Summary
本文介绍了使用同轴流聚焦装置封装人多能干细胞（hPSC）。我们证明，这种微流体封装技术能够有效地形成hPSC球体。
Abstract
人类多能干细胞（hPSCs）的三维（3D）或球状培养物具有改善分化结果和可扩展性的好处。在本文中，我们描述了一种用于hPSC球体的稳健且可重复形成的策略，其中利用同轴流聚焦装置将hPSC卡入核壳微胶囊内。核心溶液含有hPSCs的单细胞悬浮液，通过掺入高分子量聚乙二醇（PEG）和密度梯度培养基而变得粘稠。壳流由PEG-4臂马来酰亚胺或PEG-4-Mal组成，并沿着核心流流流向两个连续的油结。液滴形成发生在第一个油结处，壳溶液包裹在核心周围。壳的化学交联发生在第二个油连接处，通过向这些液滴引入二硫醇交联剂（1，4-二硫代噻嗪醇或DTT）。交联剂 通过 点击化学与马来酰亚胺官能团反应，导致在微胶囊周围形成水凝胶壳。我们的封装技术以每秒10粒胶囊的速度生产400μm直径的胶囊。由此产生的胶囊具有水凝胶壳和水性核心，允许单个细胞迅速组装成聚集体并形成球状体。包封过程不会对hPSCs的生存能力产生不利影响，包封后3天观察到>95%的存活率。为了进行比较，包封在固体凝胶微粒（无水性核心）中的hPSCs在包封后3天未形成球状体，并且具有<50%的活力。包封后48 h内核壳微胶囊内hPSCs的球状体形成，球体直径与细胞接种密度成函数关系。总体而言，该协议中描述的微流体封装技术非常适合hPSCs封装和球体形成。
Introduction
由于这种培养形式1，2，3提供了改进的多能性和分化潜力，因此对人多能干细胞（hPSCs）的3D培养物有相当大的兴趣。hPSC通常通过生物反应器，微孔，水凝胶和聚合物支架4，5，6形成球体或其他3D培养形式。封装为将单个hPSC组织成球体提供了另一种方法。一旦封装了hPSC球体，就可以轻松处理并转移到微量滴定板中，以进行分化，疾病建模或药物测试实验。将hPSC包裹在水凝胶层中还可以保护细胞免受剪切损伤，并允许以高搅拌速率在生物反应器中培养球体7。
我们的干细胞封装方法随着时间的推移而发展。首先，我们专注于固体水凝胶微粒，并展示了小鼠胚胎干细胞（mESCs）的成功封装和培养8。然而，值得注意的是，当包封在这种水凝胶微粒中时，人类胚胎干细胞（hESCs）具有低活力，可能是由于这些细胞在包封后更需要重新建立细胞 - 细胞接触。我们推断，具有水性核心的异质微胶囊可能更适合于依赖于细胞 - 细胞接触的快速重建的细胞的包封。用于制造水性核/水凝胶壳微胶囊的同轴流聚焦微流体装置的概念改编自He等人，但原始方法中采用了藻酸盐，而是将基于PEG的水凝胶掺入壳中。我们首先证明了核壳微胶囊10 中原代肝细胞的成功包封和球体形成，以及最近描述的hES和iPS细胞7的包封。如图 1A所示，胶囊在流动聚焦装置中制造，其中壳和核心流动流在喷射到油相之前从一侧到另一侧过渡到同轴流。核心流含有增加溶液粘度的细胞和添加剂（非反应性PEG MW 35kD和碘克沙醇 - 商业名称OptiPrep），而壳流含有反应性分子（PEG-4-Mal）。连续的同轴流被离散化为保留核壳结构的液滴。通过暴露于二硫醇交联剂（DTT）使核壳结构永久化，DTT 通过 点击化学与PEG-4-Mal反应，并形成薄（〜10μm）的水凝胶表皮或壳。在乳液破碎并且胶囊被转移到水相之后，PEG分子从核心扩散并被水分子取代。这导致水性核心和水凝胶壳微胶囊。
下面提供了有关如何制造微流体器件，如何制备细胞以及如何进行hPSC封装的分步说明。
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Protocol
1. 设备制造
- 使用CAD软件10，11进行微囊化装置和解离装置的设计。
- 在硅晶圆上依次纺涂三层SU-8光刻胶（图2A），以获得具有所需高度的结构：60，100和150μm。
注：顶部和底部模具的工艺相同。- 用SU-8 2025负光刻胶以1，100 rpm的速度旋转涂覆干净的10厘米硅片，以产生第一个60μm层。在热板上在65°C下软烘烤3分钟和95°C烘烤10分钟后，通过将核心通道图案的设计文件上传到μPG 101 PC，使用无掩模对准器暴露模具。然后，在65°C下进行暴露后烘烤3分钟，在95°C下烘烤10分钟。
- 以 1，500 rpm 的速度旋转涂覆第二层 SU-8 2025 层 （40 μm），并通过上传壳体通道图案的相应 CAD 文件进行暴露。
