Summary
Dieser Bericht beschreibt die Methoden zur Erstellung eines Modells der Temporallappenepilepsie, das auf dem elektrischen Anzünden transgener VGAT-Cre-Mäuse basiert. Entzündete VGAT-Cre-Mäuse können nützlich sein, um die Ursachen von Epilepsie zu bestimmen und neue Therapien zu untersuchen.
Abstract
Es wurde entdeckt, dass das elektrische Anzünden von VGAT-Cre-Mäusen zu den spontanen motorischen und elektrographischen Anfällen führte. Eine kürzlich erschienene Arbeit konzentrierte sich darauf, wie einzigartige VGAT-Cre-Mäuse bei der Entwicklung spontan wiederkehrender Anfälle (SRS) nach dem Anzünden verwendet wurden, und ein wahrscheinlicher Mechanismus - die Insertion von Cre in das VGAT-Gen - störte seine Expression und reduzierte den GABAergen Tonus. Die vorliegende Studie dehnt diese Beobachtungen auf eine größere Kohorte von Mäusen aus und konzentriert sich auf Schlüsselfragen wie die Dauer des SRS nach dem Anzünden und die Auswirkungen des Geschlechts und des Alters des Tieres. Dieser Bericht beschreibt die Protokolle für die folgenden wichtigen Schritte: Herstellung von Headsets mit Hippocampus-Tiefenelektroden zur elektrischen Stimulation und zum Lesen des Elektroenzephalogramms; Operation, um das Headset sicher am Schädel der Maus zu befestigen, damit es nicht herunterfällt; und wichtige Details des elektrischen Anzündprotokolls wie Dauer des Impulses, Frequenz des Zuges, Dauer des Zuges und Menge des eingespeisten Stroms. Das Anzündprotokoll ist insofern robust, als es bei den meisten VGAT-Cre-Mäusen zuverlässig zu Epilepsie führt und ein neues Modell zum Testen auf neuartige Antiepileptogene Medikamente darstellt.
Introduction
Epilepsie ist eine schwere neurologische Erkrankung mit erheblichen wirtschaftlichen und menschlichen Belastungen. NINDS schätzt, dass es 3 Millionen Amerikaner mit Epilepsie gibt. Etwa 0,6 Millionen dieser Patienten leiden an Temporallappenepilepsie (TLE)1. Leider scheitert die medikamentöse Behandlung von TLE bei einem Drittel der Patienten aufgrund von Unwirksamkeit, Entwicklung von Arzneimittelresistenzen oder Unverträglichkeit gegenüber Nebenwirkungen2. Es besteht eindeutig ein erheblicher Bedarf, neuartige Therapien für TLE zu entwickeln, eine Schlussfolgerung, die vom Basic Science Committee der American Epilepsy Society, der International League Against Epilepsy Working Group for Preclinical Epilepsy Drug Discovery und dem National Advisory Neurological Disorders and Stroke Councilgeteilt wird 3,4.
Aktuelle Tiermodelle der Temporallappenepilepsie verwenden entweder Chemokonvulsiva (z. B. Kainat, Pilocarpin) oder eine verlängerte elektrische Stimulation, um einen lang anhaltenden Status epilepticus zu induzieren 5,6,7. Viele Tiere sterben während des Eingriffs (10%-30% bei Ratten, bis zu 90% bei Mäusen8). Tiere, die überleben und Epilepsie entwickeln, zeigen einen ausgedehnten neuronalen Tod im gesamten Gehirn 9,10. Dieser Tod löst eine Kaskade von Reaktionen aus, beginnend mit der Aktivierung von Mikroglia, Astrozyten und infiltrierenden Monozyten. Zu den neuronalen Reaktionen gehören die Reorganisation von Schaltkreisen (z. B. das Keimen moosiger Fasern), die Geburt neuer Neuronen, die sich nicht richtig in Schaltkreise integrieren (z. B. ektopische Körnerzellen), und intrinsische Veränderungen, die zu Übererregbarkeit führen (z. B. Hochregulierung von Na+-Kanälen). Ein Epilepsiemodell ohne signifikanten neuronalen Tod wird die Suche nach neuen Antiepileptika erleichtern.
Beim Testen der GABA-Hypothese der Epilepsie wurde entdeckt, dass die Behandlung von VGAT-Cre-Mäusen mit einem milden elektrischen Anzündprotokoll zu den spontanen motorischen und elektrographischen Anfällen führte11. Im Allgemeinen führt das elektrische Anzünden von Nagetieren nicht zu spontanen Anfällen, die Epilepsie definieren, obwohl dies bei übermäßigem Anzünden der Fall sein kann11. VGAT-Cre-Mäuse exprimieren die Cre-Rekombinase unter der Kontrolle des vesikulären GABA-Transporter-Gens (VGAT), das spezifisch in GABAergen inhibitorischen Neuronen exprimiert wird. Es wurde festgestellt, dass die Insertion von Cre die Expression von VGAT auf mRNA- und Proteinebene stört und somit die GABAerge synaptische Übertragung im Hippocampus beeinträchtigt. Es wurde der Schluss gezogen, dass entzündete VGAT-Cre-Mäuse nützlich sein könnten, um die Mechanismen der Epileptogenese zu untersuchen und neue Therapeutika zu untersuchen11. Der vorliegende Bericht beschreibt die Methoden, die bei der Erstellung des Modells verwendet werden, im Detail.
