Summary
Denne artikel beskriver indkapsling af humane pluripotente stamceller (hPSC'er) ved hjælp af en koaksial flowfokuseringsenhed. Vi demonstrerer, at denne mikrofluidiske indkapslingsteknologi muliggør effektiv dannelse af hPSC-sfæroider.
Abstract
Tredimensionelle (3D) eller sfæroidkulturer af humane pluripotente stamceller (hPSC'er) giver fordelene ved forbedrede differentieringsresultater og skalerbarhed. I dette papir beskriver vi en strategi for robust og reproducerbar dannelse af hPSC-sfæroider, hvor en koaksial flowfokuseringsenhed bruges til at fange hPSC'er inde i kerneskalmikrokapsler. Kerneopløsningen indeholdt enkeltcellesuspension af hPSC'er og blev gjort tyktflydende ved inkorporering af poly(ethylenglycol) (PEG) med høj molekylvægt og densitetsgradientmedie. Skalstrømmen bestod af PEG-4 arm-maleimid eller PEG-4-Mal og flød langs kernestrømmen mod to på hinanden følgende oliekryds. Dråbedannelse fandt sted ved det første oliekryds med skalopløsning, der viklede sig rundt om kernen. Kemisk tværbinding af skallen forekom ved det andet oliekryds ved at indføre en di-thiol-tværbinding (1,4-dithiothreitol eller DTT) til disse dråber. Tværbindingen reagerer med maleimidfunktionelle grupper via klikkemi, hvilket resulterer i dannelsen af en hydrogelskal omkring mikrokapslerne. Vores indkapslingsteknologi producerede kapsler med en diameter på 400 μm med en hastighed på 10 kapsler i sekundet. De resulterende kapsler havde en hydrogelskal og en vandig kerne, der gjorde det muligt for enkeltceller hurtigt at samle sig i aggregater og danne sfæroider. Indkapslingsprocessen påvirkede ikke hPSC'ernes levedygtighed negativt, idet >95 % levedygtighed blev observeret 3 dage efter indkapslingen. Til sammenligning dannede hPSC'er indkapslet i faste gelmikropartikler (uden en vandig kerne) ikke sfæroider og havde <50% levedygtighed 3 dage efter indkapsling. Sfæroiddannelse af hPSC'er inde i kerneskalmikrokapsler forekom inden for 48 timer efter indkapsling, hvor sfæroiddiameteren var en funktion af celleinokuleringstætheden. Samlet set var den mikrofluidiske indkapslingsteknologi, der er beskrevet i denne protokol, velegnet til hPSC'er indkapsling og sfæroiddannelse.
Introduction
Der er stor interesse for 3D-kulturer af humane pluripotente stamceller (hPSC'er) på grund af den forbedrede pluripotens og differentieringspotentiale, som dette kulturformat 1,2,3 giver. hPSC'er dannes typisk til sfæroider eller andre 3D-kulturformater ved hjælp af bioreaktorer, mikrobrønde, hydrogeler og polymere stilladser 4,5,6. Indkapsling tilbyder et andet middel til at organisere enkelte hPSC'er i sfæroider. Når indkapslede hPSC-sfæroider kan håndteres med lethed og overføres til mikrotiterplader til differentiering, sygdomsmodellering eller lægemiddeltestforsøg. Indkapsling af hPSC'er i et hydrogellag beskytter også celler mod forskydningsskader og gør det muligt at dyrke sfæroider i en bioreaktor ved høje omrøringshastigheder7.
Vores metode til indkapsling af stamceller udviklede sig over tid. For det første fokuserede vi på faste hydrogelmikropartikler og demonstrerede vellykket indkapsling og dyrkning af museembryonale stamceller (mESC'er)8. Det blev imidlertid bemærket, at humane embryonale stamceller (hESC'er) havde lav levedygtighed, når de blev indkapslet i sådanne hydrogelmikropartikler, formodentlig på grund af det større behov for, at disse celler genoprettede celle-cellekontakter efter indkapslingen. Vi ræsonnerede, at heterogen mikrokapsel, der besidder en vandig kerne, kan være bedre egnet til indkapsling af celler, der er afhængige af hurtig genetablering af celle-cellekontakter. Konceptet med koaksial strømningsfokuserende mikrofluidisk enhed til fremstilling af vandige kerne / hydrogelskalmikrokapsler blev tilpasset fra He et al.9, men i stedet for alginat anvendt i den oprindelige tilgang blev en PEG-baseret hydrogel inkorporeret i skallen. Vi demonstrerede først vellykket indkapsling og sfæroiddannelse af primær hepatocyt i kerneskalmikrokapsler10 og senest beskrevet indkapsling af hES- og iPS-celler7. Som skitseret i figur 1A fremstilles kapsler i en flowfokuseringsanordning, hvor skal- og kernestrømstrømmene overgår fra side til side til koaksial strømning, inden de skubbes ud i oliefasen. Kernestrømmen indeholder celler og additiver, der øger opløsningens viskositet (ikke-reaktiv PEG MW 35kD og iodixanol - kommercielt navn OptiPrep), mens skalstrømmen indeholder reaktive molekyler (PEG-4-Mal). Kontinuerlig koaksial strømningsstrøm diskretiseres i dråber, der bevarer kerneskalarkitektur. Kerneskalstrukturen gøres permanent ved udsættelse for di-thiol crosslinker (DTT), som reagerer med PEG-4-Mal via klikkemi og resulterer i dannelse af en tynd (~ 10 μm) hydrogelhud eller skal. Efter at emulsionen er brudt, og kapsler overføres til en vandig fase, diffunderer molekyler af PEG fra kernen og erstattes af vandmolekyler. Dette resulterer i vandige kerne- og hydrogelskalmikrokapsler.