注意：软烘焙和曝光后烘焙与上一步类似。 - 以1，400 rpm的速度旋转涂覆第三层SU-8 2025层以达到50μm高度，并重复上述过程，但暴露油相的结构。
- 通过浸没在SU-8显影剂中，一步完成所有三层的模具，直到所有未暴露的光刻胶被去除。
- 将模具在160°C的热板上硬烤10分钟，以提高附着力并密封显影后可能出现的轻微裂缝。
- 将模具暴露在下一步中，以避免弹性体粘合，并将其置于15厘米的培养皿中直至使用。
- 以相同的方式制备解离装置模具，如图 1D 和 图2B所述。如前面的步骤1.2.3所述，在硅晶圆上旋转涂覆一层SU-8光刻胶，以实现所需高度：50μm的结构。进行软烘烤和曝光后烘烤、显影和硬烘烤，与上一步类似。
注意：一系列三角形柱子覆盖了整个腔室，柱子之间的间距随着腔室宽度向出口减小而减小。三角形柱每侧200μm，间距范围从400μm（入口处）到30μm（出口处）。 - 使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）通过软光刻制备模具。
- 在行星离心机中以 10：1 w/w 的比例混合 PDMS 弹性体基料和弹性体固化剂。将混合物倒入微囊化主模和解离母模上，形成3-4毫米的层。
注意：50 克弹性体基料与 5 克固化剂的混合物足以覆盖厚度为 3 mm 的主模。 - 将含有模具的培养皿置于真空干燥器中15分钟，以对未固化的PDMS进行脱气。
- 将培养皿移至烤箱中，在80°C下烘烤至少60分钟。
- 从烤箱中取出母模，让它们冷却。使用精密刀，按照晶圆的形状小心地切割PDMS，并从母模中剥离PDMS件。
- 通过用手术刀修剪每个设备的边缘来切割PDMS板坯，然后在解离设备中打出入口/出口流体端口，并且仅在使用不锈钢针的顶部微流体设备中。用魔术胶带盖住设备，以避免污染。
注：针规分别为 14 G 和 15 G，用于入口和出口端口。 - 对于粘合，在等离子体蚀刻机上用O2 等离子体处理顶部和底部PDMS片的图案侧2分钟。
- 直接在微通道（2 μL）中加入一层薄的蒸馏水分离层后，在立体镜下对齐两个PDMS部件。
- 将对齐的PDMS器件置于80°C的烘箱中过夜，以完成粘合并将PDMS恢复到其原始疏水状态。存储设备，直到进一步使用。
注意：这导致同轴流动聚焦装置具有三种不同的高度，核心为120μm，壳体为200μm，油道为300μm。 - 为了在等离子体粘合后立即使用该装置，小心但牢固地将30μL疏水涂层溶液注入流体通道中，以实现疏水涂层。然后，立即将空气吹扫到通道中，直到在设备中未观察到疏水涂层溶液的残留物。
- 通过首先用O2 等离子体处理设备的图案侧和清洁的载玻片2分钟来粘合解离装置，然后组装它们以在80°C的烘箱中进一步固化过夜。
注意：设备可以存储，直到进一步使用。
- 在行星离心机中以 10：1 w/w 的比例混合 PDMS 弹性体基料和弹性体固化剂。将混合物倒入微囊化主模和解离母模上，形成3-4毫米的层。
2. 溶液的制备
- 库存解决方案。首先，准备储备溶液（浓缩溶液），将其稀释至较低浓度以备实际使用。
注意：在制备较低浓度的工作溶液时，储备溶液用于节省制备时间，节省材料，减少存储空间并提高准确性。- 制备30 mL 2x核心溶液（16%PEG和34%密度梯度培养基）：混合4.8g 35 kDa PEG，10.2 mL密度梯度培养基和19.8 mL DMEM / F12培养基。使用0.22 μm注射器过滤器过滤此核心溶液。
- 用3%表面活性剂制备50 mL矿物油：混合48.5 mL矿物油和1.5 mL表面活性剂。通过0.22μm注射器过滤器过滤后保持无菌状态。
- 用0.5%表面活性剂制备50 mL矿物油：混合49.75 mL矿物油和0.25 mL表面活性剂。保持无菌状态。
- 制备1 M二硫热醇（DTT）：将1.5425gDTT溶解在10mL蒸馏水中。保持无菌状态。
- 制备1 M三乙醇胺（TEA）：在433.6μL蒸馏水中加入66.4μLTEA。保持无菌状态。
- 制备1%Pluronic F127（PF127）：将100mg PF127溶解在10mL蒸馏水中。保持无菌状态。
- 工作解决方案
- 通过将4.5 mL矿物油与3%表面活性剂和300μL 1 M DTT（1：15比例）混合来制备交联剂乳液。涡旋溶液2分钟，并在20°C的超声浴中超声处理45-60分钟。 将此溶液装入带有27 G针头的5 mL注射器中。
注：乳液是通过超声处理油/水混合物而产生的。 - 通过将矿物油与0.5%表面活性剂装入具有27G针头的5mL注射器中来制备屏蔽油溶液。