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Protocol
Die Verwendung von Tieren folgte den ARRIVE12-Richtlinien und wurde vom Animal Care and Use Committee der University of Virginia genehmigt.
1. Herstellung von Headsets mit zwei bipolaren Elektroden (Abbildung 1)
Abbildung 1: Wichtige Schritte bei der Herstellung von EEG-Headsets. (A) Aussehen der Elektroden bei den verschiedenen Schritten im Protokoll (Nummern im linken Übereinstimmungsschritt). (B) Ein Bild des Endprodukts, das in einer selbstgebauten Halterung montiert ist, die in den stereotaktischen Rahmen passt. Beachten Sie, dass die Halterung mit einem Kragenstift endet, der in den Headset-Sockel passt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
- Schneiden Sie 3,5 cm rostfreien Polytetrafluorethylen-beschichteten Edelstahldraht ab.
- Ziehen Sie an beiden Enden ca. 1 mm der Isolierschicht vom Draht ab. Lassen Sie nicht zu viel vom Draht abisolieren.
- Setzen Sie zwei Stifte auf einen Schraubstockhalter, wobei der untere Teil des Stifts einen längeren Schlitz nach unten hat.
- Tragen Sie Flussmittel auf die abisolierten Enden des Drahtes und auf die Oberseite der Stifte auf.
- Verzinn Sie den abisolierten Teil des Drahtes mit gerade genug Lot, um ihn zu beschichten.
- Fügen Sie eine minimale Menge Lot auf die Oberseite des Stifts hinzu, ohne auf die Seiten überzulaufen.
- Stecken Sie ein Ende der abisolierten Enden des Drahtes so tief wie möglich in den Stift, während das Lot geschmolzen ist.
HINWEIS: Es gibt ein seitliches Loch, aus dem der Draht herauskommen kann - lassen Sie den Draht nicht aus dem Stift herauskommen. Der gesamte abisolierte Draht muss innerhalb des Stifts bleiben. - Wiederholen Sie die Schritte 1.6-1.7 für den zweiten Pin, jetzt mit den anderen abisolierten Enden des Kabels.
- Lassen Sie die Stifte 30 Sekunden einwirken, entfernen Sie sie aus dem Schraubstockhalter und ziehen Sie dann daran, um sicherzustellen, dass die Verbindung zwischen dem Draht und den Stiften fest ist und hält.
- Spülen Sie die Stifte in kaltem Wasser ab und trocknen Sie sie dann ab.
- Überprüfen Sie die Leitfähigkeit zwischen Pin 1 und Pin 2 mit einem Ohmmeter.
- Bringen Sie die Stifte an den Enden des Drahtes zusammen; Halten Sie sie parallel und dicht. Klemmen Sie einen Hämostat an die Mitte des Drahtes. Drehen Sie dann den Hämostat, so dass sich der Draht ziemlich fest um sich selbst dreht. Entfernen Sie den Hämostat.
- Klemmen Sie eine Pinzette auf den verdrillten Draht 2 mm unter den Stiften und biegen Sie den Draht um 90°.
- Schieben Sie den gleichen Draht erneut um 90° über die Pinzette zurück, um eine weitere Biegung von 1 mm von der ersten zu erzeugen.
- Schneiden Sie den verdrillten Draht in einem Winkel von 45° unterhalb der Biegung bei 3,5 mm mit einer kleinen scharfen Schere ab.
- Bereiten Sie zwei dieser bipolaren (doppelpoligen verdrillten) Elektroden für jedes Headset vor (optional, zweite ist Backup bei elektrischen Problemen mit dem ersten).
- Bereiten Sie eine einzelne Referenzelektrode vor, indem Sie einen Draht mit an beiden Enden verlöteten Stiften in zwei Teile schneiden (Schritte 1.1-1.17, Abbildung 1A).
- Schneiden Sie den Draht bei 7 mm ab.
- Biegen Sie das Ende 1 mm unter die Spitze.
- Decken Sie dann die gebogene 1-mm-Spitze des Drahtes mit einer Pinzette ab und drehen Sie den Draht fest um die Pinzette, um eine kleine Schlaufe (1 mm Durchmesser) zu erzeugen.
- Biegen Sie die Schlaufe senkrecht zum geraden Teil des Drahtes, damit die Drahtspitze wieder nach außen zeigt.
