Summary
Het gecombineerde gebruik van micro-elektrode array-technologie en 4-aminopyridine-geïnduceerde chemische stimulatie voor het onderzoeken van nociceptieve activiteit op netwerkniveau in de dorsale hoorn van het ruggenmerg wordt geschetst.
Abstract
De rollen en connectiviteit van specifieke soorten neuronen in de dorsale hoorn van het ruggenmerg (DH) worden in een snel tempo afgebakend om een steeds gedetailleerder beeld te geven van de circuits die ten grondslag liggen aan de verwerking van spinale pijn. De effecten van deze verbindingen voor bredere netwerkactiviteit in de DH blijven echter minder goed begrepen omdat de meeste studies zich richten op de activiteit van enkele neuronen en kleine microcircuits. Als alternatief biedt het gebruik van micro-elektrode arrays (MEA's), die de elektrische activiteit in veel cellen kunnen volgen, een hoge ruimtelijke en temporele resolutie van neurale activiteit. Hier wordt het gebruik van MEA's met muisplakken van het ruggenmerg beschreven om DH-activiteit te bestuderen die wordt geïnduceerd door chemisch stimulerende DH-circuits met 4-aminopyridine (4-AP). De resulterende ritmische activiteit is beperkt tot de oppervlakkige DH, stabiel in de tijd, geblokkeerd door tetrodotoxine, en kan worden onderzocht in verschillende plakoriëntaties. Samen biedt dit preparaat een platform om dh-circuitactiviteit in weefsel van naïeve dieren, diermodellen van chronische pijn en muizen met een genetisch veranderde nociceptieve functie te onderzoeken. Bovendien kunnen MEA-opnames in 4-AP-gestimuleerde ruggenmergplakken worden gebruikt als een snelle screeningtool om het vermogen van nieuwe antinociceptieve verbindingen te beoordelen om de activiteit in het ruggenmerg DH te verstoren.
Introduction
De rollen van specifieke soorten remmende en exciterende interneuronen in het ruggenmerg DH worden in een snel tempo blootgelegd 1,2,3,4. Samen vormen interneuronen meer dan 95% van de neuronen in de DH en zijn ze betrokken bij sensorische verwerking, inclusief nociceptie. Bovendien zijn deze interneuroncircuits belangrijk om te bepalen of perifere signalen de neuroaxis opstijgen om de hersenen te bereiken en bijdragen aan de perceptie van pijn 5,6,7. Tot op heden hebben de meeste studies de rol van DH-neuronen op het niveau van analyse van één cel of het hele organisme onderzocht met behulp van combinaties van in vitro intracellulaire elektrofysiologie, neuroanatomische etikettering en in vivo gedragsanalyse 1,3,8,9,10,11,12,13,14 . Deze benaderingen hebben het begrip van de rol van specifieke neuronpopulaties bij pijnverwerking aanzienlijk verbeterd. Er blijft echter een kloof bestaan in het begrijpen hoe specifieke celtypen en kleine macrocircuits grote populaties neuronen op microcircuitniveau beïnvloeden om vervolgens de output van de DH, gedragsreacties en de pijnervaring vorm te geven.
Een technologie die macrocircuits of meercellige functies kan onderzoeken, is de micro-elektrode array (MEA)15,16. MEAs worden al tientallen jaren gebruikt om de werking van het zenuwstelsel te onderzoeken17,18. In de hersenen hebben ze de studie van neuronale ontwikkeling, synaptische plasticiteit, farmacologische screening en toxiciteitstests vergemakkelijkt17,18. Ze kunnen worden gebruikt voor zowel in vitro als in vivo toepassingen, afhankelijk van het type MEA. Bovendien is de ontwikkeling van MEA's snel geëvolueerd, met verschillende elektrodenummers en configuraties die nu beschikbaarzijn 19. Een belangrijk voordeel van MEA's is hun vermogen om tegelijkertijd elektrische activiteit in veel neuronen te beoordelen met een hoge ruimtelijke en temporele nauwkeurigheid via meerdere elektroden15,16. Dit biedt een bredere uitlezing van hoe neuronen interageren in circuits en netwerken, onder controleomstandigheden en in de aanwezigheid van lokaal toegepaste verbindingen.
Een uitdaging van in vitro DH-preparaten is dat de voortdurende activiteitsniveaus meestal laag zijn. Hier wordt deze uitdaging aangepakt in DH-circuits van het ruggenmerg met behulp van de voltage-gated K + kanaalblokker, 4-aminopryidine (4-AP), om DH-circuits chemisch te stimuleren. Dit medicijn is eerder gebruikt om ritmische synchrone elektrische activiteit vast te stellen in de DH van acute ruggenmergplakken en onder acute in vivo omstandigheden 20,21,22,23,24. Deze experimenten hebben eencellige patch en extracellulaire opname of calciumbeeldvorming gebruikt om 4-AP-geïnduceerde activiteit 20,21,22,23,24,25 te karakteriseren. Samen heeft dit werk de vereiste aangetoond van exciterende en remmende synaptische transmissie en elektrische synapsen voor ritmische 4-AP-geïnduceerde activiteit. De 4-AP-respons wordt dus gezien als een benadering die inheemse polysynaptische DH-circuits met biologische relevantie ontmaskert in plaats van als een door geneesmiddelen geïnduceerd epifenomeen. Bovendien vertoont 4-AP-geïnduceerde activiteit een vergelijkbaar responsprofiel op analgetische en anti-epileptica als neuropathische pijnaandoeningen en is het gebruikt om nieuwe spinale analgetische medicijndoelen voor te stellen, zoals connexinen 20,21,22.
Hier wordt een preparaat beschreven dat MEAs en chemische activering van de spinale DH combineert met 4-AP om deze nociceptieve circuits op macrocircuit of netwerkniveau van analyse te bestuderen. Deze aanpak biedt een stabiel en reproduceerbaar platform voor het onderzoeken van nociceptieve circuits onder naïeve en neuropathische 'pijnachtige' omstandigheden. Deze voorbereiding is ook gemakkelijk toepasbaar om de werking op circuitniveau van bekende analgetica te testen en om nieuwe analgetica in het hyperactieve ruggenmerg te screenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studies werden uitgevoerd op mannelijke en vrouwelijke c57Bl/6 muizen in de leeftijd van 3-12 maanden. Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Animal Care and Ethics Committee van de University of Newcastle (protocollen A-2013-312 en A-2020-002).
1. In vitro elektrofysiologie
- Bereiding van oplossingen voor de bereiding en registratie van ruggenmergsneden
- Kunstmatig hersenvocht
OPMERKING: Kunstmatige hersenvocht (aCSF) wordt gebruikt in een interface-incubatiekamer, waar plakjes worden opgeslagen totdat de opname begint en tijdens experimenten als zowel perfusaat als verdunningsmiddel voor geneesmiddelen. Zie tabel 1 voor de gedetailleerde samenstelling.
- Kunstmatig hersenvocht
| Chemisch | aCSF (mM) | aCSF (g/100 ml) | Sucrose-gesubstitueerde aCSF (mM) | Sucrose-gesubstitueerde aCSF (g/100 ml) | Kaliumrijke aCSF (mM) | Kaliumrijke aCSF (g/100 ml) |
| Natriumchloride (NaCl) | 118 | 0.690 | - | - | 118 | 0.690 |
| Natriumwaterstofcarbonaat (NaHCO3) | 25 | 0.210 | 25 | 0.210 | 25 | 0.210 |
| Glucose | 10 | 0.180 | 10 | 0.180 | 10 | 0.180 |
| Potasiumchloride (KCl) | 2.5 | 0.019 | 2.5 | 0.019 | 4.5 | 0.034 |
| Natriumdiwaterstoffosfaat (NaH2PO4) | 1 | 0.012 | 1 | 0.012 | 1 | 0.012 |
| Magnesium cloride (MgCl2) | 1 | 0.01 | 1 | 0.01 | 1 | 0.01 |
| Calciumchloride (CaCl2) | 2.5 | 0.028 | 2.5 | 0.028 | 2.5 | 0.028 |
| Sacharose | - | - | 250 | 8.558 | - | - |
Tabel 1: Kunstmatige cerebrospinale vloeistofsamenstellingen. Afkorting: aCSF = kunstmatige hersenvocht.
- Bereid aCSF met (in mM) 118 NaCl, 25 NaHCO3, 10 glucose, 2,5 KCl, 1 NaH2PO4, 1 MgCl2 en 2,5 CaCl2 door de vereiste hoeveelheden van het bovenstaande, met uitzondering van CaCl2, toe te voegen aan 2 L gedestilleerd water.
- Bel de bovenstaande oplossing met carbogen (95% O2, 5% CO2) gedurende 5 minuten en voeg CaCl2 toe.
OPMERKING: Deze stap voorkomt caCl2 neerslag, d.w.z. de oplossing mag niet bewolkt worden. Voor medicijntoepassing tijdens experimenten verdunt u de geneesmiddelvoorraadoplossingen in aCSF tot de gewenste eindconcentraties.
