Summary
Denne rapport beskriver metoderne til at generere en model af temporal lobe epilepsi baseret på elektrisk antænding af transgene VGAT-Cre-mus. Kindled VGAT-Cre-mus kan være nyttige til at bestemme, hvad der forårsager epilepsi og til screening af nye terapier.
Abstract
Det blev opdaget, at elektrisk antænding af VGAT-Cre-mus førte til spontane motoriske og elektrografiske anfald. En nylig artikel fokuserede på, hvordan unikke VGAT-Cre-mus blev brugt til at udvikle spontane tilbagevendende anfald (SRS) efter antænding, og en sandsynlig mekanisme - indsættelse af Cre i VGAT-genet - forstyrrede dets ekspression og reducerede GABAergic tone. Denne undersøgelse udvider disse observationer til en større kohorte af mus med fokus på nøglespørgsmål som hvor længe SRS fortsætter efter antænding og effekten af dyrets køn og alder. Denne rapport beskriver protokollerne for følgende vigtige trin: fremstilling af headset med hippocampale dybdeelektroder til elektrisk stimulering og til læsning af elektroencefalogrammet; kirurgi for at fastgøre headsettet sikkert på musens kranium, så det ikke falder af; og nøgledetaljer om den elektriske tændingsprotokol, såsom pulsens varighed, togets frekvens, togets varighed og mængden af injiceret strøm. Optændingsprotokollen er robust, fordi den pålideligt fører til epilepsi hos de fleste VGAT-Cre-mus, hvilket giver en ny model til test for nye antiepileptogene lægemidler.
Introduction
Epilepsi er en alvorlig neurologisk lidelse med betydelige økonomiske og menneskelige byrder. NINDS anslår, at der er 3 millioner amerikanere med epilepsi. Ca. 0,6 millioner af disse patienter har tindingelapepilepsi (TLE)1. Desværre mislykkes medicinsk behandling af TLE hos en tredjedel af patienterne på grund af ineffektivitet, udvikling af lægemiddelresistens eller intolerance over for bivirkninger2. Det er klart, at der er et betydeligt behov for at udvikle nye terapier til TLE, en konklusion, der deles af American Epilepsy Society Basic Science Committee, International League Against Epilepsy Working Group for Preclinical Epilepsy Drug Discovery og National Advisory Neurological Disorders and Stroke Council 3,4.
Nuværende dyremodeller af temporal lobe epilepsi bruger enten kemokonvulsiva (fx kainat, pilocarpin) eller langvarig elektrisk stimulering for at inducere en langvarig status epilepticus 5,6,7. Mange dyr dør under proceduren (10% -30% hos rotter, op til 90% hos mus8). Dyr, der overlever og udvikler epilepsi, viser omfattende neuronal død i hele hjernen 9,10. Denne død udløser en kaskade af reaktioner, der begynder med aktiveringen af mikroglia, astrocytter og infiltrerende monocytter. Neuronale reaktioner omfatter kredsløbsreorganisering (f.eks. Mossy fiber spiring), fødsel af nye neuroner, der ikke integreres korrekt i kredsløb (fx ektopiske granulatceller) og iboende ændringer, der fører til hyperexcitabilitet (fx opregulering af Na + kanaler). En epilepsimodel uden signifikant neuronal død vil lette søgningen efter nye antiepileptiske lægemidler.
Mens man testede GABA-hypotesen om epilepsi, blev det opdaget, at behandling af VGAT-Cre-mus med en mild elektrisk antændingsprotokol førte til spontane motoriske og elektrografiske anfald11. Generelt fører den elektriske antænding af gnavere ikke til spontane anfald, der definerer epilepsi, selvom det kan i tilfælde af overtænding11. VGAT-Cre-mus udtrykker Cre-rekombinase, under kontrol af VGAT-genet (vesikulær GABA-transportør), som specifikt udtrykkes i GABAerge hæmmende neuroner. Det blev konstateret, at indsættelse af Cre forstyrrede ekspressionen af VGAT på mRNA- og proteinniveauerne og dermed forringede GABAerg synaptisk transmission i hippocampus. Det blev konkluderet, at tændte VGAT-Cre-mus kunne være nyttige til at studere mekanismerne involveret i epileptogenese og til screening af nye lægemidler11. Denne rapport indeholder en detaljeret beskrivelse af de metoder, der er anvendt til at generere modellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrebrug fulgte ARRIVE12 retningslinjer og blev godkendt af Animal Care and Use Committee ved University of Virginia.
