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Bioengineering

सभी ऑप्टिकल Mechanobiology मानव कैंसर और सामान्य कोशिकाओं में हाँ से जुड़े प्रोटीन की पूछताछ एक बहु-कार्यात्मक प्रणाली का उपयोग कर

Published: December 20, 2021 doi: 10.3791/62934
Automatic Translation
*1, *2, 2, 3, 1, 1, 4,5, 4,5, 5,6,7, 4,5, 2,5
1Department of Electrical and Computer Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering, University of Florida, 2Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering, University of Florida, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of California, 4Department of Radiation Oncology, College of Medicine, University of Florida, 5UF Health Cancer Center, University of Florida, 6Department of Physics, College of Liberal Arts and Sciences, University of Florida, 7Department of Anatomy and Cell Biology, College of Medicine, University of Florida
* These authors contributed equally

Summary

यह पेपर एक एकीकृत बहु-कार्यात्मक और उपयोगकर्ता-प्रोग्राम योग्य प्रणाली का उपयोग करने के तरीके पर एक विस्तृत चरणबद्ध प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो स्वचालित बहु-चैनल इमेजिंग और मेचानोबायोलॉजिकल विश्लेषण को हाँ से जुड़े प्रोटीन (वाईएपी) की मेचानो-संवेदनशीलता को स्पष्ट करने में सक्षम बनाता है।

Abstract

लंबे समय तक बहु-कार्यात्मक इमेजिंग और लाइव कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए विभिन्न हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर प्लेटफार्मों के सुव्यवस्थित, कार्यात्मक समन्वय की आवश्यकता होती है। हालांकि, विभिन्न निर्माताओं द्वारा उत्पादित विभिन्न उपकरणों का मैनुअल नियंत्रण श्रम-गहन और समय लेने वाला है, संभावित रूप से अधिग्रहित डेटा की सटीकता, पुनरुत्पादन और गुणवत्ता को कम करता है। इसलिए, एक ऑल-इन-वन और उपयोगकर्ता-प्रोग्राम करने योग्य प्रणाली जो स्वचालित, बहु-कार्यात्मक और दीर्घकालिक छवि अधिग्रहण को सक्षम बनाती है और अधिकांश फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी प्लेटफार्मों के साथ संगत है, वैज्ञानिक समुदाय को लाभ पहुंचा सकती है। यह पेपर एक उपन्यास एकीकृत सॉफ़्टवेयर सिस्टम का उपयोग करने के पूर्ण ऑपरेटिंग प्रोटोकॉल का परिचय देता है जिसमें (1) एक घर-निर्मित सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम होता है, जिसका शीर्षक "स्वचालित बहु-कार्यात्मक एकीकरण कार्यक्रम (AMFIP)" है, जो स्वचालित बहु-चैनल इमेजिंग अधिग्रहण को सक्षम बनाता है, और (2) मात्रात्मक इमेजिंग विश्लेषण और सेल ट्रैक्शन गणना पैकेज का एक सूट।

इस एकीकृत प्रणाली को मेचानो-संवेदनशील हां-संबद्ध प्रोटीन (वाईएपी) के स्थानिक-अस्थायी वितरण और सेल यांत्रिकी के बीच पहले से अज्ञात संबंध को प्रकट करने के लिए लागू किया जाता है, जिसमें सेल प्रसार और कर्षण शामिल है, CRISPR / Cas9-इंजीनियर मानव सामान्य कोशिकाओं (B2B) और फेफड़ों के कैंसर कोशिकाओं (PC9) में। मल्टी-चैनल नियंत्रण और रीडआउट की इस प्रणाली की क्षमता का लाभ उठाते हुए, परिणाम से पता चलता है: (1) बी 2 बी सामान्य कोशिकाएं और पीसी 9 कैंसर कोशिकाएं सेल प्रसार और माइग्रेशन प्रक्रियाओं के दौरान वाईएपी अभिव्यक्ति, कर्षण और सेल गतिशीलता के बीच एक अलग संबंध दिखाती हैं; और (2) PC9 कैंसर कोशिकाएं सब्सट्रेट पर ध्यान देने योग्य पेरी-परमाणु बलों को लागू करती हैं। संक्षेप में, यह पेपर एक एकीकृत उपयोगकर्ता-प्रोग्राम योग्य प्रणाली का उपयोग करने के तरीके पर एक विस्तृत चरणबद्ध प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो स्वचालित बहु-कार्यात्मक इमेजिंग और विश्लेषण को वाईएपी मेचानो-संवेदनशीलता को स्पष्ट करने में सक्षम बनाता है। ये उपकरण सेल फिजियोलॉजी और पैथोलॉजी के संदर्भ में बहुआयामी सिग्नलिंग गतिशीलता के विस्तृत अन्वेषणों की संभावना खोलते हैं।

Introduction

इस विधि का समग्र लक्ष्य सभी ऑप्टिकल बहु-कार्यात्मक इमेजिंग और जीवित कोशिकाओं के विश्लेषण को सक्षम करना है। एक ऑल-इन-वन इमेजिंग प्रोग्राम जो बहु-कार्यात्मक ऑप्टोइलेक्ट्रॉनिक उपकरणों के स्वचालित समन्वय को सक्षम बनाता है, श्रम-गहन और त्रुटि-प्रवण मैनुअल संचालन को कम करेगा और शोधकर्ताओं के लिए दीर्घकालिक लाइव-सेल इमेजिंग 1,2,3,4 का संचालन करने के लिए आवश्यक है। हालांकि, बायोमेडिकल अनुसंधान समुदाय में अधिकांश मौजूदा सार्वजनिक कार्यक्रम या तो केवल सीमित ऑप्टोइलेक्ट्रॉनिक उपकरणों पर लागू होते हैं या विभिन्न उपकरणों के समन्वय के लिए अतिरिक्त हार्डवेयर की आवश्यकता होती है5,6,7,8,9। हाल ही में, एक ओपन-सोर्स और सॉफ़्टवेयर-आधारित प्रोग्राम विकसित किया गया है, जिसका शीर्षक "स्वचालित बहु-कार्यात्मक एकीकरण कार्यक्रम (AMFIP)" है, जो बहु-चैनल और टाइम-लैप्स इमेजिंग को सक्षम करता है। जावा भाषा और μManager11,12 के एप्लिकेशन प्रोग्रामिंग इंटरफेस (एपीआई) के आधार पर, AMFIP को μManager में एक प्लगइन के रूप में विकसित किया गया था जो कई ऑप्टोइलेक्ट्रॉनिक हार्डवेयर और सॉफ़्टवेयर प्लेटफार्मों के सॉफ़्टवेयर-आधारित संचार को पूरा करने के लिए अनुकूलित जावा स्क्रिप्ट निष्पादित करता है, जिसमें शामिल हैं लेकिन निकॉन से उन तक सीमित नहीं हैं। एएमएफआईपी की स्थापना सेल व्यवहार के प्रोग्राम योग्य और बहु-कार्यात्मक पूछताछ की संभावना खोलती है। इस पेपर में एक एकीकृत प्रयोगात्मक और कम्प्यूटेशनल प्रणाली विकसित की गई है और डिजिटल इमेजिंग विश्लेषण और सेल ट्रैक्शन फोर्स माइक्रोस्कोपी के साथ एएमएफआईपी को जोड़ती है। सिस्टम CRISPR / Cas9-इंजीनियर मानव सामान्य B2B (चित्रा 1) और फेफड़ों के कैंसर PC9 (चित्रा 2) सेल लाइनों में विशिष्ट YAP mechanobiology के स्पष्टीकरण को सक्षम बनाता है। सिस्टम वैज्ञानिक समुदाय को एक व्यापक समाधान प्रदान करता है जो अतिरिक्त नियंत्रण उपकरणों को खरीदने की मांग से बचता है जो प्रत्येक इमेजिंग सिस्टम के लिए उपलब्ध नहीं हो सकते हैं और / या संगत हो सकते हैं।

इस पेपर में प्रस्तुत प्रोटोकॉल परिचय कैसे करें (1) CRISPR / Cas9-इंजीनियर सेल लाइनों के लिए स्वचालित दीर्घकालिक इमेजिंग का संचालन करने के लिए एएमएफआईपी लागू करें जो mNEonGreen2-टैग किए गए YAP को व्यक्त करते हैं; और (2) फिजी इमेजजे, MATLAB, और मूल को YAP परमाणु / साइटोप्लाज्म (एन / सी) अनुपात के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए उनके फ्लोरोसेंट तीव्रता (चित्रा 3 और चित्रा 4), सेलुलर विस्थापन क्षेत्र (चित्रा 1 सी और चित्रा 2 सी), और सेलुलर कर्षण क्षेत्र (चित्रा 1 डी और चित्रा 2 डी) के आधार पर जोड़ते हैं, और सेलुलर कर्षण क्षेत्र (चित्रा 1 डी और चित्रा 2 डी) ). परिणाम बताते हैं कि (1) सब्सट्रेट्स पर फैलने वाले सेल के पहले 10 एच के दौरान जिसमें शारीरिक रूप से प्रासंगिक यांत्रिक कठोरता होती है13,14,15,16,17,18, एकल बी 2 बी कोशिकाओं का वाईएपी एन / सी अनुपात एकल पीसी 9 कोशिकाओं की तुलना में अधिक ध्यान देने योग्य समय-निर्भर भिन्नता और उतार-चढ़ाव दिखाता है (चित्रा 5 और चित्रा 6) ); और (2) PC9 कैंसर कोशिकाएं अपने पेरी-न्यूक्लियर क्षेत्रों में ध्यान देने योग्य कर्षण उत्पन्न करती हैं (चित्रा 7)। इस प्रोटोकॉल में वर्णित एकीकृत प्रणाली और तरीके विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं और ऑप्टोजेनेटिक अणुओं को पार करते हैं। शोधकर्ता अपने विशिष्ट लाइव-सेल पूछताछ प्रयोगों को अनुकूलित करने के लिए प्रोटोकॉल लागू कर सकते हैं और सेल फिजियोलॉजी और पैथोलॉजी के संदर्भ में बहुआयामी सिग्नलिंग गतिशीलता को स्पष्ट कर सकते हैं।

Protocol

1. स्थिर CRISPR / Cas9-संपादित मानव फेफड़े के कैंसर सेल लाइन (PC9) और मानव ब्रोन्कियल उपकला सेल लाइन (Beas2B) की पीढ़ी है कि अंतर्जात रूप से mNeonGreen21-10/11-टैग किए गए YAP प्रोटीन व्यक्त

  1. प्रतिदीप्ति प्रोटीन के 11 वें स्ट्रैंड को कोडिंग करने वाले डीएनए अनुक्रम को बढ़ाने के लिए पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) करें, mNeonGreen2, उच्च-निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करके ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. CRISPR-Cas9 जीन-संपादन प्रणाली का उपयोग करके PC9 और B2B सेल लाइनों के YAP जीनोमिक लोकस में प्रवर्धित डीएनए अनुक्रम में नॉक-इन।
    नोट: यह डीएनए अनुक्रम प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करने के लिए mNeonGreen2 के स्ट्रैंड 1-10 को पूरक करता है। YAP-mNeonGreen21-10/11 का जीनोमिक अनुक्रम मानचित्र पूरक चित्र S1 में दिखाया गया है। मानचित्र में लेबल किए गए जीनोमिक, दाता और mNeonGreen2 अनुक्रम शामिल हैं।
  3. CRISPR/ Cas9-engineered mNeonGreen2 अभिव्यक्ति की जाँच करें एक epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग करके ( सामग्री की तालिका देखें)। क्योंकि mNeonGreen2 को YAP को टैग किया जाता है जब भी कोशिकाएं अपने मूल जीन नियामक नेटवर्क के संदर्भ में YAP को व्यक्त करती हैं, CRISPR / Cas9-इंजीनियर कोशिकाओं दोनों में प्रतिदीप्ति तीव्रता की उपस्थिति की जांच करें और इसकी तुलना माता-पिता की कोशिकाओं (नियंत्रण) में करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए, (1) उत्तेजना के लिए एक 488 एनएम लेजर (47.5 mW / mm2) का उपयोग करें, (2) एक 40x उद्देश्य (संख्यात्मक एपर्चर (NA) = 0.95) और प्रतिदीप्ति माप के लिए एक बैंड-पास उत्सर्जन फ़िल्टर (ET525/50 एनएम) और (3) इमेजजे सॉफ़्टवेयर को मापने, मापने और प्रतिदीप्ति तीव्रता की तुलना करने के लिए।
  4. CRISPR/Cas9-संपादित सेल लाइनों से जीनोमिक डीएनए निकालकर mNeonGreen211 के सही एकीकरण की पुष्टि करें; सही जीनोमिक loci19,20 पर सम्मिलन की पुष्टि करने के लिए जीनोमिक सम्मिलित करें और अनुक्रमण flanking प्राइमरों का उपयोग कर पीसीआर प्रदर्शन।
  5. CRISPR/Cas9 जीन-संपादन प्रणाली का उपयोग करके mNeonGreen211 को नीचे गिराएं, और चरण 1.3 में वर्णित समान माइक्रोस्कोप सिस्टम और इमेजिंग पैरामीटर का उपयोग करके कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति तीव्रता में कमी की जांच करें।
    नोट:: यह चरण प्रतिदीप्ति तीव्रता की तुलना द्वारा mNeonGreen211 के सही एकीकरण की पुष्टि करता है। CRISPR / Cas9-इंजीनियर कोशिकाओं को नॉक-डाउन और माता-पिता की कोशिकाओं के बिना नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है।
  6. प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) छँटाई के माध्यम से ब्याज के टैग किए गए प्रोटीन के साथ कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
    1. FACS छँटाई के लिए कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, ट्रिप्सिनाइज़ करें और उन्हें फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) में फिर से निलंबित करें।
    2. FACS छँटाई के दो समृद्ध दौर में माता पिता के सेल लाइनों की पृष्ठभूमि के स्तर से ऊपर mNeonGreen2 प्रतिदीप्ति के साथ कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
      नोट:: CRISPR/Cas9-संपादित कक्ष पंक्तियाँ यहाँ वर्णित जनरेट करने के लिए समयरेखा 1-2 महीने के क्रम पर है। सभी सेल लाइनों को अनुरोध पर सार्वजनिक रूप से उपलब्ध कराया जाता है ताकि अन्य अनुसंधान प्रयोगशालाएं परिणामों को पुन: पेश कर सकें।

