Summary
本报告描述了基于转基因VGAT-Cre小鼠的电点燃生成颞叶癫痫模型的方法。点燃的VGAT-Cre小鼠可能有助于确定导致癫痫的原因和筛选新疗法。
Abstract
结果发现，VGAT-Cre小鼠的电点燃导致自发的运动和电图癫痫发作。最近的一篇论文侧重于独特的VGAT-Cre小鼠如何在点燃后发生自发性反复发作（SRS），并且可能的机制 - 将Cre插入VGAT基因 - 破坏其表达并降低GABA能张力。本研究将这些观察结果扩展到更大的小鼠队列，重点关注关键问题，例如SRS在点燃后持续多长时间以及动物性别和年龄的影响。本报告描述了以下关键步骤的协议：制作带有海马深度电极的耳机，用于电刺激和读取脑电图;手术将耳机牢固地固定在鼠标的头骨上，使其不会脱落;以及电点火协议的关键细节，例如脉冲持续时间、火车频率、火车持续时间和注入的电流量。点燃方案是稳健的，因为它可靠地导致大多数VGAT-Cre小鼠的癫痫，为测试新型抗癫痫药物提供了一种新模型。
Introduction
癫痫是一种主要的神经系统疾病，具有巨大的经济和人类负担。NINDS估计有300万美国人患有癫痫。这些患者中约有60万患有颞叶癫痫（TLE）1。不幸的是，由于无效，耐药性的发展或对副作用的不耐受，三分之一的患者对TLE的药物治疗失败了2。显然，迫切需要开发针对TLE的新疗法，美国癫痫学会基础科学委员会，国际抗癫痫联盟临床前癫痫药物发现工作组以及国家咨询神经系统疾病和中风委员会3，4都同意这一结论。
目前的颞叶癫痫动物模型使用化学惊厥药（例如红藻酸盐、毛果芸香碱）或长时间电刺激来诱导长期癫痫持续状态5，6，7。许多动物在手术过程中死亡（大鼠10%-30%，小鼠高达90%8）。存活和发展癫痫的动物在整个大脑中表现出广泛的神经元死亡9，10。这种死亡引发了一连串的反应，从小胶质细胞、星形胶质细胞和浸润单核细胞的激活开始。神经元反应包括回路重组（例如，苔藓纤维发芽），无法正确整合到回路中的新神经元的诞生（例如，异位颗粒细胞）以及导致过度兴奋的内在变化（例如，Na+通道的上调）。没有明显神经元死亡的癫痫模型将有助于寻找新的抗癫痫药物。
在测试癫痫的GABA假说时，发现用温和的电点火方案治疗VGAT-Cre小鼠导致自发运动和电图癫痫发作11。一般来说，啮齿动物的电点燃不会导致定义癫痫的自发性癫痫发作，尽管在过度点燃的情况下可以11.VGAT-Cre小鼠在囊泡GABA转运蛋白（VGAT）基因的控制下表达Cre重组酶，其在GABA能抑制神经元中特异性表达。结果发现，插入Cre会破坏VGAT在mRNA和蛋白质水平上的表达，从而损害GABA在海马体中的突触传递。结论是，点燃的VGAT-Cre小鼠可用于研究癫痫发生的机制和筛选新型疗法11。本报告详细介绍了用于生成模型的方法。
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Protocol
动物使用遵循ARRIVE12 指南，并得到弗吉尼亚大学动物护理和使用委员会的批准。
1. 制作带有两个双极电极的耳机（图 1）
图 1：EEG 耳机制造的关键步骤。 （A）电极在协议中各个步骤的外观（左侧匹配步骤中的数字）。（B） 安装在适合立体定位框架的自制支架中的最终产品的图片。请注意，支架末端有一个适合耳机基座的环销组件。 请点击此处查看此图的大图。
- 切割 3.5 厘米的不锈钢聚四氟乙烯涂层不锈钢丝。
- 从电线两端剥下约 1 毫米的绝缘涂层。不要剥太多的电线。
- 将两个销钉放在虎钳支架上，针脚的底部有一个较长的狭缝朝下。
- 将助焊剂涂在电线的剥皮端和引脚的顶部。
- 用刚好足够的焊料对电线的剥离部分进行镀锡。
- 在引脚顶部添加少量焊料，不要溢出到侧面。
- 将导线剥线端的一端放入引脚中，在焊料熔化时尽可能深。