- 通过在400μL 1x DPBS中加入32mg PEG-4-Mal以形成8%w / v溶液，并涡旋溶液2分钟，制备壳（8%w / v PEG-4-Mal和15mM TEA）溶液。然后，加入6μL1M TEA（终浓度15mM TEA）。最后，通过旋转过滤器以13，000× g 离心5分钟，并将其保持在摇臂上的黑暗中30分钟。然后，用27G针头将此溶液加载到1mL注射器中。
注意：在打开盖子之前，将PEG-4-Mal容器置于室温下10分钟，并在关闭盖子之前吹N2气体以用N 2替换O 2。在添加到溶液之前涡旋TEA。
- 通过将4.5 mL矿物油与3%表面活性剂和300μL 1 M DTT（1：15比例）混合来制备交联剂乳液。涡旋溶液2分钟，并在20°C的超声浴中超声处理45-60分钟。 将此溶液装入带有27 G针头的5 mL注射器中。
- 在核心溶液中制备细胞悬浮液
- 用胰蛋白酶在37°C下处理hPSCs5至10分钟。 然后，从盘子中收集它们。细胞分离后用培养基淬灭胰蛋白酶，然后将细胞转移到15mL锥形管中。
- 离心本体细胞悬浮液（400× g，5分钟）。小心地吸出上清液，然后使用最小体积的生长培养基重悬细胞沉淀。使用自动细胞计数器对细胞进行计数。
注意：典型的细胞等分试样含有12-20 x 106 个细胞，足以制造400μL的核心溶液。 - 从本体细胞悬浮液中取出12-20 x 106 个细胞，离心细胞/培养基悬浮液（400× g，5分钟）。
- 小心地从细胞沉淀中吸取培养基。然后，加入200μL培养基和200μL2x PEG溶液（终浓度30-50×106 细胞/ mL）并轻轻混合。
注意：低细胞浓度（小于20 x 106 个细胞/ mL）导致许多空胶囊。 - 向溶液中加入30μL1%PF127。
- 将微型搅拌棒（2 mm x 7 mm）插入1 mL注射器中，然后用27 G针头将含有核心溶液的电池加载到注射器中。在整个封装过程中用冰保持溶液冷却。
3. 实验设置
- 将粘合的 PDMS 液滴装置、4 个 20 厘米长的 20 厘米长和一条 5 厘米长的入口微管（内径 0.38 毫米 x 外径 1.1 毫米）、1 根 10 厘米出口管（内径 0.5 毫米 x 外径 1.5 毫米）和 6 根 0.5 厘米的接头管（内径 1 毫米 x 外径 1.8 毫米）放置在杀菌光源（通常内置于生物安全柜中）下方，对 30 厘米进行灭菌最小值
- 使用镊子将卡套管安装到流体入口端口和解离端口中。
- 使用三片20厘米长的入口微管用于壳，油，交联剂乳液入口，一块用于解离装置的入口。然后，将管子的另一端与相应的溶液一起插入注射器的针头上。同时，用一个5cm的微管连接微流体装置的核心入口和解离装置的出口（图1C）。
注意：入口微管应紧紧地固定在上一步插入的接头管内。 - 将一个出口管插入流体出口，并将另一端放入收集储液器中。
- 将设备放在显微镜载物台上并连接管子以避免移动。将显微镜对准并聚焦在设备喷嘴上，以进行流量检测。
- 将每个注射器放在不同的注射器泵上并正确固定（图1B）。根据制造商的协议，对每个泵进行以速编程：核心（ 3 - 5 μL / min ）、壳体（ 3 - 5 μL / min ）、屏蔽油（ 20 - 80 μL / min ）和交联油（ 40 - 60 μL / min ）。启动所有泵中的流量。
- 等待每种流体进入设备并填充通道，同时推出剩余的空气。
注意：如果进气管中有大量的空气，请暂时增加每个流速，直到空气完全排出。请注意，过大的流速可能导致 PDMS 到 PDMS 键合失效。 - 当胶囊形成稳定时（图3），将收集管的另一端放入具有5mL mTeSR培养基的新锥形管中。
注意：培养基含有10μM ROCK抑制剂，100 U / mL青霉素和100μg / mL链霉素。 - 收集足够数量的胶囊后，在37°C下用5%CO2 孵育10分钟。存在于油相中的胶囊将位于管的顶部（见 图4A）。轻轻敲击管子会使胶囊沉淀到底部。在此之后，大部分油和介质可能会被吸入。
- 从锥形管的底部收集胶囊，将它们放在细胞过滤器（100μm孔径）上，并用大量的培养基洗涤。然后，使用2mL培养基在6孔培养板中收集微胶囊，方法是将培养基通过过滤器，因为它倒置在孔板顶部（见 图4A）。
4. 微胶囊中的hPSC培养和分析
- 基本文化
- 将干细胞胶囊在37°C的6孔板培养皿中用5%CO2孵育。