- Montieren Sie die beiden bipolaren Elektroden und die einzelne Referenzelektrode so in den sechspoligen Sockel, dass die bipolaren Elektroden mit einem Abstand von 6 mm nebeneinander liegen und die Referenzelektrode im mittleren äußeren Loch platziert wird (Abbildung 1B).
HINWEIS: Eine alternative Methode besteht darin, die Elektroden zu implantieren, sie zu zementieren und dann ihre Stifte in den Sockel einzuführen.
2. Stereotaktische Elektrodenimplantation
- Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente und die sechspolige Elektrodenbaugruppe durch Autoklavieren vor der Operation. Während der Operation muss ein steriles Operationsfeld aufrechterhalten werden, und es müssen sterile OP-Handschuhe verwendet werden. Sterile Abdecktücher (z. B. Press n' Seal) werden empfohlen, um das Tier mit Ausnahme des Operationsbereichs abzudecken.
- Verwenden Sie 8 Wochen alte VGAT-Cre-Mäuse (altersangepasst, sowohl männlich als auch weiblich) für Operationen 4 Wochen nach dem Absetzen. Notieren Sie das Gewicht des Tieres vor der Operation, um die Messung des postoperativen Gewichtsverlusts zu ermöglichen.
- Verwenden Sie einen zertifizierten Isofluran-Vaporizer oder ein Low-Flow-Anästhesiesystem, das mit einer Präzisionsspritzenpumpe, einem integrierten digitalen Vaporizer und einem Feedback-Wärmekissen ausgestattet ist.
HINWEIS: Low-Flow-Systeme sind in der Lage, eine Anästhesie mit niedrigen Flussraten proportional zur Größe des Tieres entweder in eine Induktionskammer oder durch einen Nasenkegel auf dem stereotaktischen Rahmen durchzuführen (70 ml/min, Isoflurankonzentration in der Luft beträgt 4% für die Induktion und 2% für die Operation). Die Verwendung einer geringeren Anästhesie kommt nicht nur dem Tier während der Operationen zugute, sondern verringert auch das Risiko, dass das Laborpersonal Isofluran ausgesetzt ist. - Legen Sie das betäubte Tier auf ein auf 37 °C erwärmtes Heizkissen, um es während der Operation warm zu halten. Wenn Sie ein rückkopplungsgesteuertes Temperatursystem verwenden, führen Sie die leicht geschmierte Temperatursonde zur Temperaturüberwachung während der Operation in das Rektum des Tieres ein.
- Montieren Sie das Tier auf dem stereotaktischen Rahmen, indem Sie die Ohrbügel vorsichtig in die Ohren und die vorderen oberen Zähne in den Schneidezahn stecken. Platzieren Sie den Nasenkegel über der Nase, um eine ordnungsgemäße Anästhesie zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, dass der Kopf nivelliert und zentriert ist und bei leichter Sondierung nicht bewegt werden kann.
- Injizieren Sie subkutan 0,5 ml Normosol zur Hydratation.
- Tragen Sie Augenschmiermittel auf, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.
- Überwachen Sie die Tiefe der Anästhesie durch das Fehlen des Entzugsreflexes nach dem Einklemmen eines Hinterbeins, und senken Sie dann Isofluran während der Operation auf 1,5% -2,0%.
- Entfernen Sie die Haare am und um den Operationsbereich durch Zupfen oder mit einer Haarschneidemaschine (Rasur) oder Enthaarungscreme und desinfizieren Sie die Haut mit drei Zyklen abwechselnder Anwendung von Jod und Ethanol und beenden Sie sie mit Jod. Das Entfernen von Haaren von der Operationsstelle wird nur empfohlen, wenn an dieser Stelle Mittel zur Aufrechterhaltung der Anästhesie vorhanden sind. Verwenden Sie bei Bedarf in Alkohol getauchte Baumwollspitzenapplikatoren, um Haare aus der unmittelbaren Umgebung des Kopfes zu entfernen. Injizieren Sie 0,05 ml des lokalen Analgetikums Bupivacain (0,25%) subkutan.
- Machen Sie mit einem Skalpell einen Schnitt in den Schädel und schneiden Sie dann mit einer scharfen chirurgischen Schere einen Teil der Haut heraus, um den Schädel freizulegen. Schieben Sie die Haut mit einem Wattestäbchen beiseite und reinigen Sie den Schädel von allen Muskeln und darunter liegenden Geweben, die die Sicht behindern.
HINWEIS: Um versehentliche Blutungen zu stoppen, üben Sie mit einem sterilen Wattestäbchen Druck auf die Blutungsstelle aus, bis sie aufhört. - Reinigen Sie den Schädel mit Wasserstoffperoxid und sterilen Wattestäbchen, um die Schädelnähte und sowohl Bregma als auch Lambda sichtbar zu machen.