Nedenfor er trinvise instruktioner om, hvordan man fremstiller mikrofluidiske enheder, hvordan man forbereder celler, og hvordan man udfører indkapsling af hPSC'er.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af enhed
- Lav designene til mikroindkapslingsenheden og dissociationsenheden ved hjælp af CAD-software10,11.
- Spin-coat de tre lag SU-8 photoresist sekventielt på en siliciumskive (figur 2A) for at opnå strukturer med de ønskede højder: 60, 100 og 150 μm.
BEMÆRK: Processen for de øverste og nederste forme er identisk.- Spincoat en ren 10 cm siliciumskive med SU-8 2025 negativ fotoresist ved 1.100 o / min for at skabe det første 60 μm lag. Efter en blød bagning ved 65 ° C i 3 minutter og 95 ° C i 10 minutter på en kogeplade skal du udsætte formen ved hjælp af en maskeløs justering ved at uploade designfilen for kernekanalmønsteret til μPG 101 PC. Fortsæt derefter med eftereksponeringsbagningen ved 65 ° C i 3 minutter og ved 95 ° C i 10 minutter.
- Spincoat det andet SU-8 2025-lag (40 μm) ved 1.500 o / min og eksponere ved at uploade den relevante CAD-fil til shell-kanalmønsteret.
BEMÆRK: Bløde og eftereksponeringsbagninger lignede det foregående trin. - Spin coat det tredje SU-8 2025 lag ved 1.400 o / min for at opnå 50 μm højde og gentage ovenstående proces, men udsætte strukturerne for oliefasen.
- Udvikl formen med alle tre lag i et enkelt trin ved nedsænkning i SU-8-udvikleren, indtil al den ueksponerede fotoresist er fjernet.
- Hårdbag formen på en kogeplade ved 160 ° C i 10 minutter for at forbedre vedhæftningen og forsegle mindre revner, der kan forekomme efter udviklingen.
- Udsæt formen for chlorotrimethylsilen for at undgå elastomerbinding i næste trin og læg den i 15 cm petriskåle indtil brug.
- Dissociationsanordningens form forberedes på samme måde som beskrevet i figur 1D og figur 2B. Spincoat et lag SU-8 photoresist på en siliciumskive, som beskrevet tidligere i trin 1.2.3, for at opnå strukturer med den ønskede højde: 50 μm. Udfør den bløde og eftereksponeringsbagning, udvikling og hårde bagning på samme måde som det foregående trin.
BEMÆRK: En række trekantede stolper dækkede hele kammeret, hvor afstanden mellem stolperne faldt, efterhånden som kammerbredden faldt mod udløbet. Trekantstolperne var 200 μm pr. side med en stigning fra 400 μm (ved indløbet) til 30 μm (ved udløbet). - Forbered formene ved blød litografi ved hjælp af polydimethylsiloxan (PDMS).
- Bland PDMS-elastomerbase og elastomerhærdningsmiddel i et forhold på 10:1 w/w i en planetarisk centrifuge. Hæld blandingen på både mikroindkapslingsmasterforme og dissociationsmasterform for at skabe et 3-4 mm lag.
BEMÆRK: En blanding af 50 g elastomerbase med 5 g hærdningsmiddel er tilstrækkelig til at dække en masterform med en tykkelse på 3 mm. - Anbring petriskålene, der indeholder formene, i en vakuumtørrer i 15 minutter for at afgasse den uhærdede PDMS.
- Flyt petriskålene til en ovn og bag ved 80 °C i minimum 60 min.
- Fjern masterformene fra ovnen, og lad dem køle af. Brug en præcisionskniv til forsigtigt at skære PDMS efter waferens form og skræl PDMS-stykkerne ud af masterformen.
- Skær PDMS-pladerne ud ved at trimme kanterne på hver enhed med en skalpel, og stans derefter indløbs- / udløbsvæskeporte ud i dissociationsenheden og kun i den øverste mikrofluidiske enhed ved hjælp af nåle i rustfrit stål. Dæk enhederne med magisk tape for at undgå forurening.