2. PC9 और B2B कोशिकाओं का रखरखाव

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% CO2 के साथ humidified ऊतक-संस्कृति इनक्यूबेटर में दोनों सेल लाइनों को बनाए रखें।
  2. संस्कृति 106 अंतर्जात रूप से 75 सेमी 2 फ्लास्क में PC9 और Beas2B कोशिकाओं को RPMI-1640 माध्यम के 12 mL के साथ 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 100 μg / mL पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक किया गया। Subculture दोनों सेल लाइनों जब सेल confluency ~ 80% तक पहुँच जाता है।
  3. माइकोप्लाज्मा के लिए दोनों सेल लाइनों का परीक्षण हर 3 महीने में माइकोप्लाज्मा डिटेक्शन किट का उपयोग करके, सभी निर्माता के अनुशंसित प्रोटोकॉल का सख्ती से पालन करते हुए।
  4. सेल लाइनों को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में संग्रहीत करें।
  5. सभी प्रयोगों के लिए पिघलने से <20 मार्ग हैं कि सेल लाइनों का उपयोग करें।

3. हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर वातावरण का सेटअप

  1. प्रयोग का हार्डवेयर परिवेश सेटअप
    1. confocal नियंत्रक और उल्टे माइक्रोस्कोप को कंप्यूटर से कनेक्ट करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. सॉफ़्टवेयर प्लेटफ़ॉर्म (सामग्री की तालिका) स्थापित करें।
    3. confocal नियंत्रक और उल्टे माइक्रोस्कोप को चालू करें। अगला, तत्वों को लॉन्च करें।
    4. confocal, लेजर, और तत्वों में उल्टे माइक्रोस्कोप के नियंत्रण कक्ष खोलें। इसके बाद, जांचें कि क्या तीन पैनल मोटरचालित चरण के आंदोलन, माइक्रोस्कोप उद्देश्यों के स्विचन और लेजर लाइनों की स्थानिक स्कैनिंग का परीक्षण करके ठीक से काम करते हैं।
  2. AMFIP के सॉफ़्टवेयर वातावरण सेटअप
    1. IntelliJ, जावा विकास किट 14.0, μManager संस्करण 2.0 गामा, और फिजी ImageJ कंप्यूटर पर स्थापित करें।
    2. IntelliJ में GitHub (लिंक: https://github.com/njheadshotz/AMFIP) से डाउनलोड किए गए AMFIP प्रोजेक्ट को खोलें।
    3. Settings | पर क्लिक करें कंपाइलर | एनोटेशन प्रोसेसर और जाँच करें एनोटेशन संसाधन सक्षम करें.
    4. Project Structure | पर क्लिक करें कलाकृतियों और एक JAR फ़ाइल बनाएँ। आउटपुट निर्देशिका mmplugins के लिए μManager निर्देशिका के अंतर्गत सेट करें।
    5. Project Structure | पर क्लिक करें पुस्तकालयों और mmplugins और μManager निर्देशिका के तहत plugins जोड़ें.
    6. रन ड्रॉप-डाउन मेनू के तहत कॉन्फ़िगरेशन जोड़ें पर क्लिक करें और एक एप्लिकेशन बनाएं।
    7. ij दर्ज करें . मुख्य वर्ग में ImageJ.
    8. VM विकल्प में -Xmx3000m -Dforce.annotation.index=true दर्ज करें.
    9. कार्य निर्देशिका के लिए μManager निर्देशिका सेट करें।
    10. AMFIP प्लगइन के साथ μManager को सक्रिय करने के लिए रन पर क्लिक करें।
  3. उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ μManager कनेक्ट करें।
    1. μManager निर्देशिका के लिए उल्टे माइक्रोस्कोप21 के अनुकूली ड्राइवर जोड़ें।
    2. खुला μManager. Devices | पर क्लिक करें हार्डवेयर कॉन्फ़िगरेशन विज़ार्ड और एक नया कॉन्फ़िगरेशन बनाएँ।
    3. उपलब्ध डिवाइस के अंतर्गत Ti2 ड्रायवर जोड़ें।
    4. सभी परिधीय उपकरणों का चयन करें और नई कॉन्फ़िगरेशन फ़ाइल सहेजें।
    5. μManager पुनरारंभ करें और माइक्रो-मैनेजर स्टार्टअप कॉन्फ़िगरेशन में चरण 3.2.4 में कॉन्फ़िगरेशन फ़ाइल का चयन करें।

4. जेल तैयारी

  1. कमरे के तापमान (24 डिग्री सेल्सियस) पर 7 मिनट के लिए 3-aminopropyltrymethoxysilane के साथ ग्लास coverslip का इलाज करें।
  2. कांच के कवरस्लिप को कुल्ला करने के लिए विआयनीकृत (डीआई) पानी का उपयोग करें और 160 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए कवरस्लिप को सुखाएं।
  3. 30 मिनट के लिए 0.5% ग्लूटाराल्डिहाइड के साथ ग्लास कवरस्लिप का इलाज करें और डीआई पानी के साथ कुल्ला करें।
  4. मिश्रण एक्रिलामाइड समाधान, एन, N'-methylenebisacrylamide (बीआईएस) समाधान, और फ्लोरोसेंट मोती 10 mM HEPES-बफ़र्ड खारा में निलंबित कर दिया. पोलीमराइजेशन के प्रारंभकर्ताओं के रूप में 10% (डब्ल्यू / वी) अमोनियम परसल्फेट समाधान और एन, एन, एन', एन'-टेट्रामेथिलेथिलीनेडियामाइन (टीईएमईडी) का उपयोग करें। पहले वर्णित स्थापित प्रोटोकॉल के बाद पॉलीएक्रिलामाइड (पीएए) हाइड्रोजेल की वांछित यांत्रिक कठोरता प्राप्त करने के लिए प्रत्येक घटक का प्रतिशत बदलें13,14।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, 2 kPa जेल: एक्रिलामाइड = 12.5% और bis-acrylamide = 6.5%; 5 kPa जेल: एक्रिलामाइड = 12.5% और bis-acrylamide = 21.5%; और 40 kPa जेल: एक्रिलामाइड = 12.5% और bis-acrylamide = 31.5%। सूचीबद्ध सभी % वॉल्यूम प्रतिशत हैं।
  5. 35 मिनट के बाद, ठोस पीएए हाइड्रोजेल से ग्लास कवरस्लिप को छील लें और हाइड्रोजेल को 50 एमएम एचईपीईएस-बफ़र्ड खारा के साथ दो बार (हर बार 5 मिनट) धोलें।
  6. 6 ज के लिए एक hydrazine-हाइड्रेट समाधान के साथ हाइड्रोजेल सतह का इलाज करें।
  7. 30 मिनट के लिए एसिटिक एसिड के साथ हाइड्रोजेल कुल्ला। एसिटिक एसिड निकालें और 30 मिनट के लिए पीबीएस के साथ कुल्ला।
  8. 30 मिनट के लिए सोडियम पीरियडेट के साथ फाइब्रोनेक्टिन समाधान (पीबीएस में 50 μg / mL) को ऑक्सीकरण करें।
  9. ऑक्सीकरण फाइब्रोनेक्टिन समाधान के साथ हाइड्रोजेल सतह को कोट करें और 35 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  10. हाइड्रोजेल को विसर्जित करने के लिए पीबीएस जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। Hydrogels के लिए किसी भी प्रकाश जोखिम से बचने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ hydrogels होते हैं कि सभी पेट्री व्यंजन ों को कवर करें।

5. सेल संस्कृति

नोट: एसेप्टिक तकनीक का उपयोग करके सेल संस्कृति करें।

  1. सेल सीडिंग और इमेजिंग प्रक्रियाओं के दौरान जैल के भौतिक बहाव से बचने के लिए 35 मिमी ग्लास-बॉटम पेट्री डिश के लिए पीएए हाइड्रोजेल के साथ ग्लास कवरलिप्स को बांड करें।
    1. निष्फल साफ चिमटी का उपयोग करते हुए, तैयार जैल युक्त पेट्री डिश से कवरस्लिप (शीर्ष पर पीएए हाइड्रोजेल के साथ) उठाएं।
    2. कांच के कवरस्लिप की निचली सतह पर पानी की बूंदों को साफ करने के लिए एक सूखे पोंछे का उपयोग करें।
    3. कांच coverslip पकड़ करने के लिए निष्फल चिमटी का उपयोग करें।
    4. नीचे की सतह पर दो विकर्ण कोनों पर साइनोएक्रिलेट गोंद की छोटी बूंदों (1-5 μL) को रखें।
    5. अतिरिक्त गोंद को हटाने के लिए निष्फल पोंछे का उपयोग करें।
    6. कांच के नीचे पेट्री डिश में coverslip को बदलने के लिए निष्फल चिमटी का उपयोग करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कवरस्लिप के कोनों को थोड़ा दबाएं कि गोंद की बूंदें पेट्री डिश की सतह के साथ पूर्ण संपर्क बनाती हैं।
    7. पीएए हाइड्रोजेल में पीबीएस के वाष्पीकरण को कम करने के लिए पेट्री डिश पर ढक्कन वापस रखें। गोंद को मजबूत करने और पेट्री डिश में सूखने की अनुमति देने के लिए 3 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    8. पीबीएस के 4 एमएल के साथ पेट्री डिश भरें।
    9. इमेजिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले पेट्री व्यंजनमें शेष पीएए हाइड्रोजेल नमूनों के लिए उपरोक्त चरणों को 5.1.1-5.1.8 दोहराएं।
    10. सभी पेट्री व्यंजनों की बाहरी सतह को निष्फल करने और उन्हें ऊतक संस्कृति जैव सुरक्षा कैबिनेट में स्थानांतरित करने के लिए 75% इथेनॉल का उपयोग करें। 5 मिनट के लिए पराबैंगनी प्रकाश को चालू करें और नमूनों को निष्फल करें।
  2. जेल की ऊपरी सतह पर कोशिकाओं को बीज दें।
    1. पराबैंगनी प्रकाश बंद कर दें। बायोसेफ्टी कैबिनेट में 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से फ्लास्क (B2B / PC9 कोशिकाओं वाले) को बाहर निकालें। सभी संस्कृति माध्यम aspirate करने के लिए एक वैक्यूम पंप से जुड़े एक पिपेट का उपयोग करें और फ्लास्क धोने के लिए PBS के 5 मिलीलीटर जोड़ें।
    2. फ्लास्क के नीचे से कोशिकाओं को अलग करने के लिए 0.05% ट्रिप्सिन के 2 एमएल जोड़ें।
    3. फ्लास्क को इनक्यूबेटर में रखें। 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    4. फ्लास्क को जैव सुरक्षा कैबिनेट में स्थानांतरित करें। फ्लास्क में 8 मिलीलीटर ताजा संस्कृति माध्यम जोड़ें और कोशिकाओं को सजातीय रूप से निलंबित करने के लिए कई बार पिपेट ऊपर और नीचे।
    5. सेल निलंबन के सभी 10 मिलीलीटर को 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें और 5 मिनट के लिए 300 × जी पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    6. ट्यूब के नीचे सेल गोली की जाँच करें। धीरे-धीरे ट्यूब को क्षैतिज रूप से झुकाएं और सेल गोली को छूने के बिना ट्यूब से सभी संस्कृति माध्यम को हटाने के लिए एस्पिरेटिंग पिपेट का उपयोग करें। इसके बाद, ताजा संस्कृति माध्यम के 8 मिलीलीटर जोड़ें और पिपेट को कई बार ऊपर और नीचे करें जब तक कि सभी कोशिकाओं को माध्यम के साथ सजातीय रूप से मिश्रित नहीं किया जाता है।
    7. जेल की सतह पर सेल निलंबन (150 कोशिकाओं / μL) के 100 μL जमा करें और 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें। अगला, धीरे-धीरे पेट्री व्यंजनों में 4 एमएल ताजा संस्कृति माध्यम जोड़ें; जेल पर सीधे ताजा माध्यम जोड़ने से बचें।
    8. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में पेट्री डिश रखें। कोशिकाओं को जेल की सतह से जुड़ने की अनुमति देने के लिए प्रतीक्षा करें (B2B: 0.5-1 h; PC9: 4-5 ज)।

