Summary
Dette papir præsenterer en detaljeret trinvis protokol om, hvordan man bruger et integreret multifunktionelt og brugerprogrammerbart system, der muliggør automatisk flerkanalsbilleddannelse og mekanobiologisk analyse for at belyse mekanofølsomheden af Ja-associeret protein (YAP).
Abstract
Langsigtet multifunktionel billeddannelse og analyse af levende celler kræver strømlinet, funktionel koordinering af forskellige hardware- og softwareplatforme. Manuel styring af forskelligt udstyr produceret af forskellige producenter er imidlertid arbejdskrævende og tidskrævende, hvilket potentielt reducerer nøjagtigheden, reproducerbarheden og kvaliteten af erhvervede data. Derfor kan et alt-i-et og brugerprogrammerbart system, der muliggør automatisk, multifunktionel og langsigtet billedoptagelse og er kompatibelt med de fleste fluorescerende mikroskopiplatforme, gavne det videnskabelige samfund. Dette papir introducerer de komplette driftsprotokoller for at udnytte et nyt integreret softwaresystem, der består af (1) et hjemmebygget softwareprogram med titlen "Automatic Multi-functional Integration Program (AMFIP)", som muliggør automatisk multikanals billedanskaffelse og (2) en række kvantitative billeddannelsesanalyse- og celletrækkraftberegningspakker.
Dette integrerede system anvendes til at afsløre det hidtil ukendte forhold mellem den rumlige-tidsmæssige fordeling af mekanofølsomt Ja-associeret protein (YAP) og cellemekanikken, herunder cellespredning og trækkraft, i CRISPR/Cas9-konstruerede humane normale celler (B2B) og lungekræftceller (PC9). Ved at udnytte dette systems evne til flerkanalskontrol og udlæsning viser resultatet: (1) B2B-normale celler og PC9-kræftceller viser et særskilt forhold mellem YAP-ekspression, trækkraft og celledynamik under cellesprednings- og migrationsprocesser; og (2) PC9-kræftceller anvender mærkbare peri-nukleare kræfter på substrater. Sammenfattende præsenterer dette papir en detaljeret trinvis protokol om, hvordan man bruger et integreret brugerprogrammerbart system, der muliggør automatisk multifunktionel billeddannelse og analyse for at belyse YAP-mekanofølsomhed. Disse værktøjer åbner mulighed for detaljerede udforskninger af mangesidet signaldynamik i forbindelse med cellefysiologi og patologi.
Introduction
Det overordnede mål med denne metode er at muliggøre optisk multifunktionel billeddannelse og analyse af levende celler. Et alt-i-et-billeddannelsesprogram, der muliggør automatisk koordinering af multifunktionelle optoelektroniske enheder, reducerer arbejdskrævende og fejlbehæftede manuelle operationer og er afgørende for forskere at udføre langsigtet levende cellebilleddannelse1,2,3,4. Imidlertid gælder de fleste eksisterende offentlige programmer i det biomedicinske forskningsmiljø enten kun for begrænset optoelektronisk udstyr eller kræver yderligere hardware til koordinering af forskelligt udstyr5,6,7,8,9. For nylig er der udviklet et open source- og softwarebaseret program med titlen "Automatic Multi-functional Integration Program (AMFIP)", der muliggør flerkanals- og time-lapse-billeddannelse. Baseret på Java-sprog og Application Programming Interface (API) på μManager11,12 blev AMFIP udviklet som et plugin i μManager, der udfører tilpassede Java-scripts for at udføre softwarebaseret kommunikation af flere optoelektroniske hardware- og softwareplatforme, herunder, men ikke begrænset til, dem fra Nikon. Etableringen af AMFIP åbner mulighed for programmerbar og multifunktionel forhør af celleadfærd. Et integreret eksperimentelt og beregningssystem er udviklet i dette papir og kombinerer AMFIP med digital billeddannelsesanalyse og celletrækkraftmikroskopi. Systemet gør det muligt at belyse den særskilte YAP-mekanobiologi i CRISPR/Cas9-konstruerede humane normale B2B (figur 1) og lungekræft PC9 (figur 2) cellelinjer. Systemet giver det videnskabelige samfund en omfattende løsning, der undgår efterspørgslen efter at købe yderligere styreenheder, der muligvis ikke er tilgængelige for og / eller kompatible med alle billeddannelsessystem.
De protokoller, der præsenteres i dette papir, introducerer, hvordan man (1) anvender AMFIP til at udføre automatisk langsigtet billeddannelse for begge CRISPR/Cas9-konstruerede cellelinjer, der udtrykker mNEonGreen2-mærket YAP; og (2) kombinere Fiji ImageJ, MATLAB og Origin til kvantitativ analyse af YAP-nukleart / cytoplasma (N / C) -forhold baseret på deres fluorescerende intensitet (figur 3 og figur 4), cellulært forskydningsfelt (figur 1C og figur 2C) og cellulært trækkraftfelt (figur 1D og figur 2D ). Resultaterne tyder på, at (1) i løbet af de første 10 timer af cellespredning på substrater, der har fysiologisk relevant mekanisk stivhed13,14,15,16,17,18, viser YAP N/C-forholdet mellem enkelte B2B-celler mere mærkbar tidsafhængig variation og udsving sammenlignet med for enkelte PC9-celler (figur 5 og figur 6 ); og (2) PC9-kræftceller genererer mærkbar trækkraft i deres peri-nukleare regioner (figur 7). Det integrerede system og metoder, der er beskrevet i denne protokol, overskrider de specifikke typer celler og optogenetiske molekyler. Forskere kan anvende protokollerne til at tilpasse deres specifikke levende celleforhørseksperimenter og belyse mangesidet signaldynamik i forbindelse med cellefysiologi og patologi.
Protocol
1. Generering af stabil CRISPR/Cas9-redigeret human lungekræftcellelinje (PC9) og human bronchial epitelcellelinje (Beas2B), der endogent udtrykker mNeonGreen21-10/11-mærket YAP-protein
- Udfør polymerasekædereaktion (PCR) for at forstærke DNA-sekvensen, der koder for den 11. streng af fluorescensproteinet, mNeonGreen2, ved anvendelse af DNA-polymerasen med høj troskab (se materialetabellen).
- Knock-in den amplificerede DNA-sekvens ind i YAP-genomiske locus af PC9- og B2B-cellelinjerne ved hjælp af CRISPR-Cas9-genredigeringssystemet.
BEMÆRK: Denne DNA-sekvens supplerer trådene 1-10 af mNeonGreen2 for at udsende fluorescens. Det genomiske sekvenskort over YAP-mNeonGreen21-10/11 er vist i supplerende figur S1. Kortet indeholder de mærkede genomiske, donor- og mNeonGreen2-sekvenser. - Kontroller det CRISPR/Cas9-konstruerede mNeonGreen2-udtryk ved hjælp af et epifluorescensmikroskop (se materialetabellen). Fordi mNeonGreen2 er mærket til YAP, når cellerne udtrykker YAP i forbindelse med dets oprindelige genregulerende netværk, skal du kontrollere tilstedeværelsen af fluorescensintensiteten i begge CRISPR / Cas9-konstruerede celler og sammenligne den med den i forældrecellerne (kontrol).
BEMÆRK: For at følge denne protokol skal du bruge (1) en 488 nm laser (47,5 mW/mm2) til excitation, (2) et 40x mål (numerisk blænde (NA) = 0,95) og et båndpasemissionsfilter (ET525/50 nm) til fluorescensmåling og (3) ImageJ-software til måling, kvantificere og sammenligne fluorescensintensiteterne. - Bekræft den korrekte integration af mNeonGreen211 ved at udtrække genomisk DNA fra de CRISPR/Cas9-redigerede cellelinjer; udføre PCR ved hjælp af primere, der flankerer den genomiske indsats og sekventering for at bekræfte indsættelsen ved det korrekte genomiske loci19,20.
- Slå mNeonGreen211 ned ved hjælp af CRISPR/Cas9-genredigeringssystemet, og kontroller fluorescensintensitetsreduktionen i celler ved hjælp af de samme mikroskopsystemer og billeddannelsesparametre beskrevet i trin 1.3.
BEMÆRK: Dette trin bekræfter den korrekte integration af mNeonGreen211 ved sammenligning af fluorescensintensiteter. De CRISPR/Cas9-konstruerede celler uden knock-down og forældreceller bruges som kontrol. - Saml cellerne med det mærkede protein af interesse gennem fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) sortering.
- For at forberede celler til FACS-sortering skal du trypsinisere dem og suspendere dem igen i fosfatbufret saltvand (PBS).
- Saml celler med mNeonGreen2 fluorescens over baggrundsniveauet for forældrecellelinjerne i to berigende runder af FACS-sortering.
BEMÆRK: Tidslinjen for at generere de CRISPR/Cas9-redigerede cellelinjer, der er beskrevet her, er i størrelsesordenen 1-2 måneder. Alle cellelinjer gøres offentligt tilgængelige efter anmodning, så andre forskningslaboratorier kan reproducere resultaterne.
2. Vedligeholdelse af PC9- og B2B-celler
- Oprethold begge cellelinjer i befugtede vævskulturinkubatorer med 5% CO2 ved 37 °C.
