Summary
Este artigo descreve o encapsulamento de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) usando um dispositivo de foco de fluxo coaxial. Demonstramos que essa tecnologia de encapsulamento microfluido permite a formação eficiente de esferoides hPSC.
Abstract
Culturas tridimensionais (3D) ou esferoides de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) oferecem os benefícios de melhores resultados de diferenciação e escalabilidade. Neste artigo, descrevemos uma estratégia para a formação robusta e reprodutível de esferoides hPSC onde um dispositivo de foco de fluxo coaxial é utilizado para prender hPSCs dentro de microcápsulas de conchas centrais. A solução central continha suspensão celular única de hPSCs e foi feita viscosa pela incorporação de poli de alto peso molecular (etileno glicol) (PEG) e mídia gradiente de densidade. O fluxo de conchas era composto por PEG-4 arm-maleimide ou PEG-4-Mal e fluiu ao lado do fluxo central em direção a duas junções de óleo consecutivas. A formação de gotículas ocorreu na primeira junção de óleo com a solução shell envolvendo-se em torno do núcleo. A interligação química da casca ocorreu na segunda junção de óleo introduzindo um crosslinker di-thiol (1,4-dithiothreitol ou DTT) nessas gotículas. O crosslinker reage com grupos funcionais de maleimiide via química de clique, resultando na formação de uma concha de hidrogel ao redor das microcápsulas. Nossa tecnologia de encapsulamento produziu cápsulas de 400 μm de diâmetro a uma taxa de 10 cápsulas por segundo. As cápsulas resultantes tinham uma concha de hidrogel e um núcleo aquoso que permitia que células únicas se reunissem rapidamente em agregados e formassem esferoides. O processo de encapsulamento não afetou negativamente a viabilidade dos hPSCs, com viabilidade >95% observada 3 dias após o encapsulamento. Para comparação, os hPSCs encapsulados em micropartículas de gel sólido (sem núcleo aquoso) não formavam esferoides e tinham <50% de viabilidade 3 dias após o encapsulamento. A formação esferoide de hPSCs dentro de microcápsulas de conchas núcleo ocorreu dentro de 48 h após o encapsulamento, com o diâmetro esferoide sendo uma função da densidade de inoculação celular. No geral, a tecnologia de encapsulamento microfluido descrita neste protocolo foi adequada para encapsulamento de hPSCs e formação de esferoides.
Introduction
Há um interesse considerável nas culturas 3D das células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) devido à melhoria da pluripotência e potencial de diferenciação proporcionada por esse formato de cultura 1,2,3. hPSCs são tipicamente formados em esferoides ou outros formatos de cultura 3D por meio de bioreatores, microwells, hidrogéis e andaimes poliméricos 4,5,6. Encapsulamento oferece outro meio para organizar hPSCs únicos em esferoides. Uma vez encapsulados spheroids hPSC podem ser tratados com facilidade e transferidos para placas de microtiter para diferenciação, modelagem de doenças ou experimentos de teste de drogas. Encostendo hPSCs em uma camada de hidrogel também protege as células contra danos à tesoura e permite cultivar esferoides em um bioreator a altas taxas de agitação7.