1. Fremstilling af headset med to bipolære elektroder (figur 1)
Figur 1: Vigtige trin i fremstillingen af EEG-headset. (A) Elektrodernes udseende på de forskellige trin i protokollen (tal i venstre matchtrin). (B) Et billede af slutproduktet monteret i en hjemmelavet holder, der passer til stereotaxic rammen. Bemærk, at holderen slutter med en kravestiftsamling, der passer ind i headsetpiedestalen. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Skær 3,5 cm rustfri polytetrafluorethylenbelagt rustfri ståltråd.
- Fjern ca. 1 mm af isoleringsbelægningen fra ledningen i begge ender. Har ikke for meget af ledningen strippet.
- Sæt to stifter på en skruestikholder med den nederste del af stiften, der har en længere slids nedad.
- Påfør flux på de afstrippede ender af ledningen og på toppen af stifterne.
- Tin den strippede del af ledningen med lige nok loddemetal til at belægge den.
- Tilsæt en minimal mængde loddemetal til toppen af stiften uden at flyde over på siderne.
- Placer den ene ende af de strippede ender af ledningen i stiften så dybt som det tillader, mens loddet smeltes.
BEMÆRK: Der er et sidehul, hvor ledningen kan komme ud - lad ikke ledningen komme ud af stiften. Al den fjernede ledning skal forblive inden for stiften. - Gentag trin 1.6-1.7 for den anden stift, nu med de andre afskårne ender af ledningen.
- Lad stifterne sidde i 30 s for at sætte sig, fjern dem fra skruestikholderen, og træk derefter i dem for at sikre, at forbindelsen mellem ledningen og stifterne er stærk og holder.
- Skyl stifterne i koldt vand, og tør derefter.
- Kontroller konduktansen mellem pin 1 og pin 2 ved hjælp af et ohmmeter.
- Bring stifterne i enderne af ledningen sammen; Hold dem parallelt og tæt. Klem en hemostat til midten af ledningen. Drej derefter hæmostaten, så ledningen snor sig ret stramt. Fjern hæmostaten.
- Fastgør en tang på den snoede ledning 2 mm under stifterne, og bøj ledningen 90°.
- Skub den samme ledning igen 90° tilbage over tangen, og lav endnu en bøjning 1 mm fra den første.
- Klip den snoede ledning i en vinkel på 45° under bøjningen ved 3,5 mm med en lille skarp saks.
- Forbered to af disse bipolære (dobbeltpolede snoede) elektroder til hvert headset (valgfrit, andet er backup i tilfælde af elektriske problemer med det første).
- En enkelt referenceelektrode fremstilles ved at skære en ledning med loddestifter i begge ender i to (trin 1.1-1.17, figur 1A).
- Skær ledningen ved 7 mm.
- Bøj enden 1 mm under spidsen.
- Dæk derefter den bøjede 1 mm spids af ledningen med tang og drej ledningen tæt omkring tangen for at skabe en lille løkke (1 mm i diameter).
- Bøj løkken vinkelret på den lige del af ledningen for at få trådspidsen til at pege udad igen.
- De to bipolære elektroder og den enkelte referenceelektrode samles i soklen med seks ben på en sådan måde, at de bipolære elektroder er side om side med 6 mm afstand mellem dem, og at referenceelektroden placeres i det midterste ydre hul (figur 1B).
BEMÆRK: En alternativ metode er at implantere elektroderne, cementere dem på plads og derefter indsætte deres stifter i piedestalen.
2. Stereotaksisk elektrodeimplantation
- Steriliser alle kirurgiske værktøjer og den seks-polede elektrodesamling ved autoklavering før operationen. Et sterilt kirurgisk felt skal opretholdes under operationen, og sterile kirurgiske handsker skal anvendes. Sterile gardiner (f.eks. Press n' Seal) anbefales at dække dyret undtagen det kirurgiske område.
- Brug 8 uger gamle VGAT-Cre-mus (aldersmatchede, både han- og hundyr) til operationer 4 uger efter fravænning. Optag dyrets vægt før operationen for at muliggøre måling af postkirurgisk vægttab.