- Sucrose-gesubstitueerde kunstmatige hersenvocht
OPMERKING: Sucrose-gesubstitueerde aCSF wordt gebruikt tijdens dissectie en het snijden van het ruggenmerg. Zoals aangegeven door de naam, wordt sucrose vervangen door NaCl om neuronale excitatie tijdens deze procedures te verminderen met behoud van osmolariteit. Zie tabel 1 voor de gedetailleerde samenstelling.- Bereid sucrose-gesubstitueerde aCSF met (in mM) 250 sucrose, 25 NaHCO3, 10 glucose, 2,5 KCl, 1 NaH2PO4, 1 MgCl2 en 2,5 CaCl2 door de vereiste hoeveelheden van al het bovenstaande, met uitzondering van CaCl2, toe te voegen aan 300 ml gedestilleerd water.
- Bel de oplossing gedurende 5 minuten met carbogen en voeg vervolgens CaCl2 toe.
- Bewaar de oplossing in een vriezer van -80 °C gedurende ongeveer 40 minuten of totdat de oplossing een drijfmest vormt. Vermijd het bevriezen van vaste stoffen en gebruik het in drijfmestconsistentie.
- Micro-elektrode array voorbereiding
OPMERKING: Het contactoppervlak van de MEA vereist een voorbehandeling om het hydrofiel te maken.- Vul vóór het experiment de MEA-put gedurende 30 minuten met foetaal runderserum (FBS) of paardenserum (HS).
- Verwijder de FBS of HS en spoel MEA grondig af met ongeveer vijf wasbeurten gedestilleerd water totdat het gedestilleerde water niet meer schuimig is. Vul de put met aCSF, klaar voor gebruik.
- Acute voorbereiding van ruggenmergsneden
OPMERKING: De voorbereiding van het ruggenmergsegment van de muis is zoals eerder beschreven door Smith et al.2. Idealiter zou het verwijderen van de lumbosacrale vergroting niet meer dan 8-10 minuten moeten duren (stappen 1.3.2-1.3.11 hieronder).- Verdoof de muis diep met 100 mg/kg ketamine (i.p.) en onthoofd hem vervolgens met een grote chirurgische schaar.
- Verwijder de huid over de buikstreek door een kleine snee in de huid te maken ter hoogte van de heupen. Trek de huid aan weerszijden van de snee rostrally totdat alle huid is verwijderd, d.w.z. van de bovenkant van de ribbenkast naar de bovenkant van het bekken (zowel ventraal als dorsaal).
- Plaats het lichaam op ijs en gebruik een ventrale benadering om de wervelkolom bloot te leggen door alle ingewanden te verwijderen en door de ribben lateraal naar het borstbeen te snijden.
- Verwijder de ventrale ribbenkast, zowel scapulae (afgesneden bij ongeveer T2) als de onderste ledematen en het bekken (afgesneden aan ongeveer de bovenkant van het heiligbeen).
- Breng de wervelkolom en het ribpreparaat over naar een ontleedbad met ijskoude sucrose aCSF. Pin alle vier de hoeken van het preparaat (ventraal oppervlak naar boven) door pinnen door de onderrugspieren en de bevestigde bovenste ribben te plaatsen.
- Verwijder al het spier- en bindweefsel boven het ventrale oppervlak van de wervels met rongeurs en identificeer het wervelgebied over de lumbosacrale vergroting, die ongeveer onder de T12 tot L2 wervellichamen ligt.
- Verwijder een wervellichaam dat caudaal is naar het lumbosacrale vergrotingsgebied om toegang te bieden tot het ruggenmerg terwijl het in het wervelkanaal zit.
- Snijd met behulp van een gebogen veerschaar bilateraal door de wervelstelen terwijl u het wervellichaam rostrale optilt en trekt om de ventrale en dorsale aspecten van de wervels te scheiden en het ruggenmerg bloot te leggen.
- Zodra de wervellichamen zijn verwijderd om de lumbosacrale vergroting te onthullen, verwijdert u zorgvuldig de resterende wortels die het ruggenmerg verankeren met een veerschaar totdat het koord vrij zweeft.
- Isoleer het ruggenmerg met rostrale en caudale sneden ruim boven en onder de lumbosacrale vergroting, waardoor het doelgebied van het koord 'vrij kan zweven'.
OPMERKING: De voorkeursrichting van het segment bepaalt hoe het snoer vervolgens wordt gemonteerd voor secties (figuur 1). - Voor dwarse plakjes tilt u het lumbosacrale segment op met een aangehechte wortel en plaatst u het op een voorgesneden polystyreenblok (piepschuim) blok (1 cm x 1 cm x 1 cm) met een ondiep kanaal in het midden gesneden. Gebruik cyanoacrylaatlijm (zie de tabel met materialen) om het blok en het koord aan het snijplatform te bevestigen en in het snijbad met ijskoude sucrose aCSF (slurry) te plaatsen.
OPMERKING: Het ondiepe kanaal helpt het ruggenmerg vast te zetten en te oriënteren, met de dorsale kant bloot en het thoracale uiteinde van het koord aan de onderkant van het blok. - Leg voor sagittale plakjes een dunne lijn cyanoacrylaatlijm op het snijplatform, til de lumbosacrale vergroting op door een bevestigde wortel en plaats het koord langs de lijmlijn, zodat het ene laterale oppervlak in de lijm zit en het andere naar boven is gericht. Leg het in het snijbad met ijskoude sucrose aCSF (drijfmest).
- Voor horizontale plakjes legt u een dunne lijn cyanoacrylaatlijm op het snijplatform. Til de lumbosacrale vergroting op door een bevestigde wortel en plaats de lumbosacrale vergroting langs de lijn van lijm, zodat het ventrale oppervlak in de lijm zit en het dorsale oppervlak naar boven is gericht. Gebruik bevestigde wortels om het snoer te positioneren. Leg het in het snijbad met ijskoude sucrose aCSF (drijfmest).
Figuur 1: Oriëntaties van ruggenmergsegmenten, montage- en snijmethoden. (A) Dwarsplakken vereisen een piepschuim snijblok met een ondersteunende groef erin gesneden. Het ruggenmerg rust tegen het blok in de steungroef, de dorsale kant van het koord weg van het blok. Het blok en koord worden met cyanoacrylaatlijm op een snijtrap gelijmd. (B) Sagittale plakjes worden bereid door een dunne lijn cyanoacrylaatlijm op de snijfase te plaatsen en vervolgens het ruggenmerg op zijn kant op de lijm te plaatsen. (C) Horizontale plakjes worden bereid door een dunne lijn cyanoacrylaatlijm op de snijfase te plaatsen en vervolgens de ventrale kant van het ruggenmerg op de lijm te plaatsen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Verkrijg 300 μm dikke plakken (L1-L5, dezelfde dikte ongeacht de oriëntatie) met behulp van een trillende microtoom met de volgende instellingen: snelheid 0,06 mm / s, amplitude 2,50 mm en gekalibreerd tot binnen ±0,02 hoogte amplitudeafwijking.
- Breng de plakjes over naar een incubatiekamer met luchtinterface met zuurstofrijke aCSF.
- Laat de plakjes voor het opnemen 1 uur bij kamertemperatuur (20-24 °C) in evenwicht zijn.
- Micro-elektrode array opnames
OPMERKING: In de volgende stappen wordt beschreven hoe u recordgegevens van op MEA gebaseerde experimenten op ruggenmergsegmenten kunt gebruiken. Afhankelijk van het experiment kunnen verschillende MEA-ontwerpen worden gebruikt. Ontwerpdetails voor MEA's die in deze experimenten worden gebruikt, worden weergegeven in Tabel 2 en Figuur 2. Gedetailleerde ontwerpinformatie is gepubliceerd door Egert et al.26 en Thiebaud et al.27 voor respectievelijk planaire en 3-dimensionale (3D) MEA's. Beide MEA-types zijn samengesteld uit 60 titaniumnitride-elektroden, met een siliciumnitride-isolerende laag en titaniumnitridesporen en contactpads.- Experimentele opstelling
- Schakel de computer en het interfacebord in en start de opnamesoftware.
- Laad de voorgemonteerde opnamesjabloon (figuur 3A). Geef de bestanden voor de dag een naam op het tabblad Recorder.
- Bel aCSF continu met carbogen (5% CO2, 95% O2) voor de duur van het experiment.
- Schakel het perfusiesysteem in, dat wordt geregeld door een peristaltische pomp. Plaats de inlaatlijn in aCSF en het inlaatuiteinde in een afvalbeker. Prime de perfusielijnen met aCSF.
- Bereid 4-AP en andere geneesmiddeloplossingen door voorraden in 50 ml aCSF te verdunnen tot de vereiste eindconcentratie (bijv. 200 μM voor 4-AP).
- Plaats de medicijnoplossingen in medicijnpotten en bubbel ze met carbogen.
- 4-AP activiteit
- Breng na incubatie een enkele plak uit de incubator over met behulp van een Pasteur-pipet met grote punt gevuld met aCSF.
- Plaats het plakje in het MEA-putje en voeg extra aCSF toe.
- Plaats de plak over de opname-array met 60 elektroden met een fijne verfkwast met kort haar. Vermijd contact maken met de elektroden met de kwast of het weefsel over de elektroden slepen, vooral als u 3D-arrays gebruikt.