- Dyrkning 106 endogent mærkede PC9- og Beas2B-celler i 75 cm2 kolber med 12 ml RPMI-1640-medium suppleret med 10 % føtalt kvægserum og 100 μg/ml penicillin-streptomycin. Subkultur begge cellelinjer, når cellesammenløbet når ~ 80%.
- Test begge cellelinjer for mycoplasma hver 3. måned ved hjælp af et mycoplasma-detektionssæt, der følger alle producentens anbefalede protokoller strengt.
- Opbevar cellelinjerne i en -80 °C fryser.
- Brug de cellelinjer, der er <20 passager fra optøning til alle eksperimenterne.
3. Opsætning af hardware- og softwaremiljø
- Opsætning af hardwaremiljø af eksperimentet
- Tilslut den konfokale controller og det omvendte mikroskop til computeren (se materialetabellen).
- Installer softwareplatformen (Table of Materials).
- Tænd for den konfokale controller og det omvendte mikroskop. Start derefter Elements.
- Åbn kontrolpanelerne på konfokalen, laseren og det omvendte mikroskop i Elements. Kontroller derefter, om de tre paneler fungerer korrekt ved at teste bevægelsen af det motoriserede trin, skiftet af mikroskopmålene og den rumlige scanning af laserlinjerne.
- Opsætning af softwaremiljø af AMFIP
- Installer IntelliJ, Java Development Kit 14.0, μManager version 2.0 gamma og Fiji ImageJ på computeren.
- Åbn AMFIP-projektet, der er downloadet fra GitHub (link: https://github.com/njheadshotz/AMFIP) i IntelliJ.
- Klik på Indstillinger | Compiler | Anmærkningsprocessorer , og marker Aktivér anmærkningsbehandling.
- Klik på projektstruktur | Artefakter og opret en JAR-fil. Indstil outputmappen til mmpluginer under mappen μManager .
- Klik på projektstruktur | Biblioteker og tilføj mmplugins og plugins under μManager-mappen .
- Klik på tilføj konfiguration under rullemenuen Kør , og opret et program.
- Indtast ij. ImageJ ind i hovedklassen.
- Indtast -Xmx3000m -Dforce.annotation.index=true i VM-indstillingen.
- Indstil mappen μManager til mappen Arbejde.
- Klik på Kør for at aktivere μManager med AMFIP-pluginet.
- Tilslut μManager med det omvendte mikroskop.
- Føj den adaptive driver i det omvendte mikroskop21 til mappen μManager .
- Åbn μManager. Klik på Enheder | Guiden Hardwarekonfiguration , og opret en ny konfiguration.
- Tilføj Ti2-driveren under Tilgængelige enheder.
- Vælg alle eksterne enheder, og gem den nye konfigurationsfil.
- Genstart μManager, og vælg konfigurationsfilen i trin 3.2.4 i Micro-Manager Startup Configuration.
4. Gel forberedelse
- Behandl glasdæksedlen med 3-aminopropyltrymethoxysilin i 7 minutter ved stuetemperatur (24 °C).
- Brug deioniseret (DI) vand til at skylle glasdækslen og tørre dæksedlen i 20 minutter ved 160 °C.
- Behandl glasdæksedlen med 0,5% glutaraldehyd i 30 min og skyl med DI-vand.
- Acrylamidopløsning, N,N′-methylenbisacrylamidopløsning (bis) blandes og fluorescerende perler suspenderet i 10 mM HEPES-bufferet saltvand. Der anvendes 10 % ammoniumpersulfatopløsning (w/v) og N,N,N′,N′-tetramethylethylendiamin (TEMED) som initiatorer for polymerisation. Procentdelen af hver komponent ændres for at opnå den ønskede mekaniske stivhed af polyacrylamidhydrogeler (PAA) efter etablerede protokoller beskrevet tidligere13,14.
BEMÆRK: I denne protokol er 2 kPa gel: acrylamid = 12,5% og bis-acrylamid = 6,5%; 5 kPa gel: acrylamid = 12,5% og bis-acrylamid = 21,5%; og 40 kPa gel: acrylamid = 12,5% og bis-acrylamid = 31,5%. Alle anførte % er volumenprocent. - Efter 35 minutter skal du skrælle glasdækslet fra den størknede PAA-hydrogel og vaske hydrogelen med 50 mM HEPES-bufferet saltvand to gange (5 minutter hver gang).
- Behandl hydrogeloverfladen med en hydrazinhydratopløsning i 6 timer.
- Skyl hydrogelen med eddikesyre i 30 minutter. Fjern eddikesyren og skyl med PBS i 30 min.
- Oxider fibronectinopløsningen (50 μg/ml i PBS) med natriumperionat i 30 minutter.
- Belæg hydrogeloverfladen med den oxiderede fibronectinopløsning og vent i 35 minutter.
- Tilsæt PBS for at nedsænke hydrogelen og opbevar ved 4 °C. Dæk alle petriskåle, der indeholder hydrogelerne, med aluminiumsfolie for at undgå lyseksponering for hydrogelerne.
5. Cellekultur
BEMÆRK: Udfør cellekultur ved hjælp af aseptisk teknik.
- Lim glasdækslipsene med PAA-hydrogelerne til 35 mm glasbundet petriskål for at undgå fysisk drift af geler under cellesånings- og billeddannelsesprocesserne.
- Brug steriliseret ren pincet til at løfte dæksedlen (med PAA-hydrogelen ovenpå) fra petriskålen, der indeholder de tilberedte geler.
- Brug en tør aftørring til at rense vanddråber på den nederste overflade af glasdækslen.
- Brug den steriliserede pincet til at holde glasdækslen.
- Anbring små dråber (1-5 μL) cyanoacrylatlim i de to diagonale hjørner på bundfladen.
- Brug steriliserede klude til at fjerne overskydende lim.
- Brug den steriliserede pincet til at erstatte dæksedlen i petriskålen med glasbund. Tryk let på hjørnerne af dæksedlen for at sikre, at limdråberne kommer i fuld kontakt med overfladen af petriskålen.
- Læg låget tilbage på petriskålen for at minimere fordampningen af PBS i PAA-hydrogelerne. Vent i 3 minutter for at lade limen størkne og tørre i petriskålen.
- Fyld petriskålen med 4 ml PBS.
- Gentag ovenstående trin 5.1.1-5.1.8 for de resterende PAA-hydrogelprøver i de petriskåle, der anvendes til billeddannelse.
- Brug 75% ethanol til at sterilisere den ydre overflade af alle petriskålene og overføre dem til vævskulturens biosikkerhedsskab. Tænd for det ultraviolette lys i 5 minutter, og steriliser prøverne.
- Frø cellerne på gelens øverste overflade.
- Sluk for det ultraviolette lys. Kolben (indeholdende B2B/PC9-celler) tages ud af 37 °C-inkubatoren og ind i biosikkerhedsskabet. Brug en pipette, der er tilsluttet en vakuumpumpe, til at aspirere hele dyrkningsmediet, og tilsæt 5 ml PBS for at vaske kolben.
- Der tilsættes 2 ml 0,05 % trypsin for at løsne cellerne fra bunden af kolben.
- Anbring kolben i inkubatoren. Vent i 5 minutter.
- Kolben overføres til biosikkerhedsskabet. Der tilsættes 8 ml friskkulturmedium til kolben og pipettes op og ned flere gange for at suspendere cellerne homogent.
- Overfør alle 10 ml af cellesuspensionen til et 15 ml rør og centrifuge ved 300 × g i 5 minutter.
- Kontroller cellepillen i bunden af røret. Vip langsomt røret vandret, og brug den aspirerende pipette til at fjerne alt kulturmediet fra røret uden at røre ved cellepillen. Derefter tilsættes 8 ml friskkulturmedium og pipette op og ned flere gange, indtil alle cellerne blandes homogent med mediet.
- Aflejr 100 μL af cellesuspensionen (150 celler/μL) på geloverfladen og vent i 5 min. Tilsæt derefter langsomt 4 ml frisk kulturmedium til petriskålene; undgå at tilsætte det friske medium direkte på gelen.
- Læg petriskålen i 37 °C-inkubatoren. Vent med at lade cellerne binde sig til geloverfladen (B2B: 0,5-1 time; PC9: 4-5 timer).
6. Cellebilleddannelse
BEMÆRK: AMFIP muliggør automatisk, flerkanals og langsigtet billeddannelse ved at koordinere med forskellige hardware- og softwaresystemer: (1) AMFIP manipulerer μManager til automatisk at flytte det motoriserede trin i Ti2-E-mikroskopet til flere synsfelter (FOV'er) og erhverve lysfeltbilleder gennem et monokromt kamera (Table of Materials); og (2) AMFIP aktiverer flere makrofiler inde i Elements med et tilpasset Java-script for at udføre automatiske operationer til konfokal z-stack-billeddannelse og skift af forskellige laserkanaler (405 nm og 488 nm).
- Indstil miljøet til langsigtet billeddannelse.
- Placer miljøkammeret på det motoriserede stadium af det omvendte mikroskop. Indstil CO2-strømningshastigheden til 160 ml/min., og juster kammerets temperatur (top: 44 °C, bad: 42 °C, trin: 40 °C). Derefter tilsættes 40 ml renset vand i kammerets bad.