- Brug en certificeret isofluranfordamper eller et lavflowanæstesisystem udstyret med en præcisionssprøjtepumpe, integreret digital fordamper og feedbackvarmepude.
BEMÆRK: Lavstrømssystemer er i stand til at levere anæstesi ved lave strømningshastigheder, der er proportionale med dyrets størrelse, til enten et induktionskammer eller gennem en næsekegle på stereotaksrammen (70 ml / min, isoflurankoncentration i luft er 4% for induktion og 2% for kirurgi). Brug af mindre anæstesi gavner ikke kun dyret under operationer, men reducerer også risikoen for laboratoriepersonalets eksponering for isofluran. - Anbring det bedøvede dyr på en opvarmet pude opvarmet til 37 °C for at holde det varmt under operationen. Hvis du bruger et feedback-kontrolleret temperatursystem, skal du indsætte den let smurte temperatursonde i dyrets endetarm til temperaturovervågning under operationen.
- Monter dyret på den stereotaksiske ramme ved forsigtigt at placere ørestænger i ørerne og de forreste øvre tænder i forænderstangen. Placer næsekeglen over næsen for korrekt anæstesilevering. Sørg for, at hovedet er nivelleret og centreret og ikke kan flyttes, når det er let undersøgt.
- Subkutant injiceres 0,5 ml normosol til hydrering.
- Påfør okulært smøremiddel for at forhindre hornhindetørring.
- Overvåg for dybden af anæstesi ved fravær af tilbagetrækningsrefleksen efter klemning af en bagbentå, og reducer derefter isofluran til 1,5% -2,0% under operationen.
- Fjern hår på og omkring det kirurgiske område ved at plukke eller bruge klippere (barbering) eller hårfjerningscreme, og desinficere huden med tre cyklusser med skiftevis påføring af jod og ethanol, efterbehandling med jod. Det anbefales kun at fjerne hår væk fra det kirurgiske sted, hvis der er midler til at opretholde anæstesi på dette sted. Brug om nødvendigt alkoholdyppede applikatorer til bomuldsspidser til at fjerne hår fra det umiddelbare område omkring hovedet. Injicer 0,05 ml af det lokale smertestillende bupivacain (0,25%) subkutant.
- Lav et snit på kraniet ved hjælp af en skalpel, og skær derefter en del af huden ud med skarp kirurgisk saks og udsæt kraniet. Skub huden til side ved hjælp af en vatpind, rengør kraniet fra alle muskler og underliggende væv, der forhindrer udsigten.
BEMÆRK: For at stoppe utilsigtet blødning skal du lægge tryk over blødningsstedet med en steril vatpind, indtil den stopper. - Rens kraniet med hydrogenperoxid ved hjælp af sterile vatpinde for at gøre kraniets suturer og både bregma og lambda synlige.
- Tør kraniet grundigt, og påfør derefter en dråbe selvætsende tandklæbemiddel ved hjælp af dets applikator. Børst det ind i kraniet, vent 60 s, og hærd med et dental UV-lys i 40 s. En blank overflade indikerer, at klæbemidlet effektivt er blevet tværbundet med kraniet.
BEMÆRK: Dette trin er afgørende for sikker fastgørelse af headsettet. - Brug et 0,031" bor (0,79 mm) til at bore to grathuller bilateralt til implantation af hippocampale dybdeelektroder (ca. 5.000 omdr./min.). Bor et ekstra grathul til referenceelektroden over lillehjernen bag lambdaen.
BEMÆRK: Når du borer, skal du sørge for at sænke boret langsomt og undgå at bore ind i hjernen. - Koordinaterne for elektroderne er som følger (fra bregma i mm): hippocampale elektroder ved 3 mm bageste, 3 mm laterale og 3 mm dybde; og cerebellær referenceelektrode ved 6 mm bageste, 0 mm laterale og 0 mm dybde (subdural).
- For at øge nøjagtigheden skal du bruge en stereotaksisk monteret boremaskine, nulstille stereotaxic manipulator X / Y-aksen, når du rører bregma - dette er referencepunktet for koordinaterne.
- Saml et headset ved at indsætte alle elektroderne i den seksbenede piedestal, og sørg for, at stifterne skubbes helt ind i piedestalen. Monter soklen i elektrodeholderen på en stereotaksisk ramme (figur 1B).