BEMÆRK: Nålemåleren er 14 G og 15 G for henholdsvis indløbs- og udløbsporte. - Til limning behandles de mønstrede sider af de øverste og nederste PDMS-stykker medO2-plasma på en plasmaætser i 2 minutter.
- Juster begge PDMS-dele under et stereoskop efter tilsætning af et tyndt adskillelseslag af destilleret vand direkte i mikrokanalerne (2 μL).
- Anbring den justerede PDMS-enhed i ovnen ved 80 °C natten over for at fuldføre limningen og gendanne PDMS til sin oprindelige hydrofobe tilstand. Opbevar enhederne indtil videre brug.
BEMÆRK: Dette resulterer i en koaksial flowfokuseringsanordning med tre forskellige højder på 120 μm for kerne, 200 μm for skal og 300 μm for oliekanaler. - For at bruge enheden lige efter plasmabindingen injiceres forsigtigt, men fast 30 μL hydrofob belægningsopløsning i de fluidiske kanaler for at opnå hydrofob belægning. Derefter renses straks luft ind i kanalerne, indtil der ikke observeres rester af den hydrofobe belægningsopløsning i enheden.
- Lim dissociationsanordningen ved først at behandle den mønstrede side af enheden og et renset glasglas medO2-plasma i 2 minutter, og saml dem derefter til yderligere hærdning i ovnen ved 80 °C natten over.
BEMÆRK: Enheder kan opbevares indtil videre brug.
- Bland PDMS-elastomerbase og elastomerhærdningsmiddel i et forhold på 10:1 w/w i en planetarisk centrifuge. Hæld blandingen på både mikroindkapslingsmasterforme og dissociationsmasterform for at skabe et 3-4 mm lag.
2. Fremstilling af opløsninger
- Lagerløsninger. Forbered først stamopløsninger (koncentrerede opløsninger), der vil blive fortyndet til lavere koncentrationer til faktisk brug.
BEMÆRK: Lagerløsninger bruges til at spare forberedelsestid, spare materialer, reducere lagerplads og forbedre nøjagtigheden, når der udarbejdes en arbejdsløsning i lavere koncentrationer.- Forbered 30 ml 2x kerneopløsning (16% PEG og 34% densitetsgradientmedier): bland 4,8 g 35 kDa PEG, 10,2 ml densitetsgradientmedier og 19,8 ml DMEM/F12-medier. Filtrer denne kerneopløsning ved hjælp af et 0,22 μm sprøjtefilter.
- Forbered 50 ml mineralolie med 3% overfladeaktivt stof: Bland 48,5 ml mineralolie og 1,5 ml overfladeaktivt stof. Opbevares i steril tilstand efter filtrering gennem et 0,22 μm sprøjtefilter.
- Forbered 50 ml mineralolie med 0,5% overfladeaktivt stof: Bland 49,75 ml mineralolie og 0,25 ml overfladeaktivt stof. Opbevares i steril tilstand.
- Forbered 1 M Dithiotheritol (DTT): 1,5425 g DTT opløses i 10 ml destilleret vand. Opbevares i steril tilstand.
- Forbered 1 M triethanolamin (TEA): Tilsæt 66,4 μL TEA i 433,6 μL destilleret vand. Opbevares i steril tilstand.
- Forbered 1% Pluronic F127 (PF127): Opløs 100 mg PF127 i 10 ml destilleret vand. Opbevares i steril tilstand.
- Arbejdsløsninger
- Forbered en tværbindingsemulsion ved at blande 4,5 ml mineralolie med 3% overfladeaktivt stof og 300 μL 1 M DTT (1:15 forhold). Vortex opløsningen i 2 min og sonikat i 45-60 min i et ultralydsbad ved 20 °C. Læg denne opløsning på en 5 ml sprøjte med en 27 G nål.
BEMÆRK: Emulsion genereres ved sonikering af olie / vandblanding. - Forbered afskærmningsolieopløsning ved at fylde mineralolien med 0,5% overfladeaktivt stof til en 5 ml sprøjte med en 27 G nål.
- Der fremstilles skalopløsning (8 % w/v PEG-4-Mal og 15 mM TEA) ved at tilsætte 32 mg PEG-4-Mal i 400 μL 1x DPBS til dannelse af 8 % w/v-opløsning, og hvirvel opløsningen i 2 minutter. Derefter tilsættes 6 μL 1 M TEA (endelig koncentration 15 mM TEA). Til sidst centrifugeres ved 13.000 x g i 5 min gennem et spin-filter og opbevares i mørket på vippen i 30 min. Læg derefter denne opløsning i en 1 ml sprøjte med en 27 G nål.
BEMÆRK: Lad PEG-4-Mal-beholderen sidde ved stuetemperatur i 10 minutter, før låget åbnes, ogblæs N2-gas for at erstatteO2 medN2 , inden låget lukkes. Vortex TEA inden tilsætning til opløsningen.