OPMERKING: Afhankelijk van de MEA-lay-out kan dit worden gedaan met of zonder de hulp van een microscoop voor nauwkeurige positionering. - Nadat u het plakje hebt geplaatst, plaatst u een verzwaard net over het weefsel om het op zijn plaats te houden en goed contact met MEA-elektroden te bevorderen.
OPMERKING: Het segment moet mogelijk worden verplaatst na nettoplaatsing. - Plaats de MEA in het opnamehoofdstadium (figuur 2A,B).
- Controleer de positie van het weefsel over de elektroden met behulp van een omgekeerde microscoop (2x vergroting) om te bevestigen dat zoveel mogelijk elektroden zich onder de oppervlakkige DH (SDH) bevinden. Zorg ervoor dat ten minste 2-6 elektroden niet in contact komen met het segment, omdat deze elektroden belangrijk zijn voor het aftrekken van ruis en het opnemen van artefacten tijdens de analyse (figuur 2E).
- Schakel de camera in, sluit deze aan op het apparaat en maak een referentieafbeelding van het segment ten opzichte van de MEA voor gebruik tijdens de analyse.
- Druk op Start DAQ in de opnamesoftware en controleer of alle elektroden een duidelijk signaal ontvangen.
OPMERKING: Als het signaal luidruchtig is, maakt u het hoofdpodium los en reinigt u zowel de MEA-contactpads als de gouden veercontacten met 70% ethanol (gebruik een laboratoriumdoekje om ervoor te zorgen dat de pads en contacten droog zijn na het reinigen). Als het signaal nog steeds luidruchtig is, schakelt u de defecte elektroden in de opnamesoftware uit of noteert u later tijdens de analyse voor uitsluiting. - Bevestig de perfusie-inlaat- en uitlaatleidingen aan de MEA-put (eerder gevuld met aCSF) en schakel het perfusiesysteem in. Controleer het debiet, idealiter 4-6 badvolumes per minuut, en zorg ervoor dat de uitstroom voldoende is om overloop van het superfusaat te voorkomen.
- Laat het weefsel gedurende 5 minuten in evenwicht zijn en noteer vervolgens 5 minuten ruwe, ongefilterde basisgegevens.
- Verplaats de perfusie-inlaatlijn van aCSF naar een 4-AP-oplossing en wacht 12 minuten tot de 4-AP-geïnduceerde ritmische activiteit de steady state bereikt (2 minuten voor medicijnen om het bad te bereiken en 10 minuten voordat de activiteit piekt en vervolgens plateau).
- Noteer 5 minuten 4-AP-geïnduceerde activiteit. Wees voorbereid op volgende opnames om de medicijnen te testen of om de stabiliteit van 4-AP te controleren.
- Experimentele opstelling
| Microelectrode Array Lay-outs | ||||
| Micro-elektrode Array Model | 60MEA 200/30iR-Ti | 60-3DMEA 100/12/40iR-Ti | 60-3DMEA 200/12/50iR-Ti | 60MEA 500/30iR-Ti |
| Vlak of 3-dimensionaal (3D) | Planar | 3D | 3D | Planar |
| Elektrode Grid | 8 x 8 cm | 8 x 8 cm | 8 x 8 cm | 6 x 10 cm |
| Elektrodeafstand | 200 μm | 100 μm | 200 μm | 500 μm |
| Diameter van de elektrode | 30 μm | 12 μm | 12 μm | 30 μm |
| Elektrode Hoogte (3D) | N.v.t | 40 μm | 50 μm | N.v.t |
| Experimenten | Dwarssegment | Dwarssegment | Sagittale + horizontale | Sagittale + horizontale |
Tabel 2: Micro-elektrode array lay-outs.
Figuur 2: Weefselpositionering op de micro-elektrode array. (A) Afbeelding toont een open MEA-headstage met een MEA op zijn plaats. (B) Hetzelfde als A met mea-headstage gesloten voor opnames en weefselperfusiesysteem op zijn plaats. (C) Afbeelding toont een MEA zoals geleverd door de fabrikant. Contactpads, die communiceren met de gouden veren van het hoofdstadium, en het MEA-weefselbad dat de weefselbadoplossing en weefselschijf bevat, worden getoond. Het gebied dat wordt gemarkeerd door het rode vierkant in het midden is de locatie van de elektrode-array. (D) Schema's tonen de twee MEA-elektrodeconfiguraties die in dit onderzoek zijn gebruikt, met nadere bijzonderheden in tabel 2. De referentie-elektrode wordt aangeduid met het blauwe trapezium. De linker MEA-elektrode-indeling toont een vierkante configuratie van 60 elektroden, die het meest wordt gebruikt in de gepresenteerde werkmodellen 60MEA200/30iR-Ti met elektroden met een diameter van 30 μm die 200 μm uit elkaar liggen, of 200 μm tussen elkaar en 100 μm verdeelde 3-dimensionale MEA's (60MEA200/12/50iR-Ti en 60MEA100/12/40iR-Ti) met elektroden met een diameter van 12 μm en een hoogte van 50 μm of 40 μm hoog, respectievelijk. De linker MEA elektrode lay-out toont een rechthoekige lay-out van 6 x 10 elektrode-60MEA500/30iR-Ti. (E) Hoge vergrotingsafbeelding van een 60MEA100/12/40iR-Ti vierkante MEA met dwarsbalksegment geplaatst voor opname. De plak zit op elektroderijen 3-8. De bovenste rij elektroden, die geen contact maken met weefsel, dienen als referentie-elektroden. Het SDH-gebied verschijnt als een semitransparante band. In dit geval overtreft de SDH elektroden in rijen 4, 5 en 6 en kolommen 2, 3, 4, 5 en 7 van de MEA. Schaalbalk = 200 μm. Afkortingen: MEA = microelectrode array; SDH = oppervlakkige dorsale hoorn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Segmenten wijzigen
- Spoel na elke opnamesessie de lijnen af met aCSF.
- Verwijder de MEA uit het hoofdpodium.
- Verwijder het net en het weefsel uit de MEA-put, spoel ze goed af met aCSF en herhaal de bovenstaande stappen met een nieuwe plak.
2. Gegevensverwerking en -analyse
OPMERKING: In de volgende stappen wordt beschreven hoe u de analysesoftware kunt gebruiken voor MEA-experimenten op ruggenmergsegmenten. Een van de 60 elektroden dient als interne referentie (gemarkeerd door een trapezium in figuur 2 C, D), terwijl tussen de vier en vijfentwintig van de resterende 59 onder de SDH worden geplaatst in een ruggenmergsegment voor volwassen muizen. Latere analyse detecteert extracellulaire actiepotentiaal (EAP) en lokale veldpotentiaal (LFP) golfvormen (zie figuur 3B voor voorbeelden) van het ruwe signaal in dit gebied.
- Verwerking van ruwe gegevens
- Open de analysesoftware en laad de vooraf gemaakte analyselay-out (figuur 3B).
- Open het bestand van belang en deselecteer de referentie-elektrode (elektrode 15 in 8 x 8 MEA- of elektrode E1 in 6 x 10 MEA-configuratie) en alle elektroden die als te luidruchtig worden beschouwd.
- Stel het tijdvenster voor analyse in (0:00 → 5:00 min).
- Ga naar het filtertabblad Cross-channel . Selecteer Complexe referentie en selecteer de referentie-elektroden op basis van de afbeelding die tijdens het experiment is gemaakt en aantekeningen die zijn gemaakt (d.w.z. die elektroden niet onder weefsel). Als u dit wilt toepassen en controleren, drukt u op Verkennen voordat u doorgaat.
- Ga naar het tabblad EAP-filter en pas een2e orde high pass Butterworth-filter toe (200 Hz afgesneden) om LFP-activiteit te verwijderen.
- Ga naar het tabblad LFP-filter en pas een2e orde band pass Butterworth-filter (deltafrequenties van 0,5-4 Hz) toe om EAP-activiteit te verwijderen.
- Ga naar het tabblad EAP-detector en selecteer Automatische drempel. Vink de selectievakjes Stijgende en dalende randen aan en stel de dode tijd in op 0,5 ms.
- Stel positieve en negatieve drempels in op basis van de gegevens. Controleer de gegevens door terug te keren naar het scherm Raw-gegevensanalyse , de tijdmarkering te verplaatsen en vervolgens terug te keren naar het tabblad EAP-detector en op Verkennen te drukken. Herhaal dit totdat u ervan overtuigd bent dat de ingestelde detectiedrempel EAP's vastlegt zonder ruis/niet-fysiologische activiteit vast te leggen. Gebruik de referentie-elektroden om ruis/niet-fysiologische activiteit te identificeren.
OPMERKING: Er moet voor worden gezorgd dat een minimaal aantal EAP's wordt gedetecteerd in referentie-elektroden waar geen fysiologische activiteit zal optreden. Vrij kleine afwijkingen in de basislijn kunnen echter ten onrechte worden gedetecteerd als EAP's. Dit terwijl het nog steeds gericht is op het maximaliseren van het aantal echte gebeurtenissen dat in de actieve elektroden wordt gedetecteerd. - Ga naar het tabblad LFP-detector , selecteer de handmatige drempel, vink de selectievakjes Stijgende en dalende rand aan en stel de dode tijd in op 3 ms.