- Juster elektroder over de tilsvarende grathuller. Stereotaksisk implantering af snoede bipolære trådelektroder i rustfrit stål i højre og venstre hippocampus og referenceelektrode ind i lillehjernen ved langsomt at sænke headsettet og lede elektroderne ind i burrhullerne.
- Når hippocampal twistelektroden er lige over hullet, nulstilles Z-aksen og sænkes langsomt til -3,0 mm.
- Dæk kraniets overflade og elektroder med tandcement og udfyld mellemrummet mellem kraniets overflade og bunden af piedestalen. Hudkanterne støder op til tandcementen, således at intet underliggende væv forbliver eksponeret. Vent til cementen tørrer og hærder. Fjern derefter elektrodeholderen fra stereotaksarmen, og fjern holderen fra piedestalen.
- Injicer 0,1 ml ketoprofen (1 mg / ml, SC) til analgesi og en anden dosis på 0,5 ml normosol (SC) til hydrering og fjern dyret fra stereotaxic rammen.
- Anbring en isotermisk pude, der er forvarmet til 37 °C, inde i et tomt vivariumbur dækket med et køkkenrulle. Når det er helt vågen, skal du placere dyret i et rent bur med strøelse og blød mad og returnere det til vivariumet. Dyrene er opstaldet enkeltvis fra dette tidspunkt for at forhindre tygge på hinandens headset. Wire bar hoppers bruges ikke til at undgå, at headsets sidder fast, og i stedet er vandflasker bundet til undersiden af burtoppene, og chow er til stede i sengetøjet.
- Foder dyret noget blødt mad i 72 timer efter operationen, og overvåg for vægttab og kropstilstandsscore. Dehydrerede dyr kan administreres 0,5 ml normosol subkutant, hvis dehydreret (vægttab, øget hudturgor, sunkne øjne). Ketoprofen kan gives subkutant en gang dagligt i yderligere 2 dage efter operationen (følg analgesiregimet i henhold til de lokale IACUC-retningslinjer). Lad dyrene komme sig fuldstændigt i deres bure i 4-7 dage, før de overføres til EEG-registreringssystemet.
3. Protokol for elektrisk antænding
- Tilslut musene til EEG-optagelsessystemet ved hjælp af et fleksibelt kabel, der passer til stikkene på musehovedet og kommutatoren (se listen over materialetabeller ). Lad dyrene akklimatisere sig i en dag, før du fortsætter med nedenstående protokol for elektrisk stimulering. Overvåg deres generelle helbred og akklimatisering dagligt, og fjern dem fra systemet, når der er tegn på sygdom, nød og / eller kontinuerligt vægttab på over 25%
- Tilslut begge ledninger fra den stimulerende elektrode til udgangen af en konstant strømstimulator.
BEMÆRK: Det er meget nyttigt at have et printkort, der skifter disse elektroder væk fra EEG-optageren og til stimulatoren. - Indstil stimulatoren til at levere 1 ms impulser ved 50 Hz i en togvarighed på 2 s.
- Indstil stimulatorens udgang til 20 mikroampere (μA), og aflever 1. puls.
- Overvåg EEG for en karakteristisk efterladning af højfrekvente pigge, der overlever den elektriske stimuleringspuls.
- Hvis der ikke observeres nogen udledning, øges mængden af injiceret strøm i trin på 20 μA, indtil en efterafladning udløses. Den krævede strømmængde er tærsklen efter afladning (ADT).
- Typiske ADT'er er 20-50 μA. Hvis der ikke observeres nogen udladning, selv efter at den er steget til 200 μA, kræves fejlfinding af elektriske forbindelser og headsetledninger med et ohmmeter med høj følsomhed. Hvis problemet er i den stimulerende elektrode, så prøv at stimulere med de andre dybdeelektroder.
- Dyr tændes ved at stimulere enten 2x eller 6x om dagen ved hjælp af en strøm, der er 1,5x ADT-værdien for den mus.