- Tag glasbunden petriskål med celler ud af inkubatoren og læg den i miljøkammeret.
- Tænd for den konfokale controller og det omvendte mikroskop. Skift lysstien til højre, og observer cellerne, der fastgøres ved hjælp af μManager. Hvis der er fastgjort tilstrækkelige celler til gelen, skal du overføre petriskålen tilbage til inkubatoren. Hvis der ikke er bundet nok celler til gelen, skal du fortsætte celleinkubationen i yderligere 30 minutter for B2B og 60 minutter for PC9-celler.
- Skær to små stykker tape og sæt dem på kammeret omkring det cirkulære hul. Påfør derefter lidt klæbende lim på båndet (kun på det område, som petriskålen dækker).
- Tag petriskålen ud af inkubatoren. Placer derefter langsomt petriskålen i kammeret og lad bunden af fadet komme i kontakt med limen.
- Tryk på låget på petriskålen i 1 min. for at lade limen komme i fuld kontakt med petriskålen og størkne. Skub derefter forsigtigt petriskålen vandret for at bekræfte, at petriskålen er ubevægelig i kammeret.
- Luk låget på kammeret.
- Indstil parametrene for billedoptagelse for lysfeltbilleddannelse.
- Åbn IntelliJ , og indstil en parameter T1 (f.eks. 120 s) i linje 93 i filen Elements_script.java. Sørg for, at denne værdi er større end køretiden for makroen i Elements , der bruges til konfokal billeddannelse af et synsfelt (FOV). Klik på knappen Kør for at starte AMFIP IntelliJ-projektet.
- Klik på Live og Multi-D Acq. -knappen på hovedgrænsefladen til μManager. Skift derefter lysbanen for det omvendte mikroskop til højre for lysfeltbilleddannelse, skift til 10x-målet, og åbn lysdioden (LED) -lyset (lyskilden til lysfeltbilleddannelse; intensitet: 5%).
- Klik på lysstien, mikroskopmålet og LED-lampeknappen i Elements Ti2-panelet , eller tryk manuelt på de tilsvarende knapper på mikroskopet.
- Juster XY-joysticket og knappen på Z-planet for at finde den korrekte position og gelens in-focus-plan på petriskålen. Brug et 10x mål til at finde de relevante FOV'er af flere enkeltceller, der er fastgjort til gelen.
- Markér afkrydsningsfeltet Flere positioner (XY) i vinduet Multidimensionel anskaffelse . Klik på knappen Rediger positionsliste... og observer vinduet Scenepositionsliste , der dukker op. Skift derefter målet til 40x, øg intensiteten af LED-lyset til 15%, juster det XY-motoriserede trin igen for at finde FOV'erne, og optag koordinaterne ved at klikke på knappen Markér i vinduet Scenepositionsliste .
- Optag 67 ønskede FOV'er. Klik på knappen Gem som... i vinduet Scenepositionsliste for at registrere koordinaterne. Input T1 (parameteren, f.eks. 120 s, defineret i trin 6.2.1) i tidsintervallet for billedoptagelse til T1 i afsnittet Tidspunkter i vinduet Multidimensionel erhvervelse .
- Indstil billedoptagelsen for 2D-YAP- og perlebilleder.
- Åbn Elements, skift lysstien til højre for konfokal billeddannelse, og sluk LED-lyset. Klik derefter på knappen Fjern interlock og tænd FITC-laserkanalen (til YAP-billeddannelse) ved at markere FITC-boksen .
- Juster scanningshastigheden til 1 billede pr. 2 s ved at klikke på 1/2-knappen , og drej på knappen på Z-planet for hurtigt at finde Z-positionen for de vedhæftede celler. Optag de nedre og øvre grænser for Z-stakken.
- Klik på Makro på det øverste bånd, vælg Makro editor under rullemenuen Makro , og indtast værdierne fra trin 6.3.2 i en makrofil.
- Tænd for laserkanalen 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) (til perlebilleddannelse) ved at markere DAPI-boksen for at finde og registrere perlernes fokuserede Z-position. Gå til Makroeditor og indtast de optagede værdier i makrofilen.
- Indstil opgaven med at flytte det motoriserede stadium ved hjælp af AMFIP.
- Gå til μManager , og klik på Plugins | Automatisering for at åbne amfips grafiske brugergrænseflade (GUI). Klik på knapperne Tilføj punkt eller Fjern punkt for at få det nøjagtige antal valgte FOV'er. Indtast de registrerede koordinater for FOV'er i panelet Koordinater.
- Definer den samlede eksperimenttid i tekstfeltet Samlet eksperimenttid .
- Klik på knappen Ekstra tidskonfiguration , og definer tidsintervallet T2 (f.eks. 30 minutter) for at flytte det motoriserede trin til hvert synsfelt.
- Maksimer vinduesstørrelsen på Elements , og træk AMFIP's GUI til højre side af skærmen for at undgå, at GUI'en forstyrrer markørens automatiske operationer.
- Klik på Enter-knappen . Når den første makro er færdig, skal du klikke på knappen Erhverv! i vinduet Multidimensionel erhvervelse .
- Opløs cellerne efter billedoptagelsen.
- Når du er færdig med den langsigtede billeddannelse, skal du stoppe AMFIP-opgaven ved at klikke på knappen Pause i automatiseringspluginvinduet og stopknappen i vinduet Multidimensionel erhvervelse .
- Åbn Elements , og indstil Z-stack-billeddannelse ved at klikke på knapperne Top og Bottom i vinduet ND Acquisition (indstil Z-området til at være større end perlernes Z-område). Skift lysbanen til højre, og åbn LED-lyset (intensitet: 15%).
- Fjern langsomt og forsigtigt lågene på kammeret og petriskålen. I mellemtiden skal du overvåge lysfeltvisningen for enhver drift af synsfeltet.
- Brug en plastpipette til at tage 0,5 ml natriumdodecylsulfatopløsning (SDS) op, hold forsigtigt plastpipetten lidt over kulturmediet i petriskålen og tilsæt 1-2 dråber af SDS-opløsningen i kulturmediet.
- Når cellerne i lysfeltvisningen er opløst, skal du skifte lysstien til venstre, lukke LED-lyset, klikke på knappen Fjern sammenlåsning .
- Kør Z-stack-billeddannelsen. Gem billedstakken, og navngiv den som Reference_N (N er sekvensnummeret for hvert synsfelt).
- Klik på knappen Flere positioner (XY) i vinduet Multidimensionel erhvervelse . Vælg derefter det næste synsfelt og klik på knappen Gå til for at flytte det motoriserede trin til det andet synsfelt.
- Gentag trin 6.5.7 for hvert synsfelt.
7. Måling af YAP N/C-forholdet
- Udfør billedanalyse for at måle YAP N/C-forholdet ved hjælp af Fiji ImageJ-softwaren (figur 4).
- Åbn Fiji ImageJ. Importer billedstakken med lysfelt for alle FOV'er, der er erhvervet af μManager.
- Åbn rullemenuen Billede , og vælg Stakke | Værktøjer | Skive Keeper. Eksporter derefter lysfeltbilledstakken for hvert synsfelt.
- Importer fluorescensbilledet af FITC-kanalen, og overlejr det med lysfeltbilledet for det samme synsfelt. For at gøre dette skal du vælge det fluorescerende billede og vælge Overlay | Tilføj billede... (Billede for at tilføje: det lyse feltbillede; X- og Y-placering afhænger af størrelsen på det lysfeltbillede, der er erhvervet af forskellige kameraer; Uigennemsigtighed: 60-70).
- Åbn rullemenuen Analysér , og vælg Indstil målinger.... Vælg Område; Integreret tæthed og gennemsnitlig grå værdi.
- Klik på knappen Frihåndsvalg på ImageJ's hovedgrænseflade.
- Tegn omridset af cellelegemet og den ønskede kerne. Klik derefter på Analysér | Mål eller tryk på knappen M på tastaturet.
- Overhold vinduet Resultater , der dukker op. Bemærk, at værdierne under kolonnen Område repræsenterer arealet af det valgte område (μm2), og værdierne under kolonnen IntDen repræsenterer fluorescensintensiteten for det valgte område.
- Beregn YAP N/C-forholdet ved hjælp af følgende formler (1), (2) og (3):
(1)
(2)
(3)
Hvor Inuc og Icel repræsenterer den relative intensitet af kernen og cellelegemet, og Anuc og Acel repræsenterer området af kernen og cellelegemet. R er YAP N/C-forholdet. - Gem konturerne til fremtidig beregning af dipoltrækkraft og peri-celle/peri-nuklear forskydning. For at gøre dette skal du klikke på Analysér | Værktøjer | Gem XY-koordinater...
(1)
(2)
(3)8. Måling af trækkraftfelt
- Anvend trækkraftmikroskopi gennem Fiji ImageJ-plugins22,23.
- Åbn Fiji ImageJ.
- Importer billedstakken med perler til et synsfelt.
- Vælg det udsnit, der viser den klareste fordeling af perler, og udtræk det ved at klikke på Billeder | Stakke | Værktøjer | Skive Keeper.
- Importer billedstakken for referencen for det samme synsfelt.