6. सेल इमेजिंग

नोट: AMFIP विभिन्न हार्डवेयर और सॉफ़्टवेयर सिस्टम के साथ समन्वय करके स्वचालित, बहु-चैनल और दीर्घकालिक इमेजिंग को सक्षम बनाता है: (1) AMFIP μManager में हेरफेर करता है ताकि Ti2-E माइक्रोस्कोप के मोटरीकृत चरण को स्वचालित रूप से कई फ़ील्ड-ऑफ-व्यू (FOVs) में स्थानांतरित किया जा सके और मोनोक्रोम कैमरा (सामग्री की तालिका) के माध्यम से उज्ज्वल-क्षेत्र छवियों को प्राप्त किया जा सके; और (2) AMFIP एक अनुकूलित जावा स्क्रिप्ट के साथ तत्वों के अंदर कई मैक्रो फ़ाइलों को सक्रिय करने के लिए confocal z-स्टैक इमेजिंग और विभिन्न लेजर चैनलों (405 एनएम और 488 एनएम) के स्विचन के लिए स्वचालित संचालन को पूरा करने के लिए।

  1. लंबी अवधि की इमेजिंग के लिए वातावरण सेट करें।
    1. उल्टे माइक्रोस्कोप के मोटर चालित चरण पर पर्यावरण कक्ष रखें। CO2 प्रवाह दर को 160 mL/min पर सेट करें और कक्ष के तापमान को समायोजित करें (शीर्ष: 44 °C; स्नान: 42 °C; चरण: 40 °C). इसके बाद, कक्ष के स्नान में 40 मिलीलीटर शुद्ध पानी जोड़ें।
    2. इनक्यूबेटर से कोशिकाओं के साथ ग्लास-बॉटम पेट्री डिश को बाहर निकालें और इसे पर्यावरण कक्ष में रखें।
    3. confocal नियंत्रक और उल्टे माइक्रोस्कोप को चालू करें। दाईं ओर प्रकाश पथ को स्विच करें और μManager का उपयोग करके संलग्न कोशिकाओं का निरीक्षण करें। यदि पर्याप्त कोशिकाएं जेल से जुड़ी हुई हैं, तो पेट्री डिश को इनक्यूबेटर में वापस स्थानांतरित करें। यदि पर्याप्त कोशिकाएं जेल से जुड़ी नहीं हैं, तो बी 2 बी के लिए एक और 30 मिनट और पीसी 9 कोशिकाओं के लिए 60 मिनट के लिए सेल इनक्यूबेशन जारी रखें।
    4. चिपकने वाले टेप के दो छोटे टुकड़े काटें और उन्हें परिपत्र छेद के चारों ओर कक्ष पर चिपकाएं। अगला, टेप पर थोड़ा चिपकने वाला गोंद लागू करें (केवल उस क्षेत्र पर जो पेट्री डिश कवर करेगा)।
    5. इनक्यूबेटर से पेट्री डिश निकालें। इसके बाद, धीरे-धीरे पेट्री डिश को कक्ष में रखें और डिश के निचले हिस्से को गोंद के साथ संपर्क करने दें।
    6. गोंद को पेट्री डिश के साथ पूर्ण संपर्क बनाने और ठोस करने की अनुमति देने के लिए 1 मिनट के लिए पेट्री डिश का ढक्कन दबाएं। अगला, धीरे से पेट्री डिश को क्षैतिज रूप से धक्का दें ताकि यह पुष्टि हो सके कि पेट्री डिश चैंबर में अचल है।
    7. कक्ष का ढक्कन बंद कर दें।
  2. ब्राइट-फील्ड इमेजिंग के लिए छवि अधिग्रहण पैरामीटर सेट करें.
    1. IntelliJ खोलें और फ़ाइल Elements_script.java की पंक्ति 93 में एक पैरामीटर T1 (जैसे, 120 s) सेट करें। सुनिश्चित करें कि यह मान दृश्य के एक फ़ील्ड (FOV) के confocal इमेजिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले तत्वों में मैक्रो के चलने के समय से बड़ा है। AMFIP IntelliJ प्रोजेक्ट शुरू करने के लिए चलाएँ बटन पर क्लिक करें।
    2. μManager के मुख्य इंटरफ़ेस पर लाइव और मल्टी-डी Acq. बटन क्लिक करें. इसके बाद, उज्ज्वल-क्षेत्र इमेजिंग के लिए उल्टे माइक्रोस्कोप के प्रकाश पथ को दाईं ओर स्विच करें, 10x उद्देश्य पर स्विच करें, और प्रकाश-उत्सर्जक डायोड (एलईडी) प्रकाश (उज्ज्वल-क्षेत्र इमेजिंग के लिए प्रकाश स्रोत; तीव्रता: 5%) खोलें।
      1. तत्व Ti2 पैनल में प्रकाश पथ, माइक्रोस्कोप उद्देश्य, और एलईडी लैंप बटन पर क्लिक करें या मैन्युअल रूप से माइक्रोस्कोप पर संबंधित बटन दबाएँ।
    3. XY जॉयस्टिक और जेड-प्लेन के घुंडी को सही स्थिति और पेट्री डिश पर जेल के इन-फोकस प्लेन को खोजने के लिए समायोजित करें। जेल से जुड़ी कई एकल कोशिकाओं के उपयुक्त एफओवी को खोजने के लिए 10x उद्देश्य का उपयोग करें।
    4. बहु-आयामी अधिग्रहण विंडो पर एकाधिक स्थिति (XY) बॉक्स की जाँच करें। स्थिति सूची संपादित करें ... बटन पर क्लिक करें और मंच स्थिति सूची विंडो का निरीक्षण करें जो पॉप अप करता है। इसके बाद, उद्देश्य को 40x में बदलें, एलईडी प्रकाश की तीव्रता को 15% तक बढ़ाएं, FOVs का पता लगाने के लिए XY-motorized चरण को फिर से समायोजित करें, और स्टेज पोजीशन लिस्ट विंडो पर मार्क बटन पर क्लिक करके निर्देशांक रिकॉर्ड करें।
    5. रिकॉर्ड 67 वांछित FOVs. निर्देशांक रिकॉर्ड करने के लिए स्टेज पोजीशन लिस्ट विंडो पर इस रूप में सहेजें... बटन पर क्लिक करें। इनपुट T1 (पैरामीटर, उदाहरण के लिए, 120 s, चरण 6.2.1 में परिभाषित) बहु-आयामी अधिग्रहण विंडो में समय बिंदु अनुभाग में T1 के लिए इमेजिंग अधिग्रहण के समय अंतराल में।
  3. 2D-YAP और मनका छवियों के लिए छवि अधिग्रहण सेट करें।
    1. तत्वों को खोलें, confocal इमेजिंग के लिए दाईं ओर प्रकाश पथ बदलें और एलईडी प्रकाश को बंद कर दें। इसके बाद, निकालें इंटरलॉक बटन पर क्लिक करें और FITC बॉक्स की जाँच करके (YAP इमेजिंग के लिए) FITC लेजर चैनल चालू करें।
    2. 1/2 बटन पर क्लिक करके स्कैनिंग गति को 1 फ्रेम प्रति 2 सेकंड में समायोजित करें और संलग्न कोशिकाओं की जेड-स्थिति को जल्दी से खोजने के लिए जेड-प्लेन के घुंडी को स्पिन करें। Z-स्टैक के लिए निचली और ऊपरी सीमाएँ रिकॉर्ड करें.
    3. शीर्ष रिबन पर मैक्रो पर क्लिक करें, मैक्रो ड्रॉप-डाउन मेनू के तहत मैक्रो संपादक का चयन करें, और चरण 6.3.2 से मानों को मैक्रो फ़ाइल में इनपुट करें।
    4. 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) लेजर चैनल (मनका इमेजिंग के लिए) DAPI बॉक्स की जाँच करके मोतियों की केंद्रित Z-स्थिति को खोजने और रिकॉर्ड करने के लिए चालू करें। मैक्रो संपादक पर जाएँ और रिकॉर्ड किए गए मानों को मैक्रो फ़ाइल में इनपुट करें.
  4. AMFIP का उपयोग कर motorized चरण को स्थानांतरित करने का कार्य सेट करें।
    1. μManager पर जाएं और प्लगइन्स | पर क्लिक करें AMFIP के ग्राफ़िकल यूजर इंटरफ़ेस (GUI) को खोलने के लिए स्वचालन. चयनित FOVs की सटीक संख्या प्राप्त करने के लिए Add Point या Remove point बटन पर क्लिक करें। निर्देशांक पैनल में FOVs के रिकॉर्ड किए गए निर्देशांक इनपुट करें।
    2. कुल प्रयोग समय पाठ फ़ील्ड में कुल प्रयोग समय निर्धारित करें.
    3. अतिरिक्त समय कॉन्फ़िगरेशन बटन पर क्लिक करें और प्रत्येक FOV के लिए motorized चरण ले जाने के समय अंतराल T2 (जैसे, 30 मिनट) को परिभाषित करें।
    4. तत्वों के विंडो आकार को अधिकतम करें और कर्सर के स्वचालित संचालन को परेशान करने वाले जीयूआई से बचने के लिए स्क्रीन के दाईं ओर AMFIP के GUI को खींचें।
    5. Enter बटन पर क्लिक करें। पहला मैक्रो समाप्त होने के बाद, बहु-आयामी अधिग्रहण विंडो में प्राप्त करें! बटन पर क्लिक करें।
  5. छवि अधिग्रहण के बाद कोशिकाओं को भंग करें।
    1. लंबी अवधि इमेजिंग को समाप्त करने के बाद, स्वचालन प्लगइन विंडो में रोकें बटन और बहु-आयामी अधिग्रहण विंडो में स्टॉप बटन पर क्लिक करके AMFIP कार्य रोकें।
    2. तत्वों को खोलें और एनडी अधिग्रहण विंडो में शीर्ष और नीचे बटन पर क्लिक करके Z-स्टैक इमेजिंग सेट करें (Z-श्रेणी को मोतियों की Z-श्रेणी से बड़ा होने के लिए सेट करें)। प्रकाश पथ को दाईं ओर स्विच करें और एलईडी प्रकाश (तीव्रता: 15%) खोलें।
    3. धीरे-धीरे और सावधानी से कक्ष और पेट्री डिश के ढक्कन को हटा दें। इस बीच, एफओवी के किसी भी बहाव के लिए उज्ज्वल-क्षेत्र दृश्य की निगरानी करें।
    4. सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) समाधान के 0.5 मिलीलीटर लेने के लिए एक प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करके, पेट्री डिश में संस्कृति माध्यम से थोड़ा ऊपर प्लास्टिक पिपेट को ध्यान से पकड़ें और संस्कृति माध्यम में एसडीएस समाधान की 1-2 बूंदों को जोड़ें।
    5. एक बार जब उज्ज्वल-फ़ील्ड दृश्य में कोशिकाएं भंग हो जाती हैं, तो प्रकाश पथ को बाईं ओर स्विच करें, एलईडी लाइट को बंद करें, निकालें इंटरलॉक बटन पर क्लिक करें।
    6. Z-स्टैक इमेजिंग चलाएँ। छवि स्टैक को सहेजें और इसे Reference_N के रूप में नाम दें (एन प्रत्येक एफओवी की अनुक्रम संख्या है)।
    7. बहु-आयामी अधिग्रहण विंडो पर एकाधिक पदों (XY) बटन पर क्लिक करें। इसके बाद, अगले एफओवी का चयन करें और मोटरचालित चरण को दूसरे एफओवी पर ले जाने के लिए गो टू बटन पर क्लिक करें।
    8. प्रत्येक FOV के लिए चरण 6.5.7 दोहराएँ।

