Summary
Dette dokumentet presenterer en detaljert trinnvis protokoll om hvordan du bruker et integrert multifunksjonelt og brukerprogrammerbart system som muliggjør automatisk flerkanals avbildning og mekanobiologisk analyse for å belyse mekano-følsomheten til Ja-assosiert protein (YAP).
Abstract
Langsiktig multifunksjonell avbildning og analyse av levende celler krever strømlinjeformet, funksjonell koordinering av ulike maskinvare- og programvareplattformer. Manuell kontroll av ulike utstyr produsert av forskjellige produsenter er imidlertid arbeidskrevende og tidkrevende, noe som potensielt reduserer nøyaktigheten, reproduserbarheten og kvaliteten på innsamvede data. Derfor kan et alt-i-ett- og brukerprogrammerbart system som muliggjør automatisk, multifunksjonelt og langsiktig bildeanskaffelse og er kompatibelt med de fleste fluorescerende mikroskopiplattformer, være til nytte for det vitenskapelige samfunnet. Dette dokumentet introduserer de komplette driftsprotokollene for bruk av et nytt integrert programvaresystem som består av (1) et hjemmebygd program, med tittelen "Automatic Multi-functional Integration Program (AMFIP)," som muliggjør automatisk flerkanals bildeinnsamling, og (2) en pakke med kvantitativ bildeanalyse og celletraksjonsberegningspakker.
Dette integrerte systemet brukes for å avdekke det tidligere ukjente forholdet mellom romlig-temporal fordeling av mekano-sensitive Ja-assosierte proteiner (YAP) og cellemekanikken, inkludert cellespredning og trekkraft, i CRISPR/Cas9-konstruerte humane normale celler (B2B) og lungekreftceller (PC9). Ved å utnytte dette systemets evne til flerkanalskontroll og avlesning, viser resultatet: (1) B2B normale celler og PC9 kreftceller viser en tydelig sammenheng mellom YAP-uttrykk, trekkraft og celledynamikk under cellesprednings- og migreringsprosesser; og (2) PC9 kreftceller bruker merkbare peri-nukleære krefter på substrater. Oppsummert presenterer dette dokumentet en detaljert trinnvis protokoll om hvordan du bruker et integrert brukerprogrammerbart system som muliggjør automatisk multifunksjonell avbildning og analyse for å belyse YAP-mekano-følsomhet. Disse verktøyene åpner muligheten for detaljerte undersøkelser av mangefasettert signaldynamikk i sammenheng med cellefysiologi og patologi.
Introduction
Det overordnede målet med denne metoden er å muliggjøre alloptisk multifunksjonell avbildning og analyse av levende celler. Et alt-i-ett-bildebehandlingsprogram som muliggjør automatisk koordinering av multifunksjonelle optoelektroniske enheter, vil redusere arbeidsintensive og feilutsatte manuelle operasjoner og er avgjørende for at forskere skal kunne utføre langsiktig live-celleavbildning1,2,3,4. Imidlertid gjelder de fleste eksisterende offentlige programmer i det biomedisinske forskningssamfunnet enten bare for begrensede optoelektroniske enheter eller krever ekstra maskinvare for koordinering av forskjellig utstyr5,6,7,8,9. Nylig har et åpen kildekode- og programvarebasert program blitt utviklet, med tittelen "Automatic Multi-functional Integration Program (AMFIP)," som muliggjør flerkanals og tidsforløpavbildning. Basert på Java-språk og Application Programming Interface (API) til μManager11,12, ble AMFIP utviklet som et plugin i μManager som utfører tilpassede Java-skript for å oppnå programvarebasert kommunikasjon av flere optoelektroniske maskinvare- og programvareplattformer, inkludert, men ikke begrenset til, de fra Nikon. Etableringen av AMFIP åpner muligheten for programmerbar og multifunksjonell avhør av celleatferd. Et integrert eksperimentelt og beregningssystem er utviklet i dette dokumentet og kombinerer AMFIP med digital bildeanalyse og celletraksjonskraftmikroskopi. Systemet muliggjør belysning av den distinkte YAP-mekanobiologien i CRISPR/Cas9-konstruerte humane normale B2B-cellelinjer (figur 1) og lungekreft-PC9-cellelinjer (figur 2). Systemet gir det vitenskapelige samfunnet en omfattende løsning som unngår etterspørselen etter å kjøpe ekstra kontrollerende enheter som kanskje ikke er tilgjengelige for og / eller kompatible med hvert bildebehandlingssystem.
Protokollene som presenteres i dette dokumentet, introduserer hvordan du (1) bruker AMFIP til å utføre automatisk langtidsavbildning for både CRISPR/Cas9-konstruerte cellelinjer som uttrykker mNEonGreen2-kodet YAP; og (2) kombinere Fiji ImageJ, MATLAB og Origin for kvantitativ analyse av YAP kjernefysisk/ cytoplasma (N / C) forholdet basert på deres fluorescerende intensitet (figur 3 og figur 4), cellulær forskyvning felt (figur 1C og figur 2C), og cellulær trekkraft felt (figur 1D og figur 2D ). Resultatene tyder på at (1) i løpet av de første 10 t med cellespredning på underlagene som har fysiologisk relevant mekanisk stivhet13,14,15,16,17,18, viser YAP N/C-forholdet mellom enkelt B2B-celler mer merkbar tidsavhengig variasjon og svingning sammenlignet med enkelt-PC9-celler (figur 5 og figur 6 ); og (2) PC9 kreftceller genererer merkbar trekkraft i peri-nukleære regioner (figur 7). Det integrerte systemet og metodene beskrevet i denne protokollen overskrider de spesifikke typer celler og optogenetiske molekyler. Forskere kan anvende protokollene til å tilpasse sine spesifikke live-celle forhørseksperimenter og belyse mangefasettert signaldynamikk i sammenheng med cellefysiologi og patologi.
Protocol
1. Generering av stabil CRISPR/Cas9-redigert cellelinje for human lungekreft (PC9) og human bronkial epitelcellelinje (Beas2B) som endogent uttrykker mNeonGreen21-10/11-tagget YAP protein
- Utfør polymerasekjedereaksjon (PCR) for å forsterke DNA-sekvensen som koder den 11.
- Knock-in den forsterkede DNA-sekvensen inn i YAP genomiske locus av PC9 og B2B cellelinjer ved hjelp av CRISPR-Cas9 genredigeringssystem.
MERK: Denne DNA-sekvensen kompletterer tråder 1-10 mNeonGreen2 for å avgi fluorescens. Det genomiske sekvenskartet til YAP-mNeonGreen21-10/11 er vist i supplerende figur S1. Kartet inneholder de merkede genomiske, donor- og mNeonGreen2-sekvensene. - Kontroller CRISPR/Cas9-konstruert mNeonGreen2-uttrykket ved hjelp av et epifluorescensmikroskop (se materialtabellen). Fordi mNeonGreen2 er merket til YAP når cellene uttrykker YAP i sammenheng med sitt opprinnelige genregulatoriske nettverk, må du sjekke tilstedeværelsen av fluorescensintensiteten i både CRISPR / Cas9-konstruerte celler og sammenligne den med det i foreldrecellene (kontroll).
MERK: For å følge denne protokollen, bruk (1) en 488 nm laser (47,5 mW/mm2) for eksitasjon, (2) et 40x objektivt (numerisk blenderåpning (NA) = 0,95) og et utslippsfilter for båndpass (ET525/50 nm) for fluorescensmåling, og (3) ImageJ-programvare for å måle, kvantifisere og sammenligne fluorescensintensitetene. - Bekreft riktig integrering av mNeonGreen211 ved å trekke ut genomisk DNA fra CRISPR/Cas9-redigerte cellelinjer; utføre PCR ved hjelp av primere som flankerer den genomiske innsatsen og sekvenseringen for å bekrefte innsettingen ved riktig genomisk loci19,20.
- Slå ned mNeonGreen211 ved hjelp av CRISPR/Cas9 genredigeringssystem, og kontroller fluorescensintensitetsreduksjonen i celler ved hjelp av de samme mikroskopsystemene og bildeparameterne som er beskrevet i trinn 1.3.
MERK: Dette trinnet bekrefter riktig integrasjon av mNeonGreen211 ved sammenligning av fluorescensintensiteter. CRISPR/Cas9-konstruerte celler uten nedslag og foreldreceller brukes som kontroll. - Samle cellene med det taggede proteinet av interesse gjennom fluorescensaktivert cellesortering (FACS) sortering.
- For å forberede celler for FACS-sortering, prøv dem og resuspend dem i fosfatbufret saltvann (PBS).
- Samle celler med mNeonGreen2 fluorescens over bakgrunnsnivået til foreldrecellelinjene i to berikende runder med FACS-sortering.
MERK: Tidslinjen for å generere CRISPR / Cas9-redigerte cellelinjer beskrevet her er i rekkefølge 1-2 måneder. Alle cellelinjer gjøres offentlig tilgjengelige på forespørsel, slik at andre forskningslaboratorier kan reprodusere resultatene.
2. Vedlikehold av PC9- og B2B-celler
- Oppretthold begge cellelinjene i fuktede vevskulturinkubatorer med 5 % CO2 ved 37 °C.