- 每隔一天更换培养基，方法是将胶囊收集在细胞过滤器过滤器上，用多余的培养基洗涤它们，然后像步骤3.10中那样将它们重悬到具有2mL培养基的6孔板中的新孔中。
- 培养胶囊至少10天。
- 进行活/死测定以确定包封干细胞的活力。
- 解冻活/死测定溶液（同源二聚体-1和钙黄绿素AM）。
- 将4μL的2μM乙锭同源二聚体-1和1μL的4μM钙黄绿素AM溶液加入2mL无菌DPBS中。涡流确保完全混合。
- 在细胞过滤器上收集约100个微胶囊，并用无菌DPBS冲洗它们，以允许培养基从胶囊中扩散出来。
- 通过使用步骤4.2.2中制备的1mL溶液再次将它们收集到12孔培养板中。在37°C下孵育20分钟。
- 在荧光显微镜下观察细胞。
注意：通过计算活细胞总数中活细胞的百分比来量化细胞活力，活细胞可视化为绿色。
- 球体尺寸表征。
- 如果需要，将带有微胶囊的孔板置于显微镜下，并使用适当的比例尺测量相关软件上显示的球体直径。
- 测量和分析球体尺寸。
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Representative Results
通过遵循上述方案，阅读器将能够制造微流体装置并产生携带细胞的微胶囊。 图3A 显示了使用微流体液滴生成制造的最佳和次优微胶囊的示例。PEG-4-Mal的不同配方导致不同形态的胶囊 - 皱纹胶囊与凝胶化不良，机械完整性低且无法承受在搅拌生物反应器中培养有关。在PEG含量为>6%时观察到的光滑胶囊代表了所需的胶囊形态，并且对于细胞培养足够强大。通过将微珠掺入芯中并将荧光部分掺入微胶囊的壳中来确认核壳结构。 如图3B 所示，胶囊中心的磁珠聚集被用作核心是水性的指示，并且磁珠可以自由移动。 在图3C 中观察到的荧光环空表明存在水凝胶壳，并用于确定壳层厚度。我们建议用户在建立封装过程的早期阶段采用微珠掺入和荧光标记。
一旦建立了封装过程，就可以进入hPSC的封装。虽然该协议描述了H9细胞的封装，但我们使用了类似的策略来封装另一个hESC系（HUES-8）和iPSC系（1016）。6
虽然封装可以仅使用封装设备进行，但我们注意到hPSC倾向于在系统中结块，导致不均匀的封装或胶囊占用。为了应对这一挑战，我们设计了一种解离或过滤装置，并将其放置在封装装置的上游。该解离装置包括一个流道，该流道具有一系列三角形柱子，每侧测量200μm，节距范围从入口处的400μm到出口处的30μm，使得团块在进入封装装置之前被保留或分解（见 图1D）7。解离装置的使用可以显着提高球体的均匀性，并将胶囊的细胞占用率从57%提高到>90%7。
图4B，C描述了封装运行的代表性结果。从这些图像中可以看出，H9细胞具有高活力，在封装运行期间常规达到>95%的活力。我们比较了包封球体与未包封球体7的生长速率（见图4B，C）和分化潜力，并确定包封过程对hPSCs没有不利影响。另一方面，封装hPSC有几个好处。封装的球体易于处理，可以分配/分配到微量滴定板中，以开发分化方案或测试疗法。我们的实验室有兴趣使用微胶囊作为干细胞载体，在搅拌生物反应器中进行悬浮培养，并已证明水凝胶壳在此类培养物中提供防止剪切损伤的保护7。这是我们追求的另一条途径是创建生物活性微胶囊，其中水凝胶壳可能加载生长因子，以便在分化过程中局部和连续地传递诱导线索。
（A）用于胶囊生成的微流体装置由四个入口通道（核心，壳，油和交联剂油）和一个通向收集管的蛇形通道组成。该装置的制造使得核，壳和油通道的高度分别为120μm（H1），200μm（H2）和300μm（H3）。插图代表喷嘴处的横截面视图 - 水流和油流之间的连接处。此横截面视图倾斜 90°，以便读者更好地了解同轴流道。核壳微胶囊制造工艺的3D表示描述了如何在流动聚焦结的上游产生同轴流以产生核壳微胶囊结构。乳化是通过将水性液滴暴露于两个油流中来实现的，第一个油流设计用于稳定液滴，第二个油流提供交联剂DTT，其与PEG-4-Mal反应。这一数字是从参考文献12修改而来的。版权所有 2019，美国化学学会。（B）封装系统的实验设置，显示注射泵，管道，微流体装置和胶囊收集管的位置。（C）封装系统的图像，它由一个序列中的解离和封装装置组成。（D）微流控解离装置的设计，用于避免大细胞聚集体进入微囊化装置。请点击此处查看此图的大图。