- Herhaal stap 2.1.8 voor één elektrode door een elektrode met LFP-activiteit te selecteren. Als u tevreden bent, selecteert u Toepassen op iedereen , omdat drempels alleen worden toegepast op één elektrode wanneer u handmatig drempels uitvoert.
- Let bij het onderzoeken van LFP-gegevens op het tabblad Detector op het maximale aantal drempelovergangen voor de ene LFP-golfvorm en de maximale tijdscheiding van drempelovergangen voor de ene LFP-golfvorm voor gebruik in latere analyse.
- Druk op Analyse starten.
- Wanneer de analyse is voltooid, gaat u naar het tabblad EAP-analyzer en exporteert u de gegevens. Doe hetzelfde op het tabblad LFP-analyzer .
- Herhaal dit proces voor alle andere bestanden uit hetzelfde segment.
- Na het exporteren van gegevens converteert u de bestanden naar xlsx-indeling, zodat ze kunnen worden gelezen door het gebruikte programmeerscript. Geef de bestanden een naam volgens de volgende conventie voor het meegeleverde script om ze te lezen: experimentnaam (bijv. Voorbeeldgegevens) - segmentnummer (bijv. S1) - registratienummer (bijv. R1) - activiteitstype (bijv. Spikes of SP's, overeenkomend met EAP's of LFP's, respectievelijk).
OPMERKING: De hier beschreven EAP-analyse behandelt spiking van individuele kanalen als een enkele populatie, hoewel deze activiteit vaak zou voortkomen uit meerdere neuronen in de nabijheid van de opname-elektrode. Als het aantal neuronen dat bijdraagt aan EAP's in een kanaal gewenst is, kunnen elders beschreven multispike-sorteertechnieken worden toegepast om verschillende populaties van spikes te onderscheiden op basis van golfvormkenmerken28.
Figuur 3: Lay-outs van gegevensregistratie- en analysetools en voorbeeldmicro-elektrode-array-opnamen met extracellulaire actiepotentiaal en lokale veldpotentiaalgolfvormen. (A) Schematic toont vooraf geconfigureerde opnamesjabloon die wordt gebruikt voor de verwerving van MEA-gegevens. Door de MEA2100 en de opnametool (headstage/versterker) te koppelen, kunnen de gegevens een naam krijgen en worden opgeslagen. Vier voorbeeldsporen van ruwe gegevens (rechts, tijdperken van 5 minuten) werden verzameld door één MEA-kanaal met activiteit bij baseline, 12 minuten na 4-AP-toepassing, nog eens 15 minuten na vastgestelde 4-AP-activiteit en na badtoepassing van TTX (1 μM). Merk op dat de toevoeging van 4-AP (tweede spoor) een duidelijke toename van achtergrondgeluid en EAP / LFP-activiteit oplevert. Belangrijk is dat de activiteit relatief stabiel blijft gedurende ten minste 15 minuten nadat 4-AP-geïnduceerde activiteit is vastgesteld (derde spoor). Toevoeging van TTX (1 μM) elimineert alle activiteit (bottom trace). (B) Schematic (links) toont de configuratie van de analyzersoftware voor gegevensanalyse. De raw data explorer tool wordt gebruikt om opnames te importeren die zijn verzameld door opnamesoftware. Deze gegevens worden vervolgens uitgevoerd door een cross-channel filtertool die de geselecteerde referentie-elektrode(s) signaal(en) aftrekt van andere elektroden om achtergrondruis te verwijderen. Gegevens passeren het EAP-filter en de LFP-filtertools om signaal-ruisrelaties voor elke golfvorm te optimaliseren. Na deze stap komen de EAP-padgegevens in het hulpprogramma EAP-detector terecht, waar drempelwaarden worden ingesteld. EAP's worden gedetecteerd en vervolgens verzonden naar de EAP-analyzertool, waar de latenties van elke gebeurtenis worden vastgelegd en geëxporteerd als txt. bestand. Een identieke workflow vindt plaats voor LFP-gegevens met behulp van een overeenkomstige LFP-toolkit. Rechtersporen tonen gegevens van een enkel MEA-kanaal met verschillende extracellulaire golfvormen. Locatie van EAP- en LFP-signalen worden gemarkeerd in de bovenstaande 'telrasters'. Lagere sporen zijn tijdperken van de bovenste opname (aangeduid met rode balken) met golfvormen op een uitgebreide tijdschaal, inclusief verschillende LFP-signalen (let op de verscheidenheid aan verschijningen) en individuele extracellulaire EAP's (rode cirkels). Merk op dat de golfvorm en polariteit van LFP/EAP variëren ten opzichte van het aantal neuronen dat deze signalen produceert, hun nabijheid tot de opname-elektrode en hun locatie ten opzichte van de nabijgelegen elektrode(s). Afkortingen: MEA = microelectrode array; EAP = extracellulaire actiepotentiaal; LFP = lokaal veldpotentieel; 4-AP = 4-aminopyridine; TTX = tetrodotoxine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Synchroniciteitsanalyse
OPMERKING: Synchroniciteit, of het aantal 'toevallige' gebeurtenissen tussen twee elektroden, werd bepaald met behulp van het toevalscriterium binnen de A-SPIKE-synchronisatiemethode beschreven door Satuvuori et al. 29. Het hier gebruikte script vergelijkt alleen elektroden naast elkaar voor efficiëntie (d.w.z. horizontale, verticale en diagonale buren); het script kan echter worden herschreven om indien nodig alle elektroden te vergelijken.- Voer gegevensanalyse uit met behulp van een aangepast programmeerscript, dat latentietijdstempels voor elke elektrode uit de .xlsx bestanden extraheert.
OPMERKING: Dit kan handmatig worden gedaan. - Noteer in stap 2.1.11 het maximale aantal drempelovergangen en de maximale tijdsscheiding van drempelovergangen voor de ene LFP-golfvorm. Wijzig het script voor het invoeren van deze LFP-definiërende parameters voor elk segment voordat u het script uitvoert.
OPMERKING: Thresholding die eerder in analysesoftware is uitgevoerd, legt EAP's duidelijk vast als een enkele gebeurtenis. LFP's bestaan echter uit een variabel aantal pieken, afhankelijk van de vorm van de golfvorm en het daaropvolgende aantal drempeloverschrijdingen door die ene gebeurtenis. - Wijzig het script om de elektroden van belang in te voeren vóór de analyse.
- Om synchroniciteit te bepalen (gedefinieerd in het script door aanpasbare tijdframes voor synchrone activiteit die binnen kan plaatsvinden), scheidt en analyseert u de geëxtraheerde latenties om toevallige gebeurtenissen te detecteren.
OPMERKING: Met het script kan de maximale tijd tussen toevallige gebeurtenissen worden ingesteld. Deze zijn vastgesteld op 20 ms voor EAP's en 200 ms voor LFP's. - Voer het script uit om latentietijdstempels te extraheren.
OPMERKING: Het .xlsx-uitvoerbestand bevat de interpretaties van latentiegegevens, namelijk EAP- en LFP-tellingen, frequenties en toevallige gebeurtenistellingen voor afzonderlijke elektroden en hele segmenten. Deze gegevens worden gebruikt om de frequentie, EAP/LFP-tellingen, het aantal actieve elektroden, het aantal toevallige gebeurtenissen, het aantal gekoppelde elektroden en de gemiddelde sterkte van deze koppelingen te beoordelen.
- Voer gegevensanalyse uit met behulp van een aangepast programmeerscript, dat latentietijdstempels voor elke elektrode uit de .xlsx bestanden extraheert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Model van netwerkactiviteit in de dorsale hoorn van het ruggenmerg
Toepassing van 4-AP induceert op betrouwbare wijze synchrone ritmische activiteit in het ruggenmerg DH. Dergelijke activiteiten presenteren zich als verhoogde EAP's en LFP's. Het latere signaal is een laagfrequente golfvorm, die eerder is beschreven in MEA-opnames30. Veranderingen in EAP- en/of LFP-activiteit na toediening van geneesmiddelen weerspiegelen veranderde neurale activiteit. Voorbeelden van EAP's en LFP's zijn weergegeven in figuur 3B en figuur 4. De focus ligt hier op de volgende parameters of kenmerken van de EAP / LFP-gegevens: frequentie, totale tellingen, actieve elektrodetellingen, synchroniciteit zoals gekenmerkt door het aantal toevallige gebeurtenissen gedetecteerd over meerdere elektroden, aantal gekoppelde aangrenzende elektroden en de sterkte van koppelingen tussen aangrenzende elektroden. Representatieve resultaten zijn weergegeven in tabel 3 en figuur 3, figuur 4, figuur 5, figuur 6, figuur 7 en figuur 8. Ze tonen een significante toename van alle gemeten parameters (alle p<0,001 door gepaarde t-test of de Wilcoxon Signed-Rank niet-parametrische equivalente test) voor zowel EAP's (figuur 5 en figuur 6) als LFP's (figuur 7 en figuur 8) na 4-AP-stimulatie en vervolgens relatieve stabiliteit voor de rest van de opnames. Gegevens werden getest op normaliteit voorafgaand aan statistische analyse. Samenvattend induceert 4-AP EAP- en LFP-activiteit in het ruggenmerg DH en verschillende kenmerken van de gegevens kunnen worden geëxtraheerd uit de MEA-opnames. De activiteit is reproduceerbaar en veel van de activiteit, met name voor LFP's, is ritmisch en synchroon.