注意：有一个侧孔，电线可以出来 - 不要让电线从针脚中出来。所有剥皮线必须留在引脚内。 - 对第二个引脚重复步骤1.6-1.7，现在使用导线的其他剥线端。
- 让引脚静置 30 秒以固定，将它们从虎钳支架上取下，然后拉动它们以确保电线和引脚之间的连接牢固且固定。
- 用冷水冲洗针脚，然后晾干。
- 使用欧姆表验证引脚 1 和引脚 2 之间的电导。
- 将电线末端的引脚放在一起;将它们平行并关闭。将止血器夹在电线的中心。然后，旋转止血器，使电线绕得相当紧。取下止血器。
- 将镊子夹在引脚下方 2 mm 的绞线上，并将电线弯曲 90°。
- 将同一根电线再次推回镊子上 90°，从第一根镊子处再弯曲 1 毫米。
- 用锋利的小剪刀将绞线在弯曲下方 45° 角处切割 3.5 毫米。
- 为每个耳机准备两个双极（双针双绞）电极（可选，第二个是备用，以防第一个出现电气问题）。
- 通过将两端焊接引脚的导线切成两端来准备一个参比电极（步骤1.1-1.17， 图1A）。
- 将电线切割在 7 毫米处。
- 将末端弯曲到尖端下方 1 毫米处。
- 然后，用镊子盖住弯曲的 1 毫米金属丝尖端，并将电线紧紧地旋转在镊子周围以形成一个小环（直径 1 毫米）。
- 垂直于导线的直线部分弯曲环，使导线尖端再次指向外。
- 将两个双极电极和单参比电极组装到六针基座中，双极电极并排放置，它们之间的距离为 6 mm，参比电极放置在中间外孔中（图 1B）。
注意：另一种方法是植入电极，将它们粘合到位，然后将其引脚插入基座中。
2. 立体定位电极植入术
- 在手术前通过高压灭菌对所有手术工具和六针电极组件进行消毒。手术过程中必须保持无菌手术区域，并且必须使用无菌手术手套。建议使用无菌窗帘（例如，按密封）覆盖动物，手术区域除外。
- 断奶后4周使用8周龄的VGAT-Cre小鼠（年龄匹配，雄性和雌性）进行手术。在手术前记录动物的体重，以测量手术后的体重减轻。
- 使用经过认证的异氟烷蒸发器或配备精密注射泵、集成数字蒸发器和反馈热垫的低流量麻醉系统。
注意：低流量系统能够以与动物大小成比例的低流速将麻醉输送到诱导室或通过立体定位框架上的鼻锥（70 mL/min，空气中异氟烷浓度为诱导4%，手术为2%）。使用较少的麻醉不仅在手术期间有益于动物，而且还降低了实验室人员接触异氟醚的风险。 - 将麻醉动物放在加热至37°C的加热垫上，以在手术过程中保持温暖。如果使用反馈控制的温度系统，请将轻度润滑的温度探头插入动物的直肠，以便在手术过程中进行温度监测。
- 通过将耳杆轻轻放入耳朵并将前上牙放入门牙杆，将动物安装在立体定位框架上。将鼻锥放在鼻子上以进行适当的麻醉输送。确保头部水平并居中，并且在稍微探入时不能移动。
- 皮下注射0.5mL正糖醇进行水合作用。
- 涂抹眼部润滑剂以防止角膜干燥。
- 通过捏住后肢脚趾后无退出反射来监测麻醉深度，然后在手术期间将异氟醚降低至1.5%-2.0%。
- 通过拔毛或使用剪刀（剃须）或脱毛膏去除手术区域及其周围的毛发，并通过三个循环交替施用碘和乙醇对皮肤进行消毒，最后用碘结束。仅当有办法在该位置维持麻醉时，才建议从手术部位去除毛发。如有必要，使用蘸有酒精的棉头涂抹器去除头部周围区域的毛发。皮下注射0.05mL局部镇痛药布比卡因（0.25%）。
- 用手术刀在头骨上切开一个切口，然后用锋利的手术剪刀切出一部分皮肤，露出头骨。用棉签将皮肤推到一边，清除颅骨上所有阻碍视线的肌肉和下层组织。
注意：要阻止意外出血，请用无菌棉签对出血部位施加压力，直到出血停止。 - 使用无菌棉签用过氧化氢清洁头骨，使颅骨缝合线以及前骨和λ可见。
- 彻底干燥头骨，然后使用其涂抹器涂抹一滴自蚀刻牙科粘合剂。将其刷入颅骨，等待60秒，然后用牙科紫外线灯固化40秒。光滑的表面表明粘合剂已与头骨有效交联。