- Kultur 106 endogent merket PC9 og Beas2B celler i 75 cm2 kolber med 12 ml RPMI-1640 medium supplert med 10% foster bovint serum og 100 μg / ml penicillin-streptomycin. Subkultur begge cellelinjene når cellesamlestyrken når ~80%.
- Test begge cellelinjene for mykoplasma hver tredje måned ved hjelp av et mykoplasmadeteksjonssett, etter alle produsentens anbefalte protokoller strengt.
- Oppbevar cellelinjene i en -80 °C fryser.
- Bruk cellelinjene som er <20 passeringer fra opptining for alle forsøkene.
3. Oppsett av maskinvare- og programvaremiljø
- Oppsett av maskinvaremiljø for eksperimentet
- Koble den konfokale kontrolleren og det inverterte mikroskopet til datamaskinen (se materialtabellen).
- Installer programvareplattformen (Materialliste).
- Slå på konfektkontrolleren og det inverterte mikroskopet. Deretter starter du Elements.
- Åpne kontrollpanelene til det konfiskerings-, laser- og inverterte mikroskopet i Elements. Kontroller deretter om de tre panelene fungerer som de skal ved å teste bevegelsen av det motoriserte stadiet, vekslingen av mikroskopmålene og den romlige skanningen av laserlinjene.
- Oppsett av programvaremiljø for AMFIP
- Installer IntelliJ, Java Development Kit 14.0, μManager versjon 2.0 gamma og Fiji ImageJ på datamaskinen.
- Åpne AMFIP-prosjektet lastet ned fra GitHub (lenke: https://github.com/njheadshotz/AMFIP) i IntelliJ.
- Klikk på Innstillinger | Kompilator | Merknadsprosessorer , og merk av for Aktiver merknadsbehandling.
- Klikk prosjektstruktur | Artefakter og opprette en JAR-fil. Sett utdatakatalogen til mmplugins under μManager-katalogen .
- Klikk prosjektstruktur | Biblioteker og legg til mmplugins og plugins under μManager-katalogen .
- Klikk på legg til konfigurasjon under rullegardinmenyen Kjør og opprett et program.
- Angi ij. ImageJ inn i hovedklassen.
- Angi -Xmx3000m -Dforce.annotation.index=true i VM-alternativet.
- Sett μManager-katalogen til Arbeidskatalogen.
- Klikk på Kjør for å aktivere μManager med AMFIP-plugin.
- Koble μManager til det inverterte mikroskopet.
- Legg til den adaptive driveren for det inverterte mikroskopet21 i μManager-katalogen .
- Åpne μManager. Klikk på Enheter | Veiviser for maskinvarekonfigurasjon og opprett en ny konfigurasjon.
- Legg til Ti2-driveren under Tilgjengelige enheter.
- Velg alle eksterne enheter, og lagre den nye konfigurasjonsfilen.
- Start μManager på nytt, og velg konfigurasjonsfilen i trinn 3.2.4 i Oppstartskonfigurasjon for Micro-Manager.
4. Gel forberedelse
- Behandle glassdekslene med 3-aminopropyltrymethoxysilane i 7 min ved romtemperatur (24 °C).
- Bruk deionisert (DI) vann til å skylle glassdekslene og tørke dekslene i 20 minutter ved 160 °C.
- Behandle glassdekslene med 0,5% glutaraldehyd i 30 min og skyll med DI-vann.
- Bland akrylamidoppløsning, N,N′-metylenbisacrylamid (bis) oppløsning og fluorescerende perler suspendert i 10 mM HEPES-bufret saltvann. Bruk 10% (w / v) ammoniumpersulfatoppløsning og N, N, N′, N′-tetrametyletylendiamin (TEMED) som initiativtakere til polymerisasjon. Endre prosentandelen av hver komponent for å oppnå ønsket mekanisk stivhet av polyakrylamid (PAA) hydrogeler etter etablerte protokoller beskrevet tidligere13,14.
MERK: I denne protokollen, 2 kPa gel: akrylamid = 12,5% og bis-akrylamid = 6,5%; 5 kPa gel: akrylamid = 12,5% og bis-akrylamid = 21,5%; og 40 kPa gel: akrylamid = 12,5% og bis-akrylamid = 31,5%. Alle % som er oppført, er volumprosent. - Etter 35 min, skrell glassdekslene fra den størkne PAA-hydrogelen og vask hydrogelen med 50 mM HEPES-bufret saltvann to ganger (5 min hver gang).
- Behandle hydrogeloverflaten med en hydrazinhydratoppløsning i 6 timer.
- Skyll hydrogelen med eddiksyre i 30 min. Fjern eddiksyren og skyll med PBS i 30 min.
- Oksider fibronektinoppløsningen (50 μg/ml i PBS) med natrium periodat i 30 min.
- Belegge hydrogeloverflaten med den oksiderte fibronektinoppløsningen og vent i 35 min.
- Tilsett PBS for å senke hydrogelen ned og oppbevar den ved 4 °C. Dekk alle Petri-rettene som inneholder hydrogelene med aluminiumsfolie for å unngå lyseksponering for hydrogelene.
5. Cellekultur
MERK: Utfør cellekultur ved hjelp av aseptisk teknikk.
- Lim glassdekslene med PAA-hydrogelene til petriskålen på 35 mm for å unngå fysisk drift av geler under cellesåings- og bildebehandlingsprosessene.
- Bruk steriliserte rene pinsett, løft dekslene (med PAA hydrogel på toppen) fra Petri-parabolen som inneholder de tilberedte gelene.
- Bruk en tørr klut til å rydde opp vanndråper på bunnen av glassdekslene.
- Bruk de steriliserte pinsettene til å holde glassdekslene.
- Plasser små dråper (1-5 μL) cyanoacrylatlim i de to diagonale hjørnene på undersiden.
- Bruk steriliserte våtservietter for å fjerne overflødig lim.
- Bruk de steriliserte pinsettene til å erstatte dekslene i petriskålen med glassbunn. Trykk litt på hjørnene på dekslene for å sikre at limdråpene kommer i full kontakt med overflaten på Petri-parabolen.
- Sett lokket tilbake på Petri-retten for å minimere fordampning av PBS i PAA-hydrogelene. Vent i 3 min for å la limet størkne og tørke i Petri-parabolen.
- Fyll Petri-retten med 4 ml PBS.
- Gjenta trinnene ovenfor 5.1.1-5.1.8 for de resterende PAA hydrogelprøvene i Petri-rettene som brukes til avbildning.
- Bruk 75% etanol for å sterilisere den ytre overflaten av alle Petri-rettene og overføre dem til vevskulturens biosikkerhetsskap. Slå på ultrafiolett lys i 5 min og steriliser prøvene.
- Frø cellene på den øverste overflaten av gelen.
- Slå av det ultrafiolette lyset. Ta ut kolben (som inneholder B2B/PC9 celler) fra 37 °C inkubatoren inn i biosikkerhetsskapet. Bruk en pipette koblet til en vakuumpumpe for å aspirere hele kulturmediet og tilsett 5 ml PBS for å vaske kolben.
- Tilsett 2 ml 0,05% trypsin for å løsne cellene fra bunnen av kolben.
- Plasser kolben i inkubatoren. Vent i 5 min.
- Overfør kolben til biosikkerhetsskapet. Tilsett 8 ml friskt kulturmedium i kolben og pipetten opp og ned flere ganger for å suspendere cellene homogent.
- Overfør alle 10 ml av celleopphenget til et 15 ml rør og sentrifuge ved 300 × g i 5 minutter.
- Kontroller cellepelleten nederst på røret. Vipp røret langsomt horisontalt og bruk den aspirerende pipetten til å fjerne hele kulturmediet fra røret uten å berøre cellepelleten. Deretter legger du til 8 ml fersk kulturmedium og pipette opp og ned flere ganger til alle cellene blandes homogent med mediet.
- Avsett 100 μL av celleopphenget (150 celler/μL) på geloverflaten og vent i 5 min. Deretter legger du sakte til 4 ml friskt kulturmedium til Petri-rettene; unngå å tilsette det friske mediet direkte på gelen.
- Plasser Petri-retten i inkubatoren på 37 °C. Vent med å la cellene feste seg til geloverflaten (B2B: 0,5-1 t; PC9: 4-5 timer).
6. Celleavbildning
MERK: AMFIP gjør det mulig for automatisk, flerkanals og langsiktig bildebehandling ved å koordinere med forskjellige maskinvare- og programvaresystemer: (1) AMFIP manipulerer μManager for automatisk å flytte det motoriserte stadiet av Ti2-E-mikroskopet til flere synsfelt (FOVer) og skaffe seg lysfeltbilder gjennom et monokrom kamera (Materialfortegnelse); og (2) AMFIP aktiverer flere makrofiler inne i Elements med et tilpasset Java-skript for å utføre automatiske operasjoner for konfokal z-stack-avbildning og veksling av forskjellige laserkanaler (405 nm og 488 nm).
- Angi miljøet for langtidsavbildning.
- Plasser miljøkammeret på det motoriserte stadiet av det inverterte mikroskopet. Sett CO2-strømningshastigheten til 160 ml/min og juster temperaturen på kammeret (topp: 44 °C; badekar: 42 °C, trinn: 40 °C). Deretter legger du til 40 ml renset vann i kammerets bad.