- Vælg udsnittet med samme lysstyrke og kontrast som udsnittet i trin 8.1.3. Uddrag det derefter som et referencebillede.
- Vælg billeder | Stakke | Værktøjer | Sammenkæd for at kombinere de to udsnit fra trin 8.1.3 og 8.1.5 (vælg referencebilledet som det første udsnit).
- Vælg Plugins | | Juster udsnit i stak eller plugins | Billedstabilisator til justering af de to udsnit.
- Vælg Billede | Stakke | Stak til billeder. Vælg derefter | Opslagstabeller | Grøn for at konvertere farven på det første udsnit til grønt og vælge Billede | Opslagstabeller | Rød for at konvertere farven på den anden skive til rød.
- Vælg | Farve | Flet kanaler for at flette de to billeder.
- Overlap billedet med lysfeltbilledet fra det samme synsfelt, og brug dette overlappede billede til at observere perleforskydning.
- Vælg Plugins | PIV | iterativ PIV (Grundlæggende).... Indstil forhørsvinduets størrelse til 128/256; 64/128; 32/64 (mindst fire perler pr. forhørsvindue). Indstil korrelationstærsklen til 0,6.
- Klik på OK. Når beregningen er afsluttet, skal du gemme tekstfilen med de rå data for perleforskydning i en almindelig mappe oprettet af brugeren.
- Vælg Plugins | FTTC | FTTC , og vælg tekstfilen i trin 8.1.9.
- Indtast pixelstørrelsen (μm), Youngs modul af gelen (Pascal) og plotbredden og højden baseret på eksperimentet og billedet af perler.
- Klik på OK for automatisk at gemme tekstfilen, der indeholder rådataene for trækkraft, i samme mappe som tekstfilen i trin 8.1.12.
- Brug grafsoftware (Table of Materials) til at plotte trækkraftfeltet med samme skala for flere celler (figur 1B,C og figur 2B,C).
- Indsæt den tekstfil, der indeholder de rå data for trækkraft, i et regneark.
- Opret et nyt ark, indtast Y-koordinaterne for trækkraft i den første række (arranger fra høje værdier til lave værdier) og X-koordinaterne i den første kolonne (arranger fra lav til høj).
- Indtast værdien af trækkraft til hver koordinat fra rådataene.
- Gem arket i trin 8.2.2 som en *.csv fil.
- Åben oprindelse.
- Klik på File | Åbn og importer filen *.csv i trin 8.2.4. Vælg alle cellerne, og klik på Plot | Kontur| Kontur - Farvefyld.
- I vinduet Plotting: plotvm skal du vælge Y på tværs af kolonnerne for automatisk at angive Y-værdierne til den første række og X-værdierne til den første kolonne. Navngiv derefter titlen og klik på OK.
- Dobbeltklik på heatmapet i det grafvindue, der dukker op.
- Klik på Niveauer i vinduet Colormap/Contours . Skift derefter skalaniveauet til et rimeligt interval (0300 i denne analyse) og klik på OK.
- Klik på Linjer, fjern markeringen af Vis kun på større niveauer, og marker Skjul alle. Klik derefter på OK.
- Højreklik på grafen, og vælg Eksportér grafer.... Gem billedet i den angivne sti.
- Brug MATLAB til at beregne dipolcellens trækkraft.
- Gem rådatafilen (fra trin 8.1.12) og ROI-koordinaterne (cell boundary region of interest) (fra trin 7.1.9) i den samme mappe, der er defineret i trin 8.1.12. Overfør alle MATLAB-filer, der er på plads i AMFIP-pakken, til denne mappe.
- Åbn MATLAB. Åbn den mappe, der er defineret i trin 8.1.12, og åbn filen til beregning af dipoltrækkraft absdipol.m overført til denne mappe i trin 8.3.1.
- Læs de to tekst/csv-filer i trin 8.3.1 ind i MATLAB-arbejdsområdet, og tildel en matrix til to variabler (f.eks. Trækkraft og roi).
- Kør funktionen absdiple (trækkraft,roi).
BEMÆRK: Den første kolonne i udgangen er dipolens trækkraft i nN (nano-Newton). Den anden kolonne af udgangen er vinklen på dipolens trækkraft i forhold til den vandrette akse.
Representative Results
Tydelig YAP-fordeling og dynamik i CRISPR/Cas9-konstrueret PC9-kræft og B2B-normalceller under cellespredning
Repræsentative fluorescensbilleder af YAP-fordeling i enkelte B2B- og PC9-celler på 2, 5, 40 kPa PAA-geler og glasdæksler er vist i figur 1A og figur 2A. Den nukleare lokalisering af YAP i B2B-celler steg med stigende substratstivhed (figur 1A), mens PC9-celler viste lignende YAP-koncentration i kernen og cytoplasmaet på substrater med varierende stivhed (figur 2A). Repræsentative fluorescensbilleder af YAP-fordeling i enkelte, spredende B2B- og PC9-celler på 5 kPa-hydrogelsubstratet (fra 0. time til 10. time efter de celler, der er bundet til substraterne) er vist i henholdsvis figur 1B og figur 2B. B2B-cellen øgede monotont spredningsområdet over tid sammen med et fald i YAP N / C-forholdet (figur 1B), mens PC9-cellen opretholdt et forholdsvis uændret cellespredningsområde, orientering og YAP N / C-forhold gennem hele 10 timers spredningsprocessen (figur 2B). I løbet af den tidlige sprednings varighed på 10 timer deformerede den repræsentative B2B-celle konstitutivt substratoverfladen og påførte tidsudviklende celletrækkraft over hele celleområdet (figur 1C og figur 1D).
I modsætning hertil udviklede den repræsentative PC9-celle kun forskydning og trækkraft i de to ender af cellelegemet, og dens trækkraft faldt efter 7,5 timer (figur 2C og figur 2D). Flere timelapse-billeder og trækkraftmålinger af B2B- og PC9-celler i det tidlige spredningsstadium findes i supplerende figur S2 og supplerende figur S3. Andre tilstande af PC9-celledynamik blev også observeret (figur 6). Parallelt med disse forskellige spredningsegenskaber viste B2B- og PC9-celler forskellig YAP-fordeling og dynamik (figur 3). På en 5 kPa gel blev YAP i B2B-celler koncentreret i kernen ved 0. time og blev mere homogent fordelt over cellelegemet ved 10. h. PC9-celler viste imidlertid en mere homogen fordeling af YAP i kernen og cytoplasmaet gennem hele 10 timer af spredningsprocessen. For kvantitativt at analysere YAP-aktiviteten og translokationen i B2B- og PC9-celler blev YAP N/C-forholdet beregnet ved hjælp af algoritmen beskrevet i figur 4.
For yderligere at undersøge den forskellige YAP-dynamik blev tidsmæssige ændringer i YAP N / C-forhold, celle / kerneområde og trækkraft af flere enkelte B2B-celler (n = 10) og PC9-celler (n = 5) sammenlignet (figur 5). Det blev konstateret, at det gennemsnitlige YAP N / C-forhold mellem B2B-celler faldt fra 2,54 ± 0,22 til 1,79 ± 0,21 (n = 10; p = 0,0022 **; Figur 5A), mens det gennemsnitlige YAP N/C-forhold mellem PC9-celler ændrede sig fra 1,92 ± 0,26 til 1,57 ± 0,07 (n = 5; p = 0,187 (ikke signifikant (ns)); Figur 5A). Den gennemsnitlige dipoltrækkraft af B2B-celler ændrede sig fra 256,17 ± 123,69 nN til 287,44 ± 99,79 nN (p = 0,7593 (ns); Figur 5B). Den gennemsnitlige dipoltrækkraft af PC9-celler ændrede sig fra 141,19 ± 33,62 nN til 168,52 ± 73,01 nN (p = 0,7137 (ns); Figur 5B). Det gennemsnitlige cellespredningsområde for B2B-celler steg fra 613,89 ± 102,43 μm2 til 942,51 ± 226,71 μm2 (p = 0,0512 (ns); Figur 5C).
Det gennemsnitlige cellespredningsområde for PC9-celler ændrede sig fra 495,78 ± 97,04 μm2 til 563,95 ± 89,92 μm2 (p = 0,5804 (ns); Figur 5C). Det gennemsnitlige kernespredningsområde for B2B-celler steg fra 181,55 ± 36,18 μm2 til 239,38 ± 43,12 μm2 (p = 0,1217 (ns); Figur 5D) og det gennemsnitlige kernespredningsområde for PC9-celler ændrede sig fra 133,31 ± 30,05 μm2 til 151,93 ± 22,49 μm2 (p = 0,5944 (ns); Figur 5D). Disse resultater tyder på, at (1) B2B-celler viser et konstitutivt substrat-stivhedsafhængigt YAP N/C-forhold; 2) B2B-cellernes trækkraft er højere end PC9-cellernes og (3) i modsætning til B2B-celler viser PC9-celler en begrænset stigning i cellearealet og ændringer i YAP N/C-forholdet under spredningsprocessen på 10 timer.