- Forbered en tværbindingsemulsion ved at blande 4,5 ml mineralolie med 3% overfladeaktivt stof og 300 μL 1 M DTT (1:15 forhold). Vortex opløsningen i 2 min og sonikat i 45-60 min i et ultralydsbad ved 20 °C. Læg denne opløsning på en 5 ml sprøjte med en 27 G nål.
- Forbered cellesuspensionen i kerneopløsning
- Behandl hPSC'erne med trypsin i 5 til 10 minutter ved 37 °C. Saml dem derefter fra plader. Sluk trypsin med mediet efter celleløsning, og overfør derefter cellerne til et 15 ml konisk rør.
- Centrifugering af bulkcellesuspensionen (400 x g, 5 min). Aspirer forsigtigt supernatanten, og ophænd derefter cellepillen igen ved hjælp af et minimalt volumen vækstmedium. Tæl cellerne ved hjælp af en automatiseret celletæller.
BEMÆRK: Typiske cellealikvoter indeholder 12-20 x 106 celler og er nok til at fremstille 400 μL af kerneopløsningen. - Tag 12-20 x 106 celler fra bulkcellesuspensionen og centrifuger celle/mediesuspensionen (400 x g, 5 min).
- Aspirer forsigtigt medier fra cellepillen. Derefter tilsættes 200 μL medier og 200 μL 2x PEG-opløsning (slutkoncentration 30-50 x 106 celle/ml) og blandes forsigtigt.
BEMÆRK: Lave cellekoncentrationer (mindre end 20 x 106 celler / ml) resulterede i mange tomme kapsler. - Der tilsættes 30 μL 1% PF127 til opløsningen.
- Indsæt en mikroomrørerstang (2 mm x 7 mm) i en 1 ml sprøjte, og læg derefter cellen indeholdende kerneopløsning i sprøjten med en 27 G nål. Hold opløsningen kold med is under hele indkapslingsprocessen.
3. Eksperimentel opsætning
- Anbring limet PDMS-dråbeanordning, fire stykker på 20 cm lange og et stykke 5 cm lange indløbsmikrorør (0,38 mm I.D. x 1,1 mm O.D.), et stykke 10 cm udløbsrør (0,5 mm I.D. x 1,5 mm O.D.) og seks stykker 0,5 cm monteringsrør (1 mm I.D. x 1,8 mm O.D.) under en bakteriedræbende lyskilde (typisk indbygget i biologiske sikkerhedsskabe) og steriliser i 30 min.
- Brug tang til at passe slangen ind i de fluidiske indløbsporte og dissociationsportene.
- Brug de tre stykker 20 cm lange indløbsmikrorør til skallen, olien, tværbindingsemulsionsindløbene og et stykke til indløbsindløbet til dissociationsanordningen. Indsæt derefter den modsatte ende af rørene i sprøjtens nål med den tilsvarende opløsning. I mellemtiden skal du forbinde kerneindløbet til den mikrofluidiske enhed og udløbet af dissociationsanordningen med et 5 cm mikrorør (figur 1C).
BEMÆRK: Indløbsmikrorørene skal være tæt fastgjort i monteringsrørene, som blev indsat i det sidste trin. - Indsæt et udløbsrør i den fluidiske udløbsport, og anbring den modsatte ende i et opsamlingsbeholder.
- Placer enheden på et mikroskoptrin, og fastgør slangen for at undgå at bevæge sig. Juster og fokuser mikroskopet på enhedens dyse til flowinspektion.
- Anbring hver sprøjte på forskellige sprøjtepumper og fastgør den korrekt (figur 1B). Programmer hver pumpe i henhold til producentens protokoller til følgende strømningshastigheder: kerne (3-5 μL / min), skal (3-5 μL / min), afskærmningsolie (20-80 μL / min) og tværbindingsolie (40-60 μL / min). Start flowet i alle pumper.
- Vent på, at hver væske kommer ind i enheden, og fyld kanalerne op, mens du skubber den resterende luft ud.
BEMÆRK: Hvis der er en stor mængde luft i indløbsslangen, skal du midlertidigt øge hver strømningshastighed, indtil luften er helt fjernet. Vær opmærksom på, at overdreven strømningshastighed kan føre til PDMS-til-PDMS-obligationsfejl. - Når kapseldannelsen er stabiliseret (figur 3), skal du placere den modsatte ende af opsamlingsrøret til et nyt konisk rør med 5 ml mTeSR-medier.
BEMÆRK: Mediet indeholder 10 μM ROCK-hæmmer, 100 U/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin. - Når et tilstrækkeligt antal kapsler er opsamlet, inkuberes ved 37 °C med 5 % CO2 i 10 minutter. Kapsler, der befinder sig i oliefasen, vil være øverst i røret (se figur 4A). Forsigtigt at banke på røret får kapsler til at sedimentere til bunden. Herefter kan det meste af olien og medierne aspireres.
