venstre MEA-elektrodelayout viser en firkantet konfiguration med 60 elektroder, der anvendes mest i de præsenterede arbejdsmodeller 60MEA200/30iR-Ti med elektroder med en diameter på 30 μm med en indbyrdes afstand på 200 μm eller 200 μm med afstand og 100 μm adskilte 3-dimensionelle MEA'er (60MEA200/12/50iR-Ti og 60MEA100/12/40iR-Ti) med elektroder på 12 μm i diameter og enten 50 μm eller 40 μm høje, henholdsvis. Det venstre MEA-elektrodelayout viser et 6 x 10 elektrode rektangulært layout-60MEA500/30iR-Ti. (E) Billede med høj forstørrelse af en 60MEA100/12/40iR-Ti firkantet MEA med tværgående rygmarvsskive placeret til optagelse. Skiven sidder på elektroderækker 3-8. Den øverste række elektroder, som ikke kommer i kontakt med noget væv, tjener som referenceelektroder. SDH-området vises som et halvgennemsigtigt bånd. I dette tilfælde ligger SDH over elektroder i række 4, 5 og 6 og kolonne 2, 3, 4, 5 og 7 i MEA. Skala bar = 200 μm. Forkortelser: MEA = mikroelektrode array; SDH = overfladisk dorsalhorn. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Ændre udsnit
- Efter hver optagelsessession skylles linjerne med aCSF.
- Fjern MEA fra hovedscenen.
- Fjern nettet og vævet fra MEA-brønden, skyl dem godt med aCSF, og gentag ovenstående trin med en ny skive.
2. Databehandling og -analyse
BEMÆRK: Følgende trin beskriver, hvordan du bruger analysesoftwaren til MEA-eksperimenter på rygmarvsskiver. En af de 60 elektroder tjener som en intern reference (markeret med en trapez i figur 2 C, D), mens mellem fire og femogtyve af de resterende 59 er placeret under SDH i en rygmarvsskive for voksne mus. Efterfølgende analyse detekterer bølgeformer for ekstracellulært aktionspotentiale (EAP) og lokalt feltpotentiale (LFP) (se figur 3B for eksempler) fra det rå signal i dette område.
- Rå databehandling
- Åbn analysesoftwaren, og indlæs det foruddefinerede analyselayout (Figur 3B).
- Åbn filen af interesse, og fravælg referenceelektroden (elektrode 15 i 8 x 8 MEA- eller elektrode E1 i 6 x 10 MEA-konfiguration) og eventuelle elektroder, der anses for at være for støjende.
- Indstil tidsvinduet for analyse (0:00 → 5:00 min).
- Gå til filterfanen på tværs af kanaler. Vælg Kompleks reference , og vælg referenceelektroderne baseret på det billede, der er taget, og noter, der er foretaget under eksperimentet (dvs. de elektroder, der ikke er under væv). For at anvende og kontrollere dette skal du trykke på Udforsk , før du fortsætter.
- Flyt til fanen EAP-filter , og anvend et 2. ordens Butterworth-filter med højt pas (200 Hz afskåret) for at fjerne LFP-aktivitet.
- Flyt til LFP-filterfanen , og anvend et 2. ordens båndpas Butterworth-filter (deltafrekvenser på 0,5-4 Hz) for at fjerne EAP-aktivitet.
- Gå til fanen EAP-detektor, og vælg Automatisk tærskel. Marker kantfelterne Stigende og faldende , og indstil dødtiden til 0,5 ms.
- Indstil positive og negative tærskler baseret på dataene. Undersøg dataene ved at vende tilbage til skærmbilledet Rå dataanalysator , flytte tidsmarkøren og derefter vende tilbage til fanen EAP-detektor og trykke på Udforsk. Gentag, indtil du er sikker på, at den indstillede detektionstærskel fanger EAP'er uden at opfange støj/ikke-fysiologisk aktivitet. Brug referenceelektroderne til at identificere støj/ikke-fysiologisk aktivitet.
BEMÆRK: Det er nødvendigt at sikre, at et minimalt antal EAP'er detekteres i referenceelektroder, hvor fysiologisk aktivitet ikke vil forekomme. Ret små afvigelser i basisscenariet kan dog fejlagtigt påvises som EAP'er. Dette er, mens det stadig sigter mod at maksimere antallet af reelle hændelser, der registreres i de aktive elektroder. - Gå til fanen LFP-detektor, vælg manuel tærskel, marker kantfelterne Stigende og Faldende, og indstil dødtiden til 3 ms.
- Trin 2.1.8 gentages for én elektrode ved at vælge en elektrode med LFP-aktivitet. Når du er opfyldt, skal du vælge Anvend på alle , da tærskler kun vil blive anvendt på en enkelt elektrode, når du foretager manuel tærskel.
- Når du undersøger LFP-data under fanen Detektor , skal du bemærke det maksimale antal tærskelovergange for den ene LFP-bølgeform og den maksimale tidsadskillelse af tærskelkrydsninger for den ene LFP-bølgeform til brug i senere analyse.
- Tryk på Start analyse.
- Når analysen er fuldført, skal du gå til fanen EAP-analysator og eksportere dataene. Gør det samme under fanen LFP-analysator .
- Gentag denne proces for alle andre filer fra det samme udsnit.
- Efter dataeksport skal du konvertere filerne til xlsx-format, så de kan læses af det anvendte programmeringsscript. Navngiv filerne i henhold til følgende konvention for det medfølgende script for at læse dem: eksperimentnavn (f.eks. Prøvedata) - udsnitsnummer (f.eks. S1) - registreringsnummer (f.eks. R1) - aktivitetstype (f.eks. Pigge eller SP'er, svarende til henholdsvis EAP'er eller LFP'er).
BEMÆRK: EAP-analysen, der er beskrevet her, behandler spiking fra individuelle kanaler som en enkelt population, selvom denne aktivitet almindeligvis ville opstå fra flere neuroner i nærheden af optageelektroden. Hvis antallet af neuroner, der bidrager til EAP'er i en kanal, ønskes, kan multispike-sorteringsteknikker, der er beskrevet andetsteds, anvendes til at skelne mellem forskellige populationer af pigge baseret på bølgeformegenskaber28.