- Ta ut den glassbunnede Petri-retten med celler fra inkubatoren og legg den i miljøkammeret.
- Slå på konfektkontrolleren og det inverterte mikroskopet. Bytt lysbanen til høyre og følg cellene som festes ved hjelp av μManager. Hvis tilstrekkelige celler har festet seg til gelen, overfør Petri-parabolen tilbake til inkubatoren. Hvis ikke nok celler har festet seg til gelen, fortsett celleinkubasjonen i ytterligere 30 minutter for B2B og 60 min for PC9-celler.
- Klipp to små biter av tape og hold dem på kammeret rundt det sirkulære hullet. Påfør deretter litt lim på båndet (bare på området som Petri-parabolen vil dekke).
- Ta ut Petri-retten fra inkubatoren. Deretter plasserer du Petri-parabolen sakte i kammeret og la bunnen av parabolen komme i kontakt med limet.
- Trykk lokket på Petri-retten i 1 min for å la limet få full kontakt med Petri-parabolen og størkne. Skyv deretter Petri-parabolen forsiktig horisontalt for å bekrefte at Petri-parabolen er uflyttbar i kammeret.
- Lukk lokket på kammeret.
- Angi bildeanskaffelsesparametere for lysfeltavbildning.
- Åpne IntelliJ og angi en parameter T1 (f.eks. 120 s) i linje 93 i filen Elements_script.java. Kontroller at denne verdien er større enn kjøretiden for makroen i Elementer som brukes til konfokal avbildning av ett synsfelt (FOV). Klikk på Kjør-knappen for å starte AMFIP IntelliJ-prosjektet.
- Klikk på Live og Multi-D Acq. knappen på hovedgrensesnittet til μManager. Deretter bytter du lysbanen til det inverterte mikroskopet til høyre for lysfeltavbildning, bytter til 10x-målet og åpner det lysemitterende diodelyset (LED) (lyskilden for lysfeltavbildning; intensitet: 5%).
- Klikk på lysbanen, mikroskopmålet og LED-lampeknappen i Elements Ti2 Panel eller trykk manuelt på de tilsvarende knappene på mikroskopet.
- Juster XY-styrespaken og knotten på Z-planet for å finne riktig posisjon og gelens fokusplan på Petri-parabolen. Bruk et 10x mål for å finne de riktige FOVene til flere enkeltceller festet til gelen.
- Merk av for Flere posisjoner (XY) i vinduet Flerdimensjonal anskaffelse . Klikk på Rediger posisjonsliste... og se vinduet Sceneposisjonsliste som dukker opp. Deretter endrer du målet til 40x, øker intensiteten til LED-lyset til 15%, justerer det XY-motoriserte stadiet på nytt for å finne FOVene, og registrerer koordinatene ved å klikke på Mark-knappen i vinduet Sceneposisjonsliste .
- Ta opp 67 ønskede FOV-er. Klikk på Lagre som-knappen i vinduet Plasseringsliste for å registrere koordinatene. Skriv inn T1 (parameteren, for eksempel 120 s, definert i trinn 6.2.1) i tidsintervallet for bildeinnsamling til T1 i Tidspunkter-delen i multidimensjonal anskaffelsesvinduet .
- Angi bildeanskaffelse for 2D-YAP- og perlebilder.
- Åpne Elements, endre lysbanen til høyre for konfikal avbildning og slå av LED-lyset. Deretter klikker du på Fjern Interlock-knappen og slår på FITC-laserkanalen (for YAP-avbildning) ved å merke av i FITC-boksen .
- Juster skannehastigheten til 1 bilde per 2 s ved å klikke på 1/2-knappen og spinne knappen på Z-planet for å finne Z-posisjonen til de vedlagte cellene raskt. Registrer nedre og øvre grense for Z-stakken.
- Klikk Makro på det øverste båndet, velg Makroredigering på rullegardinmenyen Makro , og skriv inn verdiene fra trinn 6.3.2 i en makrofil.
- Slå på 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) laserkanal (for perleavbildning) ved å merke av i DAPI-boksen for å finne og registrere den fokuserte Z-posisjonen til perler. Gå til Makroredigering , og skriv inn de registrerte verdiene i makrofilen.
- Still inn oppgaven med å flytte det motoriserte stadiet ved hjelp av AMFIP.
- Gå til μManager og klikk på Plugins | Automatisering for å åpne det grafiske brukergrensesnittet (GUI) til AMFIP. Klikk på Legg til punkt eller Fjern punktknapper for å få nøyaktig antall VALGTE FOVer. Skriv inn de registrerte koordinatene til FOVer i koordinatpanelet.
- Definer den totale eksperimenttiden i tekstfeltet Total eksperimenteringstid .
- Klikk på Knappen Ekstra tidskonfigurasjon og definer tidsintervallet T2 (f.eks. 30 min) for å flytte det motoriserte stadiet til hver FOV.
- Maksimer vindusstørrelsen på Elements og dra GUI for AMFIP til høyre side av skjermen for å unngå at GUI forstyrrer den automatiske driften av markøren.
- Klikk på Enter-knappen . Når den første makroen er ferdig, klikker du Påhenting! -knappen i vinduet Flerdimensjonal anskaffelse .
- Løs opp cellene etter bildeanskaffelsen.
- Når du er ferdig med den langsiktige avbildningen, stopper du AMFIP-oppgaven ved å klikke på Pause-knappen i automatiseringstilleggsvinduet og Stopp-knappen i multidimensjonal anskaffelsesvinduet.
- Åpne Elements og angi Z-stack-bildebehandling ved å klikke på Topp- og Bunn-knappene i ND Acquisition-vinduet (angi at Z-området skal være større enn Z-serien til perlene). Bytt lysbanen til høyre og åpne LED-lyset (intensitet: 15%).
- Fjern forsiktig dekslene på kammeret og Petri-parabolen. I mellomtiden kan du overvåke lysfeltvisningen for enhver drift av FOV.
- Bruk en plastpipette for å ta opp 0,5 ml natriumdedylsulfat (SDS) oppløsning, hold forsiktig plastpipetten litt over kulturmediet i Petri-parabolen og tilsett 1-2 dråper SDS-løsningen i kulturmediet.
- Når cellene i lysfeltvisningen er oppløst, bytter du lysbanen til venstre, lukker LED-lyset, klikker på Fjern lås-knappen .
- Kjør Z-stack-bildet. Lagre bildestakken, og gi den et navn som Reference_N (N er sekvensnummeret for hver FOV).
- Klikk på knappen Flere posisjoner (XY) i vinduet Flerdimensjonal anskaffelse . Velg deretter neste FOV og klikk på Gå til-knappen for å flytte det motoriserte stadiet til den andre FOV.
- Gjenta trinn 6.5.7 for hver FOV.
7. Måling av YAP N / C-forholdet
- Utfør bildeanalyse for å måle YAP N/C-forholdet ved hjelp av Fiji ImageJ-programvaren (figur 4).
- Åpne Fiji ImageJ. Importer bildestakken med lyse felt for alle FOVer som er anskaffet av μManager.
- Åpne rullegardinmenyen Bilde , og velg Stabler | Verktøy | Skjær Keeper. Deretter eksporterer du lysfeltbildestakken for hver FOV.
- Importer fluorescensbildet til FITC-kanalen og overlegg det med lysfeltbildet for samme FOV. For å gjøre dette, velg det fluorescerende bildet og velg Overlegg | Legg til bilde... (Bilde som skal legges til: bildet med lyse felt; X- og Y-plassering avhenger av størrelsen på lysfeltbildet som er anskaffet av forskjellige kameraer. Tetthet: 60-70).
- Åpne rullegardinmenyen Analyser og velg Angi mål.... Velg område; Integrert tetthet og middelverdi grå verdi.
- Klikk på Freehand-valgknappen på hovedgrensesnittet til ImageJ.
- Tegn omrisset av cellekroppen og kjernen ønsket. Deretter klikker du på Analyser | Mål eller trykk på M-knappen på tastaturet.
- Vær oppmerksom på resultatvinduet som dukker opp. Legg merke til at verdiene under Område-kolonnen representerer området i det valgte området (μm2), og verdiene under IntDen - kolonnen representerer fluorescensintensiteten for det valgte området.
- Beregn YAP I/T-forholdet ved hjelp av følgende formler (1), (2) og (3):
(1)
(2)
(3)
Der Inuc og Icel representerer den relative intensiteten av kjernen og cellekroppen, og Anuc og Acel representerer området av kjernen og cellekroppen. R er YAP I/T-forholdet. - Lagre konturene for fremtidig beregning av dipol trekkraft og peri-celle / peri-kjernefysisk forskyvning. For å gjøre dette, klikk på Analyser | Verktøy | Lagre XY-koordinater...
(1)
(2)
(3)8. Måling av trekkraftfelt
- Påfør trekkraft kraft mikroskopi gjennom Fiji ImageJ plugins22,23.
- Åpne Fiji ImageJ.
- Importer bildestakken med perler for en FOV.
- Velg stykket som viser den klareste fordelingen av perler og trekk den ut ved å klikke på Bilder | Stabler | Verktøy | Skjær Keeper.
- Importer bildestakken for referansen for samme FOV.