Nossa metodologia de encapsulamento de células-tronco evoluiu ao longo do tempo. Primeiro, focamos em micropartículas de hidrogel sólido e demonstramos o sucesso do encapsulamento e cultivo de células-tronco embrionárias de camundongos (mESCs)8. No entanto, observou-se que as células-tronco embrionárias humanas (hESCs) tinham baixa viabilidade quando encapsuladas em tais micropartículas de hidrogel, presumivelmente devido à maior necessidade dessas células de restabelecer contatos celulares após o encapsulamento. Argumentamos que a microcápsula heterogênea, possuindo um núcleo aquoso, pode ser mais adequada para o encapsulamento de células que dependem do rápido restaneamento de contatos celulares. O conceito de fluxo coaxial com foco de dispositivo microfluido para fazer microcápsulas de conchas de núcleo/hidrogel aquosos foi adaptado a partir de He et al.9, mas em vez de alginato empregado na abordagem original, um hidrogel à base de PEG foi incorporado à concha. Primeiro demonstramos encapsulamento bem sucedido e formação esferoide de hepatócito primário em microcápsulas de conchas núcleo10 e mais recentemente descreveu o encapsulamento das células hES e iPS7. Conforme descrito na Figura 1A, as cápsulas são fabricadas em um dispositivo de focalizar o fluxo onde os fluxos de fluxo da concha e do núcleo transitam de fluxo lateral para o coaxial antes da ejeção para a fase do óleo. O fluxo do núcleo contém células e aditivos que aumentam a viscosidade da solução (PEG MW 35kD não reativo e iodixanol - nome comercial OptiPrep), enquanto o fluxo de conchas contém moléculas reativas (PEG-4-Mal). O fluxo de fluxo coaxial contínuo é discretizado em gotículas que retêm a arquitetura de conchas de núcleo. A estrutura do núcleo-shell é permanente pela exposição ao di-thiol crosslinker (DTT), que reage com PEG-4-Mal via química de clique e resulta na formação de uma fina (~10 μm) pele ou concha de hidrogel. Depois que a emulsão é quebrada e as cápsulas são transferidas para uma fase aquosa, moléculas de PEG se difundem do núcleo e são substituídas por moléculas de água. Isso resulta em microcápsulas aquosas do núcleo e da concha de hidrogel.
Fornecidos abaixo estão instruções passo a passo sobre como fazer dispositivos microfluidos, como preparar células e como realizar o encapsulamento de hPSCs.
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Protocol
1. Fabricação de dispositivos
- Faça os projetos para o dispositivo de microencapsulação e dispositivo de dissociação usando o software CAD10,11.
- Gire as três camadas de fotoresist SU-8 sequencialmente em um wafer de silício (Figura 2A) para alcançar estruturas com as alturas desejadas: 60, 100 e 150 μm.
NOTA: O processo para os moldes superior e inferior é idêntico.- Gire um wafer de silício limpo de 10 cm com fotoresist negativo SU-8 2025 a 1.100 rpm para criar a primeira camada de 60 μm. Depois de um cozimento macio a 65 °C por 3 min e 95 °C por 10 min em uma placa quente, exponha o molde usando um alinhador sem máscara carregando o arquivo de design do padrão do canal principal para o PC μPG 101. Em seguida, prossiga com o cozimento pós-exposição a 65 °C por 3 min e a 95 °C por 10 min.
- Gire a segunda camada SU-8 2025 (40 μm) a 1.500 rpm e exponha carregando o arquivo CAD apropriado para o padrão do canal shell.
NOTA: Os bolos macios e pós-exposição foram semelhantes à etapa anterior. - Gire a terceira camada SU-8 2025 a 1.400 rpm para atingir 50 μm de altura e repetir o processo acima, mas exponha as estruturas para a fase do óleo.
- Desenvolva o molde com todas as três camadas em um único passo por submersão no desenvolvedor SU-8 até que todos os fotoresist não expostos sejam removidos.
- Asse duro o molde em uma placa quente a 160 °C por 10 minutos para melhorar a adesão e selar pequenas rachaduras que poderiam aparecer após o desenvolvimento.
- Exponha o molde ao clorofometilsilano para evitar a ligação de elastômero na próxima etapa e coloque-o em pratos petri de 15 cm até o uso.
- Prepare o molde do dispositivo de dissociação da mesma forma, conforme descrito na Figura 1D e Figura 2B. Gire uma camada de fotoresist SU-8 em um wafer de silício, como descrito anteriormente na etapa 1.2.3, para alcançar estruturas com a altura desejada: 50 μm. Conduza o cozimento macio e pós-exposição, desenvolvimento e cozimento duro da mesma forma que a etapa anterior.