- Overvåg adfærdsresponsen på stimuleringen, som stiger fra tilstandsændringen til bilaterale tonisk-kloniske anfald med faldende. Score ved hjælp af et modificeret Racine-klassesystem11. For at undgå fremkaldte dødelige toniske anfald bør antænding sættes på pause, hvis successive stimuli fører til eskalerende sværhedsgrad og længde af anfald op til modificeret Racine score 6 (løb og spring)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dyr
Modellen blev oprindeligt udviklet ved hjælp af VGAT-Cre-mus (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J)13 på en blandet baggrund. Men, Det er også blevet anvendt på VGAT-Cre stamme, der er kongen med C57BL/6J. Der er ikke observeret nogen forskel i epilepsi, der udvikler sig mellem stammerne. Begge stammer udtrykker Cre rekombinase, under kontrol af den vesikulære GABA-transportørpromotor. Disse mus blev genereret ved at banke en IRES-Cre-kassette ind efter stopkodonet i Vgat-genet . Disse mus opdrætter normalt, så de opretholdes som homozygoter. For at forhindre koloniens genetiske drift skal du købe opdrættere og kun bruge F1-generationsmus til forsøg. Alle mus blev anbragt i et AAALAC-akkrediteret vivarium. Mus fik fri adgang til mad og vand, 12 timers lyse / mørke cyklusser og et beriget miljø. Til elektroencefalografisk (EEG) optagelse blev mus individuelt anbragt i klare plastbure (hjemmelavede), hvilket muliggjorde samtidig videoovervågning. Brug både han- og hunmus til eksperimenter. Der er ikke observeret nogen forskel mellem kønnene med hensyn til antændelseshastighed eller anfaldsfrekvens. Størstedelen af disse undersøgelser anvendte 8 uger gamle mus på tidspunktet for headsetoperation. Man kan dog også bruge mus, der er mellem 4-20 uger gamle. Efter 4 uger er musekraniet ~ 90% af sin endelige størrelse14, så anbringelse af et headset har minimal effekt på væksten. Tiden mellem operationen og påbegyndelsen af tændingsprotokollen er ikke kritisk, selvom mus skal observeres omhyggeligt under genopretning efter operation i 72 timer.
Tænding parametre
Den elektriske stimuleringsprotokol blev udviklet af Lothman og kolleger og beskrevet detaljeret i deres papirfra 1989 15. Kort sagt er hippocampalelektroden forbundet til en konstant strømstimulator, og en 1 ms bifasisk kvadratbølgepuls leveres ved 50 Hz over 2 s. Forskellige parametre i tændingsprotokollen er blevet testet16. Brug en strømintensitet, der er 1,5 gange den minimale mængde strøm, der kræves for at udløse et elektrografisk anfald for den mus (After-Discharge Threshold, ADT). Mus stimuleres elektrisk to gange om dagen hver anden dag (2x, midt om morgenen og tidlig eftermiddag). Figur 2A viser en oversigt over tændingsprotokollen og de vigtigste beslaglæggelsesegenskaber. Imidlertid er en hurtigtændingsprotokol også effektiv, her stimuleres mus seks gange om dagen leveret hver anden dag (6x, en time mellem stimuleringer). Interessant nok er antændingshastigheder ens mellem 2x og 6x protokoller med hensyn til antallet af stimuleringer, der kræves for at opnå den tændte tilstand (figur 2B: 2x, 15 ± 1, n = 46; 6x, 13 ± 1, n = 12, gennemsnit ± SEM, P = 0,3). Musene betragtes som fuldt tændte, når i alt fem stimuleringer fremkalder tonisk-kloniske anfald med tab af postural kontrol, hvilket er en adfærdsmæssig score på 5 på en modificeret Racine-skala17. Tænding ud over dette niveau, såkaldt overtænding, kan udføres, men medfører risiko for et dødeligt tonisk anfald eller SUDEP18. Dødeligheden i denne VGAT-Cre-protokol er ~ 13% (15 ud af 119 mus); Dette omfatter mus af begge køn, der døde efter enten fremkaldte eller spontane anfald (8 han, 7 hun).
Beslaglæggelse egenskaber
Det registreringssystem, der blev anvendt i disse undersøgelser, er blevet seponeret. Alternative leverandører af EEG-optagelsesopsætninger, der er i brug på University of Virginia Gnaverepilepsi Monitoring Unit, findes i materialetabellen. Figur 2A viser en oversigt over tændingsprotokollen og de vigtigste beslaglæggelsesegenskaber.