Korrelation af YAP-distribution og dynamik til migrationstilstandene for B2B-celler
YAP N/C-forhold og dipoltrækkraft af alle B2B- (n=10) og PC9-celler (n=5) som funktion af cellespredningsområdet og kernespredningsområdet blev sammenlignet. YAP N/C-forholdet og dipoltrækkraften i PC9-celler korrelerede ikke klart med deres småcelle- og kernespredningsområdeområder (figur 6). I modsætning hertil syntes YAP N / C-forholdet og dipoltrækkraften af B2B-celler at følge to forskellige tendenser (figur 6A og figur 6C), hvilket tyder på, at der kan være to grupper af B2B-celler, der eksisterer sammen i dette eksperiment. I den første gruppe øges YAP N/C-forholdet og dipoltrækkraften sammen med udvidelsen af cellespredningsområdet og når deres maksimum ved ~ 1000 μm2 (figur 6C og figur 6D, angivet med den gule stiplede linje). I den anden gruppe øges YAP N/C-forholdet og dipoltrækkraften langsommere med udvidelsen af cellespredningsområdet og opretholder næsten konstante værdier, når cellespredningsområdet fortsætter med at stige (figur 6C,D, angivet med den grønne stiplede linje).
PC9-kræftceller genererer trækkraft i peri-nukleare regioner
Enkelte, spredende PC9-celler fortrænger substraterne i de peri-nukleare regioner, startende fra den 6. kultur (figur 7C). For at visualisere den peri-nukleare forskydning forårsaget af celletrækkraft overlappede vi billederne af fluorescerende perler taget før (rød) og efter (grøn) fjernelsen af cellerne fra substraterne (se protokolafsnittet for detaljer). De perler, der ikke har nogen forskydning, vises gule i de overlappede billeder, dvs. tilføjelsen af røde og grønne farver. I modsætning hertil vil perlerne, der er forskudt fra deres hvilepositioner på grund af celletrækkraft, vise adskilte grønne og røde farver.
Især i både PC9 (figur 7C,D) og B2B (figur 7E) celler blev perleforskydning observeret i cytoplasmaet og i kernen ud over dem ved cellegrænsen. For at fremhæve den peri-nukleare forskydning bruges Boussinesq-ligningen fra lineær elasticitetsteori til at forudsige den teoretiske 2D-forskydning genereret af en hypotetisk dipolkraft ved cellegrænsen (sort stiplet linje i figur 7B)24. Ved at sammenligne denne teoretiske kurve med den reelle substratforskydning målt langs den samme akse (hvid stiplet linje i figur 7D) viste det sig, at de reelle forskydninger i kernen var 1,5-8 gange større end den teoretiske værdi (figur 7B), hvilket indikerer eksistensen af trækkraft i de peri-nukleare regioner.
Figur 1: Ændringer i YAP-ekspression/-fordeling, substratforskydningsfelt og trækkraftfelt for en B2B-normalcelle på substrater med varierende stivhed og under tidlig spredning. (A) YAP-ekspressionen af en B2B-celle podet på 2, 5 og 40 kPa PAA-geler og et glasdæksler efter 60 timer fra indledende celle-substratfastgørelse. (B) B2B-cellen blev podet på en 5 kPa PAA-gel og afbildet over 10 timer efter den første celle-substrat-fastgørelse. YAP-ekspression er repræsenteret af grøn fluorescensintensitet. Bemærk: YAP-intensiteten inde i kernen falder gradvist, men forbliver højere end i cytoplasmaet over tid. Farvebjælkerne angiver niveauerne af YAP-udtryk (grøn = højt udtryk; sort = lavt udtryk) i (A) og (B). (C) Substratdeformation (overlappet med lysfeltbilledet) på celleplacering er repræsenteret af forskydningsfeltet på hvert tidspunkt. Forskydningsretning og størrelse vises af henholdsvis pilretningen og farven. Forskydningen bliver større i enderne af B2B-cellelegemet, når cellespredningsområdet øges. Farvebjælken angiver forskydningsstørrelse (crimson = høj størrelse; sort = lav størrelse). D) Trækfelt (overlappet med lysfeltbilledet) beregnet ud fra forskydningsfeltet. Trækkraften er koncentreret på grænsen af B2B-cellerne. De hvide og gule prikkede konturer afgrænser grænserne for henholdsvis cellen og kernen. Farvebjælken angiver trækkraftstørrelse (crimson = høj størrelse; sort = lav størrelse). Skalastænger = 20 μm. Forkortelser: YAP = Ja-associeret protein; PAA = polyacrylamid. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Ændringer i YAP-ekspression/-fordeling, substratforskydningsfelt og trækkraftfelt for en PC9-kræftcelle på substrater med varierende stivhed og under tidlig spredning. (A) YAP-ekspressionen af en PC9-celle podet på 2, 5 og 40 kPa PAA-geler og glasdæksler efter 65 timer fra den indledende celle-substratfastgørelse. (B) PC9-cellen blev podet på en 5 kPa PAA-gel og afbildet over 10 timer efter den første celle-substrat-fastgørelse. YAP-ekspression er repræsenteret af grøn fluorescensintensitet. Bemærk: YAP-intensiteten plateauer fra 1,5 timer og fremefter. Farvebjælkerne angiver niveauerne af YAP-ekspression (grøn = højt udtryk; sort = lavt udtryk) i (A) og (B). (C) Substratdeformation (overlappet med lysfeltbilledet) på celleplacering er repræsenteret af fluorescerende perleforskydningsfelt på hvert tidspunkt. Forskydningsretning og størrelse vises af henholdsvis pilretningen og farven. Forskydningsfeltet forårsaget af PC9-celler er mindre end det, der er forårsaget af B2B-cellen. Gennem hele 10 timers spredningsprocessen forbliver arealet af PC9-celler næsten konstant. Farvebjælken angiver forskydningsstørrelse (crimson = høj størrelse; sort = lav størrelse). (D) Trækkraftfelt (overlappet med lysfeltbilledet) beregnet ud fra forskydningsfelt. Trækkraften genereret af denne repræsentative PC9-celle falder gradvist fra 6. time til 10. h. De hvide og gule prikkede konturer afgrænser grænserne for henholdsvis cellen og kernen. Farvebjælken angiver trækkraftstørrelse (crimson = høj størrelse; sort = lav størrelse). Skalastænger = 20 μm. Forkortelser: YAP = Ja-associeret protein; PAA = polyacrylamid. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: YAP-fordeling i B2B- og PC9-celler i det tidlige spredningsstadium. (A) YAP-intensiteten af B2B-cellen måles langs den tildelte røde akse ved 0. og 10. h. (B) Ved 0. time viser YAP-intensiteten dramatiske koncentrationsforskelle mellem kernen og cytoplasmaet. Ved 10. time bliver YAP-intensiteten mere homogen på tværs af hele cellekroppen. (C) YAP-intensiteten af PC9-cellen måles langs den tildelte blå akse ved 0. og 10. h. (D) Ved 0. h forekommer YAP-intensiteten i kernen højere end i cytoplasmaet, selvom forskellen ikke er så bemærkelsesværdig som i B2B-celler. Ved den 10. time forekommer YAP-intensiteten i kernen stadig lidt højere end i cytoplasmaet, med en variationstendens svarende til den ved 0. h. Skalastænger = 20 μm (A, C). Forkortelse: YAP = Ja-associeret protein. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Måling af YAP N/C-forholdet. (1) Anvend Fiji ImageJ til at tegne omridset af kernen og måle dens 2D-projicerede område Anuc. (2) Mål fluorescensintensiteten inde i kernen Inuc. (3) Tegn omridset af cellelegemet og mål dets projicerede område Acel. (4) Mål fluorescensintensiteten inde i cellen Icel. (5) Beregn YAP-kernetætheden Dnuc, YAP-cytoplasmatætheden Dcyto og deres forhold R: Dnuc = Inuc / Anuc; Dcyto=(Icel-Inuc)/(Acel-Anuc); R = Dnuc / Dcyto. Farvebjælken angiver niveauerne af YAP-udtryk (grøn = højt udtryk; sort = lavt udtryk). Skalabjælke = 20 μm. Forkortelser: YAP = Ja-associeret protein; N = kerne; C = cytoplasma. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Tydeligt YAP-udtryk, celle / kernemorfologi og cellulær trækkraft i PC9-kræft og B2B-normale celler under cellespredning. (A) YAP N/C-forholdsændring i løbet af de første 10 timer af enkeltcellespredning. Det gennemsnitlige YAP N/C-forhold mellem B2B-celler (rød kolonne; n = 10) ændrede sig fra 2,54 ± 0,22 til 1,79 ± 0,21 (n = 10; p = 0,0022**), mens det gennemsnitlige YAP N/C-forhold mellem PC9-celler (blå kolonne; n = 5) ændrede sig fra 1,92 ± 0,26 til 1,57 ± 0,07 (p = 0,187 (ns)). B) Den gennemsnitlige dipoltrækkraft som funktion af tiden. Den gennemsnitlige dipoltrækkraft af B2B-celler ændrede sig fra 256,17 ± 123,69 nN til 287,44 ± 99,79 nN (p = 0,7593 (ns)) og den gennemsnitlige dipoltrækkraft af PC9-celler ændrede sig fra 141,19 ± 33,62 nN til 168,52 ± 73,01 nN (p = 0,7137 (ns)). (C) Det gennemsnitlige celleareal som funktion af tiden. Det gennemsnitlige cellespredningsområde for B2B-celler steg fra 613,89 ± 102,43 μm2 til 942,51 ± 226,71 μm2 (p = 0,0512 (ns)) og det gennemsnitlige cellespredningsområde for PC9-celler ændrede sig fra 495,78 ± 97,04 μm2 til 563,95 ± 89,92 μm2 (p = 0,5804 (ns)). D) Det gennemsnitlige kerneareal som funktion af tiden. Det gennemsnitlige kernespredningsområde for B2B-celler steg fra 181,55 ± 36,18 μm2 til 239,38 ± 43,12 μm2 (p = 0,1217 (ns)) og det gennemsnitlige kernespredningsområde for PC9-celler ændrede sig fra 133,31 ± 30,05 μm2 til 151,93 ± 22,49 μm2 (p = 0,5944 (ns)). Forkortelser: YAP = Ja-associeret protein; N = kerne; C = cytoplasma; ns = ikke signifikant. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: YAP N/C-forhold og dipoltrækkraft som funktion af spredningsområdet for celle og kerne. YAP N/C-forhold og dipoltrækkraft af B2B-celler (n = 10) og PC9-celler (n = 5) beregnes fra 6. h til 10. time efter fastgørelse til substrat. A) YAP N/C-forholdet som funktion af cellespredningsområdet. YAP N/C-forholdet mellem B2B-celler varierer fra 1,16 til 2,53, mens YAP N/C-forholdet mellem PC9-celler varierer fra 1,27 til 1,88. Cellespredningsområdet for B2B-celler varierer fra 391,94 μm2 til 1986,40 μm2. Det cellespredningsområde af PC9-celler varierer fra 284,46 μm2 til 830,12 μm2. B) YAP N/C-forholdet som funktion af kernespredningsarealet. Kernespredningsområdet for B2B-celler varierer fra 107,09 μm2 til 514,28 μm2. Kernespredningsområdet for PC9-celler varierer fra 58,03 μm2 til 259,65 μm2. Dipoltrækkraft af B2B-celler som en funktion af cellespredningsområdet (C) og kernespredningsområdet (D). Spredende og ikke-migrerende B2B-celler viser højere trækkraft (fra 47,50 nN til 1051,48 nN) med lavere celle- og kerneområde. Under spredning og migrering viser B2B-celler lavere trækkraft (fra 105,80 nN til 310,28 nN) med større celle- og kerneområde. Forkortelser: YAP = Ja-associeret protein; N = kerne; C = cytoplasma. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Peri-nuklear forskydning i normale B2B- og kræft-PC9-celler. (A) Skematisk side-view diagram over peri-nuklear og peri-celle forskydning målt fra perleforskydning i substratet. (B) Substratforskydning under PC9-cellen måles langs celleaksen (hvid stiplet linje i 7D). Den teoretiske forskydning genereret af dipolkraften ved cellegrænsen er vist ved Boussinesq-ligningen (sort stiplet kurve). (C) og (D) Overlappende fluorescerende perlebilleder med (røde) og uden (grønne) celler til PC9-cellerne ved 6. time efter fastgørelse (øverste visning). Gule (nøjagtig overlapning af røde og grønne farver) perler indikerer ingen forskydning. De adskilte grønne og røde perler (spids af gule pile) repræsenterer den peri-nukleare forskydning. Gule pile angiver disse kontraherede peri-nucleus pletter placeret i periferien af kernen. (E) Peri-nuklear forskydning genereret af B2B-cellen ved 1,5. time efter celle-substratfastgørelse. Skalastænger = 10 μm (C-E). Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur S1: Det genomiske sekvenskort over YAP-mNeonGreen21-10/11. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S2: Ændringer i YAP-ekspression/-fordeling, substratforskydningsfelt og trækkraftfelt for B2B-normale celler under tidlig spredning. (A, D, G, J, M) B2B-cellen blev podet på en 5 kPa PAA-gel og afbildet over 10 timer efter den oprindelige celle-substrat-fastgørelse. YAP-ekspression er repræsenteret af grøn fluorescensintensitet. Bemærk: YAP-intensiteten inde i kernen falder gradvist, men forbliver højere end i cytoplasmaet over tid. Farvebjælkerne angiver niveauerne af YAP-udtryk (grøn = højt udtryk; sort = lavt udtryk) i (A, D, G, J, M). (B, E, H, K, N) Substratdeformation (overlappet med lysfeltbilledet) på celleplacering er repræsenteret af forskydningsfeltet på hvert tidspunkt. Forskydningsretning og størrelse vises af henholdsvis pilretningen og farven. Forskydningen bliver større i periferien af B2B-cellelegemet, når cellespredningsområdet øges. Farvebjælkerne angiver forskydningsstørrelse (crimson = høj størrelse; sort = lav størrelse) i (B, E, H, K, N). (C, F, I, L, O) Trækkraftfelt (overlappet med lysfeltbilledet) beregnet ud fra forskydningsfeltet ved hjælp af Traction Force Microscopy. Trækkraften er koncentreret i periferien af B2B-celler. Farvebjælkerne angiver trækkraftstørrelse (crimson = høj størrelse; sort = lav størrelse) i (C, F, I, L, O). Skalastænger = 20 μm. Forkortelser: YAP = Ja-associeret protein; PAA = polyacrylamid. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S3: Ændringer i YAP-ekspression/-fordeling, substratforskydningsfelt og trækkraftfelt for PC9-kræftceller under tidlig spredning. (A, D, G, J) PC9-cellen blev podet på en 5 kPa PAA-gel og afbildet over 10 timer efter den indledende celle-substrat-vedhæftning. YAP-ekspression er repræsenteret af grøn fluorescensintensitet. Bemærk: YAP-intensiteten inde i kernen falder gradvist, men forbliver ligner eller lidt lavere end i cytoplasmaet over tid. Farvebjælkerne angiver niveauerne af YAP-udtryk (grøn = højt udtryk; sort = lavt udtryk) i (A, D, G, J). (B, E, H, K) Substratdeformation (overlappet med lysfeltbilledet) på celleplacering er repræsenteret af forskydningsfeltet på hvert tidspunkt. Forskydningsretning og størrelse vises af henholdsvis pilretningen og farven. Forskydningen bliver større i periferien af PC9-cellelegemet, når cellespredningsområdet øges. Farvebjælkerne angiver forskydningsstørrelse (crimson = høj størrelse; sort = lav størrelse) i (B, E, H, K). (C, F, I, L) Trækkraftfelt (overlappet med lysfeltbilledet) beregnet ud fra forskydningsfeltet. Trækkraften er koncentreret i periferien af PC9-celler. Farvebjælkerne angiver trækkraftstørrelse (crimson = høj størrelse; sort = lav størrelse) i (C, F, I, L). Skalastænger = 20 μm. Forkortelser: YAP = Ja-associeret protein; PAA = polyacrylamid. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Billeddannelsesprocessen (trin 6.3) er afgørende for at sikre, at fluorescensbillederne er af tilstrækkelig god kvalitet til at give gyldige kvantificeringsresultater. Z-stack-billederne af fluorescerende protein eller perler skal have et z-område, der er stort nok til at omfatte de fokuserede billeder for alle de Z-positioner, som prøven spænder over. Et andet kritisk trin er at indsamle referencebillederne af fluorescerende perler efter opløsning af cellerne (trin 6.5). Da referencebillederne skal tages på de samme positioner i trin 6.3, bør der ikke induceres nogen relativ forskydning mellem petriskålen, miljøkammeret og mikroskopet. Efterforskerne, der udfører opløsningstrinnet, skal være omhyggelige med at fjerne låget på petriskålen og sikre, at den påførte mekaniske forstyrrelse ikke er stor nok til at ændre skålens placering i miljøkammeret.
Nedenfor findes løsninger til at løse nogle fejl, der kan opstå under eksperimenter. Hvis ingen makro er aktiveret efter at have klikket på Enter i trin 6.4, skyldes det sandsynligvis, at det venstre nederste område af skærmen er optaget af et ikke-Element-vindue. I et sådant tilfælde skal det venstre nederste område af vinduet ryddes, så makroer kan aktiveres i Elements. En anden almindelig fejl er, at lysfeltbillederne ser sorte ud. Dette problem skyldes et utilstrækkeligt tidsinterval mellem erhvervelserne af fluorescens og lysfeltbilleder. Små forsinkelser i fluorescensbilleddannelsens tidstælling kan akkumuleres over tid og forårsage betydelige forsinkelser og forstyrre lysfeltbilleddannelsen. En løsning er at justere varigheden af en billeddannelsescyklus for alle positionerne til at være mindre end (ikke lig med) tidsintervallet mellem starten af på hinanden følgende bevægelser. Denne handling opdaterer tidstællingen og eliminerer den kumulative fejl i begyndelsen af hver billedbehandlingscyklus.