- Trocknen Sie den Schädel gründlich ab und tragen Sie dann einen Tropfen selbstätzenden Zahnkleber mit dem Applikator auf. Bürsten Sie es in den Schädel, warten Sie 60 s und härten Sie 40 s lang mit einem zahnärztlichen UV-Licht aus. Eine glänzende Oberfläche zeigt an, dass der Klebstoff effektiv mit dem Schädel vernetzt wurde.
HINWEIS: Dieser Schritt ist für die sichere Befestigung des Headsets von entscheidender Bedeutung. - Verwenden Sie einen 0,031-Zoll-Bohrer (0,79 mm), um zwei Gratlöcher beidseitig für die Implantation von Hippocampus-Tiefenelektroden (ca. 5.000 U/min) zu bohren. Bohren Sie ein zusätzliches Gratloch für die Referenzelektrode über dem Kleinhirn hinter dem Lambda.
HINWEIS: Achten Sie beim Bohren darauf, den Bohrer langsam abzusenken und vermeiden Sie es, in das Gehirn zu bohren. - Die Koordinaten für die Elektroden lauten wie folgt (von Bregma in mm): Hippocampus-Elektroden 3 mm hinter, 3 mm seitlich und 3 mm tief; und zerebelläre Referenzelektrode bei 6 mm hinterem, 0 mm seitlich und 0 mm Tiefe (subdural).
- Um die Genauigkeit zu erhöhen, verwenden Sie einen stereotaktisch montierten Bohrer und stellen Sie die x/Y-Achse des stereotaktischen Manipulators beim Berühren von Bregma auf Null - dies ist der Bezugspunkt für die Koordinaten.
- Montieren Sie ein Headset, indem Sie alle Elektroden in den sechspoligen Sockel einführen und sicherstellen, dass die Stifte vollständig in den Sockel geschoben werden. Montieren Sie den Sockel im Elektrodenhalter auf einem stereotaktischen Rahmen (Abbildung 1B).
- Richten Sie die Elektroden über den entsprechenden Gratlöchern aus. Implantieren Sie stereotaktisch verdrillte bipolare Edelstahldrahtelektroden im rechten und linken Hippocampus und in der Referenzelektrode in das Kleinhirn, indem Sie das Headset langsam absenken und die Elektroden in die Gratlöcher führen.
- Wenn sich die Hippocampus-Drehelektrode direkt über dem Loch befindet, stellen Sie die Z-Achse auf Null und senken Sie sie langsam auf -3,0 mm ab.
- Decken Sie die Schädeloberfläche und die Elektroden mit Zahnzement ab und füllen Sie den Raum zwischen der Schädeloberfläche und dem Boden des Sockels aus. Die Hautränder grenzen an den Zahnzement an, so dass kein darunter liegendes Gewebe freiliegt. Warten Sie, bis der Zement getrocknet und ausgehärtet ist. Lösen Sie dann den Elektrodenhalter vom stereotaktischen Arm und entfernen Sie den Halter vom Sockel.
- Injizieren Sie 0,1 ml Ketoprofen (1 mg/ml, SC) zur Analgesie und eine zweite Dosis von 0,5 ml Normosol (SC) zur Flüssigkeitszufuhr und entfernen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen.
- Legen Sie ein auf 37 °C vorgeheiztes Isothermenkissen in einen leeren Vivariumkäfig, der mit einem Papiertuch bedeckt ist. Sobald es vollständig wach ist, legen Sie das Tier in einen sauberen Käfig mit Einstreu und weichem Futter und bringen Sie es in das Vivarium zurück. Die Tiere werden ab diesem Zeitpunkt einzeln untergebracht, um zu verhindern, dass sie sich gegenseitig an den Headsets kauen. Drahtstangentrichter werden nicht verwendet, um zu vermeiden, dass Headsets stecken bleiben, sondern Wasserflaschen werden an der Unterseite der Käfigoberseiten befestigt, und Chow ist in der Einstreu vorhanden.
- Füttern Sie das Tier nach der Operation 72 Stunden lang mit weichem Futter und überwachen Sie den Gewichtsverlust und den Körperzustand. Dehydrierten Tieren können 0,5 ml Normosol subkutan verabreicht werden, wenn sie dehydriert sind (Gewichtsverlust, erhöhter Hautturgor, eingefallene Augen). Ketoprofen kann nach der Operation einmal täglich für weitere 2 Tage subkutan verabreicht werden (befolgen Sie das Analgesieschema gemäß den lokalen IACUC-Richtlinien). Lassen Sie die Tiere 4-7 Tage lang in ihren Käfigen vollständig erholen, bevor Sie sie in das EEG-Aufzeichnungssystem überführen.