7. YAP N/C अनुपात का मापन

  1. फिजी इमेजजे सॉफ़्टवेयर (चित्रा 4) का उपयोग करके YAP N/C अनुपात को मापने के लिए छवि विश्लेषण करें.
    1. फिजी इमेजजे खोलें। μManager द्वारा अधिग्रहित सभी FOVs के लिए उज्ज्वल-फ़ील्ड छवि स्टैक आयात करें.
    2. छवि ड्रॉप-डाउन मेनू खोलें और स्टैक | का चयन करें उपकरण | स्लाइस कीपर. अगला, प्रत्येक FOV के लिए उज्ज्वल-फ़ील्ड छवि स्टैक निर्यात करें।
    3. FITC चैनल की प्रतिदीप्ति छवि आयात करें और इसे एक ही FOV के लिए उज्ज्वल-क्षेत्र छवि के साथ ओवरले करें। ऐसा करने के लिए, फ्लोरोसेंट छवि चुनें और ओवरले | का चयन करें छवि जोड़ें... (जोड़ने के लिए छवि: उज्ज्वल क्षेत्र छवि; एक्स और वाई स्थान विभिन्न कैमरों द्वारा अधिग्रहित उज्ज्वल-क्षेत्र छवि के आकार पर निर्भर करता है; अपारदर्शिता: 60-70)।
    4. ड्रॉप-डाउन का विश्लेषण करें मेनू खोलें और माप सेट करें का चयन करें .... क्षेत्र का चयन करें; एकीकृत घनत्व और मतलब ग्रे मान.
    5. ImageJ के मुख्य इंटरफ़ेस पर Freehand चयन बटन पर क्लिक करें.
    6. कोशिका शरीर और वांछित नाभिक की रूपरेखा खींचें। इसके बाद, Analyze | पर क्लिक करें मापें या कुंजीपटल पर M बटन दबाएँ।
    7. परिणाम विंडो का निरीक्षण करें जो पॉप अप करता है। ध्यान दें कि क्षेत्र स्तंभ के अंतर्गत मान चयनित क्षेत्र (μm2) के क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करते हैं और IntDen स्तंभ के अंतर्गत मान चयनित क्षेत्र की प्रतिदीप्ति तीव्रता का प्रतिनिधित्व करते हैं।
    8. निम्न सूत्रों (1), (2), और (3) का उपयोग करके YAP N/C अनुपात की गणना करें:
      Equation 1 (1)
      Equation 2 (2)
      Equation 3 (3)
      जहां Inuc और Icel नाभिक और कोशिका शरीर की सापेक्ष तीव्रता का प्रतिनिधित्व करते हैं, और Anuc और Acel नाभिक और कोशिका शरीर के क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करते हैं। R, YAP N/C अनुपात है।
    9. द्विध्रुवीय कर्षण बल और पेरी-सेल/ पेरी-न्यूक्लियर विस्थापन की भविष्य की गणना के लिए रूपरेखा को सहेजें। ऐसा करने के लिए, analyze | पर क्लिक करें उपकरण | XY निर्देशांक सहेजें...

8. कर्षण क्षेत्र का मापन

  1. फिजी ImageJ plugins22,23 के माध्यम से कर्षण बल माइक्रोस्कोपी लागू करें.
    1. फिजी इमेजजे खोलें।
    2. एक FOV के लिए मोतियों की छवि स्टैक आयात करें।
    3. उस स्लाइस का चयन करें जो मोतियों का सबसे स्पष्ट वितरण दिखाता है और छवियों पर क्लिक करके इसे निकालता है | स्टैक्स | उपकरण | स्लाइस कीपर.
    4. एक ही FOV के लिए संदर्भ की छवि स्टैक आयात करें।
    5. चरण 8.1.3 में स्लाइस के रूप में एक ही चमक और कंट्रास्ट के साथ स्लाइस चुनें। इसके बाद, इसे एक संदर्भ छवि के रूप में निकालें।
    6. छवियों | का चयन करें स्टैक्स | उपकरण | चरण 8.1.3 और 8.1.5 से दो स्लाइस को संयोजित करने के लिए Concatenate (पहले स्लाइस के रूप में संदर्भ छवि का चयन करें)।
    7. प्लगइन्स | का चयन करें टेम्पलेट मिलान | स्टैक या प्लगइन्स | में स्लाइस संरेखित करें छवि स्टेबलाइजर दो स्लाइस को संरेखित करने के लिए।
    8. छवि | का चयन करें स्टैक्स | छवियों के लिए स्टैक. अगला, छवि | का चयन करें लुकअप तालिकाएँ | हरा पहले स्लाइस के रंग को हरे रंग में बदलने के लिए और छवि | का चयन करने के लिए लुकअप तालिकाएँ | दूसरे स्लाइस के रंग को लाल रंग में बदलने के लिए लाल।
    9. छवि | का चयन करें रंग | दो छवियों को मर्ज करने के लिए चैनल मर्ज करें।
    10. एक ही FOV से उज्ज्वल क्षेत्र छवि के साथ छवि को ओवरलैप करें और मनका विस्थापन का निरीक्षण करने के लिए इस ओवरलैप की गई छवि का उपयोग करें।
    11. प्लगइन्स | का चयन करें PIV | पुनरावर्ती PIV (बेसिक). पूछताछ विंडो का आकार 128/256 पर सेट करें; 64/128; 32/64 (पूछताछ खिड़की प्रति कम से कम चार मोती)। सहसंबंध थ्रेशोल्ड को 0.6 पर सेट करें.
    12. OK पर क्लिक करें। परिकलन पूरा होने के बाद, पाठ फ़ाइल को मनका विस्थापन के कच्चे डेटा के साथ उपयोगकर्ता द्वारा बनाए गए किसी साधारण फ़ोल्डर में सहेजें.
    13. प्लगइन्स | का चयन करें FTTC | FTTC और चरण 8.1.9 में पाठ फ़ाइल का चयन करें।
    14. पिक्सेल आकार (μm), जेल (पास्कल) के यंग के मापांक, और प्रयोग और मोतियों की छवि के आधार पर प्लॉट की चौड़ाई और ऊंचाई इनपुट करें।
    15. चरण 8.1.12 में पाठ फ़ाइल के रूप में एक ही निर्देशिका में कर्षण बल के कच्चे डेटा वाली पाठ फ़ाइल को स्वचालित रूप से सहेजने के लिए ठीक पर क्लिक करें।
  2. एकाधिक कक्षों (चित्रा 1B, C और चित्रा 2B, C) के लिए एक ही पैमाने के साथ कर्षण फ़ील्ड प्लॉट करने के लिए ग्राफ़िंग सॉफ़्टवेयर (सामग्री की तालिका) का उपयोग करें.
    1. वह पाठ फ़ाइल सम्मिलित करें जिसमें किसी स्प्रेडशीट में कर्षण का कच्चा डेटा होता है.
    2. एक नया पत्रक बनाएँ, पहली पंक्ति में कर्षण के Y निर्देशांक इनपुट करें (उच्च मानों से निम्न मानों तक व्यवस्थित करें) और X निर्देशांक को पहले स्तंभ में (निम्न से उच्च तक व्यवस्थित करें).
    3. कच्चे डेटा से प्रत्येक निर्देशांक के लिए कर्षण का मान इनपुट करें।
    4. पत्रक को चरण 8.2.2 में एक *.csv फ़ाइल के रूप में सहेजें।
    5. मूल खोलें.
    6. File | पर क्लिक करें खोलें और चरण 8.2.4 में *.csv फ़ाइल आयात करें। सभी कक्षों का चयन करें और प्लॉट | पर क्लिक करें समोच्च| समोच्च - रंग भरें.
    7. प्लॉटिंग: प्लॉटवीएम विंडो में, Y मानों को स्वचालित रूप से पहली पंक्ति और X मानों को पहले स्तंभ पर सेट करने के लिए स्तंभों में Y का चयन करें. इसके बाद, शीर्षक का नाम दें और ठीक पर क्लिक करें।
    8. पॉप अप करने वाली ग्राफ विंडो में, हीटमैप पर डबल-क्लिक करें।
    9. Colormap/Contours विंडो में स्तरों पर क्लिक करें। अगला, स्केल स्तर को एक उचित श्रेणी (इस विश्लेषण में 0300) में बदलें और ठीक पर क्लिक करें।
    10. लाइन्स पर क्लिक करें, केवल प्रमुख स्तरों पर दिखाएँ को अनचेक करें, और सभी छुपाएँ की जाँच करें। इसके बाद, OK पर क्लिक करें।
    11. ग्राफ़ पर राइट-क्लिक करें और ग्राफ़ निर्यात करें का चयन करें .... छवि को निर्दिष्ट पथ पर सहेजें।
  3. द्विध्रुवीय सेल कर्षण की गणना करने के लिए MATLAB का उपयोग करें।
    1. चरण 8.1.12 में परिभाषित एक ही फ़ोल्डर में ट्रैक्शन कच्चे डेटा पाठ फ़ाइल (चरण 8.1.12 से) और कक्ष सीमा क्षेत्र (ROI) निर्देशांक फ़ाइल (चरण 7.1.9 से) सहेजें। इस फ़ोल्डर में AMFIP पैकेज में जगह में हैं जो सभी MATLAB फ़ाइलों को स्थानांतरित करें।
    2. MATLAB खोलें. चरण 8.1.12 में परिभाषित फ़ोल्डर खोलें और द्विध्रुवीय कर्षण परिकलन फ़ंक्शन फ़ाइल absdipole खोलें.m चरण 8.3.1 में इस फ़ोल्डर में स्थानांतरित किया गया है।
    3. MATLAB कार्य स्थान में चरण 8.3.1 में दो पाठ / csv फ़ाइलों को पढ़ें और दो चर (जैसे, कर्षण और आरओआई) के लिए एक मैट्रिक्स असाइन करें।
    4. समारोह absdiple (कर्षण, roi) चलाएँ.
      नोट: आउटपुट का पहला स्तंभ nN (नैनो-न्यूटन) में द्विध्रुवीय कर्षण बल है। आउटपुट का दूसरा स्तंभ क्षैतिज अक्ष के संबंध में द्विध्रुवीय कर्षण बल का कोण है।

Representative Results

CRISPR / Cas9-इंजीनियर PC9 कैंसर और B2B सामान्य कोशिकाओं में सेल प्रसार के दौरान विशिष्ट YAP वितरण और गतिशीलता
2, 5, 40 kPa PAA जैल और ग्लास coverslip पर एकल B2B और PC9 कोशिकाओं में YAP वितरण की प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति छवियों को चित्र 1A और चित्रा 2A में दिखाया गया है। बी 2 बी कोशिकाओं में वाईएपी का परमाणु स्थानीयकरण सब्सट्रेट कठोरता (चित्रा 1 ए) में वृद्धि के साथ बढ़ गया, जबकि पीसी 9 कोशिकाओं ने नाभिक में समान वाईएपी एकाग्रता और अलग-अलग कठोरता के सब्सट्रेट पर साइटोप्लाज्म दिखाया (चित्रा 2 ए)। एकल में YAP वितरण की प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति छवियां, 5 kPa हाइड्रोजेल सब्सट्रेट पर B2B और PC9 कोशिकाओं को फैलाती हैं (सब्सट्रेट से जुड़ी कोशिकाओं के बाद 0 वें h से 10 वें h तक) क्रमशः चित्रा 1B और चित्रा 2B में दिखाए गए हैं। B2B सेल monotonically YAP N / C अनुपात (चित्रा 1B) में कमी के साथ समय के साथ प्रसार क्षेत्र में वृद्धि हुई है, जबकि PC9 सेल ने 10 h प्रसार प्रक्रिया (चित्रा 2B) के दौरान तुलनात्मक रूप से अपरिवर्तित सेल स्प्रेड क्षेत्र, अभिविन्यास और YAP N / C अनुपात को बनाए रखा। प्रारंभिक प्रसार की 10 घंटे की अवधि के दौरान, प्रतिनिधि बी 2 बी सेल ने सब्सट्रेट सतह को विकृत कर दिया और पूरे सेल क्षेत्र (चित्रा 1 सी और चित्रा 1 डी) में समय-विकसित सेल कर्षण लागू किया।