注：此步骤对于安全连接头戴式耳机至关重要。 - 使用 0.031“ 钻头 （0.79 mm） 在双边钻两个毛刺孔中，以植入海马深度电极（约 5，000 rpm）。在λ后面的小脑上方为参比电极钻一个额外的毛刺孔。
注意：钻孔时，请注意缓慢降低钻头，避免钻入大脑。 - 电极的坐标如下（来自前苔，单位为毫米）：后部 3 毫米、横向 3 毫米和深度为 3 毫米的海马电极;以及后部 6 mm、侧向 0 mm 和 0 mm 深度（硬膜下）的小脑参比电极。
- 为了提高精度，请使用立体定位安装的钻头，在接触前方时将立体定位机械手 X/Y 轴归零 - 这是坐标的参考点。
- 将所有电极插入六针基座中来组装耳机，确保将针脚一直推入基座。将基座安装到立体定位框架上的电极支架中（图1B）。
- 将电极对准相应的毛刺孔上方。通过缓慢降低耳机并将电极引导到毛刺孔中，立体定位将扭曲的双极不锈钢丝电极植入左右海马体，并将参比电极植入小脑。
- 当海马扭曲电极正上方时，将 Z 轴归零并缓慢降低到 -3.0 mm。
- 用牙科水泥覆盖颅骨表面和电极，并填充颅骨表面和基座底部之间的空间。皮肤边缘将与牙科水泥相邻，这样下面的组织就不会暴露在外。等待水泥干燥并硬化。然后将电极支架从立体定位臂上拆下，并从基座上取下支架。
- 注射 0.1 mL 酮洛芬 （1 mg/mL， SC） 用于镇痛，第二剂 0.5 mL 正糖醇 （SC） 用于水合作用，并将动物从立体定位框架中取出。
- 将预热至37°C的等温垫放在用纸巾覆盖的空动物饲养笼内。一旦它完全清醒，将动物放在一个干净的笼子里，里面有床上用品和软食物，然后将其放回动物园。从这一点开始，动物被单独饲养，以防止互相咀嚼对方的耳机。钢丝杆料斗不是为了避免耳机卡住，而是将水瓶绑在笼子顶部的下面，床上用品中存在食物。
- 手术后72小时给动物喂一些软食物，并监测体重减轻和身体状况评分。如果脱水（体重减轻，皮肤弹性增加，眼睛凹陷），脱水动物可以皮下给予0.5mL正糖醇。酮洛芬可以在手术后皮下注射，每天一次，持续 2 天（根据当地 IACUC 指南遵循镇痛方案）。让动物在笼子里完全恢复 4-7 天，然后再转移到脑电图记录系统。
3. 电火协议
- 使用适合鼠标头和换向器上的插座的柔性电缆将小鼠连接到 EEG 记录系统（请参阅 材料表 列表）。让动物适应一天，然后再进行下面的电刺激方案。每天监测他们的整体健康状况和适应情况，并在出现疾病、痛苦和/或体重持续减轻超过 25% 的迹象时将其从系统中移除
- 将激励电极的两根引线连接到恒流刺激器的输出端。
注意：有一个电路板将这些电极从脑电图记录仪切换到刺激器是非常有帮助的。 - 将刺激器设置为在 2 秒的列车持续时间内以 50 Hz 提供 1 ms 脉冲。
- 将刺激器的输出设置为 20 微安 （μA） 并提供 1st 脉冲。
- 监测脑电图，了解高频尖峰放电后的特征性，持续时间超过电刺激脉冲。
- 如果未观察到放电，则以20 μA的增量增加注入的电流量，直到触发放电后。所需的电流量是放电后阈值（ADT）。
- 典型ADT为20-50 μA。如果即使增加到 200 μA 后仍未观察到放电，则需要使用高灵敏度欧姆表对电气连接和耳机接线进行故障排除。如果问题出在刺激电极上，请尝试使用其他深度电极进行刺激。
- 每天使用该鼠标ADT值的1.5倍的电流刺激2次或6次点燃动物。
- 监测对刺激的行为反应，刺激从状态变化上升到双侧强直阵挛发作。使用改进的拉辛类系统得分11.为避免诱发致命的强直性癫痫发作，如果连续刺激导致癫痫发作的严重程度和持续时间增加，应暂停点燃，直至修改后的拉辛评分 6（跑步和跳跃）
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Representative Results
动物