- Velg stykket med samme lysstyrke og kontrast som stykket i trinn 8.1.3. Deretter trekker du det ut som et referansebilde.
- Velg bilder | Stabler | Verktøy | Sett sammen for å kombinere de to sektorene fra trinn 8.1.3 og 8.1.5 (velg referansebildet som første stykke).
- Velg plugin-moduler | Samsvarende | for maler Justere stykker i stakk - eller plugin-| Bildestabilisator for å justere de to stykkene.
- Velg bilde | Stabler | Stable til bilder. Deretter velger du Bilde | Oppslagstabeller | Grønn hvis du vil konvertere fargen på det første stykket til grønt og velge Bilde | Oppslagstabeller | Rød for å konvertere fargen på det andre stykket til rødt.
- Velg bilde | Farge | Slå sammen kanaler for å slå sammen de to bildene.
- Overlapp bildet med lysfeltbildet fra samme FOV, og bruk dette overlappende bildet til å observere perleforskyvning.
- Velg plugins | PIV-| iterativ PIV (grunnleggende).... Sett størrelsen på forhørsvinduet til 128/256; 64/128; 32/64 (minst fire perler per forhørsvindu). Sett korrelasjonsterskelen til 0,6.
- Klikk på OK. Når beregningen er fullført, lagrer du tekstfilen med rådataene for perleforskyvning i en vanlig mappe opprettet av brukeren.
- Velg plugins | FTTC | FTTC og velg tekstfilen i trinn 8.1.9.
- Skriv inn pikselstørrelsen (μm), Youngs modulus av gelen (Pascal), og plottbredden og høyden basert på eksperimentet og bildet av perler.
- Klikk OK for å lagre tekstfilen som inneholder rådata for trekkraft, automatisk i samme katalog som tekstfilen i trinn 8.1.12.
- Bruk grafer programvare (Tabell over materialer) til å plotte trekkraft feltet med samme skala for flere celler (Figur 1B, C og Figur 2B, C).
- Sett inn tekstfilen som inneholder rådata for trekkraft, i et regneark.
- Opprett et nytt ark, skriv inn Y-koordinatene for trekkraft i den første raden (ordne fra høye verdier til lave verdier) og X-koordinatene i den første kolonnen (ordne fra lav til høy).
- Skriv inn verdien av trekkraft til hver koordinat fra rådataene.
- Lagre arket i trinn 8.2.2 som en *.csv-fil.
- Åpne Opprinnelse.
- Klikk på Fil | Åpne og importer filen *.csv i trinn 8.2.4. Merk alle cellene og klikk på Plott | Kontur| Kontur - fargefyll.
- I vinduet Plotting: plotvm velger du Y på tvers av kolonnene for automatisk å sette Y-verdiene til den første raden og X-verdiene til den første kolonnen. Deretter gir du tittelen et navn og klikker på OK.
- Dobbeltklikk på varmekartet i grafvinduet som dukker opp.
- Klikk på Nivåer i vinduet Fargekart/Konturer . Deretter endrer du skalanivået til et rimelig område (0300 i denne analysen) og klikker på OK.
- Klikk linjer, fjern merket for Vis bare på hovednivåer, og merk av for Skjul alle. Deretter klikker du på OK.
- Høyreklikk på grafen og velg Eksporter grafer.... Lagre bildet i den angitte banen.
- Bruk MATLAB til å beregne dipolcelle trekkraft.
- Lagre referansedatatekstfilen (fra trinn 8.1.12) og roi-koordinatfilen (cellegrenseområdet) (fra trinn 7.1.9) i samme mappe som er definert i trinn 8.1.12. Overfør alle MATLAB-filene som er på plass i AMFIP-pakken til denne mappen.
- Åpne MATLAB. Åpne mappen som er definert i trinn 8.1.12, og åpne dipole traction-beregningsfunksjonsfilen absdipole.m overført til denne mappen i trinn 8.3.1.
- Les de to tekst-/csv-filene i trinn 8.3.1 inn i MATLAB-arbeidsområdet og tilordne en matrise til to variabler (f.eks. trekkraft og roi).
- Kjør funksjonen absdiple (trekkraft, roi).
MERK: Den første kolonnen i utgangen er dipolens trekkraft i nN (nano-Newton). Den andre kolonnen av utgangen er vinkelen på dipolens trekkraft med hensyn til den horisontale aksen.
Representative Results
Distinkt YAP-distribusjon og dynamikk i CRISPR/Cas9-konstruert PC9 kreft og B2B normale celler under cellespredning
Representative fluorescensbilder av YAP-distribusjon i enkeltceller av B2B og PC9 på 2, 5, 40 kPa PAA geler og glassdeksler er vist i figur 1A og figur 2A. Den kjernefysiske lokaliseringen av YAP i B2B-celler økte med økende substratstivhet (figur 1A), mens PC9-celler viste lignende YAP-konsentrasjon i kjernen og cytoplasma på substrater av varierende stivhet (figur 2A). Representative fluorescensbilder av YAP-fordeling i enkeltstående, spredning av B2B- og PC9-celler på 5 kPa hydrogelsubstratet (fra 0.h til 10. h etter cellene festet til substratene) er vist i henholdsvis figur 1B og figur 2B. B2B-cellen økte monotont spredningsområdet over tid sammen med en reduksjon i YAP N/C-forholdet (figur 1B), mens PC9-cellen opprettholdt et forholdsvis uendret cellespredningsområde, orientering og YAP I/C-forhold gjennom hele spredningsprosessen på 10 timer (figur 2B). I løpet av den 10 h varigheten av tidlig spredning deformerte den representative B2B-cellen vanligvis substratoverflaten og påførte tidsutviklingscellegrep over hele celleområdet (figur 1C og figur 1D).
I kontrast utviklet den representative PC9-cellen bare forskyvning og trekkraft i de to endene av cellekroppen, og trekkraften ble redusert etter 7,5 timer (figur 2C og figur 2D). Flere tidsforløpbilder og trekkraftmålinger av B2B- og PC9-celler på det tidlige spredningsstadiet finnes i Supplerende figur S2 og supplerende figur S3. Andre moduser for PC9-celledynamikk ble også observert (figur 6). Parallelt med disse forskjellige spredningsegenskapene viste B2B- og PC9-cellene tydelig YAP-distribusjon og dynamikk (figur 3). På en 5 kPa gel ble YAP i B2B-celler konsentrert i kjernen i 0. PC9-celler viste imidlertid en mer homogen fordeling av YAP i kjernen og cytoplasma gjennom hele 10-timers spredningsprosessen. For å kvantitativt analysere YAP-aktiviteten og translokasjonen i B2B- og PC9-celler ble YAP I/C-forholdet beregnet ved hjelp av algoritmen beskrevet i figur 4.
For å undersøke den distinkte YAP-dynamikken ytterligere, ble temporale endringer i YAP N/C-forholdet, celle-/kjerneområdet og trekkraften til flere enkelt B2B-celler (n = 10) og PC9-celler (n = 5) sammenlignet (figur 5). Det ble funnet at det gjennomsnittlige YAP N/C-forholdet mellom B2B-celler gikk ned fra 2,54 ± 0,22 til 1,79 ± 0,21 (n = 10; p = 0,0022**; Figur 5A), mens det gjennomsnittlige YAP N/C-forholdet mellom PC9-celler endret seg fra 1,92 ± 0,26 til 1,57 ± 0,07 (n = 5; p = 0,187 (ikke signifikant (ns)); Figur 5A). Gjennomsnittlig dipol trekkraft av B2B celler endret fra 256.17 ± 123.69 nN til 287.44 ± 99.79 nN (p = 0.7593 (ns); Figur 5B). Den gjennomsnittlige dipol trekkraft av PC9 celler endret fra 141.19 ± 33.62 nN til 168.52 ± 73.01 nN (p = 0.7137 (ns); Figur 5B). Gjennomsnittlig cellespredningsområde for B2B-celler økte fra 613,89 ± 102,43 μm2 til 942,51 ± 226,71 μm2 (p = 0,0512 (ns); Figur 5C).
Gjennomsnittlig cellespredningsområde for PC9-celler endret seg fra 495,78 ± 97,04 μm2 til 563,95 ± 89,92 μm2 (p = 0,5804 (ns); Figur 5C). Det gjennomsnittlige kjernespredningsområdet for B2B-celler økte fra 181,55 ± 36,18 μm2 til 239,38 ± 43,12 μm2 (p = 0,1217 (ns); Figur 5D) og det gjennomsnittlige kjernespredningsområdet til PC9-celler endret seg fra 133,31 ± 30,05 μm2 til 151,93 ± 22,49 μm2 (p = 0,5944 (ns); Figur 5D). Disse resultatene antyder at (1) B2B-celler viser et konstituativt substrat-stivhetsavhengig YAP N/C-forhold; (2) trekkraften til B2B-celler er høyere enn for PC9-celler; og (3) i motsetning til B2B-celler, viser PC9-celler en begrenset økning i celleområdet og endringer i YAP N / C-forholdet under spredningsprosessen på 10 timer.