3. Elektrisches Anzündprotokoll
- Schließen Sie die Mäuse mit einem flexiblen Kabel an das EEG-Aufzeichnungssystem an, das in die Buchsen des Mauskopfes und des Kommutators passt (siehe Materialtabelle ). Lassen Sie die Tiere einen Tag lang akklimatisieren, bevor Sie mit dem folgenden Elektrostimulationsprotokoll fortfahren. Überwachen Sie täglich ihren allgemeinen Gesundheitszustand und ihre Akklimatisierung und entfernen Sie sie aus dem System, wenn Anzeichen von Krankheit, Stress und/oder kontinuierlichem Körpergewichtsverlust von mehr als 25% vorliegen
- Verbinden Sie beide Leitungen von der Stimulationselektrode mit dem Ausgang eines Konstantstromstimulators.
HINWEIS: Es ist sehr hilfreich, eine Leiterplatte zu haben, die diese Elektroden vom EEG-Rekorder weg und zum Stimulator schaltet. - Stellen Sie den Stimulator so ein, dass er 1 ms Impulse bei 50 Hz für eine Zugdauer von 2 s liefert.
- Stellen Sie den Ausgang des Stimulators auf 20 Mikroampere (μA) ein und geben Sie den 1. Impuls ab.
- Überwachen Sie das EEG auf eine charakteristische Nachentladung von hochfrequenten Spitzen, die den elektrischen Stimulationsimpuls überdauern.
- Wenn keine Entladung beobachtet wird, erhöhen Sie die eingespeiste Strommenge in Schritten von 20 μA, bis eine Nachentladung ausgelöst wird. Die erforderliche Strommenge ist die Nachentladungsschwelle (ADT).
- Typische ADTs sind 20-50 μA. Wenn auch nach dem Erhöhen auf 200 μA keine Entladung beobachtet wird, ist eine Fehlerbehebung bei elektrischen Verbindungen und der Verkabelung des Headsets mit einem hochempfindlichen Ohmmeter erforderlich. Wenn das Problem in der Stimulationselektrode liegt, versuchen Sie, mit den anderen Tiefenelektroden zu stimulieren.
- Die Tiere werden entzündet, indem sie entweder 2x oder 6x pro Tag mit einem Strom stimuliert werden, der dem 1,5-fachen des ADT-Wertes für diese Maus entspricht.
- Überwachen Sie die Verhaltensreaktion auf die Stimulation, die vom Zustandswechsel zu bilateralen tonisch-klonischen Anfällen mit Sturz ansteigt. Punktzahl mit einem modifizierten Racine-Klassensystem11. Um evozierte tödliche tonische Anfälle zu vermeiden, sollte das Anzünden unterbrochen werden, wenn aufeinanderfolgende Reize zu einer eskalierenden Schwere und Dauer der Anfälle bis zu einem modifizierten Racine-Score 6 (Laufen und Springen) führen
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Representative Results
Tiere
Das Modell wurde ursprünglich mit VGAT-Cre-Mäusen (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J)13 auf einem gemischten Hintergrund entwickelt. Es wurde jedoch auch auf den VGAT-Cre-Stamm angewendet, der mit C57BL/6J kongen ist. Bei der Epilepsie, die sich zwischen den Stämmen entwickelt, wurde kein Unterschied beobachtet. Beide Stämme exprimieren die Cre-Rekombinase unter der Kontrolle des vesikulären GABA-Transporter-Promotors. Diese Mäuse wurden durch Einklopfen einer IRES-Cre-Kassette nach dem Stoppcodon im Vgat-Gen erzeugt. Diese Mäuse brüten normal, so dass sie als Homozygoten gehalten werden. Um eine genetische Drift der Kolonie zu verhindern, kaufen Sie Züchter und verwenden Sie nur Mäuse der F1-Generation für Experimente. Alle Mäuse wurden in einem AAALAC-akkreditierten Vivarium untergebracht. Die Mäuse erhielten freien Zugang zu Futter und Wasser, 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklen und eine angereicherte Umgebung. Für die elektroenzephalographische (EEG) Aufzeichnung wurden die Mäuse einzeln in durchsichtigen Kunststoffkäfigen (hausgemacht) untergebracht, was eine gleichzeitige Videoüberwachung ermöglichte. Verwenden Sie sowohl männliche als auch weibliche Mäuse für Experimente. Es wurde kein Unterschied in Bezug auf die Anzündrate oder die Anfallshäufigkeit zwischen den Geschlechtern beobachtet. Die meisten dieser Studien verwendeten 8 Wochen alte Mäuse zum Zeitpunkt der Headset-Operation. Man kann aber auch Mäuse verwenden, die zwischen 4 und 20 Wochen alt sind. Nach 4 Wochen hat der Mausschädel ~90% seiner endgültigen Größe14, so dass das Anbringen eines Headsets nur minimale Auswirkungen auf das Wachstum hat. Die Zeit zwischen der Operation und dem Beginn des Anzündprotokolls ist nicht kritisch, obwohl Mäuse während der Genesung von der Operation für 72 Stunden sorgfältig beobachtet werden müssen.