该模型最初是在混合背景上使用VGAT-Cre小鼠（Slc32a1tm2（cre）Lowl/J）13 开发的。然而，它也已被应用于与C57BL / 6J同源的VGAT-Cre菌株。在菌株之间发展的癫痫中没有观察到差异。两种菌株在囊泡GABA转运蛋白启动子的控制下表达Cre重组酶。这些小鼠是通过在 Vgat 基因中的终止密码子之后敲入IRES-Cre盒产生的。这些小鼠正常繁殖，因此它们被维持为纯合子。为了防止菌落的遗传漂变，购买育种者并仅使用F1代小鼠进行实验。所有小鼠都被饲养在AAALAC认可的动物园中。小鼠可以自由获得食物和水，12小时的光照/黑暗循环和丰富的环境。对于脑电图（EEG）记录，将小鼠单独安置在透明的塑料笼子（自制）中，允许同时进行视频监测。使用雄性和雌性小鼠进行实验。在点燃率或癫痫发作频率方面，两性之间没有观察到差异。这些研究中的大多数在头戴式设备手术时使用8周龄的小鼠。但是，也可以使用4-20周大的小鼠。在 4 周时，小鼠头骨是其最终大小14 的 ~90%，因此贴上耳机对生长的影响很小。手术和点燃方案开始之间的时间并不重要，尽管在手术恢复72小时期间确实需要仔细观察小鼠。
点火参数
电刺激协议由Lothman及其同事开发，并在他们1989年的论文15中进行了详细描述。简而言之，海马电极连接到恒流刺激器，并在 2 秒内以 50 Hz 的速度传递 1 ms 双相方波脉冲。点火协议的各种参数已经过测试16.使用电流强度是触发该小鼠电图癫痫发作所需的最小电流量的 1.5 倍（放电后阈值，ADT）。每隔一天（2x，上午和下午早些时候）每天两次电刺激小鼠。 图2A 显示了点火协议和关键扣押特性的概述。然而，快速点燃方案也是有效的，本文中每隔一天（6x，两次刺激之间）刺激小鼠六次。有趣的是，就达到点火状态所需的刺激次数而言，2x 和 6x 协议之间的点燃速率相似（图 2B：2x，15 ± 1，n = 46; 6x，13 ± 1，n = 12，平均值± SEM，P = 0.3）。当总共五次刺激引起强直阵挛发作并失去姿势控制时，小鼠被认为是完全点燃的，在修改的拉辛量表17上的行为评分为5。可以进行超过此水平的点火，即所谓的过度点火，但有致命的强直性癫痫发作或SUDEP18的风险。该VGAT-Cre方案中的死亡率为~13%（119只小鼠中的15只）;这包括在诱发或自发性癫痫发作后死亡的两性小鼠（8只雄性，7只雌性）。
癫痫发作特性
这些研究中使用的记录系统已经停止使用。材料 表中提供了弗吉尼亚大学啮齿动物癫痫监测部门正在使用的脑电图记录装置的替代供应商。 图2A 显示了点火协议和关键扣押特性的概述。
图2：点燃VGAT-Cre小鼠的癫痫发作特性 。 （A）实验时间过程示意图。（二）达到完全点火状态所需电刺激次数的分布。当刺激引起五次双侧强直阵挛运动发作时，即可达到点燃状态。（C）最后一次电刺激后首次自发性癫痫发作的潜伏期分布。（D）观察到的癫痫发作频率的分布，其计算方法是癫痫发作总数除以记录的天数。（E）小鼠癫痫发作时间的分布，定义为癫痫发作间隔低于5天的自发性发作。所有图表都使用小提琴图，其中中位数用暗线显示，第 25和第 75个 四分位数用浅线显示。每个图中的动物数量显示在 X 轴上。 请点击此处查看此图的大图。
VGAT-Cre小鼠通常在15次刺激后达到点燃状态标准（合并2x和6x方案，平均±SD为7.4次刺激， 图2B）。从数据的小提琴图可以看出，许多动物需要较少的刺激（10），许多动物需要更多（18）。目前还无法找到决定差异的因素，不包括性别、年龄、ADT 值或电极放置。在被点燃的几周内，大多数小鼠会出现多次自发性癫痫发作（90%），这定义了癫痫。自发性反复发作（SRS）的潜伏期为10.7±6.3天（图2C）。一小部分小鼠在达到点燃状态之前发展SRS。如前所述11，VGAT-Cre小鼠不是自发性癫痫，需要电刺激才能发展为癫痫。一旦癫痫发作开始，它们以每天1.3±0.6次癫痫发作的频率发生（图2D）。所有电图癫痫发作均伴有强直阵挛性运动发作。最初的研究是短期的（自发性癫痫发作频率测量1-2周），但当记录期延长时，发现癫痫发作频率随着时间的推移而减少。使用连续 5 天无癫痫发作的任意截断，可靠的癫痫发作发生 23 ± 11 天。综上所述，这定义了点燃VGAT-Cre小鼠对药物筛选活动有用的时期。使用这些SD和减少50%的效应大小的功效分析表明，每组需要16只小鼠才能对点燃刺激，癫痫发作频率和癫痫持续时间产生统计学上的显着影响。