| Activiteitsfunctie | Basislijn | 4-aminopyridine | Significant verschil |
| Extracellulaire actiepotentialen (EAP's) | |||
| Frequentie | 0,07 ± 0,01 | 0,88 ± 0,09 | blz<0,001 |
| Totaal aantal pieken | 261,41 ± 70,62 | 3289. 57 ± 484,38 | blz<0,001 |
| Actief aantal elektroden | 2,36 ± 0,34 | 8,95 ± 0,68 | blz<0,001 |
| Aantal toevallige pieken | 9,26 ± 4,01 | 966,94 ± 189,21 | blz<0,001 |
| Aantal gekoppelde elektroden | 2,03 ± 0,42 | 24,06 ± 1,96 | blz<0,001 |
| Sterkte van koppelingen tussen elektroden | 1,97 ± 0,58 | 29,13 ± 4,60 | blz<0,001 |
| Local Field Potentials (LFP's) | |||
| Frequentie | 0,00 ± 0,00 | 0,28 ± 0,03 | blz<0,001 |
| Totaal aantal pieken | 4,79 ± 0,82 | 688,47 ± 121,16 | blz<0,001 |
| Actief aantal elektroden | 0,41 ± 0,16 | 7,64 ± 0,73 | blz<0,001 |
| Aantal toevallige pieken | 0,43 ± 0,23 | 108,06 ± 278,22 | blz<0,001 |
| Aantal gekoppelde elektroden | 0,24 ± 0,15 | 22,91 ± 2,46 | blz<0,001 |
| Sterkte van koppelingen tussen elektroden | 0,34 ± 0,19 | 29,20 ± 3,59 | blz<0,001 |
Tabel 3: 4-Aminopyridine-geïnduceerde activiteit. Allemaal gepresenteerd als middel ± SEM.
Figuur 4: Voorbeeld baseline extracellulaire actie potentiële activiteit. Deelvensters tonen EAP-activiteit (opnames zijn afkomstig van verschillende segmenten). De meeste elektroden in een bepaalde segmentopname vertoonden geen EAP-activiteit bij de basislijn (bovenste paneel). Laagfrequente sporadische EAP's werden af en toe waargenomen bij baseline, mogelijk met meerdere spikegolfvormen (middenpaneel). Hoogfrequente EAP-activiteit werd zelden waargenomen in opnames bij baseline (onderste paneel). Inzetstukken tonen afzonderlijke EAP's van overeenkomstige opnamen op een uitgebreide tijdschaal. Afkorting: EAP = extracellulaire actiepotentiaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afdrukstand segmenteren
De DH-circuits die door 4-AP worden geactiveerd, zijn in alle drie de dimensies met elkaar verbonden. Slice-oriëntatie is dus een belangrijke overweging voor in vitro preparaten. Sagittale of horizontale slicing kan de voorkeur hebben om intersegmentale signalering waar te nemen, terwijl transversale segmenten de mediolaterale en dorsoventrale connectiviteit beter behouden. Gezien deze overwegingen kan worden gezien dat 4-AP-stimulatie een vergelijkbare ritmische activiteit in de SDH induceert, ongeacht de slice-oriëntatie (zie figuur 9).
Stabiliteit op lange termijn van 4-AP geïnduceerde activiteit
De stabiliteit van 4-AP-geïnduceerde activiteit is uiteraard cruciaal bij het bestuderen van de effecten van toegepaste geneesmiddelen. Daarom werd de stabiliteit van 4-AP-geïnduceerde activiteitsparameters gekarakteriseerd, en dit wordt weergegeven in figuur 5, figuur 6, figuur 7 en figuur 8 en tabel 4. Alle activiteitskenmerken, plus het samenvallen van activiteit voor LFP's, waren stabiel op basis van de gelijkenis van 4-AP-geïnduceerde activiteit op 12 minuten na 4-AP-toepassing en 15 minuten later (p>0,05). Andere LFP-synchroniciteitskarakteristieken, het aantal gekoppelde aangrenzende elektroden en de koppelingssterkte tussen aangrenzende elektroden namen af gedurende 15 minuten (respectievelijk p = 0,016 en p = 0,033), hoewel het verschil bescheiden was. Deze geleidelijke verandering kan gemakkelijk worden onderscheiden van de meer directe acties van een testgeneesmiddel tijdens farmacologische studies (zie hieronder). Gegevens werden getest op normale verdeling vóór statistische vergelijkingen en vervolgens beoordeeld met behulp van gepaarde t-tests of niet-parametrische Wilcoxon Signed-Rank-tests, indien van toepassing.
| Activiteitsfunctie | 4-aminopyridine | 4-aminopyridine (15 min) | Significant verschil |
| Extracellulaire actiepotentialen (EAP's) | |||
| Frequentie | 0,8 ± 0,13 | 0,85 ± 0,10 | p>0.05 (geen dif.) |
| Totaal aantal pieken | 2706,36 ± 510,96 | 2838,09 ± 447,73 | p>0.05 (geen dif.) |
| Actief aantal elektroden | 9,32 ± 0,70 | 10,09 ± 0,56 | p>0.05 (geen dif.) |
| Aantal toevallige pieken | 1037,63 ± 306,84 | 1013,09 ± 269,80 | p>0.05 (geen dif.) |
| Aantal gekoppelde elektroden | 22,00 ± 3,37 | 22,41 ± 2,56 | p>0.05 (geen dif.) |
| Sterkte van koppelingen tussen elektroden | 30,44 ± 6,27 | 31,88 ± 7,68 | p>0.05 (geen dif.) |
| Local Field Potentials (LFP's) | |||
| Frequentie | 0,25 ± 0,03 | 0,17 ± 0,03 | p>0.05 (geen dif.) |
| Totaal aantal pieken | 792,32 ± 155,83 | 546,32 ± 120,93 | p>0.05 (geen dif.) |
| Actief aantal elektroden | 9,50 ± 1,11 | 7,86 ± 1,00 | p>0.05 (geen dif.) |
| Aantal toevallige pieken | 1631,27 ± 734,77 | 1073,00 ± 490,85 | p>0.05 (geen dif.) |
| Aantal gekoppelde elektroden | 26,68 ± 4,58 | 20,95 ± 3,68 | p<0,05 |
| Sterkte van koppelingen tussen elektroden | 33,35 ± 6,19 | 24,81 ± 5,41 | p<0,05 |
Tabel 4: 4-Aminopyridine activiteit stabiliteit. Allemaal gepresenteerd als middel ± SEM.
Farmacologisch onderzoek van activiteitskenmerken
Om aan te tonen dat mea-geregistreerde 4-AP-geïnduceerde activiteit gemakkelijk vatbaar is voor farmacologische manipulaties, werd de afhankelijkheid van deze signalen van actiepotentiaalontlading benadrukt. Badtoepassing van de spanningsafhankelijke natriumkanaalantagonist, tetrodotoxine (TTX, 1 μM), elimineerde zowel EAP- als LFP-activiteit, wat de piekafhankelijkheid van deze signalen bevestigde. Voorbeeldsporen zijn weergegeven in figuur 3A. Dit resultaat geeft ook een voorbeeld van het nut van de voorbereiding voor toekomstig farmacologisch onderzoek, waarbij nieuwe verbindingen en gevestigde analgetica kunnen worden beoordeeld op hun werking in geactiveerde spinale DH-circuits. Ten slotte, om verder licht te werpen op de relevantie van 4-AP-activering van de DH-netwerken, werd een alternatieve aanpak getest om een bescheiden depolarisatie van het DH-netwerk te bereiken. In deze benadering werd een verhoogde kalium (4,5 mM) aCSF-oplossing (tabel 1) toegepast en bleek een vergelijkbare DH-respons op 4-AP-stimulatie op te roepen. Deze manipulatie riep LFP-activiteit op die dezelfde synchrone kenmerken had als 4-AP-geïnduceerde reacties (figuur 10), wat een vergelijkbaar mechanisme en onderliggende circuits suggereert.