- Saml kapslerne fra bunden af det koniske rør, læg dem på en cellesil (100 μm porestørrelse), og vask med rigelige mængder medier. Derefter opsamles mikrokapsler ved hjælp af 2 ml medier i en 6-brønds kulturplade ved at køre mediet gennem filteret, da det inverteres oven på brøndpladen (se figur 4A).
4. hPSC-dyrkning og -analyse i mikrokapsler
- Grundlæggende kultur
- Inkuber stamcellekapslerne i en 6-brønds tallerkenkulturskål ved 37 ° C med 5% CO2.
- Skift medier hver anden dag ved at samle kapslerne på et cellesilfilter, vaske dem med overskydende medier og genbruge dem til en ny brønd i 6-brønds plader med 2 ml medier, som det blev gjort i trin 3.10.
- Kultur kapslerne i mindst 10 dage.
- Udfør levende / døde assay for at bestemme levedygtigheden af indkapslede stamceller.
- Optø levende/døde assayopløsninger (ethidium homodimer-1 og calcein AM).
- Der tilsættes 4 μL af 2 μM ethidiumhomodimer-1 og 1 μL af 4 μM calcein AM-opløsningerne til 2 ml steril DPBS. Vortex for at sikre fuldstændig blanding.
- Saml ca. 100 mikrokapsler på en cellesil og skyl dem med sterile DPBS for at tillade diffusion af medium ud fra kapslerne.
- De samles igen på en 12 brøndkulturplade ved anvendelse af 1 ml af opløsningen fremstillet i trin 4.2.2. Inkuber ved 37 °C i 20 minutter.
- Visualiser cellerne under et fluorescensmikroskop.
BEMÆRK: Cellelevedygtighed kvantificeres ved at beregne procentdelen af levende celler, der visualiseres som grønne, blandt det samlede antal celler.
- Sfæroid størrelse karakterisering.
- Når det ønskes, skal du placere brøndpladen med mikrokapsler under mikroskopet og måle diameteren af sfæroider vist på den relaterede software med korrekte skalastænger.
- Mål og analyser sfæroidstørrelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved at følge ovennævnte protokol vil læseren være i stand til at fremstille mikrofluidiske enheder og producere cellebærende mikrokapsler. Figur 3A viser eksempler på optimale og suboptimale mikrokapsler fremstillet ved hjælp af mikrofluidisk dråbegenerering. Forskellige formuleringer af PEG-4-Mal resulterede i kapsler med varierende morfologier - rynkede kapsler var forbundet med dårlig gelering, lav mekanisk integritet og modstod ikke dyrkning i en omrørt bioreaktor. Glatte kapsler observeret ved PEG-indhold på >6% repræsenterede den ønskede kapselmorfologi og var robuste nok til celledyrkning. Kerneskalstrukturen blev bekræftet ved inkorporering af mikroperler i kernen og fluorescerende moieties i skallen af mikrokapsler. Aggregering af perler i midten af kapslerne som det ses i figur 3B blev brugt som indikation på, at kernen var vandig, og perlerne var frie til at bevæge sig rundt. Fluorescerende annulus observeret i figur 3C indikerede tilstedeværelsen af en hydrogelskal og blev brugt til at bestemme skaltykkelsen. Vi anbefaler, at brugerne anvender mikroperleinkorporering og fluorescerende mærkning i de tidlige stadier af etableringen af indkapslingsprocessen.
Når indkapslingsprocessen er etableret, kan man gå videre til indkapsling af hPSC'er. Mens denne protokol beskriver indkapsling af H9-celler, har vi brugt en lignende strategi til indkapsling af en anden hESC-linje (HUES-8) og en iPSC-linje (1016). 7
Mens indkapsling kun kan udføres ved hjælp af indkapslingsanordningen, bemærkede vi, at hPSC'er havde tendens til at klumpe sig sammen i systemet, hvilket resulterede i ikke-ensartet indkapsling eller kapselbelægning. For at løse denne udfordring designede vi en dissociations- eller filtreringsenhed og placerede den opstrøms for indkapslingsenheden. Denne dissociationsanordning omfattede en strømningskanal med en række trekantformede stolper målt 200 μm pr. side og med en stigning fra 400 μm ved indløbet til 30 μm ved udløbet, således at klumper enten fastholdes eller brydes op, inden de kommer ind i indkapslingsanordningen (se figur 1D)7. Anvendelsen af dissociationsanordningen gør det muligt at forbedre ensartetheden af sfæroider betydeligt og øge cellebelægningen af kapsler fra 57% til >90%7.