Denne optiske forhørsteknologi understøtter (1) en bred vifte af hardware/software, herunder, men ikke begrænset til, Nikon, (2) forskellige typer validerede hydrogelsystemer, herunder gelatine-, PEG-, Matrigel- og kollagen I-geler, og (3) den programmerbare tilpasning baseret på forskernes forskellige behov. Men hvis nogen af kontrolfunktionerne på nederste niveau ikke er tilgængelige fra et kommercielt mikroskop, bliver tilpasning af funktionerne ved hjælp af AMFIP udfordrende. En anden begrænsning af denne teknik er prøvens rumlige drift i både XY- og fokusplanerne (Z). Selvom denne begrænsning kan overvindes under efterbehandlingen af billederne, er det vigtigt at forbedre autofokusfunktionen for at korrigere prøvernes realtidsdrift. Denne forbedring vil øge gennemstrømningen af billeddannelsesprocessen og reducere den potentielle fejl forårsaget af driften under eksperimenter.
Mekanotransducere, såsom YAP, kan tjene som nye terapeutiske mål for udviklingen af lovende kræftbehandlinger25,26,27. Nye data tyder på, at YAP fremmer spredning og invasion af kræftceller. Mekanik-induceret YAP-translokation fra cytoplasmaet til kernen aktiverer transkriptionen af gener relateret til cellemigration, proliferation, invasion og apoptose, hvilket fører til afvigende celleadfærd28,29,30,31. Dette arbejde havde til formål at undersøge den potentielle sammenhæng mellem YAP N / C-forholdet og cellemekanikken i to typiske humane lungekræft og normale cellelinjer. I løbet af cellespredningsperioden på 10 timer viser PC9-celler lignende YAP-koncentrationer i kernen og cytoplasmaet (figur 3D og figur 5A). B2B-celler viser en højere YAP-koncentration i kernen end i cytoplasmaet (figur 3C og figur 5A). Dette forhold, der blev fundet i det tidlige spredningsstadium, er forskelligt fra størstedelen af de offentliggjorte resultater, der sammenligner YAP-koncentration i kernen mellem normale og kræftceller. Selvom det ikke nødvendigvis er i det tidlige spredningsstadium, viser de fleste offentliggjorte resultater, at YAP er mere koncentreret i kernen af kræftceller end i kernen i normale celler27,28. Kun én undersøgelse af brystkræft rapporterede en undtagelse32, der viser, at YAP er mere koncentreret i cytoplasmaet, hvilket stemmer overens med vores nuværende observationer foretaget i lungekræft PC9-celler. Efter forfatternes bedste overbevisning er dette arbejde det første, der viser et lavere YAP N / C-forhold i en human lungekræftcellelinje. Forfatterne antager, at årsagen til et stabilt YAP N / C-forhold i PC9-celler kan skyldes den lave variation i celle / kernespredningsområdet og trækkraft i PC9-celler i det tidlige spredningsstadium. Dissektionen af de understøttende molekylære mekanismer med lavt YAP N/C-forhold i PC9- og B2B-celler er i gang.
I løbet af de første 10 timers spredning viser disse to cellelinjer et særskilt forhold mellem YAP N / C-forholdet, celletrækkraft og spredningsområde (figur 5). For B2B-celler er et højere YAP N/C-forhold korreleret med et højere celle- og kernespredningsområde (figur 6A,B), hvilket er i overensstemmelse med de rapporterede data for andre normale celler33. Interessant nok, selvom udviklingstendensen i dette forhold generelt findes i alle B2B-celler, der er registreret, findes to forskellige grader (høj og lav) af dette forhold. B2B-celler, der spredes og migrerer samtidigt, viser lavere trækkraft og højere celle- og kernespredningsområde med et højere YAP N / C-forhold (2,05 ± 0,32). For B2B-celler, der spredes og forbliver på samme sted, viser de højere trækkraft og lavere celle- og kernespredningsområde med et lavere YAP N / C-forhold (1,74 ± 0,21). Disse to grader af relationer er demonstreret i de forgrenede spredte datagrupper (figur 6C,D). Som rapporteret i litteraturen har stationære normale celler, såsom embryonale fibroblast NIH 3T3-celler, højere trækkraft end vandrende celler34. De data, der er rapporteret i dette papir, tyder på, at de spredende og ikke-migrerende B2B-celler anvendte højere trækkraft end spredning og migrering af B2B-celler, hvilket sandsynligvis tyder på, at der er behov for høj trækkraft for ikke-migrerende celler til at stabilisere sig på substratet.
Derudover viser disse data, at stationære normale B2B-celler genererer en højere peri-nuklear kraft, mens tidligere forskning udført af andre forskere kun rapporterede højere celletrækkraft genereret i periferien af stationære celler34,35,36,37. Forfatterne mener, at forskellen i den iboende tendens til migration i eksperimenterne kan forårsage disse modstridende resultater. I de offentliggjorte eksperimenter var firkantet mikromønster blevet brugt til at begrænse enkeltceller fra at sprede sig og hæmme migration; om cellerne havde tendens til at migrere vides ikke. Da migrerende celler ofte udviser høj trækkraft i periferien af cellerne38, er det sandsynligt, at celler med tendens til at migrere stadig vil opretholde høj trækkraft i periferien, selvom deres migration er begrænset. I denne nuværende undersøgelse er de stationære celler ikke begrænset af nogen mikromønster, men migrerer ikke, hvilket indikerer, at cellerne har tendens til at opretholde deres ikke-migrerende tilstand. En anden mulighed er, at celleformen defineret af mikromønsteret kan påvirke fordelingen af fokale adhæsioner og trækkraft39. Resultaterne i denne undersøgelse blev genereret uden nogen begrænsende mikromønster og repræsenterer kraftfordelingen af stationære celler i deres oprindelige form.
Efter forfatternes bedste overbevisning rapporterede kun én publikation til dato specifikt fundet af peri-nukleare kræfter i normale celler (museembryonale fibroblaster), potentielt forårsaget af actinhætten, der spænder over kernen40. YAP cytoplasma-til-kerne translokation er korreleret med stigningen i peri-nuklear kraft40. En grundig søgning i den relevante litteratur gav ingen publikationer, der rapporterer om en peri-atomkraft eller actinhætten i kræftceller. En indirekte undersøgelse af melanomkræftceller viste, at actinkanten (en anden peri-nuklear actinorganisation placeret omkring, men ikke dækker kernen) reducerer cellemigrationshastighederne41, hvilket indirekte tyder på eksistensen af en peri-nuklear kraft. Der rapporteres dog ingen direkte eksperimentelle data. I denne undersøgelse fandt forfatterne, at både PC9- og B2B-celler viser peri-nuklear forskydning og trækkraft. Mekanismerne i genereringen af de peri-nukleare kræfter og deres virkninger forbliver kontroversielle. I normale celler blev actinhætten rapporteret at spille en rolle i reguleringen af kernemorfologi og kromatinorganisation42, transmittere mekaniske signaler fra fokale adhæsioner ind i kernen gennem linkere af nukleoskelet og cytoskeletkompleks (LINC)43 og regulering af cellemigration44. Lamin A/C er relateret til dannelsen og forstyrrelsen af actin cap40,41,42,43,44. Rapporten, der hævdede, at actinhætten genererer en peri-atomkraft, overvejede imidlertid ikke den potentielle rolle, som actin-randen40 spiller. I kræftceller letter overekspression af Lamin A dannelsen af en actinkant og begrænser kræftcellemigration. Overekspression af Lamin B reducerer actin fælgdannelse og fremmer migration. Den peri-nukleare kraft kan være involveret i denne proces på grund af eksistensen af peri-nuklear actin-organisation og effekten af Lamin A. Resultaterne af denne undersøgelse viste imidlertid ingen tegn på målte peri-nukleare kræfter eller actinhættens opførsel. Derfor er opdagelsen af peri-nukleare kræfter i PC9-celler i denne nuværende undersøgelse den første rapport, der viser peri-nukleare kræfter og forskydninger i lungekræftceller. Forfatterne undersøger i øjeblikket de molekylære mekanismer og funktioner af peri-nukleare kræfter i CRISPR/Cas9-konstruerede PC9- og B2B-celler.
Ud over det all-optiske mekanobiologiske forhør, der demonstreres i dette papir, kan det integrerede multifunktionelle system anvendes til optisk at undersøge et utal af andre vigtige fysiologiske og patobiologiske signaler i levende systemer. For eksempel har forfatternes laboratorium for nylig etableret flere stabilt transducerede humane kræftcellelinjer, der co-udtrykker tre lysresponsive membranproteiner: membranspændingsindikator QuasAr2 (excitation: 640 nm; emission: 660 nm-740 nm), membranspændingsdepolarisator CheRiff (excitation: 488 nm) og membranspændingshyperpolarisator eNpHR3 (excitation: 590 nm). Disse tre funktionelle proteiner kan aktiveres af spektrum-ortogonale laserlinjer på en krydstalefri måde, hvilket muliggør all-optisk tovejs signalkommunikation (udlæsning og kontrol) af membranelektrofysiologi. Ved hjælp af et integreret opto-elektroniksystem og en manuel patch-klemme har forfatterne valideret den helt optiske kontrol og aflæsning af membranspændingen (Vm) i enkelte humane kræftceller og multicellulære tumorsfæroider. Det helt optiske elektrofysiologiske forhør åbner mulighed for detaljerede udforskninger af tidligere utilgængelig bioelektricitet i kræftceller, hvilket kan hjælpe med at fremme tumorbiologi fra en ny akse.