Figuur 5: Voorbeeld 4-aminopyridine-geïnduceerde extracellulaire actie potentiële activiteit. (A) Rasterplots tonen EAP-activiteit van actieve kanalen, gedetecteerd bij baseline (boven) en twee tijdspunten (12 min - vastgesteld en 27 min) na badtoevoeging van 4-AP (midden en lager). Verticale blauwe vensters markeren perioden van synchrone (close latency) activiteit in meer dan 5 opname-elektroden. (B) Panels vatten de analyse van de EAP-activiteitenkaart van MEA-gegevens samen. Linker schema toont de oriëntatie van het ruggenmergsegment ten opzichte van de elektrode-array. Het middelste linkerpaneel geeft een overzicht van de activiteit bij baseline (actieve elektroden rood gekleurd) en de EAP-frequentie die wordt aangegeven door witte arcering rond actieve elektroden (schaduwintensiteit duidt op verhoogde activiteit). Rechtermiddenpaneel toont activiteit in hetzelfde segment na 12 minuten 4-AP-belichting. Merk op dat het aantal actieve elektroden (rood) samen met de EAP-frequentie toenam. Bovendien wordt synchronisatie tussen aangrenzende elektroden aangegeven door rode verbindingslijnen, waardoor een netwerkkaart van activiteit ontstaat (lijndikte geeft de mate van EAP-gelijkenis tussen elektroden aan). Het rechterpaneel toont de activiteit in dezelfde schijf na nog eens 15 minuten 4-AP-belichting. Merk op dat het aantal actieve elektroden (rood), de mate van EAP-activiteit (wit) en de netwerkstructuur (rode lijnen) gedurende deze periode stabiel zijn gebleven. Afkortingen: 4-AP = 4-aminopyridine; EAP = extracellulaire actiepotentiaal; MEA = micro-elektrode array. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Groepsgegevenssamenvatting van 4-aminopyridine-geïnduceerde extracellulaire actiepotentiaalactiviteit. (A-F) Groepsgegevensplots die EAP-eigenschappen samenvatten van verschillende experimenten die identiek zijn aan de EAP-gegevens in figuur 4 (gegevens ook samengevat in tabel 3 en tabel 4). EAP-frequentie (A), telling (B), toevallige gebeurtenissen (C), actieve elektroden (D), gekoppelde elektroden (E) en gemiddelde koppelingssterkte (F) stegen na badtoepassing van 4-AP en waren vervolgens stabiel gedurende 15 minuten na de vaststelling van 4-AP-geïnduceerde activiteit. De gegevens zijn afkomstig van 11 experimenten (gegevens in rood zijn van het experiment in figuur 5). Afkortingen: 4-AP = 4-aminopyridine; EAP = extracellulaire actiepotentiaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: 4-Aminopyridine-geïnduceerde lokale veldpotentiaalactiviteit. De gegevens worden weergegeven zoals in figuur 5 , met uitzondering van LFP-gegevens. (A) Rasterplots tonen LFP-activiteit van meerdere kanalen, gedetecteerd op basislijn (boven) en twee tijdspunten (12 min - vastgesteld en 27 min) na badtoevoeging van 4-AP (midden en lager). Verticale blauwe vensters markeren perioden van synchrone (close latency) activiteit in meer dan 5 opname-elektroden. (B) Panels geven een samenvatting van de analyse van de LFP-activiteitenkaart van MEA-gegevens. Linker schema toont de oriëntatie van het ruggenmergsegment ten opzichte van de elektrode-array. Het middelste linkerpaneel geeft een overzicht van de activiteit bij baseline (actieve elektroden rood gekleurd), met een minimale LFP-frequentie die wordt aangegeven door witte arcering rond actieve elektroden (schaduwintensiteit duidt op verhoogde activiteit). Rechtermiddenpaneel toont activiteit in hetzelfde segment na 12 minuten 4-AP-belichting. Het aantal actieve elektroden (rood) en de LFP-frequentie zijn aanzienlijk verhoogd. Bovendien toont synchronisatie tussen aangrenzende elektroden (rode verbindingslijnen) een sterke netwerkkaart van LFP-activiteit (lijndikte geeft de mate van gelijkenis tussen elektroden aan). Het rechterpaneel toont LFP-activiteit in hetzelfde segment na nog eens 15 minuten 4-AP-belichting. Merk op dat het aantal actieve elektroden (rood), de mate van LFP-activiteit (wit) en de netwerkstructuur (rode lijnen) relatief stabiel zijn gedurende deze periode. Afkortingen: 4-AP = 4-aminopyridine; MEA = micro-elektrode array; LFP = lokaal veldpotentieel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Groepsgegevenssamenvatting van 4-aminopyridine-geïnduceerde lokale veldpotentiaalactiviteit. (A-F) Groepsgegevensplots die LFP-eigenschappen samenvatten van verschillende experimenten die identiek zijn aan de EAP-gegevens in figuur 7 (gegevens ook samengevat in tabel 3 en tabel 4). LFP-frequentie (A), telling (B), toevallige gebeurtenissen (C) en actieve elektroden (D) waren stabiel gedurende 15 minuten nadat het 4-AP-effect piekte (gegevens in rood zijn afkomstig van het experiment in figuur 7). De gekoppelde elektroden (E) en de gemiddelde LFP-koppelingssterkte (F) namen echter in de loop van de tijd af (beide p<0,05). De gegevens zijn afkomstig van 11 experimenten (gegevens in rood zijn van het experiment in figuur 7). Afkortingen: 4-AP = 4-aminopyridine; LFP = lokaal veldpotentieel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: 4-Aminopyridine-geïnduceerde extracellulaire actiepotentiaal en lokale veldpotentiaalactiviteit in sagittale en horizontale segmenten. Panels vatten EAP- en LFP-activiteit samen in MEA-netwerkkaartanalyse van 4-AP-geïnduceerde signalering in sagittale (A) en horizontale (B) ruggenmergsegmenten. Schema's (uiterst links) tonen de oriëntatie van ruggenmergsegmenten ten opzichte van rechthoekige elektrode-arrays. Linker netwerkkaarten tonen baseline EAP- en LFP-activiteit in sagittale (A) en horizontale (B) ruggenmergsegmenten (actieve elektroden zijn rood, frequentie aangegeven door witte schaduwintensiteit en synchronisatie tussen aangrenzende elektroden door rode verbindingslijnen met dikte die de mate van synchronie aangeeft). Rechter netwerkkaarten tonen EAP- en LFP-activiteit in dezelfde plak na 12 minuten 4-AP-blootstelling in sagittale (A) en horizontale (B) ruggenmergsegmenten. Let op de aanzienlijke toename van het aantal actieve elektroden, de frequentie van activiteit en de synchronisatie van deze signalen na blootstelling aan 4-AP, waarbij netwerken in beide segmentoriëntaties worden ontmaskerd. Afkortingen: MEA = microelectrode array; EAP = extracellulaire actiepotentiaal; LFP = lokaal veldpotentieel; 4-AP = 4-aminopyridine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10: Verhoogde kalium (hoge K+)-geïnduceerde lokale veldpotentiaalactiviteit. Panelen vatten hoge K + (4,5 mM) aCSF-geïnduceerde LFP-activiteit samen. (A) Voorbeeldsporen van één MEA-kanaal bij baseline en na badtoevoeging van hoge K+ aCSF (5-min tijdperken). Verhoging van de K+ concentratie leverde duidelijke LFP-activiteit op die afwezig was bij baseline, vergelijkbaar met die waargenomen bij 4-AP-toepassing (figuur 3). Inzet toont een LFP-golfvorm op een uitgebreide tijdschaal. (B) Panelen vatten de LFP-netwerkactiviteit samen die wordt veroorzaakt door een hoge K + aCSF. Linker schematische toont oriëntatie van ruggenmerg slices ten opzichte van vierkante elektrode arrays. Netwerkkaarten vergelijken basislijn en hoge K+-opgeroepen LFP-activiteit (actieve elektroden rood, frequentie aangegeven door witte schaduwintensiteit en synchronisatie tussen aangrenzende elektroden door rode verbindingslijnen met dikte die de mate van synchronie aangeeft). Let op de aanzienlijke toename van het aantal actieve elektroden, de frequentie van activiteit en de synchronisatie van deze signalen na hoge K + aCSF-blootstelling, waarbij het onderliggende netwerk op dezelfde manier wordt ontmaskerd als 4-AP. Afkortingen: aCSF = kunstmatige hersenvocht; MEA = micro-elektrode array; EAP = extracellulaire actiepotentiaal; LFP = lokaal veldpotentieel; 4-AP = 4-aminopyridine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ondanks het belang van de spinale DH bij nociceptieve signalering, verwerking en de resulterende gedrags- en emotionele reacties die pijn kenmerken, blijven de circuits binnen deze regio slecht begrepen. Een belangrijke uitdaging bij het onderzoeken van dit probleem is de diversiteit van neuronpopulaties waaruit deze circuitsbestaan 6,31,32. Recente ontwikkelingen in transgene technologieën, geleid door optogenetica en chemogenetica, beginnen deze belangrijke verbindingen te ontrafelen en definiëren de microcircuits die sensorische informatie verwerken 1,2,3,4,8,9,10,11,12,13,14 . Het verzoenen van hoe deze microcircuits samenkomen om activiteit in grotere netwerken van DH-neuronen vorm te geven, blijft een uitdaging, vooral voor het ontwikkelen van nieuwe en effectievere pijnbehandelingen. Hier wordt een functioneel model van DH-activiteit beschreven dat wordt gemonitord op MEA's en met behulp van 4-AP-gestimuleerde ritmische activiteit om bredere netwerkconnectiviteit te bestuderen. Dit model onthult lokale extracellulaire spiking (EAP's) en grotere netwerkgebaseerde LFP's, die afhankelijk zijn van actiepotentiaalontlading en kunnen worden gebruikt om wijzigingen in netwerkeigenschappen in kaart te brengen. Door het gebruik van MEA's te combineren om circuitonderzoek te vergemakkelijken en 4-AP om de onderliggende circuits bloot te leggen, maakt deze voorbereiding het mogelijk om de DH-circuitfunctie op regionaal of 'macroscopisch' niveau te bestuderen.