Figur 3: Dataregistrerings- og analyseværktøjslayouter og eksempler på mikroelektrode array-optagelser, der viser ekstracellulært handlingspotentiale og lokale feltpotentialebølgeformer. (A) Skematisk viser forudkonfigurerede optagelsesskabeloner, der bruges til erhvervelse af MEA-data. Sammenkædning af MEA2100 og optagelsesværktøjet (headstage/forstærker) gør det muligt at navngive og gemme dataene. Fire eksempler på spor af rådata (højre, 5-min epoker) blev indsamlet af en MEA-kanal, der viser aktivitet ved baseline, 12 minutter efter 4-AP-applikation, yderligere 15 minutter efter etableret 4-AP-aktivitet og efter badpåføring af TTX (1 μM). Bemærk, at tilføjelsen af 4-AP (andet spor) giver en klar stigning i baggrundsstøj og EAP / LFP-aktivitet. Det er vigtigt, at aktiviteten forbliver relativt stabil i mindst 15 minutter efter 4-AP-induceret aktivitet er etableret (tredje spor). Tilsætning af TTX (1 μM) afskaffer al aktivitet (bundspor). (B) Skematisk (til venstre) viser analysatorsoftwarekonfiguration til dataanalyse. Raw data explorer-værktøjet bruges til at importere optagelser indsamlet af optagelsessoftware. Disse data køres derefter gennem et filterværktøj på tværs af kanaler, der trækker det valgte referenceelektrodesignal fra andre elektroder for at fjerne baggrundsstøj. Data passerer gennem EAP-filteret og LFP-filterværktøjerne for at optimere signal-støj-relationer for hver bølgeform. Efter dette trin indtaster EAP-stidataene EAP-detektorværktøjet, hvor tærskler er indstillet. EAP'er registreres og sendes derefter til EAP-analysatorværktøjet, hvor latenserne for hver hændelse registreres og eksporteres som en txt. fil. Der opstår en identisk arbejdsproces for LFP-data ved hjælp af et tilsvarende LFP-værktøjssæt. Højre spor viser data fra en enkelt MEA-kanal, der indeholder forskellige ekstracellulære bølgeformer. Placeringen af EAP- og LFP-signaler er fremhævet i ovenstående 'tæl rasters'. Nedre spor er epoker fra øvre optagelse (betegnet med røde søjler), der viser bølgeformer på en udvidet tidsskala, herunder forskellige LFP-signaler (bemærk de forskellige udseender) og individuelle ekstracellulære EAP'er (røde cirkler). Bemærk, at LFP/EAP-bølgeform og polaritet varierer i forhold til antallet af neuroner, der producerer disse signaler, deres nærhed til optageelektroden og deres placering i forhold til den eller de nærliggende elektroder. Forkortelser: MEA = mikroelektrode array; EAP = ekstracellulært handlingspotentiale; LFP = lokalt feltpotentiale; 4-AP = 4-aminopyridin; TTX = tetrodotoxin. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Analyse af synkronicitet
BEMÆRK: Synkronicitet eller antallet af 'sammenfaldende' hændelser mellem to elektroder blev bestemt ved hjælp af tilfældighedskriteriet inden for A-SPIKE-synkroniseringsmetoden skitseret af Satuvuori et al. 29. Scriptet, der bruges her, sammenligner kun elektroder ved siden af hinanden for effektivitet (dvs. vandrette, lodrette og diagonale naboer); scriptet kunne dog omskrives for at sammenligne alle elektroder, hvis det kræves.- Udfør dataanalyse ved hjælp af et brugerdefineret programmeringsscript, der udtrækker latenstidsstempler for hver elektrode fra .xlsx-filerne.
BEMÆRK: Dette kan gøres manuelt. - I trin 2.1.11 registreres det maksimale antal tærskelovergange og den maksimale tidsadskillelse af tærskelovergange for den ene LFP-bølgeform. Rediger scriptet for at indtaste disse LFP-definerende parametre for hvert udsnit, før scriptet køres.
BEMÆRK: Tærskelværdier, der tidligere er udført i analysesoftware, registrerer klart EAP'er som en enkelt begivenhed. LFP'er består imidlertid af et variabelt antal toppe afhængigt af bølgeformens form og det efterfølgende antal tærskeloverskridelser ved den ene begivenhed. - Rediger scriptet for at indtaste elektroderne af interesse før analyse.
- For at bestemme synkronicitet (defineret i scriptet ved modificerbare tidsrammer for synkron aktivitet, der skal forekomme inden for), skal du adskille og analysere de ekstraherede latenstider for at opdage sammenfaldende begivenheder.
BEMÆRK: Scriptet gør det muligt at indstille den maksimale tid mellem sammenfaldende begivenheder. Disse er fastsat til 20 ms for EAP'er og 200 ms for LFP'er. - Kør scriptet for at udtrække latenstidsstempler.
BEMÆRK: Outputfilen .xlsx indeholder fortolkninger af latensdata, som er EAP- og LFP-tællinger, frekvenser og sammenfaldende hændelsestællinger for individuelle elektroder og hele skiver. Disse data bruges til at vurdere frekvensen, EAP /LFP-tællinger, antal aktive elektroder, antal sammenfaldende hændelser, antal sammenkædede elektroder og den gennemsnitlige styrke af disse forbindelser.