Korrelasjon mellom YAP-distribusjon og dynamikk til overføringstilstandene til B2B-celler
YAP I/C-forhold og dipol-trekkraft for alle B2B-celler (n=10) og PC9-celler (n=5) som en funksjon av cellespredningsområde og kjernespredningsområde ble sammenlignet. YAP N/C-forholdet og dipol-trekkraften til PC9-celler korrelerte ikke klart med de små celle- og kjernespredningsområdeområdene (figur 6). I motsetning til dette så det ut til at YAP N/C-forholdet og dipol-trekkraften til B2B-cellene fulgte to distinkte trender (figur 6A og figur 6C), noe som tyder på at det kan være to grupper av B2B-celler som eksisterer sammen i dette eksperimentet. I den første gruppen øker YAP N/C-forholdet og dipol-trekkraften sammen med forstørrelsen av cellespredningsområdet og når maksimen ved ~ 1000 μm2 (figur 6C og figur 6D, angitt av den gule stiplede linjen). I den andre gruppen øker YAP N/C-forholdet og dipol-trekkraften med en lavere hastighet med forstørrelsen av celleoppslagsområdet og opprettholder nesten konstante verdier når celleoppslagsområdet fortsetter å øke (figur 6C,D, angitt av den grønne stiplede linjen).
PC9 kreftceller genererer trekkraft i peri-nukleære regioner
Enkelt, spre PC9 celler fortrenge substratene på peri-kjernefysiske regioner, fra den sjette h av kultur (Figur 7C). For å visualisere peri-kjernefysisk forskyvning forårsaket av celle trekkraft, overlappet vi bildene av fluorescerende perler tatt før (rød) og etter (grønn) fjerning av cellene fra substratene (se protokollseksjonen for detaljer). Perlene som ikke har forskyvning vil se gule ut i de overlappende bildene, det vil si tillegg av røde og grønne farger. Til sammenligning vil perlene som er forskjøvet fra hvileposisjonene på grunn av cellegrep, vise separerte grønne og røde farger.
Spesielt i både PC9 (figur 7C, D) og B2B (figur 7E) celler ble perleforskyvning observert i cytoplasma og i kjernen, i tillegg til de ved cellegrensen. For å markere peri-kjernefysisk forskyvning brukes Boussinesq-ligningen fra lineær elastisitetsteori til å forutsi 2D-teoretisk forskyvning generert av en hypotetisk dipolkraft ved cellegrensen (svart stiplet linje i figur 7B)24. Sammenligning av denne teoretiske kurven med den virkelige substratforskyvningen målt langs samme akse (hvit stiplet linje i figur 7D), ble de virkelige forskyvningene i kjernen funnet å være 1,5-8 ganger større enn den teoretiske verdien (figur 7B), noe som indikerer eksistensen av trekkraft i peri-nukleære regioner.
Figur 1: Endringer i YAP-uttrykk/-fordeling, substratforskyvningsfelt og trekkraftfelt i en B2B-normalcelle på underlag av varierende stivhet og under tidlig spredning. (A) YAP-uttrykket for en B2B-cellefrø på 2, 5 og 40 kPa PAA geler og et glassdeksler etter 60 timer fra første celle-substrat vedlegg. (B) B2B-cellen ble sådd på en 5 kPa PAA gel og avbildet over 10 timer etter første celle-substrat vedlegg. YAP-uttrykk representeres av grønn fluorescensintensitet. Merk: YAP-intensiteten inne i kjernen reduseres gradvis, men forblir høyere enn i cytoplasma over tid. Fargelinjene angir nivåene for YAP-uttrykk (grønn = høyt uttrykk, svart = lavt uttrykk) i (A) og (B). (C) Substratdeformasjon (overlappet med lysfeltbildet) ved celleplassering representeres av forskyvningsfeltet på hvert tidspunkt. Forskyvningsretning og -størrelse vises med henholdsvis pilretningen og -fargen. Forskyvningen blir større i enden av B2B-cellekroppen etter hvert som celleoppslagsområdet øker. Fargelinjen indikerer forskyvningsstørrelse (crimson = høy størrelse; svart = lav størrelse). (D) Trekkraft-feltet (overlappet med lysfeltbildet) beregnet fra forskyvningsfeltet. Trekkraften er konsentrert på grensen til B2B-cellene. De hvite og gule stiplede konturene avgrenser grensene for henholdsvis cellen og kjernen. Fargelinjen indikerer trekkraft størrelsesorden (crimson = høy størrelse; svart = lav størrelse). Skalastenger = 20 μm. Forkortelser: YAP = Ja-assosiert protein; PAA = polyakrylamid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Endringer i YAP-uttrykk/-distribusjon, substratforskyvningsfelt og trekkraftfelt i en PC9-kreftcelle på substrater av varierende stivhet og under tidlig spredning. (A) YAP-uttrykket for et PC9-cellefrø på 2, 5 og 40 kPa PAA geler og glassdekslerlip etter 65 timer fra første celle-substrat vedlegg. (B) PC9-cellen ble sådd på en 5 kPa PAA gel og avbildet over 10 timer etter første celle-substrat vedlegg. YAP-uttrykk representeres av grønn fluorescensintensitet. Merk: YAP-intensitetsplatåene fra 1,5 h og utover. Fargelinjene angir nivåene av YAP-uttrykk (grønn = høyt uttrykk, svart = lavt uttrykk) i (A) og (B). (C) Substratdeformasjon (overlappet med lysfeltbildet) ved celleplassering representeres av fluorescerende perleforskyvningsfelt på hvert tidspunkt. Forskyvningsretning og -størrelse vises med henholdsvis pilretningen og -fargen. Forskyvningsfeltet forårsaket av PC9-celler er mindre enn det som forårsakes av B2B-cellen. Gjennom 10 h spredningsprosessen forblir området med PC9-celler nesten konstant. Fargelinjen indikerer forskyvningsstørrelse (crimson = høy størrelse; svart = lav størrelse). (D) Trekkraftfelt (overlappet med lysfeltbildet) beregnet fra forskyvningsfelt. Trekkraften generert av denne representative PC9-cellen reduseres gradvis fra 6. De hvite og gule stiplede konturene avgrenser grensene for henholdsvis cellen og kjernen. Fargelinjen indikerer trekkraft størrelsesorden (crimson = høy størrelse; svart = lav størrelse). Skalastenger = 20 μm. Forkortelser: YAP = Ja-assosiert protein; PAA = polyakrylamid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: YAP-distribusjon i B2B- og PC9-celler i det tidlige spredningsstadiet. (A) YAP-intensiteten til B2B-cellen måles langs den tildelte røde aksen ved 0. - og 10.h . (B) Ved 0.h. viser YAP-intensitet dramatiske konsentrasjonsforskjeller mellom kjernen og cytoplasma. I tiende time blir YAP-intensiteten mer homogen over hele cellekroppen. (C) YAP-intensiteten til PC9-cellen måles langs den tildelte blå aksen ved 0. og 10. h. (D) I 0. h vises YAP-intensiteten i kjernen høyere enn i cytoplasma, selv om forskjellen ikke er så bemerkelsesverdig som i B2B-celler. I 10. h vises YAP-intensiteten i kjernen fortsatt litt høyere enn i cytoplasma, med en variasjonstrend som ligner på den i 0. Skalastenger = 20 μm (A, C). Forkortelse: YAP = Ja-assosiert protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Måle YAP I/T-forholdet. (1) Bruk Fiji ImageJ for å tegne omrisset av kjernen og måle det 2D-projiserte området Anuc. (2) Mål fluorescensintensiteten inne i kjernen Inuc. (3) Tegn omrisset av cellekroppen og mål det projiserte området Acel. (4) Mål fluorescensintensiteten inne i celle Icel. (5) Beregn YAP-kjernens tetthet Dnuc, YAP cytoplasmtetthet Dcyto, og deres forhold R: Dnuc = Inuc / Anuc; Dcyto=(Icel-Inuc)/(Acel-Anuc); R=Dnuc/Dcyto. Fargelinjen angir nivåene av YAP-uttrykk (grønn = høyt uttrykk; svart = lavt uttrykk). Skalastang = 20 μm. Forkortelser: YAP = Ja-assosiert protein; N = kjerne; C = cytoplasma. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Distinkt YAP-uttrykk, celle-/kjernemorfologi og cellulær trekkraft i PC9-kreft og B2B normale celler under cellespredning. (A) YAP I/C-forholdet endres i løpet av de første 10 t med spredning av enkeltceller. Gjennomsnittlig YAP I/C-forhold mellom B2B-celler (rød kolonne; n = 10) endret fra 2,54 ± 0,22 til 1,79 ± 0,21 (n = 10; p = 0,0022**) mens gjennomsnittlig YAP I/C-forhold mellom PC9-celler (blå kolonne; n = 5) endres fra 1,92 ± 0,26 til 1,57 ± 0,07 (p = 0,187 (ns)). (B) Gjennomsnittlig dipol trekkraft som en funksjon av tid. Gjennomsnittlig dipol trekkraft av B2B celler endret fra 256.17 ± 123.69 nN til 287.44 ± 99.79 nN (p = 0.7593 (ns)) og den gjennomsnittlige dipol-trekkraften til PC9-celler endret seg fra 141,19 ± 33,62 nN til 168,52 ± 73,01 nN (p = 0,7137 (ns)). (C) Det gjennomsnittlige celleområdet som en tidsfunksjon. Gjennomsnittlig cellespredningsområde for B2B-celler økte fra 613,89 ± 102,43 μm2 til 942,51 ± 226,71 μm2 (p = 0,0512 (ns)) og det gjennomsnittlige cellespredningsområdet for PC9-celler endret seg fra 495,78 ± 97,04 μm2 til 563,95 ± 89,92 μm2 (p = 0,5804 (ns)). (D) Det gjennomsnittlige kjerneområdet som tidsfunksjon. Det gjennomsnittlige kjernespredningsområdet for B2B-celler økte fra 181,55 ± 36,18 μm2 til 239,38 ± 43,12 μm2 (p = 0,1217 (ns)) og Det gjennomsnittlige kjernespredningsområdet for PC9-celler endret seg fra 133,31 ± 30,05 μm2 til 151,93 ± 22,49 μm2 (p = 0,5944 (ns)). Forkortelser: YAP = Ja-assosiert protein; N = kjerne; C = cytoplasma; ns = ikke signifikant. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: YAP I/C-forhold og dipol trekkraft som en funksjon av spredningsområde for celle og kjerne. YAP N/C-forholdet og dipol-trekkraften til B2B-celler (n=10) og PC9-celler (n=5) beregnes fra 6. (A) YAP I/T-forhold som en funksjon av celleoppslagsområdet. YAP N/C-forholdet mellom B2B-celler varierer fra 1,16 til 2,53, mens YAP N/C-forholdet mellom PC9-celler varierer fra 1,27 til 1,88. Celleoppslagsområdet for B2B-celler varierer fra 391,94 μm2 til 1986,40 μm2. Celleoppslagsområdet til PC9-celler varierer fra 284,46 μm2 til 830,12 μm2. (B) YAP N/C-forhold som funksjon av kjernespredningsområde. Kjernespredningsområdet til B2B-celler varierer fra 107,09 μm2 til 514,28 μm2. Kjernespredningsområdet til PC9-celler varierer fra 58,03 μm2 til 259,65 μm2. Dipol trekkraft av B2B celler som en funksjon av celle spredning området (C) og kjernen spre området (D). Spredning og ikke-migrerende B2B-celler viser høyere trekkraft (fra 47,50 nN til 1051,48 nN) med nedre celle- og kjerneområde. Under spredning og migrering viser B2B-celler lavere trekkraft (fra 105,80 nN til 310,28 nN) med større celle- og kjerneområde. Forkortelser: YAP = Ja-assosiert protein; N = kjerne; C = cytoplasma. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Peri-kjernefysisk forskyvning i normale B2B- og cancer PC9-celler. (A) Skjematisk sidevisningsdiagram over peri-kjernefysisk og peri-celleforskyvning målt fra peradforskyvning i substratet. (B) Substratforskyvning under PC9-cellen måles langs celleaksen (hvit stiplet linje i 7D). Den teoretiske forskyvningen generert av dipolkraften ved cellegrensen vises av Boussinesq-ligningen (svart stiplet kurve). (C) og (D) Overlappede fluorescerende perlebilder med (røde) og uten (grønne) celler for PC9-cellene i sjette t etter tilkobling (toppvisning). Gule (nøyaktig overlapping av røde og grønne farger) perler indikerer ingen forskyvning. De separerte grønne og røde perlene (spiss av gule piler) representerer peri-kjernefysisk forskyvning. Gule piler indikerer disse kontraherte peri-kjernene som ligger i periferien av kjernen. (E) Peri-kjernefysisk forskyvning generert av B2B-cellen i 1,5 timer etter celle-substratfeste. Skalastenger = 10 μm (C–E). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur S1: Det genomiske sekvenskartet til YAP-mNeonGreen21-10/11. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S2: Endringer i YAP-uttrykk/-distribusjon, substratforskyvningsfelt og trekkraftfelt for B2B-normalceller under tidlig spredning. (A, D, G, J, M) B2B-cellen ble sådd på en 5 kPa PAA gel og avbildet over 10 timer etter det første celle-substratet. YAP-uttrykk representeres av grønn fluorescensintensitet. Merk: YAP-intensiteten inne i kjernen reduseres gradvis, men forblir høyere enn i cytoplasma over tid. Fargelinjene angir nivåene av YAP-uttrykk (grønn = høyt uttrykk, svart = lavt uttrykk) i (A, D, G, J, M). (B, E, H, K, N) Substratdeformasjon (overlappet med lysfeltbildet) ved celleplassering representeres av forskyvningsfeltet på hvert tidspunkt. Forskyvningsretning og -størrelse vises med henholdsvis pilretningen og -fargen. Forskyvningen blir større i periferien av B2B-cellekroppen etter hvert som celleoppslagsområdet øker. Fargestolpene angir forskyvningsstørrelse (crimson = høy størrelse; svart = lav størrelse) i (B, E, H, K, N). (C, F, JEG, L, O) Trekkraftfelt (overlappet med lysfeltbildet) beregnet fra forskyvningsfeltet ved hjelp av Traction Force Microscopy. Trekkraften er konsentrert i periferien av B2B-celler. Fargestolpene indikerer trekkraft størrelsesorden (crimson = høy størrelse; svart = lav størrelse) i (C, F, I, L, O). Skalastenger = 20 μm. Forkortelser: YAP = Ja-assosiert protein; PAA = polyakrylamid. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S3: Endringer i YAP-uttrykk/-distribusjon, substratforskyvningsfelt og trekkraftfelt for PC9-kreftceller under tidlig spredning. (A, D, G, J) PC9-cellen ble sådd på en 5 kPa PAA gel og avbildet over 10 timer etter det første celle-substratet. YAP-uttrykk representeres av grønn fluorescensintensitet. Merk: YAP-intensiteten inne i kjernen reduseres gradvis, men forblir lik eller litt lavere enn den i cytoplasma over tid. Fargelinjene angir nivåene av YAP-uttrykk (grønn = høyt uttrykk, svart = lavt uttrykk) i (A, D, G, J). (B, E, H, K) Substratdeformasjon (overlappet med lysfeltbildet) ved celleplassering representeres av forskyvningsfeltet på hvert tidspunkt. Forskyvningsretning og -størrelse vises med henholdsvis pilretningen og -fargen. Forskyvningen blir større i periferien av PC9-cellekroppen etter hvert som celleoppslagsområdet øker. Fargestolpene angir forskyvningsstørrelse (crimson = høy størrelse; svart = lav størrelse) i (B, E, H, K). (C, F, JEG, L) Trekkraftfelt (overlappet med lysfeltbildet) beregnet fra forskyvningsfeltet. Trekkraften er konsentrert i periferien av PC9-celler. Fargelinjene angir trekkraft størrelsesorden (crimson = høy størrelse; svart = lav størrelse) i (C, F, I, L). Skalastenger = 20 μm. Forkortelser: YAP = Ja-assosiert protein; PAA = polyakrylamid. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Avbildningsprosessen (trinn 6.3) er avgjørende for å sikre at fluorescensbildene er av tilstrekkelig god kvalitet til å gi gyldige kvantifiseringsresultater. Z-stack-bildene av fluorescerende protein eller perler bør ha et z-område som er stort nok til å inkludere bilder i fokus for alle Z-posisjonene som prøven spenner over. Et annet kritisk trinn er å samle referansebildene av fluorescerende perler etter oppløsning av cellene (trinn 6.5). Fordi referansebildene må tas i samme posisjon i trinn 6.3, bør ingen relativ forskyvning induseres mellom Petri-parabolen, miljøkammeret og mikroskopet. Etterforskerne som utfører oppløsningstrinnet må være forsiktige med å fjerne lokket på Petri-parabolen og sørge for at den påførte mekaniske perturbasjonen ikke er stor nok til å endre plasseringen av parabolen i miljøkammeret.
Løsningene finner du nedenfor for å løse noen feil som kan oppstå under eksperimenter. Hvis ingen makro er aktivert etter at du har klikket Enter i trinn 6.4, er det mest sannsynlig fordi det venstre nederste området på skjermen er opptatt av et ikke-elementvindu. I slike tilfeller må venstre bunnområde av vinduet fjernes slik at makroer kan aktiveres i Elements. En annen vanlig feil er at lysfeltbildene ser svarte ut. Dette problemet skyldes et utilstrekkelig tidsintervall mellom oppkjøp av fluorescens og lysfeltbilder. Små forsinkelser i antall fluorescensavbildninger kan akkumuleres over tid og forårsake betydelige forsinkelser og forstyrre lysfeltavbildningen. En løsning er å justere varigheten av en bildesyklus for alle posisjonene slik at den er mindre enn (ikke lik) tidsintervallet mellom starten av påfølgende bevegelser. Denne operasjonen oppdaterer tidstellingen og eliminerer den kumulative feilen i begynnelsen av hver bildesyklus.