图2：用于封装的微流体器件的制造。 （A）封装装置的制造。对三层SU-8光刻胶进行旋涂，并涂上照片图案，生成不同高度的核、壳和油道。核心通道的宽度为220 μm，在胶囊结处变窄至135 μm。所有相位的通道都遵循相同的原理：壳体和油通道从500μm的宽度开始，在结处变窄至220μm，屏蔽油从500μm开始变窄至270μm。出口蛇纹石的宽度为1.5毫米，长度约为55毫米。然后对上和下PDMS片进行对齐，并进行等离子体粘合。（二）解离装置的制造。一层SU-8光刻胶被旋转涂覆，并涂上照片图案以产生解离通道。然后将PDMS片用载玻片等离子体粘合。解离装置由一个小腔室组成，高度为30μm，长度为16.5 mm，入口宽度为5 mm，出口宽度为1.7 mm。它具有三角形结构（200μm，等边），彼此之间相隔420μm的入口，并在通往出口的途中变得更近，最后一行的间隔为50μm。 请点击此处查看此图的大图。
图3：微胶囊的表征。 （A）胶囊形态的差异作为壳中PEG-4-Mal含量的函数。具有明亮边缘的光滑胶囊与所需的机械完整性相关。（B）确认微胶囊的水性核心。被截留的微珠在水性核心中自由移动，并在微胶囊中心聚集。（C）通过将罗丹明B标记的PEG掺入微胶囊的壳中来确认核壳结构。 请点击此处查看此图的大图。
图4：hPSCs的封装。（A）油相中的微胶囊被收集到充满介质的锥形管中。在将微胶囊沉降到管的底部后，吸出油和培养基，洗涤微胶囊，然后将其转移到6孔板中进行培养。（B）包封H9细胞后6小时活/死染色。（C）图像比较胶囊中H9细胞和商业3D培养板中随时间变化的球体尺寸（底部图像）。（D）定量在H9培养基中7天内微胶囊和标准3D培养板中hPSC增加的球体直径。统计分析 -t 检验，p < 0.05， n = 20。比例尺：200 μm。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
这里描述的封装过程导致hPSC球体的可重复形成。微胶囊形式可以很容易地将球体分配到微量滴定板的孔中，用于旨在改善/优化分化方案或测试疗法的实验。包封的干细胞球体也可用于悬浮培养物，其中水凝胶壳保护细胞免受剪切诱导的损伤7。
协议中有几个关键步骤。将核心、壳和油流的流速保持在“协议”部分所述的范围内非常重要。如果壳流速太低，则流量变得不稳定，导致胶囊变形和机械不稳定。成功的细胞封装应类似于 图4C所示的微胶囊。微胶囊应具有相似的直径，并且具有相当数量的细胞被困在核心中。单细胞聚集成球体通常在48小时内发生，72小时未形成球体是一个警告信号。缺乏球体形成的一个原因可能是核心中的粘性分子没有通过水凝胶壳足够快地浸出。当使用高分子量聚合物（如羧甲基纤维素（MW 250 kD））调整核心溶液的粘度时，我们遇到了这种情况。人们可以封装微珠（见 图3B）来测试这些细胞大小的物体是否可以在核心周围自由移动，以及核心成分浸出的速度。当使用peg-4-Mal浓度为>8%w / v时，我们也遇到了缺乏球体形成的情况。在这种情况下，水凝胶壳的孔隙率和扩散率降低，核心中的高粘度元素不会迅速浸出以允许细胞形成聚集体。可以想象，PEG-4-Mal的质量可能因批次或制造商而异。因此，可能需要对壳中的聚合物浓度进行一些调整。再一次，磁珠掺入方法应该揭示核心中的粘性组分如何被水分子取代的速度。根据我们的经验，这应该发生在将微胶囊转移到水环境中的3小时内。
这里描述的封装方案对几种hPSC系7，原代肝细胞10和多种癌细胞系（未发表的结果）效果很好。然而，在干细胞来源的（sc）肝细胞和sc-β细胞的封装后，我们确实遇到了形成球体的困难。使用封装的微珠进行故障排除表明，粘性成分从核心中迅速洗脱出来，细胞可以自由移动并形成细胞 - 细胞接触。其他故障排除涉及将二硫醇交联剂DTT（存在于油相中）的滴定浓度从66 mM降至10 mM。sc-hepatocytes和β细胞的球体形成确实发生在这种较低浓度的DTT下。因此，用户可能需要考虑优化交联剂浓度，但前提是上面列出的其他故障排除步骤尚未成功。我们发现，DTT浓度对于保持66 mM DTT微胶囊的机械完整性至关重要，从而产生机械坚固的微胶囊，并且对迄今为止使用的绝大多数细胞类型无毒。
文献中已经描述了许多创建3D干细胞构建体的策略。在核壳微胶囊内形成干细胞构建体的好处是多方面的。一旦封装，球体可以很容易地用水凝胶胶囊处理，提供防止剪切损伤的保护。包封的球状体可以在悬浮液中培养，剧烈搅拌而不会损伤干细胞。