点燃的VGAT-Cre模型与癫痫持续状态模型的一个区别在于没有神经元死亡。使用两种公认的方法（图3）进行测定：一种，通过计数用抗NeuN抗体染色的CA1层中的细胞核;第二，通过测量易受化学惊厥诱导的细胞死亡（齿状、CA1 和内嗅皮层）影响的海马亚野中的氟玉 C 染色量。
图 3：通过抗 NeuN 染色或 Fluoro-Jade C 染色测定的神经元死亡。 （A）海马体和内嗅皮层各个子领域中抗NeuN阳性神经元的图。简称如下：DGC、齿状颗粒细胞层;肺门是指齿状肺门，CA1，角氨锥体I层;和EC，内嗅皮层;L2，第 2 层;和 L3，第 3 层。从每只动物身上染色两个水平脑切片，对应于前膛下-4mm（对照幼稚小鼠，n = 7;癫痫VGAT-Cre，n = 13;详见Straub等人11）。将数据标准化为在相应亚领域中的幼稚VGAT-Cre小鼠中确定的平均神经元计数。来自癫痫VGAT-Cre小鼠（B）和状态后大鼠（C）的Fluoro-Jade C染色图像（Li/毛果芸香碱模型，有关详细信息和分析，请参阅Dey等人10）。VGAT-Cre小鼠的Fluoro-Jade C染色分析在Straub等人11中提出）。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
本报告描述了一种协议，其中电点燃小鼠导致癫痫。由于刺激电极放置在海马体中，因此这是一种局灶性边缘癫痫，可模拟患者的颞叶癫痫（TLE）。该协议中的一个关键步骤是使用VGAT-Cre小鼠，由于在 Vgat 基因中插入IRES-Cre重组酶盒，显示出抑制性GABA电流受损11。C57BL / 6在使用该协议点燃后不会发生癫痫，尽管其他小鼠品系可能会。
该方案是使用在海马体中放置刺激深度电极来开发的。坐标为目标提供了内嗅皮层进入CA1子场时的穿孔路径投影。电刺激引起的电场尚未定义，因此，电极的精确位置并不重要。事实上，啮齿动物可以在边缘回路的任何地方被电点燃，例如杏仁核和梨状皮层19。以下是协议中的关键步骤：第一，正确焊接EEG耳机以确保对刺激电流的低电阻;第二，使用牙科诊所中使用的牙科粘合剂与颅骨结合并提供粘附牙科水泥的表面;第三，使用恒流放大器来传递所描述的电脉冲。
故障排除通常仅限于检查电气连接，包括耳机中的连接、耳机与电缆的连接、与换向器的电缆以及换向器与记录设备的换向器。使用高灵敏度的欧姆表至关重要。
该技术的局限性包括需要适当的专业知识和设备来执行手术和记录脑电图。
与现有的TLE动物模型相比，该模型的一个优点是神经元的死亡最小11。其他TLE模型是癫痫持续状态后模型，其触发广泛的神经元死亡10。这种死亡导致小胶质细胞、星形胶质细胞的广泛活化和循环单核细胞的浸润。综上所述，很难区分导致癫痫的机制和长期癫痫持续状态引发的机制。预计点燃的VGAT-Cre小鼠将有助于开发抗癫痫和抗癫痫的新疗法。本报告提供了关键指标和功效分析，可以指导未来使用这些小鼠的药物开发工作。
点燃VGAT-Cre模型的另一个优点是患癫痫的动物比例高（90%）和自发性癫痫发作的规律性。该模型的缺点是癫痫发作频率相对较低（1.5 /天），并且癫痫发作频率在 3 周后下降，在某些情况下癫痫发作似乎停止。正在努力解决这些问题。
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Disclosures