Denne alloptiske forhørsteknologien støtter (1) et bredt spekter av maskinvare/programvare, inkludert, men ikke begrenset til Nikon, (2) forskjellige typer validerte hydrogelsystemer, inkludert gelatin, PEG, Matrigel og kollagen I geler, og (3) programmerbar tilpasning basert på ulike behov fra forskere. Imidlertid, hvis noen av kontrollfunksjonene på nederste nivå ikke er tilgjengelige fra et kommersielt mikroskop, blir tilpasning av funksjonene ved hjelp av AMFIP utfordrende. En annen begrensning ved denne teknikken er den romlige driften av prøven i både XY- og focus (Z)-planene. Selv om denne begrensningen kan overvinnes under etterbehandling av bildene, er det viktig å forbedre autofokusfunksjonen for å korrigere sanntidsdriften til prøvene. Denne forbedringen vil øke gjennomstrømningen til bildebehandlingsprosessen og redusere den potensielle feilen forårsaket av driften under eksperimenter.
Mechanotransducers, som YAP, kan tjene som nye terapeutiske mål for utvikling av lovende kreftbehandlinger25,26,27. Nye data tyder på at YAP fremmer spredning og invasjon av kreftceller. Mekanikkindusert YAP-translokasjon fra cytoplasma til kjernen aktiverer transkripsjon av gener relatert til cellemigrasjon, spredning, invasjon og apoptose, noe som fører til avvikende celleatferd28,29,30,31. Dette arbeidet hadde som mål å utforske den potensielle korrelasjonen mellom YAP N/ C-forholdet og cellemekanikken i to typiske humane lungekreft og normale cellelinjer. I løpet av 10 h cellespredningsperioden viser PC9-celler lignende YAP-konsentrasjoner i kjernen og cytoplasma (figur 3D og figur 5A). B2B-celler viser en høyere YAP-konsentrasjon i kjernen enn i cytoplasma (figur 3C og figur 5A). Dette forholdet som ble funnet i det tidlige spredningsstadiet er forskjellig fra de fleste publiserte funn som sammenligner YAP-konsentrasjon i kjernen mellom normale og kreftceller. Selv om de ikke nødvendigvis er i det tidlige spredningsstadiet, viser de fleste publiserte funn at YAP er mer konsentrert i kjernen av kreftceller enn i kjernen av normale celler27,28. Bare en studie om brystkreft rapporterte et unntak32 som viser at YAP er mer konsentrert i cytoplasma, som er enig med våre nåværende observasjoner gjort i lungekreft PC9-celler. Så vidt forfatterne vet, er dette arbeidet det første som viser et lavere YAP N / C-forhold i en menneskelig lungekreftcellelinje. Forfatterne hypoteser at årsaken til et stabilt YAP N / C-forhold i PC9-celler kan skyldes den lave variasjonen i celle / kjernespredningsområdet og trekkraft i PC9-celler i det tidlige spredningsstadiet. Disseksjonen av de understøttende molekylære mekanismene for lavt YAP N/C-forhold i PC9- og B2B-celler pågår.
I løpet av de første 10 h med spredning viser disse to cellelinjene en tydelig sammenheng mellom YAP I/C-forholdet, cellegrep og oppslagsområde (figur 5). For B2B-celler er et høyere YAP N/C-forhold korrelert med et høyere celle- og kjerneoppslagsområde (figur 6A,B), som samsvarer med de rapporterte dataene i andre normale celler33. Interessant, selv om den utviklingsmessige trenden i dette forholdet generelt finnes i alle B2B-celler som er registrert, finnes to forskjellige grader (høye og lave) av dette forholdet. B2B-celler som sprer seg og migrerer samtidig, viser lavere trekkraft og høyere celle- og kjernespredningsområde med høyere YAP N/C-forhold (2,05 ± 0,32). For B2B-celler som sprer seg og forblir på samme sted, viser de høyere trekkraft og nedre celle- og kjernespredningsområde med et lavere YAP N /C-forhold (1,74 ± 0,21). Disse to relasjonsgradene er demonstrert i de todelte spredte datagruppene (figur 6C, D). Som rapportert i litteraturen har stasjonære normale celler, som embryonale fibroblast NIH 3T3-celler, høyere trekkraft enn trekkceller34. Dataene som rapporteres i dette dokumentet antyder at sprednings- og ikke-migrerende B2B-celler brukte høyere trekkraft enn å spre og migrere B2B-celler, noe som sannsynligvis tyder på at høy trekkraft er nødvendig for ikke-migrerende celler for å stabilisere seg på substratet.
I tillegg viser disse dataene at stasjonære normale B2B-celler genererer en høyere peri-kjernefysisk kraft, mens tidligere forskning utført av andre forskere rapporterte bare høyere celle trekkraft generert i periferien av stasjonære celler34,35,36,37. Forfatterne tror at forskjellen i den iboende tendensen til migrasjon i forsøkene kan føre til disse motstridende resultatene. I de publiserte eksperimentene hadde firkantet mikropatterning blitt brukt til å begrense enkeltceller fra å spre og hemme migrasjon; om cellene hadde en tendens til å migrere er ukjent. Ettersom trekkceller ofte viser høy trekkraft i periferien av cellene38, er det sannsynlig at celler med tendens til å migrere fortsatt vil opprettholde høy periferi trekkraft selv om overføringen er begrenset. I denne nåværende studien er de stasjonære cellene ikke begrenset av noen mikropattern, men migrerer ikke, noe som indikerer at cellene har en tendens til å opprettholde sin ikke-migrerende tilstand. En annen mulighet er at celleformen definert av mikropatternen kan påvirke fordelingen av fokale vedheft og trekkraftkrefter39. Resultatene i denne studien ble generert uten begrenset mikropatterning og representerer kraftfordelingen av stasjonære celler i sin opprinnelige form.
Så vidt forfatterne vet, rapporterte bare en publikasjon til dags dato spesifikt funn av peri-nukleære krefter i normale celler (mus embryonale fibroblaster), potensielt forårsaket av aktin cap som spenner over kjernen40. YAP cytoplasma-til-kjernetranslokasjon er korrelert med økningen i peri-kjernefysisk kraft40. Et grundig søk i den aktuelle litteraturen ga ingen publikasjonersom rapporterte en peri-kjernefysisk kraft eller aktin cap i kreftceller. En indirekte studie på melanomkreftceller viste at aktinkanten (en annen peri-nukleær actin-organisasjon som ligger rundt, men ikke dekker kjernen) reduserer cellemigrasjonsratene41, noe som indirekte antyder eksistensen av en peri-kjernefysisk kraft. Det rapporteres imidlertid ingen direkte eksperimentelle data. I denne studien fant forfatterne at både PC9- og B2B-celler viser peri-kjernefysisk forskyvning og trekkraft. Mekanismene for genereringen av peri-nukleære krefter og deres effekter forblir kontroversielle. I normale celler ble aktinhetten rapportert å spille en rolle i å regulere kjernens morfologi og kromatinorganisasjon42, overføre mekaniske signaler fra fokale adhesjoner inn i kjernen gjennom koblinger av nukleoskeleton og cytoskjelett (LINC) complex43, og regulere cellemigrasjon44. Lamin A/C er relatert til dannelsen og forstyrrelsen av aktin cap40,41,42,43,44. Rapporten som hevdet at aktin-hetten genererer en peri-kjernefysisk kraft, vurderte imidlertid ikke actin rim40s potensielle rolle. I kreftceller letter overekspressering av Lamin A dannelsen av en aktinkant og begrenser kreftcellemigrasjon. Overekspression av Lamin B reduserer aktin felgdannelse og fremmer migrasjon. Den peri-kjernefysiske styrken kan være involvert i denne prosessen på grunn av eksistensen av peri-kjernefysisk actin organisasjon og effekten av Lamin A. Resultatene av denne studien viste imidlertid ingen bevis for målte peri-nukleære krefter eller oppførselen til aktin-hetten. Derfor er oppdagelsen av peri-nukleære krefter i PC9-celler i denne nåværende studien den første rapporten som viser peri-nukleære krefter og forskyvninger i lungekreftceller. Forfatterne undersøker for tiden molekylære mekanismer og funksjoner til peri-nukleære krefter i CRISPR / Cas9-konstruerte PC9- og B2B-celler.
Utover det helt optiske mekanobiologiforhøret som er demonstrert i dette papiret, kan det integrerte multifunksjonelle systemet brukes til optisk å sondere et utall andre essensielle fysiologiske og patologiske signaler i levende systemer. Eksempel: forfatternes laboratorium har nylig etablert flere stabilt transduserte cellelinjer for human kreft som samtidig uttrykker tre lysresponsive membranproteiner: membranspenningsindikator QuasAr2 (eksitasjon: 640 nm; utslipp: 660 nm-740 nm), membranspenningsdepolarizer CheRiff (eksitasjon: 488 nm) og membranspenning hyperpolarizer eNpHR3 (eksitasjon: 590 nm). Disse tre funksjonelle proteinene kan aktiveres av spektrum-ortogonale laserlinjer på en krysstalefri måte, noe som muliggjør alloptisk toveis signalkommunikasjon (avlesning og kontroll) av membranelektrofysiologi. Ved hjelp av et integrert opto-elektronikksystem og en manuell patch-clamp har forfatterne validert den helt optiske kontrollen og avlesningen av membranspenningen (Vm) i enkeltmenneskelige kreftceller og multicellulære tumorsfæroider. Det alloptiske elektrofysiologiavhøret åpner muligheten for detaljerte undersøkelser av tidligere utilgjengelig bioelektrisitet i kreftceller, noe som kan bidra til å fremme tumorbiologi fra en ny akse.
Disclosures
Det er ingen interessekonflikter å erklære.