Figur 2: Beslaglæggelsesegenskaber hos antændte VGAT-Cre-mus. (A) Skematisk diagram over et forsøgs tidsforløb. (B) Fordelingen af antallet af elektriske stimuleringer, der kræves for at nå den fuldt tændte tilstand. Den tændte tilstand opnås, når stimuleringer fremkalder fem bilaterale tonisk-kloniske motoriske anfald. (C) Fordelingen af latenstid til første spontane anfald efter den sidste elektriske stimulering. D) Fordelingen af observerede anfaldsfrekvenser, der beregnes som det samlede antal anfald divideret med antallet af registrerede dage. (E) Fordelingen af, hvor længe mus var epileptiske som defineret ved spontane anfald, der forekom med et interval mellem anfald på under 5 dage. Alle graferne bruger violinplot, hvor medianen vises med en mørk linje, og 25. og 75. kvartil vises med lyse linjer. Antallet af dyr i hvert plot vises på X-aksen. Klik her for at se en større version af denne figur.
VGAT-Cre-mus når typisk kindled state-kriteriet efter 15 stimuleringer (poolede 2x- og 6x-protokoller, gennemsnit ± SD på 7,4 stimuleringer, figur 2B). Som det kan ses af violinplottet i dataene, kræver mange dyr færre stimuleringer (10), og mange kræver mere (18). Det har ikke været muligt at finde en faktor, der bestemmer forskellen, eksklusive køn, alder, ADT-værdi eller elektrodeplacering. Inden for få uger efter antændelse udvikler de fleste mus flere spontane anfald (90%), hvilket definerer epilepsi. Latenstiden for spontane tilbagevendende anfald (SRS) er 10,7 ± 6,3 dage (figur 2C). En brøkdel af mus udvikler SRS, før de når den tændte tilstand. Som nævnt tidligere11 er VGAT-Cre-mus ikke spontant epileptiske og kræver elektrisk stimulering for at udvikle epilepsi. Når anfald begynder, forekommer de med en frekvens på 1,3 ± 0,6 anfald om dagen (figur 2D). Alle elektrografiske anfald ledsages af tonisk-kloniske motoriske anfald. De indledende undersøgelser var kortvarige (spontan anfaldsfrekvens målt 1-2 uger), men da optagelsesperioden blev forlænget, blev det opdaget, at anfaldsfrekvensen faldt med tiden. Ved anvendelse af en vilkårlig afskæring på 5 på hinanden følgende dage uden beslaglæggelse forekommer pålidelige anfald i 23 ± 11 dage. Samlet set definerer dette perioden tændt VGAT-Cre-mus er nyttige til lægemiddelscreeningskampagner. Effektanalyse ved hjælp af disse SD og en effektstørrelse på 50% reduktion viser, at der kræves 16 mus pr. Gruppe for statistisk signifikante effekter på stimuleringer til tænding, anfaldsfrekvens og epilepsivarighed.
Et træk ved den tændte VGAT-Cre-model, der adskiller den fra epilepticusmodeller efter status, er fraværet af neuronal død. Dette blev analyseret ved hjælp af to accepterede metoder (figur 3): den ene ved at tælle kerner i CA1-laget farvet med anti-NeuN-antistof; og to ved at måle mængden af fluor-Jade C-farvning i hippocampale underfelter, der er sårbare over for kemokonvulsiv-induceret celledød (dentat, CA1 og entorhinal cortex).