扩展微胶囊的功能有多种方式。我们的团队之前已经描述了使用含肝素的水凝胶来封装肝细胞和干细胞8，12，并且目前正在开发含肝素的生物活性核壳微胶囊，作为储存和局部释放诱导线索（GFs）到干细胞的仓库。这种微胶囊可能有助于减少昂贵的GF的使用，同时改善分化结果。通过将ECM蛋白掺入核心，从而调节干细胞微环境，可以进一步增强微胶囊。核壳微胶囊可以降解，以使其更容易检索hPSC球体13，14。总体而言，核壳微胶囊代表了一种平台技术，可以对其进行修改和增强，以满足特定干细胞分化方案的需求。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究部分得到了梅奥诊所再生医学中心，J. W. Kieckhefer基金会，Al Nahyan基金会，明尼苏达州再生医学（RMM 101617 TR 004）和NIH（DK107255）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe Filters | Genesee Scientific | 25-244 | |
| 1 ml syringe luer-lock tip | BD | 309628 | |
| 1x DPBS | Corning | 23220003 | |
| 4-arm PEG maleimide, 10kDa | Laysan Inc. | 164-68 | |
| 5 ml syringe luer-lock tip | BD | 309646 | |
| 6-WELL NON-TREATED PLATE | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Aquapel Applicator Pack | Aquapel Glass Treatment | 47100 | |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD v2020 | |
| CELL STRAINER 100 µm pore size | cardinal | 335583 | |
| Chlorotrimethylsilane | Aldrich | 386529-100mL | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Life technology | A27974 | |
| Digital hot plate | Dataplate | ||
| Digital vortex mixer | Fisher Scientific | 215370 | |
| Distilled water | Gibco | 15230-162 | |
| Dithiotheritol (DTT) | Sigma | D0632-10G | |
| DMEM/F12 media | gibco | 11320-033 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge | live | 13-100-675 | |
| HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Inverted Fluorescence Motorized Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Laurell Spin Coaters | Laurell Technologies | WS-650MZ-23NPPB | |
| Live/Dead mammalian staining kit | Fisher | L3224 | |
| Magic tape | Staples | 483535 | |
| Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.) | Scientific Commodities, Inc | BB31695-PE/2 | |
| Micro stir bar | Daigger Scientific | EF3288E | |
| MilliporeSigma Filter Forceps | Fisher scientific | XX6200006P | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | |
| mTeSR 1 Basal Medium | STEMCELL TECHNOLOGY | 85850 | |