- Udfør dataanalyse ved hjælp af et brugerdefineret programmeringsscript, der udtrækker latenstidsstempler for hver elektrode fra .xlsx-filerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Model af netværksaktivitet i rygmarvsoperandet
Anvendelse af 4-AP inducerer pålideligt synkron rytmisk aktivitet i rygmarven DH. En sådan aktivitet fremstår som øgede EAP'er og ugunstigt stillede områder. Det senere signal er en lavfrekvent bølgeform, som tidligere har været beskrevet i MEA-optagelser30. Ændringer i EAP og / eller LFP-aktivitet efter lægemiddelapplikation afspejler ændret neural aktivitet. Eksempler på EAP'er og LFP'er er vist i figur 3B og figur 4. Fokus her er på følgende parametre eller funktioner i EAP / LFP-dataene: frekvens, samlede antal, aktive elektrodetællinger, synkronicitet som karakteriseret ved antallet af sammenfaldende hændelser detekteret over flere elektroder, antal forbundne tilstødende elektroder og styrken af forbindelser mellem tilstødende elektroder. Repræsentative resultater er vist i tabel 3 og figur 3, figur 4, figur 5, figur 6, figur 7 og figur 8. De viser en signifikant stigning i alle de målte parametre (alle p<0,001 ved parret t-test eller Wilcoxon Signed-Rank ikke-parametrisk ækvivalent test) for både EAP'er (figur 5 og figur 6) og LFP'er (figur 7 og figur 8) efter 4-AP-stimulering og derefter relativ stabilitet for resten af optagelserne. Data blev testet for normalitet forud for statistisk analyse. Sammenfattende inducerer 4-AP EAP- og LFP-aktivitet i rygmarven DH, og forskellige funktioner i dataene kan ekstraheres fra MEA-optagelserne. Aktiviteten er reproducerbar, og meget af aktiviteten, især for LFP'er, er rytmisk og synkron.
| Aktivitet Funktion | Grundlinje | 4-aminopyridin | Væsentlig forskel |
| Ekstracellulære handlingspotentialer (EAP'er) | |||
| Frekvens | 0,07 ± 0,01 | 0,88 ± 0,09 | s<0.001 |
| Samlet antal spidser | 261,41 ± 70,62 | 3289. 57 ± 484,38 | s<0.001 |
| Aktivt elektrodeantal | 2.36 ± 0.34 | 8,95 ± 0,68 | s<0.001 |
| Antal sammenfaldende pigge | 9.26 ± 4.01 | 966,94 ± 189,21 | s<0.001 |
| Antal forbundne elektroder | 2.03 ± 0.42 | 24.06 ± 1.96 | s<0.001 |
| Styrken af forbindelser mellem elektroder | 1,97 ± 0,58 | 29.13 ± 4.60 | s<0.001 |
| Lokale feltpotentialer (LFP'er) | |||
| Frekvens | 0,00 ± 0,00 | 0,28 ± 0,03 | s<0.001 |
| Samlet antal spidser | 4,79 ± 0,82 | 688,47 ± 121,16 | s<0.001 |
| Aktivt elektrodeantal | 0,41 ± 0,16 | 7,64 ± 0,73 | s<0.001 |
| Antal sammenfaldende pigge | 0,43 ± 0,23 | 108.06 ± 278.22 | s<0.001 |
| Antal forbundne elektroder | 0,24 ± 0,15 | 22.91 ± 2.46 | s<0.001 |
| Styrken af forbindelser mellem elektroder | 0,34 ± 0,19 | 29.20 ± 3.59 | s<0.001 |
Tabel 3: 4-aminopyridininduceret aktivitet. Alle præsenteret som midler ± SEM.
Figur 4: Eksempel baseline ekstracellulær aktion potentiel aktivitet. Paneler viser EAP-aktivitet (optagelser er fra forskellige udsnit). De fleste elektroder i en given udsnitsoptagelse viste ikke baseline EAP-aktivitet (øverste panel). Lavfrekvente sporadiske EAP'er blev lejlighedsvis observeret ved baseline, hvilket potentielt indeholdt flere spikebølgeformer (midterpanel). Højfrekvent EAP-aktivitet blev sjældent observeret i optagelser ved baseline (nederste panel). Indsatser viser individuelle EAP'er fra tilsvarende optagelser på en udvidet tidsskala. Forkortelse: EAP = ekstracellulært handlingspotentiale. Klik her for at se en større version af denne figur.
Udsnit retning
DH-kredsløbet aktiveret af 4-AP er forbundet i alle tre dimensioner. Skiveorientering er således en vigtig overvejelse for in vitro-præparater . Sagittal eller vandret udskæring kan være foretrukket at observere intersegmental signalering, mens tværgående skiver bedre bevarer middelmådig og dorsoventral forbindelse. I betragtning af disse overvejelser kan det ses, at 4-AP-stimulering inducerer lignende rytmisk aktivitet i SDH, uanset skiveorientering (se figur 9).
Langsigtet stabilitet af 4-AP-induceret aktivitet
Stabiliteten af 4-AP-induceret aktivitet er naturligvis afgørende, når man studerer virkningerne af anvendte lægemidler. Derfor blev stabiliteten af 4-AP-inducerede aktivitetsparametre karakteriseret, og dette er vist i figur 5, figur 6, figur 7 og figur 8 og tabel 4. Alle aktivitetskarakteristika plus sammenfaldet af aktivitet for LFP'er var stabile baseret på ligheden mellem 4-AP-induceret aktivitet 12 minutter efter 4-AP-applikation og 15 minutter senere (s>0.05). Andre LFP-synkronicitetsegenskaber, antallet af forbundne tilstødende elektroder og koblingsstyrken mellem tilstødende elektroder faldt over 15 minutter (henholdsvis p = 0,016 og p = 0,033), selvom forskellen var beskeden. Denne gradvise ændring kunne let skelnes fra de mere umiddelbare virkninger af et testlægemiddel under farmakologiske undersøgelser (se nedenfor). Data blev testet for normalfordeling før statistiske sammenligninger og derefter vurderet ved hjælp af parrede t-tests eller ikke-parametriske Wilcoxon Signed-Rank-tests efter behov.