इसके विपरीत, प्रतिनिधि PC9 सेल ने केवल सेल बॉडी के दो सिरों पर विस्थापन और कर्षण विकसित किया और इसका कर्षण 7.5 h (चित्रा 2C और चित्रा 2D) के बाद कम हो गया। प्रारंभिक प्रसार चरण में B2B और PC9 कोशिकाओं के अधिक समय-अंतराल छवियों और कर्षण माप पूरक चित्रा S2 और पूरक चित्रा S3 में प्रदान किए जाते हैं। PC9 सेल गतिशीलता के अन्य मोड भी देखे गए थे (चित्रा 6)। इन विभिन्न प्रसार विशेषताओं के समानांतर, B2B और PC9 कोशिकाओं ने अलग-अलग YAP वितरण और गतिशीलता (चित्रा 3) को दिखाया। 5 kPa जेल पर, B2B कोशिकाओं में YAP 0 वें h पर नाभिक में केंद्रित था और 10 वें h पर सेल शरीर में अधिक सजातीय रूप से वितरित हो गया था। हालांकि, PC9 कोशिकाओं ने प्रसार प्रक्रिया के पूरे 10 घंटे में नाभिक और साइटोप्लाज्म में YAP का अधिक सजातीय वितरण दिखाया। B2B और PC9 कोशिकाओं में YAP गतिविधि और स्थानांतरण का मात्रात्मक रूप से विश्लेषण करने के लिए, YAP N/C अनुपात की गणना चित्र 4 में वर्णित एल्गोरिथ्म का उपयोग करके की गई थी।

अलग-अलग YAP गतिशीलता की आगे की जांच करने के लिए, YAP N/C अनुपात, सेल /नाभिक क्षेत्र, और कई एकल B2B कोशिकाओं (n = 10) और PC9 कोशिकाओं (n = 5) के कर्षण में अस्थायी परिवर्तनों की तुलना की गई (चित्रा 5)। यह पाया गया कि B2B कोशिकाओं का औसत YAP N/C अनुपात 2.54 ± 0.22 से घटकर 1.79 हो गया ± 0.21 (n = 10; p = 0.0022**; चित्रा 5A), जबकि PC9 कोशिकाओं का औसत YAP N/C अनुपात 1.92 ± 0.26 से 1.57 ± 0.07 (n = 5; p = 0.187 (महत्वपूर्ण नहीं (ns)) से बदल गया; चित्रा 5ए)। B2B कोशिकाओं का औसत द्विध्रुवीय कर्षण 256.17 ± 123.69 nN से 287.44 ± 99.79 nN (p = 0.7593 (ns) में बदल गया; चित्रा 5B)। PC9 कोशिकाओं का औसत द्विध्रुवीय कर्षण 141.19 ± 33.62 nN से 168.52 ± 73.01 nN (p = 0.7137 (ns) में बदल गया; चित्रा 5B)। B2B कोशिकाओं का औसत सेल प्रसार क्षेत्र 613.89 ± 102.43 μm2 से बढ़कर 942.51 ± 226.71 μm2 (p = 0.0512 (ns) हो गया; चित्रा 5C)।

PC9 कोशिकाओं का औसत सेल प्रसार क्षेत्र 495.78 ± 97.04 μm2 से 563.95 ± 89.92 μm2 (p = 0.5804 (ns) में बदल गया; चित्रा 5C)। B2B कोशिकाओं का औसत नाभिक प्रसार क्षेत्र 181.55 ± 36.18 μm2 से बढ़कर 239.38 ± 43.12 μm2 (p = 0.1217 (ns); चित्रा 5D) और PC9 कोशिकाओं का औसत नाभिक प्रसार क्षेत्र 133.31 ± 30.05 μm2 से 151.93 ± 22.49 μm2 (p = 0.5944 (ns) तक बदल गया; चित्रा 5D)। इन परिणामों से पता चलता है कि (1) बी 2 बी कोशिकाएं एक संरचनात्मक रूप से सब्सट्रेट-कठोरता-निर्भर वाईएपी एन / सी अनुपात दिखाती हैं; (2) बी 2 बी कोशिकाओं का कर्षण पीसी 9 कोशिकाओं की तुलना में अधिक है; और (3) बी 2 बी कोशिकाओं के विपरीत, PC9 कोशिकाएं सेल क्षेत्र में सीमित वृद्धि दिखाती हैं और 10 ज प्रसार प्रक्रिया के दौरान YAP N / C अनुपात में परिवर्तन दिखाती हैं।

YAP वितरण और गतिशीलता का सहसंबंध B2B कोशिकाओं के माइग्रेशन राज्यों के लिए
YAP N/C अनुपात और सभी B2B (n = 10) और PC9 (n = 5) कोशिकाओं के द्विध्रुवीय कर्षण की तुलना सेल प्रसार क्षेत्र और नाभिक प्रसार क्षेत्र के एक समारोह के रूप में की गई थी। YAP N/C अनुपात और PC9 कोशिकाओं के द्विध्रुवीय कर्षण ने स्पष्ट रूप से उनके छोटे सेल और नाभिक प्रसार क्षेत्र श्रेणियों (चित्रा 6) के साथ सहसंबंधित नहीं किया। इसके विपरीत, YAP N/C अनुपात और B2B कोशिकाओं का द्विध्रुवीय कर्षण दो अलग-अलग रुझानों (चित्रा 6A और चित्रा 6C) का पालन करने के लिए दिखाई दिया, यह सुझाव देते हुए कि B2B कोशिकाओं के दो समूह हो सकते हैं जो इस प्रयोग में सह-मौजूद हैं। पहले समूह में, YAP N/C अनुपात और द्विध्रुवीय कर्षण सेल स्प्रेड क्षेत्र के विस्तार के साथ-साथ बढ़ता है और ~ 1000 μm2 (चित्रा 6C और चित्रा 6D, पीले डैश्ड लाइन द्वारा इंगित) पर उनकी मैक्सिमा तक पहुंचता है। दूसरे समूह में, YAP N/C अनुपात और द्विध्रुवीय कर्षण सेल स्प्रेड क्षेत्र के विस्तार के साथ धीमी दर से बढ़ते हैं और लगभग स्थिर मानों को बनाए रखते हैं जब सेल स्प्रेड क्षेत्र में वृद्धि जारी रहती है (चित्रा 6C, D, हरी डैश्ड लाइन द्वारा इंगित)।

PC9 कैंसर कोशिकाएं पेरी-परमाणु क्षेत्रों में कर्षण उत्पन्न करती हैं
एकल, प्रसार पीसी 9 कोशिकाएं पेरी-परमाणु क्षेत्रों में सब्सट्रेट को विस्थापित करती हैं, जो संस्कृति के 6 वें एच (चित्रा 7 सी) से शुरू होती हैं। सेल कर्षण के कारण पेरी-परमाणु विस्थापन की कल्पना करने के लिए, हमने सब्सट्रेट से कोशिकाओं को हटाने से पहले (लाल) और बाद में (हरे) फ्लोरोसेंट मोतियों की छवियों को ओवरलैप किया (विवरण के लिए प्रोटोकॉल अनुभाग देखें)। जिन मोतियों में कोई विस्थापन नहीं होता है, वे ओवरलैप की गई छवियों में पीले दिखाई देंगे, यानी, लाल और हरे रंगों के अलावा। इसके विपरीत, सेल कर्षण के कारण अपने आराम की स्थिति से विस्थापित होने वाले मोती अलग-अलग हरे और लाल रंग दिखाएंगे।

विशेष रूप से, PC9 (चित्रा 7C, D) और B2B (चित्रा 7E) दोनों कोशिकाओं में, मनका विस्थापन कोशिका सीमा पर उन लोगों के अलावा, साइटोप्लाज्म में और नाभिक के भीतर देखा गया था। पेरी-न्यूक्लियर विस्थापन को उजागर करने के लिए, रैखिक-लोच सिद्धांत से Boussinesq समीकरण का उपयोग सेल सीमा पर एक काल्पनिक द्विध्रुवीय बल द्वारा उत्पन्न 2D सैद्धांतिक विस्थापन की भविष्यवाणी करने के लिए किया जाता है ( चित्र 7B में काली धराशायी रेखा)24। इस सैद्धांतिक वक्र की तुलना एक ही अक्ष ( चित्रा 7 डी में सफेद धराशायी रेखा) के साथ मापे गए वास्तविक सब्सट्रेट विस्थापन के साथ की जाती है, नाभिक के भीतर वास्तविक विस्थापन सैद्धांतिक मूल्य (चित्रा 7 बी) की तुलना में 1.5-8-गुना-बड़ा पाया गया, जो पेरी-परमाणु क्षेत्रों में कर्षण बल के अस्तित्व को दर्शाता है।