Figur 4B,C beskriver repræsentative resultater fra en indkapslingskørsel. Som det fremgår af disse billeder, har H9-celler høj levedygtighed med >95% levedygtighed opnået rutinemæssigt under indkapslingskørslerne. Vi sammenlignede vækstraten (se figur 4B,C) og differentieringspotentialet for indkapslede vs. ikke-indkapslede sfæroider7 og fastslog, at indkapslingsprocessen ikke har nogen negative virkninger på hPSC'er. På den anden side er der flere fordele ved at indkapsle hPSC'er. Indkapslede sfæroider er nemme at håndtere og kan udleveres/fordeles i mikrotiterplader til udvikling af differentieringsprotokoller eller testterapier. Vores laboratorium er interesseret i at bruge mikrokapsler som stamcellebærere til suspensionsdyrkning i omrørte bioreaktorer og har vist, at hydrogelskal giver beskyttelse mod forskydningsskader i sådanne kulturer7. Dette er en yderligere vej, som vi forfølger, er at skabe bioaktive mikrokapsler, hvor hydrogelskal kan være fyldt med vækstfaktorer til lokal og kontinuerlig levering af induktive signaler under differentiering.
Figur 1: Fremstilling af kerne-skal-mikrokapsler. (A) Den mikrofluidiske enhed til kapselgenerering består af fire indløbskanaler (kerne-, skal-, olie- og tværbindingsolie) og en serpentinkanal, der fører til et opsamlingsrør. Enheden er fremstillet således, at kerne-, skal- og oliekanaler er henholdsvis 120 μm (H1), 200 μm (H2) og 300 μm (H3) i højden. Indlægget repræsenterer et tværsnitsbillede ved dysen - krydset mellem vandige og oliestrømme. Denne tværsnitsvisning vippes med 90° for at give læseren et bedre overblik over koaksiale strømningskanaler. En 3D-repræsentation af kerne-skal-mikrokapselfremstillingsprocessen viser, hvordan den koaksiale strøm genereres opstrøms for det flowfokuserede kryds for at producere kerne-skal-mikrokapselstruktur. Emulgering opnås ved at udsætte vandige dråber for to oliestrømme, hvoraf den første er designet til at stabilisere dråberne, og den anden til at tilvejebringe tværbindingsforbindelsen DTT, som reagerer med PEG-4-Mal. Dette tal er ændret i forhold til reference12. Copyright 2019, American Chemical Society. B) Eksperimentel opsætning af indkapslingssystemet, der viser placeringen af sprøjtepumper, slanger, mikrofluidiske anordninger og kapselopsamlingsrør. (C) Et billede af indkapslingssystemet, som består af dissociations- og indkapslingsanordninger i en sekvens. D) Design af den mikrofluidiske dissociationsanordning, der anvendes til at undgå, at storcelleaggregater kommer ind i mikroindkapslingsanordningen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Fremstilling af mikrofluidiske anordninger, der anvendes til indkapsling. A) Fremstilling af indkapslingsanordningen. Tre lag SU-8 photoresist blev spin-coated, og foto mønstret for at generere kerne-, skal- og oliekanaler med forskellige højder. Kernekanaler har en bredde på 220 μm, der indsnævres ved kapselkrydset til 135 μm. Kanaler for alle faser følger det samme princip: skal- og oliekanaler starter med en bredde på 500 μm, indsnævres ved krydset til 220 μm, og afskærmningsolie starter ved 500 μm indsnævring til 270 μm. Udløbsserpenin har en bredde på 1,5 mm og en længde på ~55 mm. Top og bund PDMS-stykker blev derefter justeret og plasmabundet. (B) Fremstilling af dissociationsanordningen. Et lag SU-8 photoresist blev spin-coated, og foto mønstret for at generere dissociationskanaler. PDMS-stykket blev derefter plasmabundet med glasglas. Dissociationsanordning består af et lille kammer med en højde på 30 μm, længde på 16,5 mm og bredde på 5 mm ved indløbet og 1,7 mm ved udløbet. Den har trekantformede strukturer (200 μm, ligesidede), der adskilles fra hinanden med 420 μm af indløbet og bliver tættere på vej til udløbet med en adskillelse på 50 μm i den sidste række. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Karakterisering af mikrokapsler. (A) Forskelle i kapselmorfologi som funktion af PEG-4-Mal-indholdet i skallen. Glatte kapsler med lyse kanter er forbundet med ønsket mekanisk integritet. B) Bekræftelse af mikrokapslernes vandige kerne. Indespærrede mikroperler er frie til at bevæge sig i den vandige kerne og aggregere i midten af mikrokapsler. (C) Bekræftelse af kerneskalstrukturen ved at inkorporere Rhodamin B-mærket PEG i skallen af mikrokapsler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Indkapsling af hPSC'er. (A) Mikrokapsler i oliefasen opsamles i et konisk rør fyldt med medier. Efter at mikrokapsler er lavet til at slå sig ned i bunden af røret, aspireres olie og medier, mikrokapsler vaskes og overføres derefter til en 6-brønds plade til dyrkning. (B) Levende/død farvning 6 timer efter indkapsling af H9-celler. Øverste billede blev taget ved 10x og lavere billede ved 20x. (C) Billeder, der sammenligner sfæroidstørrelser, der ændrer sig over tid for H9-celler i kapsler og i kommercielle 3D-kulturplader (nederste billeder). D) Kvantificering af sfæroiddiameter, der øges for hPSC'er i mikrokapsler og i standard 3D-dyrkningsplader i løbet af 7 dage i H9-medier. Statistisk analyse -t-test, p < 0,05, n = 20. Skalabjælke: 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Indkapslingsprocessen beskrevet her resulterer i reproducerbar dannelse af hPSC-sfæroider. Mikrokapselformatet gør det nemt at dispensere sfæroider i brønde på en mikrotiterplade til eksperimenter, der sigter mod at forbedre / optimere differentieringsprotokoller eller testterapier. Indkapslede stamcellesfæroider kan også anvendes i suspensionskulturer, hvor hydrogelskallen beskytter celler mod forskydningsinduceret skade7.