| Aktivitet Funktion | 4-aminopyridin | 4-Aminopyridin (15 min) | Væsentlig forskel |
| Ekstracellulære handlingspotentialer (EAP'er) | |||
| Frekvens | 0,8 ± 0,13 | 0,85 ± 0,10 | s>0.05 (ingen dif.) |
| Samlet antal spidser | 2706.36 ± 510.96 | 2838,09 ± 447,73 | s>0.05 (ingen dif.) |
| Aktivt elektrodeantal | 9.32 ± 0,70 | 10.09 ± 0.56 | s>0.05 (ingen dif.) |
| Antal sammenfaldende pigge | 1037,63 ± 306,84 | 1013.09 ± 269.80 | s>0.05 (ingen dif.) |
| Antal forbundne elektroder | 22.00 ± 3.37 | 22.41 ± 2.56 | s>0.05 (ingen dif.) |
| Styrken af forbindelser mellem elektroder | 30.44 ± 6.27 | 31,88 ± 7,68 | s>0.05 (ingen dif.) |
| Lokale feltpotentialer (LFP'er) | |||
| Frekvens | 0,25 ± 0,03 | 0,17 ± 0,03 | s>0.05 (ingen dif.) |
| Samlet antal spidser | 792,32 ± 155,83 | 546,32 ± 120,93 | s>0.05 (ingen dif.) |
| Aktivt elektrodeantal | 9.50 ± 1.11 | 7,86 ± 1,00 | s>0.05 (ingen dif.) |
| Antal sammenfaldende pigge | 1631,27 ± 734,77 | 1073,00 ± 490,85 | s>0.05 (ingen dif.) |
| Antal forbundne elektroder | 26.68 ± 4.58 | 20,95 ± 3,68 | s<0.05 |
| Styrken af forbindelser mellem elektroder | 33.35 ± 6.19 | 24.81 ± 5.41 | s<0.05 |
Tabel 4: 4-Aminopyridin aktivitet stabilitet. Alle præsenteret som midler ± SEM.
Farmakologisk undersøgelse af aktivitetskarakteristika
For at demonstrere, at MEA-registreret 4-AP-induceret aktivitet let kan overføres til farmakologiske manipulationer, blev afhængigheden af disse signaler af handlingspotentialeudladning fremhævet. Badpåføring af den spændingsstyrede natriumkanalantagonist, tetrodotoxin (TTX, 1 μM), afskaffede både EAP- og LFP-aktivitet, hvilket bekræfter spikeafhængighed af disse signaler. Eksempelspor er vist i figur 3A. Dette resultat giver også et eksempel på præparatets anvendelighed til fremtidige farmakologiske undersøgelser, hvor nye forbindelser og etablerede analgetika kan vurderes for deres virkning i aktiverede spinal DH-kredsløb. Endelig, for at kaste yderligere lys over relevansen af 4-AP-aktivering af DH-netværkene, blev der afprøvet en alternativ tilgang for at opnå beskeden depolarisering af DH-netværket. I denne tilgang blev en forhøjet kalium (4,5 mM) aCSF-opløsning (tabel 1) badepåført og vist sig at fremkalde et lignende DH-respons på 4-AP-stimulering. Denne manipulation fremkaldte LFP-aktivitet, der indeholdt de samme synkrone egenskaber som 4-AP-inducerede reaktioner (figur 10), hvilket tyder på en lignende mekanisme og underliggende kredsløb.
Figur 5: Eksempel 4-aminopyridin-induceret ekstracellulær virkning potentiel aktivitet. (A) Rasterdiagrammer viser EAP-aktivitet fra aktive kanaler, detekteret ved baseline (øvre) og to tidspunkter (12 min - etableret og 27 min) efter badtilsætning af 4-AP (mellem og nedre). Lodrette blå vinduer fremhæver perioder med synkron (tæt latenstid) aktivitet i mere end 5 optageelektroder. (B) Panelerne opsummerer analysen af aktivitetskort over EAP'en for MEA-data. Venstre skematisk viser orienteringen af rygmarvsskiven i forhold til elektrodearrayet. Midterste venstre panel opsummerer aktivitet ved baseline (aktive elektroder farvet rød) og EAP-frekvens indikeret ved hvid skygge omkring aktive elektroder (skyggeintensitet angiver øget aktivitet). Midterste højre panel viser aktivitet i samme udsnit efter 12 minutters eksponering med 4 AP. Bemærk, at antallet af aktive elektroder (rød) steg sammen med EAP-frekvensen. Derudover er synkronisering mellem tilstødende elektroder angivet med røde forbindelseslinjer, hvilket producerer et netværkskort over aktivitet (linjetykkelse angiver graden af EAP-lighed mellem elektroder). Højre panel viser aktivitet i samme udsnit efter yderligere 15 minutters 4-AP eksponering. Bemærk, at antallet af aktive elektroder (rød), graden af EAP-aktivitet (hvid) og netværksstrukturen (røde linjer) har været stabil i denne periode. Forkortelser: 4-AP = 4-aminopyridin; EAP = ekstracellulært handlingspotentiale; MEA = mikroelektrode array. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Gruppedataoversigt over 4-aminopyridininduceret ekstracellulær aktionspotentialeaktivitet. (A-F) Gruppedatadiagrammer, der opsummerer EAP-egenskaber fra flere eksperimenter, der er identiske med EAP-dataene præsenteret i figur 4 (data også opsummeret i tabel 3 og tabel 4). EAP-frekvens (A), antal (B), sammenfaldende hændelser (C), aktive elektroder (D), bundne elektroder (E) og gennemsnitlig koblingsstyrke (F) steg efter badpåføring af 4-AP og var derefter stabile i 15 minutter efter etablering af 4-AP-induceret aktivitet. Data er fra 11 eksperimenter (data med rødt er fra eksperimentet i figur 5). Forkortelser: 4-AP = 4-aminopyridin; EAP = ekstracellulært handlingspotentiale. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: 4-Aminopyridin-induceret lokal feltpotentiale aktivitet. Data præsenteres som i figur 5 undtagen LFP-data. (A) Rasterdiagrammer viser LFP-aktivitet fra flere kanaler, detekteret ved baseline (øvre) og to tidspunkter (12 min - etableret og 27 min) efter tilsætning af 4-AP (mellem og nedre). Lodrette blå vinduer fremhæver perioder med synkron (tæt latenstid) aktivitet i mere end 5 optageelektroder. (B) Panelerne opsummerer analysen af LFP-aktivitetskortanalysen af MEA-data. Venstre skematisk viser orienteringen af rygmarvsskiven i forhold til elektrodearrayet. Midterste venstre panel opsummerer aktivitet ved baseline (aktive elektroder farvet rødt) med minimal LFP-frekvens indikeret ved hvid skygge omkring aktive elektroder (skyggeintensitet angiver øget aktivitet). Midterste højre panel viser aktivitet i samme udsnit efter 12 minutters eksponering med 4 AP. Antallet af aktive elektroder (rød) og LFP-frekvens øges væsentligt. Derudover viser synkronisering mellem tilstødende elektroder (røde forbindelseslinjer) et stærkt netværkskort over LFP-aktivitet (linjetykkelse angiver graden af lighed mellem elektroder). Højre panel viser LFP-aktivitet i samme udsnit efter yderligere 15 minutters 4-AP-eksponering. Bemærk, at antallet af aktive elektroder (rød), graden af LFP-aktivitet (hvid) og netværksstrukturen (røde linjer) er relativt stabil i denne periode. Forkortelser: 4-AP = 4-aminopyridin; MEA = mikroelektrode array; LFP = lokalt feltpotentiale. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Gruppedataoversigt over 4-aminopyridininduceret lokal feltpotentialeaktivitet. (A-F) Gruppedatadiagrammer, der opsummerer LFP-egenskaber fra flere eksperimenter, der er identiske med EAP-dataene i figur 7 (data også opsummeret i tabel 3 og tabel 4). LFP-frekvens (A), antal (B), sammenfaldende hændelser (C) og aktive elektroder (D) var stabile i 15 minutter, efter at 4-AP-effekten toppede (data i rødt er fra eksperimentet i figur 7). Imidlertid faldt sammenkædede elektroder (E) og den gennemsnitlige LFP-koblingsstyrke (F) over tid (begge p<0,05). Data er fra 11 eksperimenter (data med rødt er fra eksperimentet i figur 7). Forkortelser: 4-AP = 4-aminopyridin; LFP = lokalt feltpotentiale. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: 4-Aminopyridin-induceret ekstracellulært aktionspotentiale og lokal feltpotentialeaktivitet i sagittale og vandrette skiver. Paneler opsummerer EAP- og LFP-aktivitet i MEA-netværkskortanalyse af 4-AP-induceret signalering i sagittale (A) og vandrette (B) rygmarvsskiver. Skemaer (yderst til venstre) viser orienteringen af rygmarvsskiver i forhold til rektangulære elektrodearrays. Venstre netværkskort viser baseline EAP og LFP aktivitet i sagittal (A) og vandret (B) rygmarvsskiver (aktive elektroder er røde, frekvens angivet med hvid skyggeintensitet og synkronitet mellem tilstødende elektroder ved røde forbindelseslinjer med tykkelse, der angiver graden af synkronisering). Højre netværkskort viser EAP- og LFP-aktivitet i samme skive efter 12 minutters 4-AP-eksponering i sagittale (A) og vandrette (B) rygmarvsskiver. Bemærk den betydelige stigning i antallet af aktive elektroder, aktivitetsfrekvensen og synkroniseringen af disse signaler efter 4-AP-eksponering, demaskeringsnetværk i begge skiveretninger. Forkortelser: MEA = mikroelektrode array; EAP = ekstracellulært handlingspotentiale; LFP = lokalt feltpotentiale; 4-AP = 4-aminopyridin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 10: Forhøjet kalium (høj K+)-induceret lokal feltpotentialeaktivitet. Paneler opsummerer høj K + (4,5 mM) aCSF-induceret LFP-aktivitet. (A) Eksempelspor fra en MEA-kanal ved baseline og efter badtilsætning af høj K+ aCSF (5-min epoker). Forhøjelse af K+ koncentration frembragte klar LFP-aktivitet, der var fraværende ved baseline, svarende til den, der blev set med 4-AP-applikation (figur 3). Indsat viser en LFP-bølgeform på en udvidet tidsskala. (B) Paneler opsummerer LFP-netværksaktivitet induceret af høj K + aCSF. Venstre skematisk viser orientering af rygmarvsskiver i forhold til firkantede elektrodearrays. Netværkskort sammenligner baseline og høj K +-fremkaldt LFP-aktivitet (aktive elektroder rød, frekvens angivet med hvid skyggeintensitet og synkron mellem tilstødende elektroder ved røde forbindelseslinjer med tykkelse, der angiver graden af synkronitet). Bemærk den betydelige stigning i antallet af aktive elektroder, aktivitetsfrekvensen og synkroniseringen af disse signaler efter høj K + aCSF-eksponering, der afslører det underliggende netværk på samme måde som 4-AP. Forkortelser: aCSF = kunstig cerebrospinalvæske; MEA = mikroelektrode array; EAP = ekstracellulært handlingspotentiale; LFP = lokalt feltpotentiale; 4-AP = 4-aminopyridin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På trods af betydningen af spinal DH i nociceptiv signalering, behandling og de resulterende adfærdsmæssige og følelsesmæssige reaktioner, der karakteriserer smerte, forbliver kredsløbene i denne region dårligt forstået. En vigtig udfordring i undersøgelsen af dette problem har været mangfoldigheden af neuronpopulationer, der omfatter disse kredsløb 6,31,32. Nylige fremskridt inden for transgene teknologier, ledet af optogenetik og kemoogenetik, begynder at opklare disse vigtige forbindelser og definere de mikrokredsløb, der behandler sensorisk information 1,2,3,4,8,9,10,11,12,13,14 . At forene, hvordan disse mikrokredsløb kommer sammen for at forme aktivitet i større netværk af DH-neuroner, er fortsat udfordrende, især for at udvikle nye og mere effektive smertebehandlinger. Her beskrives en funktionel model af DH-aktivitet overvåget på MEA'er og ved hjælp af 4-AP-stimuleret rytmisk aktivitet til at studere bredere netværksforbindelse. Denne model afslører lokal ekstracellulær spiking (EAP'er) og større netværksbaserede LFP'er, som afhænger af handlingspotentialeudladning og kan bruges til at kortlægge ændringer i netværksegenskaber. Ved at kombinere brugen af MEA'er til at lette kredsløbsundersøgelse og 4-AP til at afdække de underliggende kredsløb, gør dette præparat det muligt at studere DH-kredsløbsfunktionen på regionalt eller 'makroskopisk' niveau.