Figure 1
चित्र 1: YAP अभिव्यक्ति/वितरण, सब्सट्रेट विस्थापन क्षेत्र, और B2B सामान्य सेल के कर्षण क्षेत्र में परिवर्तन अलग-अलग कठोरता के सब्सट्रेट पर और शुरुआती प्रसार के दौरान। (A) 2, 5, और 40 kPa PAA जैल पर सीड किए गए B2B सेल की YAP अभिव्यक्ति और प्रारंभिक सेल-सब्सट्रेट अनुलग्नक से 60 घंटे के बाद एक ग्लास कवरस्लिप। (बी) बी 2 बी सेल को 5 केपीए पीएए जेल पर सीड किया गया था और प्रारंभिक सेल-सब्सट्रेट अनुलग्नक के बाद 10 घंटे से अधिक की छवि बनाई गई थी। YAP अभिव्यक्ति को हरे रंग की प्रतिदीप्ति तीव्रता द्वारा दर्शाया जाता है। नोट: नाभिक के अंदर वाईएपी तीव्रता धीरे-धीरे कम हो जाती है लेकिन समय के साथ साइटोप्लाज्म की तुलना में अधिक रहती है। रंग सलाखों में YAP अभिव्यक्ति (हरा = उच्च अभिव्यक्ति; काला = कम अभिव्यक्ति) के स्तर (A) और (B) में इंगित करते हैं। (सी) सेल स्थान पर सब्सट्रेट विरूपण (उज्ज्वल-क्षेत्र छवि के साथ ओवरलैप) को प्रत्येक समय बिंदु पर विस्थापन क्षेत्र द्वारा दर्शाया जाता है। विस्थापन दिशा और परिमाण क्रमशः तीर दिशा और रंग द्वारा दिखाए जाते हैं। विस्थापन बी 2 बी सेल बॉडी के सिरों पर बड़ा हो जाता है क्योंकि सेल स्प्रेड क्षेत्र बढ़ता है। रंग पट्टी विस्थापन परिमाण को इंगित करती है (क्रिमसन = उच्च परिमाण; काला = कम परिमाण)। (डी) कर्षण क्षेत्र (उज्ज्वल क्षेत्र छवि के साथ ओवरलैप) विस्थापन क्षेत्र से गणना की जाती है। कर्षण B2B कोशिकाओं की सीमा पर केंद्रित है। सफेद और पीले रंग की बिंदीदार रूपरेखा क्रमशः कोशिका और नाभिक की सीमाओं को चित्रित करती है। रंग पट्टी कर्षण परिमाण को इंगित करती है (क्रिमसन = उच्च परिमाण; काला = कम परिमाण)। स्केल सलाखों = 20 μm. संक्षेप: YAP = हाँ से जुड़े प्रोटीन; PAA = polyacrylamide कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: YAP अभिव्यक्ति / वितरण, सब्सट्रेट विस्थापन क्षेत्र, और एक PC9 कैंसर सेल के कर्षण क्षेत्र में परिवर्तन अलग-अलग कठोरता के सब्सट्रेट पर और शुरुआती प्रसार के दौरान। (ए) एक PC9 सेल की YAP अभिव्यक्ति 2, 5, और 40 kPa PAA जैल पर seeded और ग्लास coverslip प्रारंभिक सेल-सब्सट्रेट अनुलग्नक से 65 ज के बाद। (बी) पीसी 9 सेल को 5 केपीए पीएए जेल पर सीड किया गया था और प्रारंभिक सेल-सब्सट्रेट अनुलग्नक के बाद 10 घंटे से अधिक की छवि बनाई गई थी। YAP अभिव्यक्ति को हरे रंग की प्रतिदीप्ति तीव्रता द्वारा दर्शाया जाता है। नोट: YAP तीव्रता 1.5 घंटे के बाद से पठारों. रंग सलाखों YAP अभिव्यक्ति के स्तर को इंगित करते हैं (हरा = उच्च अभिव्यक्ति; काला = कम अभिव्यक्ति) (A) और (B) में. (C) सेल स्थान पर सब्सट्रेट विरूपण (उज्ज्वल-क्षेत्र छवि के साथ ओवरलैप) प्रत्येक समय बिंदु पर फ्लोरोसेंट मनका विस्थापन क्षेत्र द्वारा दर्शाया जाता है। विस्थापन दिशा और परिमाण क्रमशः तीर दिशा और रंग द्वारा दिखाए जाते हैं। PC9 कक्षों के कारण विस्थापन फ़ील्ड B2B कक्ष के कारण होने वाली विस्थापन फ़ील्ड से छोटा होता है. 10 ज प्रसार प्रक्रिया के दौरान, PC9 कोशिकाओं का क्षेत्र लगभग स्थिर रहता है। रंग पट्टी विस्थापन परिमाण को इंगित करती है (क्रिमसन = उच्च परिमाण; काला = कम परिमाण)। (डी) कर्षण क्षेत्र (उज्ज्वल क्षेत्र छवि के साथ ओवरलैप) विस्थापन क्षेत्र से गणना की। इस प्रतिनिधि PC9 सेल द्वारा उत्पन्न कर्षण धीरे-धीरे 6 वें h से 10 वें h तक कम हो जाता है। सफेद और पीले रंग की बिंदीदार रूपरेखा क्रमशः कोशिका और नाभिक की सीमाओं को चित्रित करती है। रंग पट्टी कर्षण परिमाण को इंगित करती है (क्रिमसन = उच्च परिमाण; काला = कम परिमाण)। स्केल सलाखों = 20 μm. संक्षेप: YAP = हाँ से जुड़े प्रोटीन; PAA = polyacrylamide कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: प्रारंभिक प्रसार चरण में B2B और PC9 कोशिकाओं में YAP वितरण। (A) B2B सेल की YAP तीव्रता को 0 वें और 10 वें h पर असाइन किए गए लाल अक्ष के साथ मापा जाता है( B) 0 वें h पर, YAP तीव्रता नाभिक और साइटोप्लाज्म के बीच नाटकीय एकाग्रता अंतर दिखाती है। 10 वें एच में, वाईएपी तीव्रता पूरे सेल शरीर में अधिक समरूप हो जाती है। (C) PC9 सेल की YAP तीव्रता को 0 वें और 10 वें h पर असाइन किए गए नीले अक्ष के साथ मापा जाता है( D) 0 वें h पर, नाभिक में YAP तीव्रता साइटोप्लाज्म की तुलना में अधिक दिखाई देती है, हालांकि अंतर B2B कोशिकाओं की तुलना में अधिक नहीं है। 10 वें एच पर, नाभिक में वाईएपी तीव्रता अभी भी साइटोप्लाज्म की तुलना में थोड़ी अधिक दिखाई देती है, जिसमें 0 वें एच के समान भिन्नता प्रवृत्ति होती है। स्केल सलाखों = 20 μm (ए, सी). संक्षिप्त नाम: YAP = हाँ से जुड़े प्रोटीन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: YAP N/C अनुपात को मापना। (1) नाभिक की रूपरेखा खींचने और इसके 2 डी अनुमानित क्षेत्र एनुक को मापने के लिए फिजी इमेजजे लागू करें। (2) नाभिक Inuc के अंदर प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने. (3) सेल बॉडी की रूपरेखा खींचें और इसके अनुमानित क्षेत्र एसेल को मापें। (4) सेल Icel के अंदर प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने. (5) YAP नाभिक घनत्व Dnuc, YAP साइटोप्लाज्म घनत्व Dcyto, और उनके अनुपात R: Dnuc = Inuc / Anuc की गणना करें; Dcyto = (Icel-Inuc)/(Acel-Anuc); R = Dnuc/ Dcyto रंग पट्टी YAP अभिव्यक्ति के स्तर को इंगित करती है (हरा = उच्च अभिव्यक्ति; काला = कम अभिव्यक्ति)। स्केल बार = 20 μm. संक्षेप: YAP = हाँ से जुड़े प्रोटीन; N = नाभिक; C = साइटोप्लाज्म। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: विशिष्ट YAP अभिव्यक्ति, सेल / नाभिक आकृति विज्ञान, और PC9 कैंसर और B2B सामान्य कोशिकाओं में सेलुलर कर्षण सेल प्रसार के दौरान। (ए) वाईएपी एन / सी अनुपात एकल-सेल प्रसार के पहले 10 घंटे के दौरान बदलता है। B2B कोशिकाओं का औसत YAP N/C अनुपात (लाल स्तंभ; n = 10) 2.54 ± 0.22 से 1.79 ± 0.21 (n = 10; p = 0.0022**) से बदल गया, जबकि PC9 कोशिकाओं का औसत YAP N/C अनुपात (नीला स्तंभ; n = 5) 1.92 ± 0.26 से 1.57 ± 0.07 (p = 0.07) (p = 0.07) तक बदल गया। (बी) समय के एक समारोह के रूप में औसत द्विध्रुवीय कर्षण। B2B कोशिकाओं का औसत द्विध्रुवीय कर्षण 256.17 ± 123.69 nN से 287.44 ± 99.79 nN (p = 0.7593 (ns)) में बदल गया और PC9 कोशिकाओं का औसत द्विध्रुवीय कर्षण 141.19 ± 33.62 nN से 168.52 ± 73.01 nN (p = 0.713) हो गया। (c) समय के एक समारोह के रूप में औसत सेल क्षेत्र। B2B कोशिकाओं का औसत सेल प्रसार क्षेत्र 613.89 ± 102.43 μm2 से बढ़कर 942.51 ± 226.71 μm2 (p = 0.0512 (ns)) हो गया और PC9 कोशिकाओं का औसत सेल स्प्रेड क्षेत्र 495.78 ± 97.04 μm2 से 563.95 ± 89.92 μm2 (p = 0.58) तक बदल गया। (d) समय के एक कार्य के रूप में औसत नाभिक क्षेत्र। B2B कोशिकाओं का औसत नाभिक प्रसार क्षेत्र 181.55 ± 36.18 μm2 से बढ़कर 239.38 ± 43.12 μm2 (p = 0.1217 (ns)) हो गया और PC9 कोशिकाओं का औसत नाभिक प्रसार क्षेत्र 133.31 ± 30.05 μm2 से 151.93 ± 22.49 μm2 (p = 0.59) तक बदल गया। संक्षेप: YAP = हाँ से जुड़े प्रोटीन; N = नाभिक; C = साइटोप्लाज्म; एनएस = महत्वपूर्ण नहीं है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: YAP N/C अनुपात और द्विध्रुवीय कर्षण बल सेल और नाभिक के प्रसार क्षेत्र के एक समारोह के रूप में। YAP N/C अनुपात और B2B कोशिकाओं (n = 10) और PC9 कोशिकाओं (n = 5) के द्विध्रुवीय कर्षण की गणना सब्सट्रेट से जुड़ने के बाद 6 वें h से 10 वें h तक की जाती है। (ए) सेल स्प्रेड क्षेत्र के एक फ़ंक्शन के रूप में वाईएपी एन / सी अनुपात। B2B कोशिकाओं के YAP N/C अनुपात 1.16 से 2.53 तक भिन्न होते हैं, जबकि PC9 कोशिकाओं के YAP N/C अनुपात 1.27 से 1.88 तक भिन्न होते हैं। B2B कोशिकाओं का सेल स्प्रेड क्षेत्र 391.94 μm2 से 1986.40 μm2 तक भिन्न होता है। PC9 कोशिकाओं का सेल स्प्रेड क्षेत्र 284.46 μm2 से 830.12 μm2 तक होता है। (बी) नाभिक प्रसार क्षेत्र के एक कार्य के रूप में वाईएपी एन / सी अनुपात। B2B कोशिकाओं का नाभिक प्रसार क्षेत्र 107.09 μm2 से 514.28 μm2 तक भिन्न होता है। PC9 कोशिकाओं का नाभिक प्रसार क्षेत्र 58.03 μm2 से 259.65 μm2 तक होता है। कोशिका प्रसार क्षेत्र (सी) और नाभिक प्रसार क्षेत्र (डी) के एक समारोह के रूप में बी 2 बी कोशिकाओं का द्विध्रुवीय कर्षण। प्रसार और गैर-माइग्रेटिंग बी 2 बी कोशिकाएं कम कोशिका और नाभिक क्षेत्र के साथ उच्च कर्षण (47.50 nN से 1051.48 nN तक) दिखाती हैं। फैलते और माइग्रेट करते समय, बी 2 बी कोशिकाएं सेल और नाभिक क्षेत्र की बड़ी श्रेणियों के साथ कम कर्षण (105.80 nN से 310.28 nN तक) दिखाती हैं। संक्षेप: YAP = हाँ से जुड़े प्रोटीन; N = नाभिक; C = साइटोप्लाज्म। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: सामान्य बी 2 बी और कैंसर पीसी 9 कोशिकाओं में पेरी-परमाणु विस्थापन। (ए) पेरी-न्यूक्लियर और पेरी-सेल विस्थापन का योजनाबद्ध साइड-व्यू आरेख सब्सट्रेट में मनका विस्थापन से मापा जाता है। (बी) पीसी 9 सेल के नीचे सब्सट्रेट विस्थापन को सेल अक्ष ( 7 डी में सफेद डैश्ड लाइन) के साथ मापा जाता है। सेल सीमा पर द्विध्रुवीय बल द्वारा उत्पन्न सैद्धांतिक विस्थापन को Boussinesq समीकरण (काला धराशायी वक्र) द्वारा दिखाया गया है। (सी) और (डी) ओवरलैप फ्लोरोसेंट मनका छवियों के साथ (लाल) और बिना (हरे) कोशिकाओं के लिए PC9 कोशिकाओं के लिए संलग्न करने के बाद 6 वें ज पर (शीर्ष दृश्य)। पीला (लाल और हरे रंग का सटीक ओवरलैप) मोती कोई विस्थापन का संकेत नहीं देते हैं। अलग किए गए हरे और लाल मोती (पीले तीरों द्वारा इंगित) पेरी-परमाणु विस्थापन का प्रतिनिधित्व करते हैं। पीले तीर नाभिक की परिधि पर स्थित इन संकुचित पेरी-न्यूक्लियस धब्बों को इंगित करते हैं। (ई) सेल-सब्सट्रेट अनुलग्नक के बाद 1.5 वें घंटे पर बी 2 बी सेल द्वारा उत्पन्न पेरी-परमाणु विस्थापन। स्केल सलाखों = 10 μm (C-E). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा S1: YAP-mNeonGreen21-10/11 का जीनोमिक अनुक्रम मानचित्र। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा S2: YAP अभिव्यक्ति / वितरण, सब्सट्रेट विस्थापन क्षेत्र, और प्रारंभिक प्रसार के दौरान B2B सामान्य कोशिकाओं के कर्षण क्षेत्र में परिवर्तन। (A, D, G, J, M) बी 2 बी सेल को 5 केपीए पीएए जेल पर सीड किया गया था और प्रारंभिक सेल-सब्सट्रेट अनुलग्नक के बाद 10 घंटे से अधिक की छवि बनाई गई थी। YAP अभिव्यक्ति को हरे रंग की प्रतिदीप्ति तीव्रता द्वारा दर्शाया जाता है। नोट: नाभिक के अंदर वाईएपी तीव्रता धीरे-धीरे कम हो जाती है लेकिन समय के साथ साइटोप्लाज्म की तुलना में अधिक रहती है। रंग सलाखों में YAP अभिव्यक्ति (हरा = उच्च अभिव्यक्ति; काला = कम अभिव्यक्ति) के स्तर (A, D, G, J, M) को इंगित करते हैं। (B, E, H, K, N) सेल स्थान पर सब्सट्रेट विरूपण (उज्ज्वल-क्षेत्र छवि के साथ ओवरलैप) प्रत्येक समय बिंदु पर विस्थापन क्षेत्र द्वारा दर्शाया जाता है। विस्थापन दिशा और परिमाण क्रमशः तीर दिशा और रंग द्वारा दिखाए जाते हैं। विस्थापन बी 2 बी सेल बॉडी की परिधि पर बड़ा हो जाता है क्योंकि सेल स्प्रेड क्षेत्र बढ़ता है। रंग सलाखों (क्रिमसन = उच्च परिमाण; काला = कम परिमाण) में (बी, ई, एच, के, एन) में विस्थापन परिमाण (क्रिमसन = उच्च परिमाण; काला = कम परिमाण) को इंगित करते हैं। (C, F, I, L, O) कर्षण क्षेत्र (उज्ज्वल-क्षेत्र छवि के साथ ओवरलैप) कर्षण बल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके विस्थापन क्षेत्र से गणना की जाती है। कर्षण बी 2 बी कोशिकाओं की परिधि पर केंद्रित है। रंग सलाखों ( C, F, I, L, O) में कर्षण परिमाण (क्रिमसन = उच्च परिमाण; काला = कम परिमाण) को इंगित करते हैं। स्केल सलाखों = 20 μm. संक्षेप: YAP = हाँ से जुड़े प्रोटीन; PAA = polyacrylamide कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा S3: YAP अभिव्यक्ति / वितरण, सब्सट्रेट विस्थापन क्षेत्र, और प्रारंभिक प्रसार के दौरान PC9 कैंसर कोशिकाओं के कर्षण क्षेत्र में परिवर्तन। (A, D, G, J) PC9 सेल को 5 kPa PAA जेल पर सीड किया गया था और प्रारंभिक सेल-सब्सट्रेट अनुलग्नक के बाद 10 h से अधिक की छवि बनाई गई थी। YAP अभिव्यक्ति को हरे रंग की प्रतिदीप्ति तीव्रता द्वारा दर्शाया जाता है। नोट: नाभिक के अंदर YAP तीव्रता धीरे-धीरे कम हो जाती है, लेकिन समय के साथ साइटोप्लाज्म के समान या उससे थोड़ी कम रहती है। रंग सलाखों में YAP अभिव्यक्ति (हरा = उच्च अभिव्यक्ति; काला = कम अभिव्यक्ति) के स्तर (A, D, G, J) को इंगित करते हैं। (B, E, H, K) सेल स्थान पर सब्सट्रेट विरूपण (उज्ज्वल-क्षेत्र छवि के साथ ओवरलैप) प्रत्येक समय बिंदु पर विस्थापन क्षेत्र द्वारा दर्शाया जाता है। विस्थापन दिशा और परिमाण क्रमशः तीर दिशा और रंग द्वारा दिखाए जाते हैं। विस्थापन PC9 सेल बॉडी की परिधि पर बड़ा हो जाता है क्योंकि सेल स्प्रेड क्षेत्र बढ़ जाता है। रंग सलाखों ( B, E, H, K) में विस्थापन परिमाण (क्रिमसन = उच्च परिमाण; काला = कम परिमाण) को इंगित करते हैं। (C, F, I, L) कर्षण क्षेत्र (उज्ज्वल क्षेत्र छवि के साथ ओवरलैप) विस्थापन क्षेत्र से गणना की गई। कर्षण PC9 कोशिकाओं की परिधि पर केंद्रित है। रंग सलाखों ( C, F, I, L) में कर्षण परिमाण (क्रिमसन = उच्च परिमाण; काला = कम परिमाण) को इंगित करते हैं। स्केल सलाखों = 20 μm. संक्षेप: YAP = हाँ से जुड़े प्रोटीन; PAA = polyacrylamide कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