Anzünd-Parameter
Das elektrische Stimulationsprotokoll wurde von Lothman und Mitarbeitern entwickelt und in ihrem 1989 erschienenen Artikel15 ausführlich beschrieben. Kurz gesagt, die Hippocampus-Elektrode ist mit einem Konstantstromstimulator verbunden, und ein zweiphasiger Rechteckwellenimpuls von 1 ms wird bei 50 Hz über 2 s abgegeben. Verschiedene Parameter des Anzündprotokolls wurden getestet16. Verwenden Sie eine Stromstärke, die dem 1,5-fachen der minimalen Strommenge entspricht, die erforderlich ist, um einen elektrografischen Anfall für diese Maus auszulösen (After-Discharge Threshold, ADT). Mäuse werden zweimal täglich jeden zweiten Tag elektrisch stimuliert (2x, am Vormittag und am frühen Nachmittag). Abbildung 2A zeigt einen Überblick über das Anzündprotokoll und die wichtigsten Anfallseigenschaften. Es ist jedoch auch ein Fast-Kindling-Protokoll wirksam, bei dem Mäuse sechsmal täglich stimuliert werden und jeden zweiten Tag (6x, eine Stunde zwischen den Stimulationen) verabreicht werden. Interessanterweise sind die Anzündraten zwischen 2x- und 6x-Protokollen in Bezug auf die Anzahl der Stimulationen, die erforderlich sind, um den angezündeten Zustand zu erreichen, ähnlich (Abbildung 2B: 2x, 15 ± 1, n = 46; 6x, 13 ± 1, n = 12, Mittelwert ± SEM, P = 0,3). Die Mäuse gelten als vollständig entzündet, wenn insgesamt fünf Stimulationen tonisch-klonische Anfälle mit Verlust der Haltungskontrolle hervorrufen, was einem Verhaltenswert von 5 auf einer modifizierten Racine-Skala17 entspricht. Ein Anzünden über dieses Niveau hinaus, das sogenannte Überanzünden, kann durchgeführt werden, birgt jedoch das Risiko eines tödlichen tonischen Anfalls oder SUDEP18. Die Mortalität in diesem VGAT-Cre-Protokoll beträgt ~13% (15 von 119 Mäusen); Dazu gehören Mäuse beiderlei Geschlechts, die entweder nach evozierten oder spontanen Anfällen starben (8 männlich, 7 weiblich).
Anfallseigenschaften
Das in diesen Studien verwendete Aufzeichnungssystem wurde eingestellt. Alternative Anbieter von EEG-Aufzeichnungsaufbauten, die an der Nagetier-Epilepsie-Überwachungseinheit der University of Virginia verwendet werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt. Abbildung 2A zeigt einen Überblick über das Anzündprotokoll und die wichtigsten Anfallseigenschaften.
Abbildung 2: Anfallseigenschaften von entzündeten VGAT-Cre-Mäusen . (A) Schematische Darstellung des zeitlichen Verlaufs eines Experiments. (B) Die Verteilung der Anzahl der elektrischen Stimulationen, die erforderlich sind, um den vollständig entzündeten Zustand zu erreichen. Der entzündete Zustand wird erreicht, wenn Stimulationen fünf bilaterale tonisch-klonische motorische Anfälle hervorrufen. (C) Die Verteilung der Latenz auf den ersten spontanen Anfall nach der letzten elektrischen Stimulation. (D) Die Verteilung der beobachteten Anfallshäufigkeiten, die sich aus der Gesamtzahl der Anfälle dividiert durch die Anzahl der aufgezeichneten Tage errechnet. (E) Die Verteilung, wie lange Mäuse epileptisch waren, definiert durch spontane Anfälle, die mit einem Inter-Anfallsintervall von weniger als 5 Tagen auftraten. Alle Diagramme verwenden Geigendiagramme, bei denen der Median mit einer dunklen Linie und das 25. und 75. Quartil mit hellen Linien dargestellt sind. Die Anzahl der Tiere in jedem Diagramm wird auf der X-Achse angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