NOTA: Uma matriz de postes em forma de triangular cobriu toda a câmara, com o espaçamento entre os postes diminuindo à medida que a largura da câmara diminuía em direção à tomada. Os postes triângulo foram de 200 μm por lado com um arremesso variando de 400 μm (na entrada) a 30 μm (na tomada). - Prepare os moldes por litografia macia usando poliditilsiloxano (PDMS).
- Misture base de elastômero PDMS e agente de cura de elastômero em uma proporção de 10:1 w/w em uma centrífuga planetária. Despeje a mistura em ambos os moldes mestres de microencapsulação e molde mestre de dissociação para criar uma camada de 3-4 mm.
NOTA: Uma mistura de 50 g de base de elastômero com 5 g de agente de cura é suficiente para cobrir um molde mestre com espessura de 3 mm. - Coloque as placas de Petri contendo os moldes em um desiccador a vácuo por 15 minutos para desafosar o PDMS nãocurado.
- Mova as louças de Petri para um forno e leve ao forno a 80 °C por um mínimo de 60 min.
- Retire os moldes mestres do forno e deixe esfriar. Usando uma faca de precisão, corte cuidadosamente o PDMS seguindo a forma do wafer e retire as peças do PDMS do molde mestre.
- Corte as lajes PDMS aparando as bordas de cada dispositivo com um bisturi, em seguida, solve as portas fluidas de entrada/saída no dispositivo de dissociação e apenas no dispositivo microfluidic superior usando agulhas de aço inoxidável. Cubra os dispositivos com fita mágica para evitar contaminação.
NOTA: O medidor de agulha é de 14 G e 15 G para portas de entrada e saída, respectivamente. - Para a ligação, trate os lados padronizados das peças PDMS superior e inferior com plasma O2 em um plasma etcher por 2 minutos.
- Alinhe ambas as peças de PDMS sob um estereoscópio depois de adicionar uma fina camada de separação de água destilada diretamente nos microcanais (2 μL).
- Coloque o dispositivo PDMS alinhado no forno a 80 °C durante a noite para completar a ligação e restaurar o PDMS ao seu estado hidrofóbico original. Armazene os dispositivos até que use mais.
NOTA: Isso resulta em um dispositivo coaxial de foco de fluxo com três alturas diferentes de 120 μm para núcleo, 200 μm para shell e 300 μm para canais de óleo. - A fim de usar o dispositivo logo após a ligação plasmática, injete cuidadosamente, mas firmemente, 30 μL de solução de revestimento hidrofóbico nos canais fluidos para alcançar o revestimento hidrofóbico. Em seguida, expurgue imediatamente o ar nos canais até que não sejam observados resíduos da solução de revestimento hidrofóbico no dispositivo.
- Conecte o dispositivo de dissociação tratando primeiro o lado padronizado do dispositivo e um vidro deslizante limpo com plasma O2 por 2 minutos, e depois monte-os para uma maior cura no forno a 80 °C durante a noite.
NOTA: Os dispositivos podem ser armazenados até que sejam usados.
- Misture base de elastômero PDMS e agente de cura de elastômero em uma proporção de 10:1 w/w em uma centrífuga planetária. Despeje a mistura em ambos os moldes mestres de microencapsulação e molde mestre de dissociação para criar uma camada de 3-4 mm.
2. Preparação de soluções
- Soluções de estoque. Primeiro, prepare soluções de estoque (soluções concentradas) que serão diluídas para menores concentrações para uso real.
NOTA: As soluções de estoque são usadas para economizar tempo de preparação, conservar materiais, reduzir o espaço de armazenamento e melhorar a precisão ao preparar uma solução de trabalho em concentrações mais baixas.- Prepare 30 mL de solução núcleo 2x (16% PEG e 34% de massa gradiente de densidade): misture 4,8 g de 35 kDa PEG, 10,2 mL de mídia gradiente de densidade e 19,8 mL de mídia DMEM/F12. Filtre esta solução principal usando um filtro de seringa de 0,22 μm.