इमेजिंग प्रक्रिया (चरण 6.3) यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि प्रतिदीप्ति छवियां वैध परिमाणीकरण परिणाम प्राप्त करने के लिए पर्याप्त रूप से अच्छी गुणवत्ता की हैं। फ्लोरोसेंट प्रोटीन या मोतियों की जेड-स्टैक छवियों में एक जेड-रेंज होनी चाहिए जो सभी जेड-पदों के लिए इन-फोकस छवियों को शामिल करने के लिए पर्याप्त बड़ी है जो नमूना फैलाती है। एक और महत्वपूर्ण कदम कोशिकाओं को भंग करने के बाद फ्लोरोसेंट मोतियों की संदर्भ छवियों को इकट्ठा कर रहा है (चरण 6.5)। क्योंकि संदर्भ छवियों को चरण 6.3 में एक ही स्थिति में लेने की आवश्यकता है, इसलिए पेट्री डिश, पर्यावरण कक्ष और माइक्रोस्कोप के बीच कोई सापेक्ष विस्थापन प्रेरित नहीं किया जाना चाहिए। भंग चरण का प्रदर्शन करने वाले जांचकर्ताओं को पेट्री डिश के ढक्कन को हटाने के लिए सावधान रहना चाहिए और यह सुनिश्चित करना चाहिए कि लागू यांत्रिक गड़बड़ी पर्यावरण कक्ष में पकवान के स्थान को बदलने के लिए पर्याप्त बड़ी नहीं है।

प्रयोगों के दौरान होने वाली कुछ त्रुटियों को हल करने के लिए समाधान नीचे दिए गए हैं। यदि चरण 6.4 में Enter पर क्लिक करने के बाद कोई मैक्रो सक्रिय नहीं है, तो यह सबसे अधिक संभावना है क्योंकि स्क्रीन का बायाँ निचला क्षेत्र एक गैर-तत्व विंडो द्वारा कब्जा कर लिया गया है। ऐसे मामले में, विंडो के बाएं नीचे के क्षेत्र को साफ़ करने की आवश्यकता होती है ताकि मैक्रोज़ को तत्वों में सक्रिय किया जा सके। एक और सामान्य त्रुटि यह है कि उज्ज्वल-फ़ील्ड छवियां काली दिखाई देती हैं। यह समस्या प्रतिदीप्ति और उज्ज्वल-फ़ील्ड छवियों के अधिग्रहण के बीच एक अपर्याप्त समय अंतराल के कारण होती है। प्रतिदीप्ति इमेजिंग समय की गिनती में मामूली देरी समय के साथ जमा हो सकती है और काफी देरी का कारण बन सकती है और उज्ज्वल-क्षेत्र इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकती है। एक समाधान सभी पदों के एक इमेजिंग चक्र की अवधि को समायोजित करना है जो लगातार गति की शुरुआत के बीच के समय अंतराल से कम (बराबर नहीं) है। यह कार्रवाई समय की गणना को ताज़ा करती है और प्रत्येक इमेजिंग चक्र की शुरुआत में संचयी त्रुटि को समाप्त करती है।

यह ऑल-ऑप्टिकल पूछताछ तकनीक (1) हार्डवेयर / सॉफ़्टवेयर की एक विस्तृत श्रृंखला का समर्थन करती है, जिसमें निकॉन तक सीमित नहीं है, (2) जिलेटिन, पीईजी, मैट्रिगेल और कोलेजन आई जैल सहित विभिन्न प्रकार के मान्य हाइड्रोजेल सिस्टम, और (3) शोधकर्ताओं की विभिन्न जरूरतों के आधार पर प्रोग्राम योग्य अनुकूलन। हालांकि, यदि किसी भी निचले स्तर के नियंत्रण फ़ंक्शन वाणिज्यिक माइक्रोस्कोप से उपलब्ध नहीं हैं, तो AMFIP का उपयोग करके फ़ंक्शन का अनुकूलन चुनौतीपूर्ण हो जाता है। इस तकनीक की एक और सीमा XY और फोकस (Z) विमानों दोनों में नमूने का स्थानिक बहाव है। यद्यपि छवियों के पोस्ट-प्रोसेसिंग के दौरान इस सीमा को दूर किया जा सकता है, लेकिन नमूनों के वास्तविक समय के बहाव को सही करने के लिए ऑटो-फोकस फ़ंक्शन में सुधार करना आवश्यक है। यह सुधार इमेजिंग प्रक्रिया के थ्रूपुट को बढ़ाएगा और प्रयोगों के दौरान बहाव के कारण संभावित त्रुटि को कम करेगा।

Mechanotransducers, जैसे YAP, होनहार कैंसर उपचार 25,26,27 के विकास के लिए नए चिकित्सीय लक्ष्यों के रूप में काम कर सकते हैं। उभरते हुए आंकड़ों से पता चलता है कि वाईएपी कैंसर कोशिकाओं के प्रसार और आक्रमण को बढ़ावा देता है। साइटोप्लाज्म से नाभिक में यांत्रिकी-प्रेरित वाईएपी ट्रांसलोकेशन सेल माइग्रेशन, प्रसार, आक्रमण और एपोप्टोसिस से संबंधित जीन के प्रतिलेखन को सक्रिय करता है, जिससे सेल व्यवहार 28,29,30,31 हो जाता है। इस काम का उद्देश्य दो विशिष्ट मानव फेफड़ों के कैंसर और सामान्य सेल लाइनों में वाईएपी एन / सी अनुपात और सेल यांत्रिकी के संभावित सहसंबंध का पता लगाना था। 10 एच सेल प्रसार अवधि के दौरान, PC9 कोशिकाएं नाभिक और साइटोप्लाज्म (चित्रा 3 डी और चित्रा 5 ए) में समान वाईएपी सांद्रता दिखाती हैं। बी 2 बी कोशिकाएं साइटोप्लाज्म (चित्रा 3 सी और चित्रा 5 ए) की तुलना में नाभिक में एक उच्च वाईएपी एकाग्रता दिखाती हैं। प्रारंभिक प्रसार चरण के दौरान पाया जाने वाला यह संबंध प्रकाशित निष्कर्षों के बहुमत से अलग है जो सामान्य और कैंसर कोशिकाओं के बीच नाभिक में वाईएपी एकाग्रता की तुलना करते हैं। हालांकि जरूरी नहीं कि शुरुआती प्रसार चरण में, अधिकांश प्रकाशित निष्कर्षों से पता चलता है कि वाईएपी सामान्य कोशिकाओं के नाभिक की तुलना में कैंसर कोशिकाओं के नाभिक में अधिक केंद्रित है27,28। स्तन कैंसर पर केवल एक अध्ययन ने एक अपवाद 32 की सूचना दी जो दिखाती है कि वाईएपी साइटोप्लाज्म में अधिक केंद्रित है, जो फेफड़ों के कैंसर पीसी 9 कोशिकाओं में किए गए हमारे वर्तमान अवलोकनों से सहमत है। लेखकों के सर्वोत्तम ज्ञान के लिए, यह काम मानव फेफड़ों के कैंसर सेल लाइन में कम वाईएपी एन / सी अनुपात दिखाने वाला पहला है। लेखकों ने परिकल्पना की है कि PC9 कोशिकाओं में एक स्थिर YAP N / C अनुपात का कारण सेल / नाभिक प्रसार क्षेत्र में कम भिन्नता और प्रारंभिक प्रसार चरण में PC9 कोशिकाओं में कर्षण के कारण हो सकता है। PC9 और B2B कोशिकाओं में कम YAP N/C अनुपात के आणविक तंत्र को रेखांकित करने का विच्छेदन चल रहा है।

फैलने के पहले 10 घंटे के दौरान, ये दो सेल लाइनें वाईएपी एन / सी अनुपात, सेल कर्षण और प्रसार क्षेत्र (चित्रा 5) के बीच एक अलग संबंध दिखाती हैं। B2B कोशिकाओं के लिए, एक उच्च YAP N/C अनुपात एक उच्च सेल और नाभिक प्रसार क्षेत्र (चित्रा 6A, B) के साथ सहसंबद्ध है, जो अन्य सामान्य कोशिकाओं के रिपोर्ट किए गए डेटा के अनुरूप है33। दिलचस्प बात यह है कि, हालांकि इस रिश्ते की विकासात्मक प्रवृत्ति आमतौर पर दर्ज सभी बी 2 बी कोशिकाओं में पाई जाती है, इस संबंध के दो अलग-अलग डिग्री (उच्च और निम्न) पाए जाते हैं। बी 2 बी कोशिकाएं जो एक साथ फैलती हैं और प्रवास करती हैं, वे उच्च वाईएपी एन / सी अनुपात (2.05 ± 0.32) के साथ कम कर्षण और उच्च कोशिका और नाभिक प्रसार क्षेत्र दिखाती हैं। बी 2 बी कोशिकाओं के लिए जो एक ही स्थान पर फैलते हैं और रहते हैं, वे कम वाईएपी एन / सी अनुपात (1.74 ± 0.21) के साथ उच्च कर्षण और कम सेल और नाभिक प्रसार क्षेत्र दिखाते हैं। रिश्तों की इन दो डिग्री विभाजित बिखरे हुए डेटा समूहों (चित्रा 6 सी, डी) में प्रदर्शित की जाती हैं। जैसा कि साहित्य में बताया गया है, स्थिर सामान्य कोशिकाएं, जैसे कि भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट एनआईएच 3टी 3 कोशिकाएं, प्रवासी कोशिकाओं की तुलना में अधिक कर्षण होती हैं। इस पेपर में रिपोर्ट किए गए डेटा से पता चलता है कि प्रसार और गैर-माइग्रेटिंग बी 2 बी कोशिकाओं ने बी 2 बी कोशिकाओं को फैलाने और माइग्रेट करने की तुलना में उच्च कर्षण लागू किया, संभवतः यह सुझाव देते हुए कि सब्सट्रेट पर स्थिर होने के लिए गैर-माइग्रेटिंग कोशिकाओं के लिए उच्च कर्षण की आवश्यकता होती है।