Figur 3: Neuronal død som analyseret ved enten anti-NeuN-farvning eller fluor-Jade C-farvning . (A) Plot af anti-NeuN-positive neuroner i forskellige underfelter af hippocampus og entorhinal cortex. Forkortelser er som følger: DGC, dentat granulat cellelag; hilus henviser til dentate hilus, CA1, cornus ammonis pyramidelag I; og EF, entorhinal cortex; L2, lag 2; og L3, lag 3. To vandrette hjerneskiver svarende til -4 mm under bregma blev farvet fra hvert dyr (kontrolnaive mus, n = 7; epileptisk VGAT-Cre, n = 13; se Straub et al. for detaljer11). Data blev normaliseret til gennemsnitlige neurontal bestemt i naive VGAT-Cre-mus i det respektive underfelt. Billeder af fluor-Jade C-farvning fra en epileptisk VGAT-Cre-mus (B) og fra en post-status rotte (C) (Li/pilocarpin model, se Dey et al. for detaljer og analyse10). Analyse af fluor-Jade C-farvning af VGAT-Cre-mus blev præsenteret i Straub et al.11). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne rapport beskriver en protokol, hvor elektrisk optænding af mus fører til epilepsi. Da den stimulerende elektrode er placeret i hippocampus, er dette en fokal limbisk epilepsi, der modellerer temporal lobe epilepsi (TLE) hos patienter. Et kritisk trin i denne protokol er at bruge VGAT-Cre-mus, som på grund af indsættelse af en IRES-Cre-rekombinasekassette i Vgat-genet viser nedsatte hæmmende GABA-strømme11. C57BL/6 udvikler ikke epilepsi efter antændelse med denne protokol, selvom det er muligt, at andre stammer af mus vil.
Protokollen blev udviklet ved hjælp af placering af de stimulerende dybdeelektroder i hippocampus. Koordinaterne forsynede målet med de perforante banefremspring fra entorhinal cortex, når de kommer ind i CA1-underfeltet. Det elektriske felt induceret af elektrisk stimulering er ikke defineret, derfor er elektrodernes nøjagtige placering ikke kritisk. Faktisk kan gnavere tændes elektrisk overalt i det limbiske kredsløb, fx amygdala og piriform cortex19. Følgende er kritiske trin i protokollen: en, korrekt lodning af EEG-headsettet for at sikre lav modstand mod den stimulerende strøm; to, ved hjælp af et tandklæbemiddel, der er i brug i tandklinikker til at binde til kraniet og tilvejebringe en overflade til vedhæftning af tandcementen; og tre, brugen af en konstant strømforstærker til at levere de beskrevne elektriske impulser.
Fejlfinding er typisk begrænset til kontrol af elektriske forbindelser, som omfatter forbindelserne i headsettet, headsettet til kablet, kablet til kommutatoren og kommutatoren til optageenheden. Brug af et ohmmeter med høj følsomhed er kritisk.
Begrænsninger i teknikken omfatter kravet om passende ekspertise og udstyr til at udføre operationerne og registrere EEG.
En fordel ved modellen i forhold til eksisterende dyremodeller af TLE er, at der er minimal død af neuroner11. De andre TLE-modeller er post-status epilepticus-modeller, som udløser omfattende neuronal død10. Denne død fører til omfattende aktivering af mikroglia, astrocytter og infiltration ved cirkulerende monocytter. Samlet set bliver det vanskeligt at skelne mekanismer, der forårsager epilepsi, fra mekanismer udløst af langvarig status epilepticus. Det forventes, at tændte VGAT-Cre-mus vil være nyttige til udvikling af nye terapier, der både er anti-beslaglæggelse og anti-epileptisk. Denne rapport indeholder nøgletal og strømanalyse, der kan guide fremtidige lægemiddeludviklingsbestræbelser ved hjælp af disse mus.
En anden fordel ved den tændte VGAT-Cre-model er den høje procentdel af dyr, der udvikler epilepsi (90%) og regelmæssigheden af de spontane anfald. Ulemper ved modellen er en relativt lav anfaldsfrekvens (1,5/dag), og at anfaldsfrekvensen falder efter 3 uger, og i nogle tilfælde synes anfaldene at stoppe. Der arbejdes på at løse disse problemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker John Williamson for nyttige diskussioner om denne protokol. Dette arbejde blev støttet af NIH/NINDS bevilling NS112549.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16 Channel Extracellular Differential AC Amplifier (115V/60Hz) | AD Instruments | AM3500-115-60 | Alternate EEG amplifier |
| 363/CP PLUG COLLAR, PINS SLEEVE | P1 Technologies | 363SLEEVPIN0NL | For electrode holder |