Fordelene ved MEA /4-AP rygmarvsskivemodellen inkluderer tæt eksperimentel kontrol af et in vitro-præparat , som er egnet til detaljeret farmakologisk undersøgelse og giver høj rumlig og tidsmæssig opløsning af neural aktivitetsindivid, dvs. EAP'er og LFP'er på tværs af en stor vævsregion og multikanaldata, der kan vurdere signalering på tværs af netværk og regioner. Det er vigtigt, at 4-AP-induceret rytmisk aktivitet er pålidelig, reproducerbar og kan studeres i forskellige rygmarvsskiveretninger. Dette præparat hjælper med at bygge bro mellem enkeltcelle- og heldyrsundersøgelser og kan afsløre ændringer inden for disse kredsløb under både normale og patologiske forhold. Virkningerne af forskellige lægemidler på netværksaktivitet kan også bestemmes. Således kan denne platform fungere som et screeningsværktøj til undersøgelse af handlinger fra eksisterende og nye analgetika på DH-kredsløb.
Der er flere kritiske trin i denne protokol. For det første er omhyggelig vævsforberedelse nøglen til at producere skiver, der er levedygtige til eksperimenter og følsomme over for 4-AP, uanset skiveorientering. En række ressourcer er fremhævet her, der giver detaljerede oplysninger og fejlfindingsrådgivning. Kort sagt er nøjagtighed ved fremstilling af løsninger, hurtig, men omhyggelig dissektion af rygmarven, optimerede udskæringsparametre for at minimere vævskompression og beskadigelse og pleje ved overførsel af skiver på ethvert tidspunkt alle vigtige faktorer i forberedelsesfasen. Omhyggelig håndtering af MEA'er, især når de er tæt på elektroderne, er nøglen til at opretholde disse komponenters funktion. Dh'ens optimale position i forhold til det maksimale antal MEA-elektroder er vigtig for at øge optageudbyttet af hvert eksperiment. Når du bruger 3D MEA'er, kræves der mere omhu og øvelse, især ved placering og fjernelse af skiver. Det er let at trække vævet hen over fremspringende MEA-elektroder og kompromittere fremtidig brug.
Der er nogle forbehold for den tilgang, der er beskrevet her. I modsætning til i enkeltcelleoptagelser, hvor identiteten af neuroner, der undersøges, kan bestemmes ved hjælp af enten genetisk mærkning eller post hoc immunolabeling, kan den nøjagtige kilde til de elektriske signaler, der detekteres af MEA'er, ikke bestemmes. En anden udfordring er niveauet af baseline aktivitet i rygmarvsskiver. Selvom nogle rapporter beskriver tonisk aktive DH-neuroner ved baseline, er det seneste arbejde i ungt neonatalvæv33,34. Desuden registreres tonic aktivitet rapporteret i voksenvæv typisk ved hjælp af en søgestrategi, hvor elektroder avanceres til først at identificere og derefter studere denne aktivitet35. Når der anvendes en upartisk prøveudtagningsmetode, der etablerer registrering før vurdering af aktivitet, udviser mindre end 20% af voksne DH-neuroner løbende spiking (28/150 optagelser), og regelmæssig udledning blev kun observeret i 2% af disse celler (3/150) 36.
I betragtning af dette forhold og elektrodernes faste natur i forhold til en vævsskive er det ikke overraskende, at få MEA-elektroder (~ 2 elektroder / skive i disse MEA'er) udviser aktivitet ved baseline. Denne mangel på aktivitet er den primære årsag til, at metoden beskrevet her involverer stimulering af skiver med 4-AP for at forbedre EAP'er og fremkaldt LFP-aktivitet. Denne tilgang er baseret på brugen af 4-AP til at aktivere rytmisk kredsløbsaktivitet i mange in vitro-præparater, fra at studere epileptiforme mekanismer i cortex og hippocampus til fiktiv lokomotorisk aktivitet i rygmarvens ventrale horn 37,38,39. En omfattende litteratur fremhæver også, at 4-AP inducerer aktivitet begrænset til overfladiske DH-kredsløb i spinalskiver og afhænger af excitatorisk og hæmmende synaptisk transmission samt elektriske synapser 20,21,22. Desuden producerer in vivo 4-AP administration en dosisafhængig stigning i DH neuron modtagelige felter uden at ændre reaktioner på gradueret stimulering i den centrale modtagelige zone eller forårsage degenererede reaktioner24. Endelig kan det ses, at en beskeden depolarisering af disse kredsløb ved at hæve ekstracellulær kaliumionkoncentration også producerer sammenlignelig LFP-aktivitet. Tilsammen understøtter disse observationer det synspunkt, at 4-AP afslører funktionelt relevante netværk inden for den overfladiske DH, der kan studeres med MEA'er. Endelig er den nøjagtige kilde til LFP-aktivitet uklar, selvom disse bølgeformer menes at repræsentere en summation af aktivitet detekteret fra flere neuroner omkring en elektrode. De kan vedrøre eller skyldes sprængningsaktivitet i neuroner eller svare til synaptiske potentialer30. Uanset deres oprindelse kan LFP'ernes egenskaber sammenlignes inden for og mellem skiver (flere optagelser / lægemiddelapplikationer), hvilket giver en værdifuld aflæsning af kredsløb og netværksfunktion.