VGAT-Cre-Mäuse erreichen typischerweise nach 15 Stimulationen das Kindled-State-Kriterium (gepoolte 2x- und 6x-Protokolle, mittlere ± SD von 7,4 Stimulationen, Abbildung 2B). Wie aus dem Geigendiagramm der Daten ersichtlich ist, benötigen viele Tiere weniger Stimulationen (10) und viele mehr (18). Es war nicht möglich, einen Faktor zu finden, der den Unterschied bestimmt, mit Ausnahme von Geschlecht, Alter, ADT-Wert oder Elektrodenplatzierung. Innerhalb weniger Wochen nach dem Anzünden entwickeln die meisten Mäuse mehrere spontane Anfälle (90%), was Epilepsie definiert. Die Latenz zu spontan wiederkehrenden Anfällen (SRS) beträgt 10,7 ± 6,3 Tage (Abbildung 2C). Ein Bruchteil der Mäuse entwickelt SRS, bevor sie den entzündeten Zustand erreichen. Wie bereitserwähnt 11, sind VGAT-Cre-Mäuse nicht spontan epileptisch und benötigen eine elektrische Stimulation, um Epilepsie zu entwickeln. Sobald die Anfälle beginnen, treten sie mit einer Häufigkeit von 1,3 ± 0,6 Anfällen pro Tag auf (Abbildung 2D). Alle elektrographischen Anfälle gehen mit tonisch-klonischen motorischen Anfällen einher. Die ersten Studien waren kurzfristig (spontane Anfallshäufigkeit gemessen 1-2 Wochen), aber als der Aufzeichnungszeitraum verlängert wurde, wurde festgestellt, dass die Anfallshäufigkeit mit der Zeit abnahm. Unter Verwendung eines willkürlichen Cut-offs von 5 aufeinanderfolgenden Tagen ohne Anfall treten zuverlässige Anfälle für 23 ± 11 Tage auf. Zusammengenommen definiert dies den Zeitraum, in dem entzündete VGAT-Cre-Mäuse für Drogenscreening-Kampagnen nützlich sind. Die Leistungsanalyse mit diesen SD und einer Effektstärke von 50% zeigt, dass 16 Mäuse pro Gruppe für statistisch signifikante Effekte auf die Stimulation des Anzündens, die Anfallshäufigkeit und die Epilepsiedauer erforderlich sind.
Ein Merkmal des entzündeten VGAT-Cre-Modells, das es von Post-Status-Epilepticus-Modellen unterscheidet, ist das Fehlen eines neuronalen Todes. Dies wurde mit zwei akzeptierten Methoden untersucht (Abbildung 3): erstens durch Zählen von Kernen in der CA1-Schicht, die mit Anti-NeuN-Antikörpern gefärbt waren; und zweitens durch Messung der Menge an Fluor-Jade-C-Färbung in Hippocampus-Subfeldern, die anfällig für Chemokonvulsiva-induzierten Zelltod sind (Dentat, CA1 und entorhinaler Kortex).
Abbildung 3: Neuronaler Tod, wie er entweder durch Anti-NeuN-Färbung oder Fluor-Jade-C-Färbung ermittelt wurde. (A) Darstellung von Anti-NeuN-positiven Neuronen in verschiedenen Teilbereichen des Hippocampus und des entorhinalen Kortex. Abkürzungen sind wie folgt: DGC, gezähnte Körnerzellschicht; Hilus bezieht sich auf den gezahnten Hilus, CA1, Cornus ammonis pyramidale Schicht I; und EC, entorhinaler Kortex; L2, Schicht 2; und L3, Schicht 3. Von jedem Tier wurden zwei horizontale Hirnschnitte angefärbt, die -4 mm unterhalb von Bregma entsprachen (Kontroll-naive Mäuse, n = 7; epileptische VGAT-Cre, n = 13; siehe Straub et al. für Details11). Die Daten wurden auf durchschnittliche neuronale Zählungen normalisiert, die in naiven VGAT-Cre-Mäusen im jeweiligen Teilfeld bestimmt wurden. Bilder der Fluor-Jade C-Färbung von einer epileptischen VGAT-Cre-Maus (B) und von einer Post-Status-Ratte (C) (Li/Pilocarpin-Modell, siehe Dey et al. für Details und Analyse10). Die Analyse der Fluor-Jade-C-Färbung von VGAT-Cre-Mäusen wurde in Straub et al.11 vorgestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll, bei dem elektrisches Anzünden von Mäusen zu Epilepsie führt. Da sich die Stimulationselektrode im Hippocampus befindet, handelt es sich um eine fokale limbische Epilepsie, die die Temporallappenepilepsie (TLE) bei Patienten modelliert. Ein kritischer Schritt in diesem Protokoll ist die Verwendung von VGAT-Cre-Mäusen, die aufgrund der Insertion einer IRES-Cre-Rekombinase-Kassette in das Vgat-Gen beeinträchtigte inhibitorische GABA-Ströme aufweisen11. C57BL/6 entwickeln nach dem Anzünden mit diesem Protokoll keine Epilepsie, obwohl es möglich ist, dass andere Mäusestämme dies tun.