Der er flere kritiske trin i protokollen. Det er vigtigt at holde strømningshastighederne for kerne-, skal- og oliestrømme inden for det område, der er beskrevet i protokolafsnittet. Hvis skalstrømningshastigheden er for lav, bliver strømmen ustabil, hvilket resulterer i forvrængede og mekanisk ustabile kapsler. En vellykket celleindkapsling skal ligne de mikrokapsler, der er vist i figur 4C. Mikrokapsler skal have samme diameter og have et sammenligneligt antal celler fanget i kernen. Aggregering af enkeltceller i sfæroider forekommer typisk inden for 48 timer, og manglende sfæroiddannelse ved 72 timer er et advarselstegn. En af grundene til manglende sfæroiddannelse kan være, at viskøse molekyler i kernen ikke udvaskes hurtigt nok gennem hydrogelskallen. Vi stødte på dette scenario, da vi justerede viskositeten af kerneopløsningen ved anvendelse af polymerer med høj molekylvægt, såsom carboxymethylcellulose (MW 250 kD). Man kan indkapsle mikroperler (se figur 3B) for at teste, om disse cellestore objekter er frie til at bevæge sig rundt om kernen, og hvor hurtigt komponenter i kernen udvaskes. Mangel på sfæroiddannelse blev også stødt på af os, når vi brugte PEG-4-Mal-koncentrationer på >8% w/v. I dette scenario reduceres porøsiteten og diffusiteten af hydrogelskallen, og elementer med høj viskositet i kernen udvaskes ikke hurtigt nok til, at celler kan dannes til aggregater. Det er tænkeligt, at kvaliteten af PEG-4-Mal kan variere fra batch til batch eller producent. Derfor kan en vis justering af polymerkoncentrationen i skallen være nødvendig. Endnu en gang skal perleinkorporeringsmetoden afsløre, hvor hurtigt viskøse komponenter i kernen fortrænges af vandmolekyler. Efter vores erfaring bør dette ske inden for 3 timer efter overførsel af mikrokapsler til det vandige miljø.
Indkapslingsprotokollen beskrevet her har fungeret godt for flere hPSC-linjer7, primære hepatocytter10 og flere kræftcellelinjer (upublicerede resultater). Vi stødte dog på vanskeligheder med at danne sfæroider efter indkapsling af stamcelleafledte (sc)-hepatocytter og sc-β-celler. Fejlfinding med indkapslede mikroperler afslørede, at viskøse komponenter hurtigt blev elueret fra kernen, og at celler var frie til at bevæge sig og danne celle-cellekontakter. Yderligere fejlfinding involverede titreringskoncentrationen af di-thiol-tværbindingSDT (til stede i oliefasen) ned fra 66 mM til 10 mM. Sfæroiddannelse for sc-hepatocytter og β-celler forekom ved denne lavere koncentration af DTT. Derfor kan brugeren overveje at optimere koncentrationen på tværs af links, men kun hvis andre fejlfindingstrin, der er anført ovenfor, ikke er lykkedes. Vi finder, at DTT-koncentration er afgørende for at opretholde mekanisk integritet af mikrokapsler med 66 mM DTT, hvilket resulterer i mekanisk robuste mikrokapsler og er giftfri for langt de fleste celletyper, der er brugt til dato.
En række strategier til at skabe 3D-stamcellekonstruktioner er blevet beskrevet i litteraturen. Fordelene ved at danne stamcellekonstruktioner inden for kerneskalmikrokapsler er flere. Når de er indkapslet, kan sfæroider håndteres med lethed med hydrogelkapsler, der giver beskyttelse mod forskydningsskader. Indkapslede sfæroider kan dyrkes i suspension med kraftig omrøring uden at beskadige stamceller.