Voordelen van het MEA/4-AP ruggenmerg slice model zijn onder meer een strakke experimentele controle van een in vitro preparaat, dat vatbaar is voor gedetailleerd farmacologisch onderzoek en een hoge ruimtelijke en temporele resolutie biedt van neurale activiteit-individu, d.w.z. EAP's en LPP's in een groot weefselgebied en meerkanaalsgegevens die signalering over netwerken en regio's kunnen beoordelen. Belangrijk is dat 4-AP-geïnduceerde ritmische activiteit betrouwbaar en reproduceerbaar is en kan worden bestudeerd in verschillende ruggenmergsegmentoriëntaties. Deze voorbereiding helpt de kloof tussen eencellig en dieronderzoek te overbruggen en kan veranderingen binnen deze circuits onder zowel normale als pathologische omstandigheden onthullen. De effecten van verschillende geneesmiddelen op netwerkactiviteit kunnen ook worden bepaald. Dit platform zou dus kunnen fungeren als een screeningsinstrument voor het onderzoeken van de acties van bestaande en nieuwe analgetica op DH-circuits.
Er zijn verschillende kritieke stappen in dit protocol. Ten eerste is zorgvuldige weefselvoorbereiding de sleutel tot het produceren van plakjes die levensvatbaar zijn voor experimenten en gevoelig zijn voor 4-AP, ongeacht de oriëntatie van de plak. Een aantal bronnen worden hier gemarkeerd die gedetailleerde informatie en advies over het oplossen van problemen bieden. Kortom, nauwkeurigheid bij het maken van oplossingen, snelle maar nauwgezette dissectie van het ruggenmerg, geoptimaliseerde snijparameters om weefselcompressie en -schade te minimaliseren, en zorg bij het overbrengen van plakjes op elk moment zijn allemaal belangrijke factoren in de voorbereidingsfase. Zorgvuldige omgang met MEA's, met name in de nabijheid van de elektroden, is essentieel voor het behoud van de functie van deze componenten. De optimale positie van de DH over het maximale aantal MEA-elektroden is belangrijk voor het verhogen van de opnameopbrengst van elk experiment. Bij het gebruik van 3D MEAs is meer zorg en oefening vereist, vooral bij het positioneren en verwijderen van plakjes. Het is gemakkelijk om het weefsel over uitstekende MEA-elektroden te slepen en toekomstig gebruik in gevaar te brengen.
Er zijn enkele kanttekeningen bij de hier beschreven aanpak. In tegenstelling tot bij eencellige opnames, waar de identiteit van neuronen die worden bestudeerd kan worden bepaald met behulp van genetische etikettering of post hoc immunolabeling, kan de exacte bron van de elektrische signalen die door MEA's worden gedetecteerd, niet worden bepaald. Een andere uitdaging is het niveau van basisactiviteit in ruggenmergsegmenten. Hoewel sommige rapporten tonisch actieve DH-neuronen bij baseline beschrijven, is het meest recente werk in jong neonatale weefsel33,34. Bovendien wordt de tonische activiteit die in volwassen weefsel wordt gerapporteerd, meestal geregistreerd met behulp van een zoekstrategie waarbij elektroden worden ontwikkeld om deze activiteit eerst te identificeren en vervolgens te bestuderen35. Wanneer een onbevooroordeelde bemonsteringsbenadering wordt gebruikt, waarbij registratie wordt vastgesteld voordat de activiteit wordt beoordeeld, vertoont minder dan 20% van de volwassen DH-neuronen voortdurende spiking (28/150-opnames) en regelmatige ontlading werd slechts waargenomen in 2% van deze cellen (3/150) 36.
Gezien deze verhouding en de vaste aard van elektroden ten opzichte van een weefselschijfje, is het niet verwonderlijk dat weinig MEA-elektroden (~ 2 elektroden / plak in deze MEA's) activiteit vertonen bij baseline. Dit gebrek aan activiteit is de belangrijkste reden waarom de hier beschreven methode bestaat uit het stimuleren van plakjes met 4-AP om EAP's en opgeroepen LFP-activiteit te verbeteren. Deze benadering is gebaseerd op het gebruik van 4-AP om ritmische circuitactiviteit te activeren in veel in vitro preparaten, van het bestuderen van epileptiforme mechanismen in de cortex en hippocampus tot fictieve locomotorische activiteit in de ventrale hoorn van het ruggenmerg 37,38,39. Een uitgebreide literatuur benadrukt ook dat 4-AP activiteit induceert die beperkt is tot oppervlakkige DH-circuits in spinale plakjes en afhankelijk is van exciterende en remmende synaptische transmissie en elektrische synapsen 20,21,22. Bovendien produceert in vivo 4-AP-toediening een dosisafhankelijke toename van dh-neuronreceptieve velden zonder de reacties op graduele stimulatie in de centrale receptieve zone te veranderen of gedegenereerde responsen te veroorzaken24. Ten slotte kan worden gezien dat een bescheiden depolarisatie van deze circuits door het verhogen van de extracellulaire kaliumionenconcentratie ook vergelijkbare LFP-activiteit produceert. Samen ondersteunen deze observaties de opvatting dat 4-AP functioneel relevante netwerken binnen de oppervlakkige DH ontmaskert die met MEA's kunnen worden bestudeerd. Ten slotte is de exacte bron van LFP-activiteit onduidelijk, hoewel van deze golfvormen wordt gedacht dat ze een optelsom van activiteit vertegenwoordigen die wordt gedetecteerd door meerdere neuronen rond een elektrode. Ze kunnen betrekking hebben op of het gevolg zijn van barstende activiteit in neuronen of overeenkomen met synaptische potentialen30. Ongeacht hun oorsprong kunnen de kenmerken van LFP's binnen en tussen segmenten (meerdere opnames / medicijntoepassingen) worden vergeleken, waardoor een waardevolle uitlezing van circuit- en netwerkfuncties wordt geboden.
De aard van in vitro plakpreparaten verdient ook aandacht, met de mogelijke verstoring van neuronale circuits en schade aan cellen op het plakoppervlak. Desondanks biedt het snijden van het weefsel meer directe elektrische toegang tot de relevante DH-circuits en ononderbroken farmacologische toegang. Deze experimentele voor- en nadelen moeten zorgvuldig worden overwogen, met de nadruk op het belang van het overwegen van slice-oriëntatie om de connectiviteit in de netwerken van belang maximaal te behouden. Voor de overgrote meerderheid van de gegevens die in dit artikel worden gepresenteerd, worden mediaal-laterale spreiding van activiteit in de dorsale hoorn en de intrinsieke connectiviteit van de neuronen in dit gebied gepresenteerd. Om de verspreiding van rostro-caudale activiteit te onderzoeken, handhaaft het gebruik van sagittale of horizontale segmenten bij voorkeur de connectiviteit tussen spinale segmenten, zoals gemarkeerd in figuur 9.
Bovendien is het onvermijdelijk dat het doorsnijden van het ruggenmerg zal resulteren in een zekere mate van schade aan het oppervlak van plakjes. Het minimaliseren van deze schade komt terug op de zorgvuldige voorbereiding van weefsel, snijparameters - inclusief langzame voorwaartse snelheid en hoogfrequente bladoscillaties - en oplossingen en omstandigheden die neuroprotectief zijn tijdens dit proces. Een gedetailleerde beoordeling van het voordeel van verschillende aandoeningen voor de gezondheid van ruggenmergsneden is eerder gepubliceerd40. Ondanks de mogelijke impact van de gezondheid van plakjes op MEA-opnames, zorgt interne consistentie in slicevoorbereidingsprocedures ervoor dat deze factor de resultaten in een dataset op gelijke wijze beïnvloedt. Er moet ook worden opgemerkt dat dat MEA-elektroden worden verondersteld signalen op te pikken die ongeveer 30-100 μm van de activiteitsbron ontstaan. Aangezien het beschadigde segmentoppervlak waarschijnlijk de bovenste cellaag zal overspannen, ongeveer 15-30 μm, kunnen de effecten van snijgerelateerde schade op MEA-opnames worden beheerd en beperkt om nog steeds waardevolle datasets en inzichten over DH-netwerkactiviteit op te leveren15,41.