| Cable, 363-363 5CM - 100CM W/MESH 6TCM | P1 Technologies | 363363XXXXCM004 | mouse-to-commutator cable |
| CCTV cameras Qcwox HD Sony IR LED | Sony | QC-SP316 | |
| Commutator SL6C/SB (single brush) | P1 Technologies | 8BSL6CSBC0MT | formerly Plastics One, Inc. |
| Current amplifier | A-M Systems | Model 2100 | |
| Dental cement | Stoelting | 51459 | |
| Drill bits, #75, OD 0.310" LOC 130 PT | Kyocera | 105-0210.310 | |
| E363/0 SOCKET CONTACT SKEWED | P1 Technologies | 8IE3630XXXXE | pins for connector |
| iBond Self Etch glue | Kulzer | CE0197 | |
| MS363 PEDESTAL 2298 6 PIN WHITE | P1 Technologies | 8K000229801F | EEG headset connector |
| Ohmeter | Simpson | 260 | High sensitivity |
| PowerLab 16/35 and LabChart Pro | AD Instruments | PL3516/P | Alternate EEG software |
| SomnoSuite | Kent Scientific Corp. | SS-01 | anesthesia unit & RightTemp monitoring |
| Stereotactic drill and micromotor kit | Foredom Electric Co. | K.1070 | |
| Stereotactic frame | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Teflon-coated wire for depth electrode, OD 0.008' | A-M Systems | 791400 | |
| VGAT-Cre mice on congenic C57BL/6J background | The Jackson Laboratory | 000664 |
References
- Lekoubou, A., Bishu, K. G., Ovbiagele, B. Nationwide trends in medical expenditures among adults with epilepsy: 2003-2014. Journal of the Neurological Sciences. 384, 113-120 (2018).
- Hauser, W. A., Hesdorffer, D. C. Epilepsy: Frequency, Causes, and Consequences. Epilepsy Foundation of America. , (1990).
- Galanopoulou, A. S., et al. Identification of new epilepsy treatments: issues in preclinical methodology. Epilepsia. 53 (3), 571-582 (2012).
- Kehne, J. H., Klein, B. D., Raeissi, S., Sharma, S. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP). Neurochemical Research. 42 (7), 1894-1903 (2017).
- Buckmaster, P. S. Laboratory animal models of temporal lobe epilepsy. Comparative Medicine. 54 (5), 473-485 (2004).
- Levesque, M., Avoli, M., Bernard, C. Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration. Journal of Neuroscience Methods. 260, 45-52 (2016).
- Loscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
- Buckmaster, P. S., Haney, M. M. Factors affecting outcomes of pilocarpine treatment in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Research. 102 (3), 153-159 (2012).
- Wang, L., Liu, Y. H., Huang, Y. G., Chen, L. W. Time-course of neuronal death in the mouse pilocarpine model of chronic epilepsy using Fluoro-Jade C staining. Brain Research. 1241, 157-167 (2008).
- Dey, D., et al. A potassium leak channel silences hyperactive neurons and ameliorates status epilepticus. Epilepsia. 55 (2), 203-213 (2014).
- Straub, J., et al. Characterization of kindled VGAT-Cre mice as a new animal model of temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 61 (10), 11 (2020).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 8 (6), 1000412 (2010).
- Vong, L., et al. Leptin action on GABAergic neurons prevents obesity and reduces inhibitory tone to POMC neurons. Neuron. 71 (1), 142-154 (2011).
- Vora, S. R., Camci, E. D., Cox, T. C. Postnatal ontogeny of the cranial base and craniofacial skeleton in male C57BL/6J mice: A reference standard for quantitative analysis. Frontiers in Physiology. 6, (2016).
- Lothman, E. W., Bertram, E. H., Bekenstein, J. W., Perlin, J. B. Self-sustaining limbic status epilepticus induced by 'continuous' hippocampal stimulation: electrographic and behavioral characteristics. Epilepsy Research. 3 (2), 107-119 (1989).
- Lothman, E. W., Williamson, J. M. Influence of electrical stimulus parameters on afterdischarge thresholds in the rat hippocampus. Epilepsy Research. 13 (3), 205-213 (1992).
- Lewczuk, E., et al. Electroencephalography and behavior patterns during experimental status epilepticus. Epilepsia. 59 (2), 369-380 (2018).
- Wenker, I. C., et al. Postictal death is associated with tonic phase apnea in a mouse model of sudden unexpected death in epilepsy. Annals of Neurology. 89 (5), 1023-1035 (2021).
- Morimoto, K., Fahnestock, M., Racine, R. J. Kindling and status epilepticus models of epilepsy: rewiring the brain. Progress in Neurobiology. 73 (1), 1-60 (2004).