Der er flere muligheder for at udvide mikrokapslernes muligheder. Vores team har tidligere beskrevet brugen af heparinholdige hydrogeler til indkapsling af hepatocytter og stamceller 8,12 og udvikler i øjeblikket heparinholdige bioaktive kerneskalmikrokapsler, der fungerer som depoter til opbevaring og lokal frigivelse af induktive signaler (GF'er) til stamceller. Sådanne mikrokapsler kan bidrage til at mindske brugen af dyre GF'er og samtidig forbedre differentieringsresultaterne. Mikrokapsler kan forbedres yderligere ved at inkorporere ECM-proteiner i kernen og dermed modulere stamcellemikromiljø. Core-shell mikrokapsler kan gøres nedbrydelige for at gøre det lettere at hente hPSC-sfæroider13,14. Samlet set repræsenterer kerneskalmikrokapsler en platformteknologi, der kan ændres og forbedres for at imødekomme behovene i en specifik stamcelledifferentieringsprotokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev delvist støttet af bevillingerne fra Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, J. W. Kieckhefer Foundation, Al Nahyan Foundation, Regenerative Medicine Minnesota (RMM 101617 TR 004) og NIH (DK107255).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe Filters | Genesee Scientific | 25-244 | |
| 1 ml syringe luer-lock tip | BD | 309628 | |
| 1x DPBS | Corning | 23220003 | |
| 4-arm PEG maleimide, 10kDa | Laysan Inc. | 164-68 | |
| 5 ml syringe luer-lock tip | BD | 309646 | |
| 6-WELL NON-TREATED PLATE | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Aquapel Applicator Pack | Aquapel Glass Treatment | 47100 | |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD v2020 | |
| CELL STRAINER 100 µm pore size | cardinal | 335583 | |
| Chlorotrimethylsilane | Aldrich | 386529-100mL | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Life technology | A27974 | |
| Digital hot plate | Dataplate | ||
| Digital vortex mixer | Fisher Scientific | 215370 | |
| Distilled water | Gibco | 15230-162 | |
| Dithiotheritol (DTT) | Sigma | D0632-10G | |
| DMEM/F12 media | gibco | 11320-033 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge | live | 13-100-675 | |
| HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Inverted Fluorescence Motorized Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Laurell Spin Coaters | Laurell Technologies | WS-650MZ-23NPPB | |
| Live/Dead mammalian staining kit | Fisher | L3224 | |
| Magic tape | Staples | 483535 | |
| Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.) | Scientific Commodities, Inc | BB31695-PE/2 | |
| Micro stir bar | Daigger Scientific | EF3288E | |
| MilliporeSigma Filter Forceps | Fisher scientific | XX6200006P | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | |
| mTeSR 1 Basal Medium | STEMCELL TECHNOLOGY | 85850 | |
| Needles-Stainless Steel 14 Gauge | CML supply | 901-14-025 | |
| Needles-Stainless Steel 15 Gauge | CML supply | 901-15-050 | |
| OptiPrep | STEMCELL TECHNOLOGY | 7820 | |
| Oven | Thermo Scientific | HERA THERM Oven | |
| Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin) | Gemini | 400-109 | |
| Petri Dish 150X20 Sterile Vent | Sarstedt, Inc. | 82.1184.500 | |
| Plasma Cleaning System | Yield Engineering System, Inc. | YES-G500 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| Poly(ethylene glycol) 35kDa | Sigma | 94646-250G-F | |
| PrecisionGlide Needle 27G | BD | 305109 | |
| Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride | SELLECK CHEM | S1049-10mg | |
| Silicon wafer 100mm | University Wafer | 452 | |
| Slide glass (75mm ´ 25mm) | CardinalHealth | M6146 | |
| Span 80 | Sigma | S6760-250ML | |
| SpeedMixer | Thinky | ARE-310 | |
| Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm) | Costar | 8160 | |
| SU-8 2025 | Kayaku Advanced Materials | Y111069 0500L1GL | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials | Y020100 4000L1PE | |
| Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades | fisher scientific | 22-079-684 | |
| SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 2065622 | |
| Syringe pump | New Era Pump System, Inc | NE-4000 | |
| Triethanolamine | Sigma-aldrich | T58300-25G | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-01 | |
| Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-04 | |
| Ultrasonic cleaner FS20D | Fisher Scientific | CPN-962-152R | |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42025-0000 | |
| Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x | ZEISS | 435421-0000-000 | |
| μPG 101 laser writer | Heidelberg Instruments | HI 1128 |
References
- Zhu, Z., Huangfu, D. Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology. Development. 140 (4), 705-717 (2013).
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).
- Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).
- Lei, Y., Schaffer, D. V. A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).
- Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
- Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells. Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).
- Fattahi, P., et al. Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor. Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).
- Siltanen, C., et al. Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids. Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).
- Agarwal, P., et al. One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells. Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).
- Siltanen, C., et al. One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids. Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).
- Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood. ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).
- Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes. Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).
- Shin, D. S., et al. Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells. Angewandte Chemie International Edition. , (2014).
- You, J., et al. Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells. Advanced Functional Materials. , (2015).