Das Protokoll wurde unter Verwendung der Platzierung der stimulierenden Tiefenelektroden im Hippocampus entwickelt. Die Koordinaten lieferten dem Ziel die perforanten Pfadprojektionen aus dem entorhinalen Kortex, wenn sie in das CA1-Teilfeld eintreten. Das durch elektrische Stimulation induzierte elektrische Feld wurde nicht definiert, daher ist die genaue Position der Elektroden nicht kritisch. Tatsächlich können Nagetiere überall im limbischen Kreislauf elektrisch entzündet werden, z. B. in der Amygdala und im piriformen Kortex19. Die folgenden kritischen Schritte im Protokoll sind: erstens das ordnungsgemäße Löten der EEG-Headsets, um einen geringen Widerstand gegen den stimulierenden Strom zu gewährleisten; zweitens unter Verwendung eines Zahnklebstoffs, der in Zahnkliniken verwendet wird, um sich an den Schädel zu binden und eine Oberfläche für die Haftung des Zahnzements bereitzustellen; und drittens die Verwendung eines Konstantstromverstärkers, um die beschriebenen elektrischen Impulse zu liefern.
Die Fehlerbehebung beschränkt sich in der Regel auf die Überprüfung der elektrischen Verbindungen, einschließlich der Verbindungen im Headset, des Headsets zum Kabel, des Kabels zum Kommutator und des Kommutators zum Aufzeichnungsgerät. Die Verwendung eines Ohmmeters mit hoher Empfindlichkeit ist von entscheidender Bedeutung.
Zu den Einschränkungen der Technik gehört die Forderung nach entsprechendem Fachwissen und Ausrüstung für die Durchführung der Operationen und die Aufzeichnung des EEG.
Ein Vorteil des Modells gegenüber bestehenden Tiermodellen von TLE besteht darin, dass der Tod von Neuronenminimal ist 11. Bei den anderen TLE-Modellen handelt es sich um Post-Status-Epilepticus-Modelle, die einen ausgedehnten neuronalen Tod auslösen10. Dieser Tod führt zu einer ausgedehnten Aktivierung von Mikroglia, Astrozyten und Infiltration durch zirkulierende Monozyten. Zusammengenommen wird es schwierig, Mechanismen, die Epilepsie verursachen, von Mechanismen zu unterscheiden, die durch einen verlängerten Status epilepticus ausgelöst werden. Es wird erwartet, dass entzündete VGAT-Cre-Mäuse für die Entwicklung neuartiger Therapien nützlich sein werden, die sowohl gegen Krampfanfälle als auch gegen Epileptika wirken. Dieser Bericht enthält wichtige Kennzahlen und Leistungsanalysen, die zukünftige Bemühungen zur Arzneimittelentwicklung mit diesen Mäusen leiten können.
Ein weiterer Vorteil des entzündeten VGAT-Cre-Modells ist der hohe Prozentsatz an Tieren, die Epilepsie entwickeln (90%) und die Regelmäßigkeit der spontanen Anfälle. Nachteile des Modells sind eine relativ geringe Anfallshäufigkeit (1,5/Tag) und dass die Anfallshäufigkeit nach 3 Wochen abnimmt und in einigen Fällen die Anfälle zu stoppen scheinen. Es werden Anstrengungen unternommen, um diese Probleme anzugehen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Konflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Die Autoren danken John Williamson für hilfreiche Diskussionen zu diesem Protokoll. Diese Arbeit wurde durch den NIH/NINDS-Zuschuss NS112549 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16 Channel Extracellular Differential AC Amplifier (115V/60Hz) | AD Instruments | AM3500-115-60 | Alternate EEG amplifier |
| 363/CP PLUG COLLAR, PINS SLEEVE | P1 Technologies | 363SLEEVPIN0NL | For electrode holder |
| Cable, 363-363 5CM - 100CM W/MESH 6TCM | P1 Technologies | 363363XXXXCM004 | mouse-to-commutator cable |
| CCTV cameras Qcwox HD Sony IR LED | Sony | QC-SP316 | |
| Commutator SL6C/SB (single brush) | P1 Technologies | 8BSL6CSBC0MT | formerly Plastics One, Inc. |
| Current amplifier | A-M Systems | Model 2100 | |
| Dental cement | Stoelting | 51459 | |
| Drill bits, #75, OD 0.310" LOC 130 PT | Kyocera | 105-0210.310 | |
| E363/0 SOCKET CONTACT SKEWED | P1 Technologies | 8IE3630XXXXE | pins for connector |
| iBond Self Etch glue | Kulzer | CE0197 | |
| MS363 PEDESTAL 2298 6 PIN WHITE | P1 Technologies | 8K000229801F | EEG headset connector |
| Ohmeter | Simpson | 260 | High sensitivity |
| PowerLab 16/35 and LabChart Pro | AD Instruments | PL3516/P | Alternate EEG software |
| SomnoSuite | Kent Scientific Corp. | SS-01 | anesthesia unit & RightTemp monitoring |
| Stereotactic drill and micromotor kit | Foredom Electric Co. | K.1070 | |
| Stereotactic frame | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Teflon-coated wire for depth electrode, OD 0.008' | A-M Systems | 791400 | |
| VGAT-Cre mice on congenic C57BL/6J background | The Jackson Laboratory | 000664 |
References
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