Acknowledgments
Dette prosjektet støttes økonomisk av Cancer Pilot Award fra UF Health Cancer Center (X. T. og D. S.) og Gatorade Award Start-up Package (X. T.). Forfatterne setter oppriktig pris på de intellektuelle diskusjonene med og de tekniske støttene fra Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Ji-Hyun Lee (Biostatistics, UF), Dr. Hugh Fan (MAE, UF), Dr. Warren Dixon (MAE, UF), Dr. Ghatu Subhash (MAE, UF), Dr. Sheplak (MAE &ECE, UF), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE, UF), Dr. UF), Dr. Matthew Traum (MAE, UF), Dr. David Hahn (University of Arizona), Dr. Weihong Wang (Oracle Corporation), Dr. Youhua Tan (Hong Kong Polytechnic University) og supportteamet til Nikon (Dr. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon og Jon Ekman). Forfatterne er dypt takknemlige for den sjenerøse og effektive støtten fra alle medlemmer av Tangs, Siemanns og Leans forskningslaboratorier og alle ansatte i MAE &ECE &Physics &Radiation Oncology Departments, UF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-aldrich | 440140 | |
| 0.05 % Trypsin | Corning | 25-051-CI | |
| 75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
| 8 Benchtop Centrifuge | Thermo | 75007210 | |
| A1R confocal system | Nikon | HD25 | |
| Acetic acid | Sigma-aldrich | 695092 | glacial, ACS reagent, ≥99.7% |
| BEAS-2B (B2B) cells | Sigma-aldrich | 95102433 | human epithelial cells from lung tissue |
| Carboxylate-Modified Microspheres | Invitrogen | F8797 | |
| Culture medium (RPMI-1640) | Gibco | 11875093 | |
| Desktop Computer | Dell | 2018 | with Windows 10 operating system |
| Environmental chamber TIZB | Tokai Hit | TIZB | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140 | |
| Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
| Fiji ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation | 1.53k | |
| Glass-bottom petri dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| HEPES buffered saline | Sigma-aldrich | 51558 | |
| Hydrazine hydrate solution | Sigma-aldrich | 53847 | |
| IntelliJ IDEA | JetBrains | 2020 | Java development platform |
| Java Development Kit | Oracle | 14.0 | |
| Kimwipe | Kimtech Science | 3066-05 | |
| MATLAB | MathWorks | 2020b | |
| Monochrome Camera | FLIR | BFS-U3-70S7M-C | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-218 | |
| N,N′-Methylenebisacrylamide solution | Sigma-aldrich | M1533 | |
| NIS-Elements software platform | Nikon | 4.50 | software platform |
| Origin | OriginLab | OriginPro 2017 (Learning Edition) | data analysis and graphing software |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PC9 cells | Sigma-aldrich | 90071810 | human adenocarcinoma cells from lung tissue |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | F-553S | high-fidelity DNA polymerase |
| Scotch tape | Scotch | adhesive tape | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma-aldrich | 05030 | |
| Super glue | Gorilla | cyanoacrylate glue | |
| Ti2-E inverted microscope | Nikon | MEA54000 | |
| TI2-S-SE-E Motorized Stage with Encoder | Nikon | MEC56120 | |
| μManager | version 2.0 gamma | open source microscopy software (https://micro-manager.org/) |
References
- Werley, C., Boccardo, S., Rigamonti, A., Hansson, E., Cohen, A. Multiplexed optical sensors in arrayed islands of cells for multimodal recordings of cellular physiology. Nature Communications. 11 (1), 3881 (2020).
- Yang, B., et al. Epi-illumination SPIM for volumetric imaging with high spatial-temporal resolution. Nature Methods. 16 (6), 501-504 (2019).
- Saraswathibhatla, A., Galles, E. E., Notbohm, J. Spatiotemporal force and motion in collective cell migration. Scientific Data. 7 (1), 197 (2020).
- Saraswathibhatla, A., Henkes, S., Galles, E. E., Sknepnek, R., Notbohm, J. Coordinated tractions control the size of a collectively moving pack in a cell monolayer. Extreme Mechanics Letters. 48, 101438 (2021).
- Wang, W., Kim, C. K., Ting, A. Y. Molecular tools for imaging and recording neuronal activity. Nature Chemical Biology. 15 (2), 101-110 (2019).
- Eliceiri, K. W., et al.
- Carpenter, A. E., Kamentsky, L., Eliceiri, K. W. A call for bioimaging software usability. Nature Methods. 9 (7), 666-670 (2012).
- Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nature Biotechnology. 34 (11), 1137-1144 (2016).
- Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
- Luo, Q., et al. Automatic multi-functional integration program (AMFIP) towards all-optical mechanobiology interrogation. bioRxiv. , (2021).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using manager. Current Protocols in Molecular Biology. 92 (1), 14-20 (2010).
- Tulpule, A., et al. Kinase-mediated RAS signaling via membraneless cytoplasmic protein granules. Cell. 184 (10), 2649-2664 (2021).
- Tang, X., Tofangchi, A., Anand, S. V., Saif, T. A. A novel cell traction force microscopy to study multi-cellular system. PLOS Computational Biology. 10 (6), 1003631 (2014).
- Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
- Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews Materials. 5, 351-370 (2020).
- Phelps, E. A., et al. Maleimide cross-linked bioactive PEG hydrogel exhibits improved reaction kinetics and cross-linking for cell encapsulation and in situ delivery. Advanced Materials. 24 (1), 64-70 (2012).
- Bajaj, P., Tang, X., Saif, T. A., Bashir, R. Stiffness of the substrate influences the phenotype of embryonic chicken cardiac myocytes. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 95 (4), 1261-1269 (2010).
- Temples, M. N., Adjei, I. M., Nimocks, P. M., Djeu, J., Sharma, B. Engineered three-dimensional tumor models to study natural killer cell suppression. ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (7), 4179-4199 (2020).
- Feng, S., et al. Improved split fluorescent proteins for endogenous protein labeling. Nature Communications. 8, 370 (2017).
- Guan, J., Liu, H., Shi, X., Feng, S., Huang, B. Tracking multiple genomic elements using correlative CRISPR imaging and sequential DNA FISH. Biophysical Journal. 112 (6), 1077-1084 (2017).
- Micro-Manager. , Available from: https://micro-manager.org/wiki/NikonTi2 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Martiel, J. L., et al. Measurement of cell traction forces with ImageJ. Methods in Cell Biology. 125, 269-287 (2015).
- Okumurai, I. A. On the generalization of Cerruti's problem in an elastic half-space. Doboku Gakkai Ronbunshu. 1995, 1-10 (1995).
- Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond. Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).
- Hong, W. W., Guan, K. L. The YAP and TAZ transcription co-activators: Key downstream effectors of the mammalian Hippo pathway. Seminars in Cell and Developmental Biology. 23 (7), 785-793 (2012).
- Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S.
- Wang, Y., et al. Overexpression of yes-associated protein contributes to progression and poor prognosis of non-small-cell lung cancer. Cancer Science. 101 (5), 1279-1285 (2010).
- Li, H., et al. Inhibition of YAP suppresses CML cell proliferation and enhances efficacy of imatinib in vitro and in vivo. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 35 (1), 134 (2016).
- Tang, X., et al. A mechanically-induced colon cancer cell population shows increased metastatic potential. Molecular Cancer. 13, 131 (2014).
- Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 758-770 (2017).
- Yuan, M., et al. Yes-associated protein (YAP) functions as a tumor suppressor in breast. Cell Death and Differentiation. 15 (11), 1752-1759 (2008).
- Koushki, N., et al. Lamin A redistribution mediated by nuclear deformation determines dynamic localization of YAP. bioRxiv. , (2020).
- Chang, S. S., Rape, A. D., Wong, S. A., Guo, W. H., Wang, Y. L. Migration regulates cellular mechanical states. Molecular Biology of the Cell. 30 (26), 3104-3111 (2019).
- Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
- Lee, J., Abdeen, A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Matrix directed adipogenesis and neurogenesis of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow. Acta Biomaterialia. 42, 46-55 (2016).
- Tang, X., Bajaj, P., Bashir, R., Saif, T. A. How far cardiac cells can see each other mechanically. Soft Matter. 7 (13), 6151-6158 (2011).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Rape, A., Guo, W. H., Wang, Y. L. The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions. Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2011).
- Shiu, J. Y., Aires, L., Lin, Z., Vogel, V. Nanopillar force measurements reveal actin-cap-mediated YAP mechanotransduction. Nature Cell Biology. 20 (3), 262-271 (2018).
- Fracchia, A., Asraf, T., Salmon-Divon, M., Gerlitz, G. Increased lamin B1 levels promote cell migration by altering perinuclear actin organization. Cells. 9 (10), 2161 (2020).
- Ramdas, N. M., Shivashankar, G. V. Cytoskeletal control of nuclear morphology and chromatin o1rganization. Journal of Molecular Biology. 427 (3), 695-706 (2015).
- Khatau, S. B., et al. A perinuclear actin cap regulates nuclear shape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19017-19022 (2009).
- Kim, D. H., Cho, S., Wirtz, D. Tight coupling between nucleus and cell migration through the perinuclear actin cap. Journal of Cell Science. 127 (11), 2528-2541 (2014).