Arten af in vitro-skivepræparater fortjener også overvejelse med den potentielle forstyrrelse af neuronale kredsløb og beskadigelse af celler på skiveoverfladen. På trods af dette giver udskæring af vævet mere direkte elektrisk adgang til de relevante DH-kredsløb og uafbrudt farmakologisk adgang. Disse eksperimentelle fordele og ulemper bør overvejes nøje med vægt på vigtigheden af at overveje skiveorientering for maksimalt at bevare forbindelsen i de relevante netværk. For langt de fleste data, der præsenteres i dette papir, præsenteres mediale-laterale spredning af aktivitet inden for dorsalhornet og neuronernes iboende forbindelse i denne region. For at undersøge spredning af rostro-kaudal aktivitet opretholder brugen af sagittale eller vandrette skiver fortrinsvis forbindelse mellem spinalsegmenter, som fremhævet i figur 9.
Derudover er det uundgåeligt, at sektionering af rygmarven vil resultere i en vis grad af skade på overfladen af skiver. Minimering af denne skade kommer tilbage til omhyggelig forberedelse af væv, udskæringsparametre - herunder langsom fremskudshastighed og højfrekvente bladoscillationer - og løsninger og tilstande, der er neurobeskyttende under denne proces. En detaljeret vurdering af fordelene ved forskellige betingelser for rygmarvsskivesundhed er tidligere blevet offentliggjort40. Uanset den potentielle indvirkning af udsnitssundhed på MEA-registreringer sikrer intern konsistens i skiveforberedelsesprocedurer, at denne faktor påvirker resultaterne på tværs af et datasæt ligeligt. Det skal også bemærkes, at MEA-elektroder menes at opfange signaler, der opstår ca. 30-100 μm væk fra aktivitetskilden. Da den beskadigede skiveoverflade sandsynligvis vil spænde over det øverste cellelag, ca. 15-30 μm, kan virkningerne af udskæringsrelaterede skader på MEA-optagelser styres og afbødes for stadig at give værdifulde datasæt og indsigt i DH-netværksaktivitet15,41.
Sammenfattende giver MEA / 4-AP rygmarvsskivemetoden, der er beskrevet her, en platform til forståelse af forbindelsen mellem DH-kredsløb, og hvordan de netværk, de danner, driver behandling af rygsmerter. Der er også potentiale for yderligere metodologisk ekspansion med hensyn til analyseparametre, netværksstimuleringskilde og dens kapacitet til at blive brugt som en platform for farmakologisk screening eller anvendelse med modeller af patologisk smerte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af National Health and Medical Research Council (NHMRC) i Australien (tilskud 631000, 1043933, 1144638 og 1184974 til B.A.G. og R.J.C.) og Hunter Medical Research Institute (tilskud til B.A.G. og R.J.C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-aminopyridine | Sigma-Aldrich | 275875-5G | |
| 100% ethanol | Thermo Fisher | AJA214-2.5LPL | |
| CaCl2 1M | Banksia Scientific | 0430/1L | |
| Carbonox (Carbogen - 95% O2, 5% CO2) | Coregas | 219122 | |
| Curved long handle spring scissors | Fine Science Tools | 15015-11 | |
| Custom made air interface incubation chamber | |||
| Foetal bovine serum | Thermo Fisher | 10091130 | |
| Forceps Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Glucose | Thermo Fisher | AJA783-500G | |
| Horse serum | Thermo Fisher | 16050130 | |
| Inverted microscope | Zeiss | Axiovert10 | |
| KCl | Thermo Fisher | AJA383-500G | |
| Ketamine | Ceva | KETALAB04 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14007-14 | |
| Loctite 454 Instant Adhesive | Bolts and Industrial Supplies | L4543G | |
| MATLAB | MathWorks | R2018b | |
| MEAs, 3-Dimensional | Multichannel Systems | 60-3DMEA100/12/40iR-Ti, 60-3DMEA200/12/50iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in an 8x8 square grid. Electrodes are 12 µm in diameter, 40 µm (100/12/40) or 50 µm (200/12/50) high and equidistantly spaced 100 µm (100/12/40) or 200 µm (200/12/50) apart. |
| MEA headstage | Multichannel Systems | MEA2100-HS60 | |
| MEA interface board | Multichannel Systems | MCS-IFB 3.0 Multiboot | |
| MEA net | Multichannel Systems | ALA HSG-MEA-5BD | |
| MEA perfusion system | Multichannel Systems | PPS2 | |
| MEAs, Planar | Multichannel Systems | 60MEA200/30iR-Ti, 60MEA500/30iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in either a 8x8 square grid (200/30) or a 6x10 rectangular grid (500/30). Electrodes are 30 µm in diameter and equidistantly spaced 200 µm (200/30) or 500 µm (500/30) apart. |
| MgCl2 | Thermo Fisher | AJA296-500G | |
| Microscope camera | Motic | Moticam X Wi-Fi | |
| Multi Channel Analyser software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
| Multi Channel Experimenter software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
| NaCl | Thermo Fisher | AJA465-500G | |
| NaHCO3 | Thermo Fisher | AJA475-500G | |
| NaH2PO4 | Thermo Fisher | ACR207805000 | |
| Rongeurs | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Small spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Sucrose | Thermo Fisher | AJA530-500G | |
| Superglue | cyanoacrylate adhesive | ||
| Tetrodotoxin | Abcam | AB120055 | |
| Vibration isolation table | Newport | VH3048W-OPT | |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 S |
References
- Smith, K. M., et al. Calretinin positive neurons form an excitatory amplifier network in the spinal cord dorsal horn. eLife. 8, 49190 (2019).
- Smith, K. M., et al. Functional heterogeneity of calretinin-expressing neurons in the mouse superficial dorsal horn: implications for spinal pain processing. The Journal of physiology. 593 (19), 4319-4339 (2015).
- Boyle, K. A., et al. Defining a spinal microcircuit that gates myelinated afferent input: Implications for tactile allodynia. Cell Reports. 28 (2), 526-540 (2019).