Samenvattend biedt de MEA/4-AP-benadering van het ruggenmergsegment die hier wordt beschreven een platform voor het begrijpen van de connectiviteit van DH-circuits en hoe de netwerken die ze vormen de verwerking van spinale pijn stimuleren. Er is ook potentieel voor verdere methodologische uitbreiding in termen van analyseparameters, netwerkstimulatiebron en de capaciteit ervan om te worden gebruikt als een platform voor farmacologische screening of gebruik met modellen van pathologische pijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de National Health and Medical Research Council (NHMRC) van Australië (subsidies 631000, 1043933, 1144638 en 1184974 aan B.A.G. en R.J.C.) en het Hunter Medical Research Institute (subsidie aan B.A.G. en R.J.C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-aminopyridine | Sigma-Aldrich | 275875-5G | |
| 100% ethanol | Thermo Fisher | AJA214-2.5LPL | |
| CaCl2 1M | Banksia Scientific | 0430/1L | |
| Carbonox (Carbogen - 95% O2, 5% CO2) | Coregas | 219122 | |
| Curved long handle spring scissors | Fine Science Tools | 15015-11 | |
| Custom made air interface incubation chamber | |||
| Foetal bovine serum | Thermo Fisher | 10091130 | |
| Forceps Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Glucose | Thermo Fisher | AJA783-500G | |
| Horse serum | Thermo Fisher | 16050130 | |
| Inverted microscope | Zeiss | Axiovert10 | |
| KCl | Thermo Fisher | AJA383-500G | |
| Ketamine | Ceva | KETALAB04 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14007-14 | |
| Loctite 454 Instant Adhesive | Bolts and Industrial Supplies | L4543G | |
| MATLAB | MathWorks | R2018b | |
| MEAs, 3-Dimensional | Multichannel Systems | 60-3DMEA100/12/40iR-Ti, 60-3DMEA200/12/50iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in an 8x8 square grid. Electrodes are 12 µm in diameter, 40 µm (100/12/40) or 50 µm (200/12/50) high and equidistantly spaced 100 µm (100/12/40) or 200 µm (200/12/50) apart. |
| MEA headstage | Multichannel Systems | MEA2100-HS60 | |
| MEA interface board | Multichannel Systems | MCS-IFB 3.0 Multiboot | |
| MEA net | Multichannel Systems | ALA HSG-MEA-5BD | |
| MEA perfusion system | Multichannel Systems | PPS2 | |
| MEAs, Planar | Multichannel Systems | 60MEA200/30iR-Ti, 60MEA500/30iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in either a 8x8 square grid (200/30) or a 6x10 rectangular grid (500/30). Electrodes are 30 µm in diameter and equidistantly spaced 200 µm (200/30) or 500 µm (500/30) apart. |
| MgCl2 | Thermo Fisher | AJA296-500G | |
| Microscope camera | Motic | Moticam X Wi-Fi | |
| Multi Channel Analyser software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
| Multi Channel Experimenter software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
| NaCl | Thermo Fisher | AJA465-500G | |
| NaHCO3 | Thermo Fisher | AJA475-500G | |
| NaH2PO4 | Thermo Fisher | ACR207805000 | |
| Rongeurs | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Small spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Sucrose | Thermo Fisher | AJA530-500G | |
| Superglue | cyanoacrylate adhesive | ||
| Tetrodotoxin | Abcam | AB120055 | |
| Vibration isolation table | Newport | VH3048W-OPT | |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 S |
References
- Smith, K. M., et al. Calretinin positive neurons form an excitatory amplifier network in the spinal cord dorsal horn. eLife. 8, 49190 (2019).
- Smith, K. M., et al. Functional heterogeneity of calretinin-expressing neurons in the mouse superficial dorsal horn: implications for spinal pain processing. The Journal of physiology. 593 (19), 4319-4339 (2015).
- Boyle, K. A., et al. Defining a spinal microcircuit that gates myelinated afferent input: Implications for tactile allodynia. Cell Reports. 28 (2), 526-540 (2019).
- Browne, T. J., et al. Transgenic cross-referencing of inhibitory and excitatory interneuron populations to dissect neuronal heterogeneity in the dorsal horn. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 32 (2020).
- Graham, B. A., Hughes, D. I. Rewards, perils and pitfalls of untangling spinal pain circuits. Current Opinion in Physiology. 11, 35-41 (2019).
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).
- Hughes, D. I., Todd, A. J. Central nervous system targets: inhibitory interneurons in the spinal cord. Neurotherapeutics. 17 (3), 874-885 (2020).
- Duan, B., et al. Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain. Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).
- Hachisuka, J., Chiang, M. C., Ross, S. E.
- Foster, E., et al. Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch. Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).
- Bourane, S., et al. Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control. Cell. 160 (3), 503-515 (2015).
- Cheng, L., et al. Identification of spinal circuits involved in touch-evoked dynamic mechanical pain. Nature neuroscience. 20 (6), 804-814 (2017).
- Peirs, C., et al. Mechanical allodynia circuitry in the dorsal horn is defined by the nature of the injury. Neuron. 109 (1), 73-90 (2021).
- Huang, J., et al. Circuit dissection of the role of somatostatin in itch and pain. Nature Neuroscience. 21 (5), 707-716 (2018).
- Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2015).
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
- Johnstone, A. F., et al. Microelectrode arrays: a physiologically based neurotoxicity testing platform for the 21st century. Neurotoxicology. 31 (4), 331-350 (2010).
- Stett, A., et al. Biological application of microelectrode arrays in drug discovery and basic research. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 377 (3), 486-495 (2003).
- Xu, L., et al. Trends and recent development of the microelectrode arrays (MEAs). Biosensors and Bioelectronics. 175 (1), 112854 (2020).
- Chapman, R. J., Cilia La Corte, P. F., Asghar, A. U. R., King, A. E. Network-based activity induced by 4-aminopyridine in rat dorsal horn in vitro is mediated by both chemical and electrical synapses. The Journal of Physiology. 587, Pt 11 2499-2510 (2009).
- Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. Epileptiform activity in rat spinal dorsal horn in vitro has common features with neuropathic pain. Pain. 105 (1-2), 327-338 (2003).
- Kay, C. W., Ursu, D., Sher, E., King, A. E. The role of Cx36 and Cx43 in 4-aminopyridine-induced rhythmic activity in the spinal nociceptive dorsal horn: an electrophysiological study in vitro. Physiological Reports. 4 (14), 12852 (2016).
- Jankowska, E., Lundberg, A., Rudomin, P., Sykova, E. Effects of 4-aminopyridine on synaptic transmission in the cat spinal cord. Brain Research. 240 (1), 117-129 (1982).
- Semba, K., Geller, H. M., Egger, M. D. 4-Aminopyridine induces expansion of cutaneous receptive fields of dorsal horn cells. Brain Research. 343 (2), 398-402 (1985).
- Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. Long-range oscillatory Ca2+ waves in rat spinal dorsal horn. European Journal of Neuroscience. 22 (8), 1967-1976 (2005).
- Egert, U., et al. A novel organotypic long-term culture of the rat hippocampus on substrate-integrated multielectrode arrays. Brain Research Protocols. 2 (4), 229-242 (1998).
- Thiebaud, P., De Rooij, N., Koudelka-Hep, M., Stoppini, L. Microelectrode arrays for electrophysiological monitoring of hippocampal organotypic slice cultures. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 44 (11), 1159-1163 (1997).
- Rey, H. G., Pedreira, C., Quiroga, R. Q. Past, present and future of spike sorting techniques. Brain Research Bulletin. 119, 106-117 (2015).
- Satuvuori, E., et al. Measures of spike train synchrony for data with multiple time scales. Journal of Neuroscience Methods. 287, 25-38 (2017).
- Mendis, G. D. C., Morrisroe, E., Reid, C. A., Halgamuge, S. K., Petrou, S. Use of local field potentials of dissociated cultures grown on multi-electrode arrays for pharmacological assays. 38th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 952-956 (2016).
- Hughes, D. I., et al. Morphological, neurochemical and electrophysiological features of parvalbumin-expressing cells: a likely source of axo-axonic inputs in the mouse spinal dorsal horn. The Journal of Physiology. 590 (16), 3927-3951 (2012).
- Peirs, C., Seal, R. P. Neural circuits for pain: recent advances and current views. Science. 354 (6312), 578-584 (2016).
- Li, J., Baccei, M. L. Developmental regulation of membrane excitability in rat spinal lamina I projection neurons. Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2604-2614 (2012).
- Li, J., Baccei, M. L. Pacemaker neurons within newborn spinal pain circuits. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9010-9022 (2011).
- Sandkühler, J., Eblen-Zajjur, A. Identification and characterization of rhythmic nociceptive and non-nociceptive spinal dorsal horn neurons in the rat. Neuroscience. 61 (4), 991-1006 (1994).
- Lucas-Romero, J., Rivera-Arconada, I., Roza, C., Lopez-Garcia, J. A. Origin and classification of spontaneous discharges in mouse superficial dorsal horn neurons. Scientific Reports. 8 (1), 9735-9735 (2018).
- Antonio, L., et al. L. al. In vitro seizure like events and changes in ionic concentration. Journal of Neuroscience Methods. 260, 33-44 (2016).
- Avoli, M., Jefferys, J. G. Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 260, 26-32 (2016).
- Taccola, G., Nistri, A. Low micromolar concentrations of 4-aminopyridine facilitate fictive locomotion expressed by the rat spinal cord in vitro. Neuroscience. 126 (2), 511-520 (2004).
- Mitra, P., Brownstone, R. M. An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse. Journal of Neurophysiology. 107 (2), 728-741 (2012).
- Egert, U., Heck, D., Aertsen, A. Two-dimensional monitoring of spiking networks in acute brain slices. Experimental Brain Research. 142 (2), 268-274 (2002).