Disclosures
Der er ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Dette projekt støttes økonomisk af Cancer Pilot Award fra UF Health Cancer Center (X. T. og D. S.) og Gatorade Award Start-up Package (XT). Forfatterne sætter stor pris på de intellektuelle diskussioner med og de tekniske støtter fra Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Ji-Hyun Lee (Biostatistik, UF), Dr. Hugh Fan (MAE, UF), Dr. Warren Dixon (MAE, UF), Dr. Ghatu Subhash (MAE, UF), Dr. Mark Sheplak (MAE & ECE, UF), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE, UF), Dr. Scott Banks (MAE, UF), Dr. Matthew Traum (MAE, UF), Dr. David Hahn (University of Arizona), Dr. Weihong Wang (Oracle Corporation), Dr. Youhua Tan (Hong Kong Polytechnic University) og Nikons supportteam (Dr. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon og Jon Ekman). Forfatterne er dybt taknemmelige for den generøse og effektive støtte fra alle medlemmer af Tangs, Siemanns og Guans forskningslaboratorier og alle medarbejdere på MAE & ECE & Physics & Radiation Oncology Departments, UF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-aldrich | 440140 | |
| 0.05 % Trypsin | Corning | 25-051-CI | |
| 75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
| 8 Benchtop Centrifuge | Thermo | 75007210 | |
| A1R confocal system | Nikon | HD25 | |
| Acetic acid | Sigma-aldrich | 695092 | glacial, ACS reagent, ≥99.7% |
| BEAS-2B (B2B) cells | Sigma-aldrich | 95102433 | human epithelial cells from lung tissue |
| Carboxylate-Modified Microspheres | Invitrogen | F8797 | |
| Culture medium (RPMI-1640) | Gibco | 11875093 | |
| Desktop Computer | Dell | 2018 | with Windows 10 operating system |
| Environmental chamber TIZB | Tokai Hit | TIZB | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140 | |
| Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
| Fiji ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation | 1.53k | |
| Glass-bottom petri dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| HEPES buffered saline | Sigma-aldrich | 51558 | |
| Hydrazine hydrate solution | Sigma-aldrich | 53847 | |
| IntelliJ IDEA | JetBrains | 2020 | Java development platform |
| Java Development Kit | Oracle | 14.0 | |
| Kimwipe | Kimtech Science | 3066-05 | |
| MATLAB | MathWorks | 2020b | |
| Monochrome Camera | FLIR | BFS-U3-70S7M-C | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-218 | |
| N,N′-Methylenebisacrylamide solution | Sigma-aldrich | M1533 | |
| NIS-Elements software platform | Nikon | 4.50 | software platform |
| Origin | OriginLab | OriginPro 2017 (Learning Edition) | data analysis and graphing software |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PC9 cells | Sigma-aldrich | 90071810 | human adenocarcinoma cells from lung tissue |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | F-553S | high-fidelity DNA polymerase |
| Scotch tape | Scotch | adhesive tape | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma-aldrich | 05030 | |
| Super glue | Gorilla | cyanoacrylate glue | |
| Ti2-E inverted microscope | Nikon | MEA54000 | |
| TI2-S-SE-E Motorized Stage with Encoder | Nikon | MEC56120 | |
| μManager | version 2.0 gamma | open source microscopy software (https://micro-manager.org/) |
References
- Werley, C., Boccardo, S., Rigamonti, A., Hansson, E., Cohen, A. Multiplexed optical sensors in arrayed islands of cells for multimodal recordings of cellular physiology. Nature Communications. 11 (1), 3881 (2020).
- Yang, B., et al. Epi-illumination SPIM for volumetric imaging with high spatial-temporal resolution. Nature Methods. 16 (6), 501-504 (2019).
- Saraswathibhatla, A., Galles, E. E., Notbohm, J. Spatiotemporal force and motion in collective cell migration. Scientific Data. 7 (1), 197 (2020).
- Saraswathibhatla, A., Henkes, S., Galles, E. E., Sknepnek, R., Notbohm, J. Coordinated tractions control the size of a collectively moving pack in a cell monolayer. Extreme Mechanics Letters. 48, 101438 (2021).
- Wang, W., Kim, C. K., Ting, A. Y. Molecular tools for imaging and recording neuronal activity. Nature Chemical Biology. 15 (2), 101-110 (2019).
- Eliceiri, K. W., et al.
- Carpenter, A. E., Kamentsky, L., Eliceiri, K. W. A call for bioimaging software usability. Nature Methods. 9 (7), 666-670 (2012).
- Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nature Biotechnology. 34 (11), 1137-1144 (2016).
- Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
- Luo, Q., et al. Automatic multi-functional integration program (AMFIP) towards all-optical mechanobiology interrogation. bioRxiv. , (2021).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using manager. Current Protocols in Molecular Biology. 92 (1), 14-20 (2010).
- Tulpule, A., et al. Kinase-mediated RAS signaling via membraneless cytoplasmic protein granules. Cell. 184 (10), 2649-2664 (2021).
- Tang, X., Tofangchi, A., Anand, S. V., Saif, T. A. A novel cell traction force microscopy to study multi-cellular system. PLOS Computational Biology. 10 (6), 1003631 (2014).
- Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
- Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews Materials. 5, 351-370 (2020).
- Phelps, E. A., et al. Maleimide cross-linked bioactive PEG hydrogel exhibits improved reaction kinetics and cross-linking for cell encapsulation and in situ delivery. Advanced Materials. 24 (1), 64-70 (2012).
- Bajaj, P., Tang, X., Saif, T. A., Bashir, R. Stiffness of the substrate influences the phenotype of embryonic chicken cardiac myocytes. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 95 (4), 1261-1269 (2010).
- Temples, M. N., Adjei, I. M., Nimocks, P. M., Djeu, J., Sharma, B. Engineered three-dimensional tumor models to study natural killer cell suppression. ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (7), 4179-4199 (2020).
- Feng, S., et al. Improved split fluorescent proteins for endogenous protein labeling. Nature Communications. 8, 370 (2017).
- Guan, J., Liu, H., Shi, X., Feng, S., Huang, B. Tracking multiple genomic elements using correlative CRISPR imaging and sequential DNA FISH. Biophysical Journal. 112 (6), 1077-1084 (2017).
- Micro-Manager. , Available from: https://micro-manager.org/wiki/NikonTi2 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Martiel, J. L., et al. Measurement of cell traction forces with ImageJ. Methods in Cell Biology. 125, 269-287 (2015).
- Okumurai, I. A. On the generalization of Cerruti's problem in an elastic half-space. Doboku Gakkai Ronbunshu. 1995, 1-10 (1995).
- Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond. Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).
- Hong, W. W., Guan, K. L. The YAP and TAZ transcription co-activators: Key downstream effectors of the mammalian Hippo pathway. Seminars in Cell and Developmental Biology. 23 (7), 785-793 (2012).
- Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S.
- Wang, Y., et al. Overexpression of yes-associated protein contributes to progression and poor prognosis of non-small-cell lung cancer. Cancer Science. 101 (5), 1279-1285 (2010).
- Li, H., et al. Inhibition of YAP suppresses CML cell proliferation and enhances efficacy of imatinib in vitro and in vivo. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 35 (1), 134 (2016).
- Tang, X., et al. A mechanically-induced colon cancer cell population shows increased metastatic potential. Molecular Cancer. 13, 131 (2014).
- Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 758-770 (2017).
- Yuan, M., et al. Yes-associated protein (YAP) functions as a tumor suppressor in breast. Cell Death and Differentiation. 15 (11), 1752-1759 (2008).
- Koushki, N., et al. Lamin A redistribution mediated by nuclear deformation determines dynamic localization of YAP. bioRxiv. , (2020).
- Chang, S. S., Rape, A. D., Wong, S. A., Guo, W. H., Wang, Y. L. Migration regulates cellular mechanical states. Molecular Biology of the Cell. 30 (26), 3104-3111 (2019).
- Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
- Lee, J., Abdeen, A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Matrix directed adipogenesis and neurogenesis of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow. Acta Biomaterialia. 42, 46-55 (2016).
- Tang, X., Bajaj, P., Bashir, R., Saif, T. A. How far cardiac cells can see each other mechanically. Soft Matter. 7 (13), 6151-6158 (2011).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Rape, A., Guo, W. H., Wang, Y. L. The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions. Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2011).
- Shiu, J. Y., Aires, L., Lin, Z., Vogel, V. Nanopillar force measurements reveal actin-cap-mediated YAP mechanotransduction. Nature Cell Biology. 20 (3), 262-271 (2018).
- Fracchia, A., Asraf, T., Salmon-Divon, M., Gerlitz, G. Increased lamin B1 levels promote cell migration by altering perinuclear actin organization. Cells. 9 (10), 2161 (2020).
- Ramdas, N. M., Shivashankar, G. V. Cytoskeletal control of nuclear morphology and chromatin o1rganization. Journal of Molecular Biology. 427 (3), 695-706 (2015).
- Khatau, S. B., et al. A perinuclear actin cap regulates nuclear shape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19017-19022 (2009).
- Kim, D. H., Cho, S., Wirtz, D. Tight coupling between nucleus and cell migration through the perinuclear actin cap. Journal of Cell Science. 127 (11), 2528-2541 (2014).