इसके अलावा, इन आंकड़ों से पता चलता है कि स्थिर सामान्य बी 2 बी कोशिकाएं एक उच्च पेरी-परमाणु बल उत्पन्न करती हैं, जबकि अन्य शोधकर्ताओं द्वारा किए गए पिछले शोध ने स्थिर कोशिकाओं की परिधि में उत्पन्न केवल उच्च सेल कर्षण की सूचना दी 34,35,36,37। लेखकों का मानना है कि प्रयोगों में प्रवास की आंतरिक प्रवृत्ति में अंतर इन विरोधाभासी परिणामों का कारण बन सकता है। प्रकाशित प्रयोगों में, वर्ग के आकार के माइक्रोपैटर्निंग का उपयोग एकल कोशिकाओं को फैलने और प्रवास को रोकने से रोकने के लिए किया गया था; क्या कोशिकाओं को माइग्रेट करने की प्रवृत्ति थी, यह अज्ञात है। जैसा कि प्रवासी कोशिकाएं अक्सर कोशिकाओं की परिधि पर उच्च कर्षण बल दिखाती हैं38, यह संभावना है कि प्रवास करने की प्रवृत्ति वाली कोशिकाएं अभी भी उच्च परिधि कर्षण बनाए रखेंगी, भले ही उनका प्रवास प्रतिबंधित हो। इस वर्तमान अध्ययन में, स्थिर कोशिकाओं को किसी भी माइक्रोपैटर्न द्वारा प्रतिबंधित नहीं किया जाता है, लेकिन माइग्रेट नहीं होता है, यह दर्शाता है कि कोशिकाएं अपने गैर-माइग्रेटिंग राज्य को बनाए रखती हैं। एक और संभावना यह है कि माइक्रोपैटर्न द्वारा परिभाषित सेल आकार फोकल आसंजन और कर्षण बलों के वितरण को प्रभावित कर सकता है39। इस अध्ययन में परिणाम किसी भी सीमित माइक्रोपैटर्निंग के बिना उत्पन्न किए गए थे और उनके मूल आकार में स्थिर कोशिकाओं के बल वितरण का प्रतिनिधित्व करते हैं।

लेखकों के ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, आज तक केवल एक प्रकाशन ने विशेष रूप से सामान्य कोशिकाओं (माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट्स) में पेरी-परमाणु बलों की खोज की सूचना दी, संभावित रूप से नाभिक 40 में फैले एक्टिन कैप के कारण। YAP साइटोप्लाज्म-टू-न्यूक्लियस ट्रांसलोकेशन पेरी-न्यूक्लियर फोर्स 40 में वृद्धि के साथ सहसंबद्ध है। प्रासंगिक साहित्य की पूरी तरह से खोज ने किसी भी प्रकाशन को प्राप्त नहीं किया जो कैंसर कोशिकाओं में एक पेरी-न्यूक्लियर बल या एक्टिन कैप की रिपोर्ट करता है। मेलेनोमा कैंसर कोशिकाओं पर एक अप्रत्यक्ष अध्ययन से पता चला है कि एक्टिन रिम (एक और पेरी-न्यूक्लियर एक्टिन संगठन जो चारों ओर स्थित है लेकिन नाभिक को कवर नहीं करता है) सेल माइग्रेशन दर 41 को कम करता है, अप्रत्यक्ष रूप से एक पेरी-न्यूक्लियर बल के अस्तित्व का सुझाव देता है। हालांकि, कोई प्रत्यक्ष प्रयोगात्मक डेटा रिपोर्ट नहीं किया गया है। इस अध्ययन में, लेखकों ने पाया कि PC9 और B2B दोनों कोशिकाएं पेरी-न्यूक्लियर विस्थापन और कर्षण दिखाती हैं। पेरी-न्यूक्लियर बलों की पीढ़ी के तंत्र और उनके प्रभाव विवादास्पद बने हुए हैं। सामान्य कोशिकाओं में, एक्टिन कैप को नाभिक आकृति विज्ञान और क्रोमैटिन संगठन 42 को विनियमित करने में भूमिका निभाने की सूचना दी गई थी, जो न्यूक्लियोस्केलेटन और साइटोस्केलेटन (LINC) कॉम्प्लेक्स 43 के लिंकर्स के माध्यम से नाभिक में फोकल आसंजन से यांत्रिक संकेतों को प्रसारित करता है, और सेल माइग्रेशन 44 को विनियमित करता है। लैमिन ए / सी एक्टिन कैप 40,41,42,43,44 के गठन और व्यवधान से संबंधित है। हालांकि, रिपोर्ट जिसमें दावा किया गया है कि एक्टिन कैप एक पेरी-न्यूक्लियर फोर्स उत्पन्न करता है, ने एक्टिन रिम 40 की संभावित भूमिका पर विचार नहीं किया। कैंसर कोशिकाओं में, लैमिन ए का ओवरएक्सप्रेशन एक एक्टिन रिम के गठन की सुविधा प्रदान करता है और कैंसर सेल माइग्रेशन को प्रतिबंधित करता है। लैमिन बी का ओवरएक्सप्रेशन एक्टिन रिम गठन को कम करता है और माइग्रेशन को बढ़ावा देता है। पेरी-न्यूक्लियर फोर्स पेरी-न्यूक्लियर एक्टिन संगठन के अस्तित्व और लैमिन ए के प्रभाव के कारण इस प्रक्रिया में शामिल हो सकता है। हालांकि, इस अध्ययन के परिणामों ने मापा पेरी-परमाणु बलों या एक्टिन कैप के व्यवहार का कोई सबूत नहीं दिखाया। इसलिए, इस वर्तमान अध्ययन में पीसी 9 कोशिकाओं में पेरी-न्यूक्लियर बलों की खोज पहली रिपोर्ट है जो फेफड़ों के कैंसर कोशिकाओं में पेरी-न्यूक्लियर बलों और विस्थापन को दिखाती है। लेखक वर्तमान में CRISPR / Cas9-इंजीनियर PC9 और B2B कोशिकाओं में पेरी-परमाणु बलों के आणविक तंत्र और कार्यों की जांच कर रहे हैं।

इस पेपर में प्रदर्शित सभी ऑप्टिकल मेचानोबायोलॉजी पूछताछ से परे, एकीकृत बहु-कार्यात्मक प्रणाली को जीवित प्रणालियों में अन्य आवश्यक शारीरिक और पैथोबायोलॉजिकल संकेतों के असंख्य ऑप्टिकल रूप से जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, लेखकों की प्रयोगशाला ने हाल ही में कई स्थिर रूप से ट्रांसड्यूस्ड मानव कैंसर सेल लाइनों की स्थापना की है जो तीन प्रकाश-उत्तरदायी झिल्ली प्रोटीन को सह-व्यक्त करते हैं: झिल्ली वोल्टेज संकेतक QuasAr2 (उत्तेजना: 640 एनएम; उत्सर्जन: 660 एनएम -740 एनएम), झिल्ली वोल्टेज विध्रुवीकरण CheRiff (उत्तेजना: 488 एनएम), और झिल्ली वोल्टेज हाइपरपोलराइज़र eNpHR3 (उत्तेजना: 590 एनएम)। इन तीन कार्यात्मक प्रोटीनों को एक क्रॉसस्टॉक-मुक्त तरीके से स्पेक्ट्रम-ऑर्थोगोनल लेजर लाइनों द्वारा सक्रिय किया जा सकता है, जिससे झिल्ली इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के ऑल-ऑप्टिकल दो-तरफा सिग्नलिंग संचार (रीडआउट और नियंत्रण) सक्षम हो सकते हैं। एक एकीकृत ऑप्टो-इलेक्ट्रॉनिक्स सिस्टम और एक मैनुअल पैच-क्लैंप का उपयोग करते हुए, लेखकों ने एकल मानव कैंसर कोशिकाओं और बहुकोशिकीय ट्यूमर गोलाकार में झिल्ली वोल्टेज (वीएम) के सभी ऑप्टिकल नियंत्रण और रीडआउट को मान्य किया है। ऑल-ऑप्टिकल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी पूछताछ कैंसर कोशिकाओं में पहले से दुर्गम बायोइलेक्ट्रिकिटी के विस्तृत अन्वेषणों की संभावना खोलती है, जो एक नई धुरी से ट्यूमर जीव विज्ञान को आगे बढ़ाने में मदद कर सकती है।

Disclosures

घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस परियोजना को वित्तीय रूप से यूएफ हेल्थ कैंसर सेंटर (एक्स. टी. और डी. एस.) और गेटोरेड अवार्ड स्टार्ट-अप पैकेज (एक्स. टी.) से कैंसर पायलट अवार्ड द्वारा समर्थित किया जाता है। लेखकों ने ईमानदारी से बौद्धिक चर्चाओं और डॉ जोनाथन लिच (यूएफएचसीसी), डॉ रोल्फ रेने (यूएफएएचसी), डॉ जी-ह्यून ली (बायोस्टैटिस्टिक्स, यूएफ), डॉ ह्यूग फैन (एमएई, यूएफ), डॉ वॉरेन डिक्सन (एमएई, यूएफ), डॉ घाटू सुभाष (एमएई, यूएफ), डॉ मार्क शेपलैक (एमएई और ईसीई, यूएफ), डॉ मलिसा सरनटिनोरेनोंट (एमएई, एमएई), डॉ मलिसा सरनटिनोरेनोंट (एमएई) से तकनीकी सहायता की सराहना की है। यूएफ), डॉ मैथ्यू ट्राम (एमएई, यूएफ), डॉ डेविड हान (एरिज़ोना विश्वविद्यालय), डॉ वेइहोंग वांग (ओरेकल कॉर्पोरेशन), डॉ यूहुआ टैन (हांगकांग पॉलिटेक्निक विश्वविद्यालय), और निकॉन की सहायता टीम (डॉ जोस सेरानो-वेलेज़, लैरी कोर्डन, और जॉन एकमैन)। लेखक तांग, सीमैन और गुआन की अनुसंधान प्रयोगशालाओं के सभी सदस्यों और एमएई और ईसीई और भौतिकी और विकिरण ऑन्कोलॉजी विभागों, यूएफ के सभी कर्मचारियों के सदस्यों से उदार और प्रभावी समर्थन के लिए गहराई से आभारी हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane Sigma-aldrich 440140
0.05 % Trypsin Corning 25-051-CI
75 cm2 flask Corning 430641U
8 Benchtop Centrifuge Thermo 75007210
A1R confocal system Nikon HD25
Acetic acid Sigma-aldrich 695092 glacial, ACS reagent, ≥99.7%
BEAS-2B (B2B) cells Sigma-aldrich 95102433 human epithelial cells from lung tissue
Carboxylate-Modified Microspheres Invitrogen F8797
Culture medium (RPMI-1640) Gibco 11875093
Desktop Computer Dell 2018 with Windows 10 operating system
Environmental chamber TIZB Tokai Hit TIZB
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 26140
Fibronectin Human Protein, Plasma Gibco 33016015
Fiji ImageJ National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation 1.53k
Glass-bottom petri dish MatTek P35G-1.5-14-C
HEPES buffered saline Sigma-aldrich 51558
Hydrazine hydrate solution Sigma-aldrich 53847
IntelliJ IDEA JetBrains 2020 Java development platform
Java Development Kit Oracle 14.0
Kimwipe Kimtech Science 3066-05
MATLAB MathWorks 2020b
Monochrome Camera FLIR BFS-U3-70S7M-C
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit Lonza LT07-218
N,N′-Methylenebisacrylamide solution Sigma-aldrich M1533
NIS-Elements software platform Nikon 4.50 software platform
Origin OriginLab OriginPro 2017 (Learning Edition) data analysis and graphing software
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122
PC9 cells Sigma-aldrich 90071810 human adenocarcinoma cells  from lung tissue
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010023
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs  F-553S high-fidelity DNA polymerase
Scotch tape Scotch adhesive tape
Sodium dodecyl sulfate solution Sigma-aldrich 05030
Super glue Gorilla cyanoacrylate glue
Ti2-E inverted microscope Nikon MEA54000
TI2-S-SE-E Motorized Stage with Encoder Nikon MEC56120
μManager version 2.0 gamma open source microscopy software (https://micro-manager.org/)

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References

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Bioengineering अंक 178
सभी ऑप्टिकल Mechanobiology मानव कैंसर और सामान्य कोशिकाओं में हाँ से जुड़े प्रोटीन की पूछताछ एक बहु-कार्यात्मक प्रणाली का उपयोग कर
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Luo, Q., Huang, M., Liang, C., Zhang, J., Lin, G., Yu, S., Tanaka, M., Lepler, S., Guan, J., Siemann, D., Tang, X. All-optical Mechanobiology Interrogation of Yes-associated Protein in Human Cancer and Normal Cells using a Multi-functional System. J. Vis. Exp. (178), e62934, doi:10.3791/62934 (2021).

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