| Needles-Stainless Steel 14 Gauge | CML supply | 901-14-025 | |
| Needles-Stainless Steel 15 Gauge | CML supply | 901-15-050 | |
| OptiPrep | STEMCELL TECHNOLOGY | 7820 | |
| Oven | Thermo Scientific | HERA THERM Oven | |
| Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin) | Gemini | 400-109 | |
| Petri Dish 150X20 Sterile Vent | Sarstedt, Inc. | 82.1184.500 | |
| Plasma Cleaning System | Yield Engineering System, Inc. | YES-G500 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| Poly(ethylene glycol) 35kDa | Sigma | 94646-250G-F | |
| PrecisionGlide Needle 27G | BD | 305109 | |
| Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride | SELLECK CHEM | S1049-10mg | |
| Silicon wafer 100mm | University Wafer | 452 | |
| Slide glass (75mm ´ 25mm) | CardinalHealth | M6146 | |
| Span 80 | Sigma | S6760-250ML | |
| SpeedMixer | Thinky | ARE-310 | |
| Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm) | Costar | 8160 | |
| SU-8 2025 | Kayaku Advanced Materials | Y111069 0500L1GL | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials | Y020100 4000L1PE | |
| Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades | fisher scientific | 22-079-684 | |
| SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 2065622 | |
| Syringe pump | New Era Pump System, Inc | NE-4000 | |
| Triethanolamine | Sigma-aldrich | T58300-25G | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-01 | |
| Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-04 | |
| Ultrasonic cleaner FS20D | Fisher Scientific | CPN-962-152R | |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42025-0000 | |
| Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x | ZEISS | 435421-0000-000 | |
| μPG 101 laser writer | Heidelberg Instruments | HI 1128 |
References
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- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).
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