- Prepare 50 mL de óleo mineral com 3% de surfactante: misture 48,5 mL de óleo mineral e 1,5 mL de surfactante. Mantenha-se em uma condição estéril após a filtragem através de um filtro de seringa de 0,22 μm.
- Prepare 50 mL de óleo mineral com 0,5% de surfactante: misture 49,75 mL de óleo mineral e 0,25 mL de surfactante. Mantenha-se em uma condição estéril.
- Prepare 1 M Dithiotheritol (DTT): dissolva 1,5425 g de DTT em água destilada de 10 mL. Mantenha-se em uma condição estéril.
- Prepare 1 M Trietanolamina (TEA): adicione 66,4 μL de TEA em 433,6 μL de água destilada. Mantenha-se em uma condição estéril.
- Prepare 1% Pluronic F127 (PF127): dissolver 100 mg de PF127 em 10 mL de água destilada. Mantenha-se em uma condição estéril.
- Soluções de trabalho
- Prepare uma emulsão crosslinker misturando 4,5 mL de óleo mineral com 3% de surfactante e 300 μL de 1 M DTT (razão de 1:15). Vórtice a solução para 2 min e sonicate por 45-60 min em um banho ultrassônico a 20 °C. Carregue esta solução para uma seringa de 5 mL com uma agulha de 27 G.
NOTA: A emulsão é gerada pela mistura óleo/água sônica. - Prepare a solução de óleo de blindagem carregando o óleo mineral com 0,5% de surfactante a uma seringa de 5 mL com uma agulha de 27 G.
- Prepare a solução shell (8% c/v PEG-4-Mal e 15 mM TEA) adicionando 32 mg de PEG-4-Mal em 400 μL de 1x DPBS para formar solução de 8% w/v, e vórtice da solução por 2 min. Em seguida, adicione 6 μL de 1 M TEA (concentração final de 15 mM TEA). Finalmente, centrífuga a 13.000 x g por 5 min através de um spin-filter e mantê-lo no escuro no roqueiro por 30 minutos. Em seguida, carregue esta solução para uma seringa de 1 mL com uma agulha de 27 G.
NOTA: Deixe o recipiente PEG-4-Mal para sentar à temperatura ambiente por 10 minutos antes de abrir a tampa, e soprar gás N2 para substituir o O2 por N2 antes de fechar a tampa. Vortex TEA antes de adicionar à solução.
- Prepare uma emulsão crosslinker misturando 4,5 mL de óleo mineral com 3% de surfactante e 300 μL de 1 M DTT (razão de 1:15). Vórtice a solução para 2 min e sonicate por 45-60 min em um banho ultrassônico a 20 °C. Carregue esta solução para uma seringa de 5 mL com uma agulha de 27 G.
- Prepare a suspensão da célula na solução principal
- Trate os hPSCs com trippsina por 5 a 10 min a 37 °C. Então, recolham-nas das placas. Sacie a trippsina com o meio após o descolamento celular e, em seguida, transfira as células para um tubo cônico de 15 mL.
- Centrifugar a suspensão da célula a granel (400 x g, 5 min). Aspire cuidadosamente o supernasce e, em seguida, resuspende a pelota celular usando um volume mínimo de meio de crescimento. Conte as células usando um contador automático de células.
NOTA: As alíquotas típicas das células contêm células de 12-20 x 106 e são suficientes para fazer 400 μL da solução principal. - Pegue 12-20 x 106 células da suspensão da célula a granel e centrifugar a suspensão celular/mídia (400 x g, 5 min).
- Aspirar cuidadosamente a mídia da pelota celular. Em seguida, adicione 200 μL de mídia e 200 μL de solução PEG 2x (concentração final 30-50 x 106 células/mL) e misture suavemente.