作者没有需要披露的冲突。
Acknowledgments
作者感谢约翰威廉姆森关于该协议的有益讨论。这项工作得到了NIH / NINDS资助NS112549的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16 Channel Extracellular Differential AC Amplifier (115V/60Hz) | AD Instruments | AM3500-115-60 | Alternate EEG amplifier |
| 363/CP PLUG COLLAR, PINS SLEEVE | P1 Technologies | 363SLEEVPIN0NL | For electrode holder |
| Cable, 363-363 5CM - 100CM W/MESH 6TCM | P1 Technologies | 363363XXXXCM004 | mouse-to-commutator cable |
| CCTV cameras Qcwox HD Sony IR LED | Sony | QC-SP316 | |
| Commutator SL6C/SB (single brush) | P1 Technologies | 8BSL6CSBC0MT | formerly Plastics One, Inc. |
| Current amplifier | A-M Systems | Model 2100 | |
| Dental cement | Stoelting | 51459 | |
| Drill bits, #75, OD 0.310" LOC 130 PT | Kyocera | 105-0210.310 | |
| E363/0 SOCKET CONTACT SKEWED | P1 Technologies | 8IE3630XXXXE | pins for connector |
| iBond Self Etch glue | Kulzer | CE0197 | |
| MS363 PEDESTAL 2298 6 PIN WHITE | P1 Technologies | 8K000229801F | EEG headset connector |
| Ohmeter | Simpson | 260 | High sensitivity |
| PowerLab 16/35 and LabChart Pro | AD Instruments | PL3516/P | Alternate EEG software |
| SomnoSuite | Kent Scientific Corp. | SS-01 | anesthesia unit & RightTemp monitoring |
| Stereotactic drill and micromotor kit | Foredom Electric Co. | K.1070 | |
| Stereotactic frame | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Teflon-coated wire for depth electrode, OD 0.008' | A-M Systems | 791400 | |
| VGAT-Cre mice on congenic C57BL/6J background | The Jackson Laboratory | 000664 |
References
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