- Browne, T. J., et al. Transgenic cross-referencing of inhibitory and excitatory interneuron populations to dissect neuronal heterogeneity in the dorsal horn. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 32 (2020).
- Graham, B. A., Hughes, D. I. Rewards, perils and pitfalls of untangling spinal pain circuits. Current Opinion in Physiology. 11, 35-41 (2019).
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).
- Hughes, D. I., Todd, A. J. Central nervous system targets: inhibitory interneurons in the spinal cord. Neurotherapeutics. 17 (3), 874-885 (2020).
- Duan, B., et al. Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain. Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).
- Hachisuka, J., Chiang, M. C., Ross, S. E.
- Foster, E., et al. Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch. Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).
- Bourane, S., et al. Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control. Cell. 160 (3), 503-515 (2015).
- Cheng, L., et al. Identification of spinal circuits involved in touch-evoked dynamic mechanical pain. Nature neuroscience. 20 (6), 804-814 (2017).
- Peirs, C., et al. Mechanical allodynia circuitry in the dorsal horn is defined by the nature of the injury. Neuron. 109 (1), 73-90 (2021).
- Huang, J., et al. Circuit dissection of the role of somatostatin in itch and pain. Nature Neuroscience. 21 (5), 707-716 (2018).
- Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2015).
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
- Johnstone, A. F., et al. Microelectrode arrays: a physiologically based neurotoxicity testing platform for the 21st century. Neurotoxicology. 31 (4), 331-350 (2010).
- Stett, A., et al. Biological application of microelectrode arrays in drug discovery and basic research. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 377 (3), 486-495 (2003).
- Xu, L., et al. Trends and recent development of the microelectrode arrays (MEAs). Biosensors and Bioelectronics. 175 (1), 112854 (2020).
- Chapman, R. J., Cilia La Corte, P. F., Asghar, A. U. R., King, A. E. Network-based activity induced by 4-aminopyridine in rat dorsal horn in vitro is mediated by both chemical and electrical synapses. The Journal of Physiology. 587, Pt 11 2499-2510 (2009).
- Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. Epileptiform activity in rat spinal dorsal horn in vitro has common features with neuropathic pain. Pain. 105 (1-2), 327-338 (2003).
- Kay, C. W., Ursu, D., Sher, E., King, A. E. The role of Cx36 and Cx43 in 4-aminopyridine-induced rhythmic activity in the spinal nociceptive dorsal horn: an electrophysiological study in vitro. Physiological Reports. 4 (14), 12852 (2016).
- Jankowska, E., Lundberg, A., Rudomin, P., Sykova, E. Effects of 4-aminopyridine on synaptic transmission in the cat spinal cord. Brain Research. 240 (1), 117-129 (1982).
- Semba, K., Geller, H. M., Egger, M. D. 4-Aminopyridine induces expansion of cutaneous receptive fields of dorsal horn cells. Brain Research. 343 (2), 398-402 (1985).
- Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. Long-range oscillatory Ca2+ waves in rat spinal dorsal horn. European Journal of Neuroscience. 22 (8), 1967-1976 (2005).
- Egert, U., et al. A novel organotypic long-term culture of the rat hippocampus on substrate-integrated multielectrode arrays. Brain Research Protocols. 2 (4), 229-242 (1998).
- Thiebaud, P., De Rooij, N., Koudelka-Hep, M., Stoppini, L. Microelectrode arrays for electrophysiological monitoring of hippocampal organotypic slice cultures. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 44 (11), 1159-1163 (1997).
- Rey, H. G., Pedreira, C., Quiroga, R. Q. Past, present and future of spike sorting techniques. Brain Research Bulletin. 119, 106-117 (2015).
- Satuvuori, E., et al. Measures of spike train synchrony for data with multiple time scales. Journal of Neuroscience Methods. 287, 25-38 (2017).
- Mendis, G. D. C., Morrisroe, E., Reid, C. A., Halgamuge, S. K., Petrou, S. Use of local field potentials of dissociated cultures grown on multi-electrode arrays for pharmacological assays. 38th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 952-956 (2016).
- Hughes, D. I., et al. Morphological, neurochemical and electrophysiological features of parvalbumin-expressing cells: a likely source of axo-axonic inputs in the mouse spinal dorsal horn. The Journal of Physiology. 590 (16), 3927-3951 (2012).
- Peirs, C., Seal, R. P. Neural circuits for pain: recent advances and current views. Science. 354 (6312), 578-584 (2016).
- Li, J., Baccei, M. L. Developmental regulation of membrane excitability in rat spinal lamina I projection neurons. Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2604-2614 (2012).
- Li, J., Baccei, M. L. Pacemaker neurons within newborn spinal pain circuits. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9010-9022 (2011).
- Sandkühler, J., Eblen-Zajjur, A. Identification and characterization of rhythmic nociceptive and non-nociceptive spinal dorsal horn neurons in the rat. Neuroscience. 61 (4), 991-1006 (1994).
- Lucas-Romero, J., Rivera-Arconada, I., Roza, C., Lopez-Garcia, J. A. Origin and classification of spontaneous discharges in mouse superficial dorsal horn neurons. Scientific Reports. 8 (1), 9735-9735 (2018).
- Antonio, L., et al. L. al. In vitro seizure like events and changes in ionic concentration. Journal of Neuroscience Methods. 260, 33-44 (2016).
- Avoli, M., Jefferys, J. G. Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 260, 26-32 (2016).
- Taccola, G., Nistri, A. Low micromolar concentrations of 4-aminopyridine facilitate fictive locomotion expressed by the rat spinal cord in vitro. Neuroscience. 126 (2), 511-520 (2004).
- Mitra, P., Brownstone, R. M. An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse. Journal of Neurophysiology. 107 (2), 728-741 (2012).
- Egert, U., Heck, D., Aertsen, A. Two-dimensional monitoring of spiking networks in acute brain slices. Experimental Brain Research. 142 (2), 268-274 (2002).