NOTA: Baixas concentrações celulares (menos de 20 x 106 células/mL) resultaram em muitas cápsulas vazias. - Adicione 30 μL de 1% PF127 à solução.
- Insira uma barra de micro agitador (2 mm x 7 mm) em uma seringa de 1 mL e, em seguida, carregue a célula contendo solução central para a seringa com uma agulha de 27 G. Mantenha a solução fria com gelo durante todo o processo de encapsulamento.
3. Configuração experimental
- Coloque o dispositivo de gotícula PDMS ligado, quatro peças de 20 cm de comprimento e um pedaço de micro tubos de entrada de 5 cm de comprimento (0,38 mm I.D. x 1,1 mm O.D.), um pedaço de tubo de saída de 10 cm (0,5 mm I.D. x 1,5 mm O.D.), e seis peças de tubos de 0,5 cm de encaixe (1 mm I.D. x 1,8 mm O.D.) sob uma fonte de luz germicidal (tipicamente construída em armários de segurança biológica) e esterilizar para 30 Min.
- Use fórceps para encaixar a tubulação nas portas fluidas de entrada e nas portas de dissociação.
- Use as três peças de microtubos de entrada de 20 cm de comprimento para as entradas da casca, óleo, entradas de emulsão de crosslinker e uma peça para a entrada do dispositivo de dissociação. Em seguida, insira a extremidade oposta dos tubos à agulha da seringa com a solução correspondente. Enquanto isso, conecte a entrada central do dispositivo microfluido e a saída do dispositivo de dissociação com um microtubo de 5 cm (Figura 1C).
NOTA: Os microtubos de entrada devem ser firmemente fixados dentro dos tubos de encaixe, que foram inseridos na última etapa. - Insira um tubo de saída na porta de saída fluida e coloque a extremidade oposta em um reservatório de coleta.
- Coloque o dispositivo em um estágio de microscópio e conecte a tubulação para evitar se mover. Alinhe e concentre o microscópio no bocal do dispositivo para inspeção de fluxo.
- Coloque cada seringa em diferentes bombas de seringa e fixe corretamente (Figura 1B). Programe cada bomba de acordo com os protocolos do fabricante para as seguintes taxas de fluxo: núcleo (3-5 μL/min), shell (3-5 μL/min), óleo de blindagem (20-80 μL/min) e óleo de crosslinking (40-60 μL/min). Inicie o fluxo em todas as bombas.
- Aguarde que cada fluido entre no dispositivo e encha os canais enquanto empurra o ar restante.
NOTA: Se houver uma grande quantidade de ar na tubulação de entrada, aumente temporariamente cada vazão até que o ar seja completamente removido. Tenha em mente que a taxa de fluxo excessiva pode levar à falha de títulos PDMS-to-PDMS. - Quando a formação da cápsula estiver estabilizada (Figura 3), coloque a extremidade oposta do tubo de coleta em um novo tubo cônico com 5 mL de mídia mTeSR.
NOTA: A mídia contém inibidor rock de 10 μM, penicilina U/mL de 100 U/mL e estreptomicina de 100 μg/mL. - Após a coleta de um número suficiente de cápsulas, incubar a 37 °C com 5% de CO2 por 10 min. As cápsulas residentes na fase do óleo estarão no topo do tubo (ver Figura 4A). Tocar suavemente no tubo faz com que as cápsulas se sedimentem até o fundo. Depois disso, a maior parte do petróleo e da mídia podem ser aspirados.
- Recolher as cápsulas da parte inferior do tubo cônico, colocá-las em um coador de células (tamanho de poros de 100 μm) e lavar com quantidades abundantes de mídia. Em seguida, colete microcápsulas usando mídia de 2 mL em uma placa de cultura de 6 poços, executando a mídia através do filtro, pois ela é invertida em cima da placa de poço (ver Figura 4A).
4. cultura e análise hPSC em microcápsulas
- Cultura básica
- Incubar as cápsulas de células-tronco em um prato de cultura de placa de 6 poços a 37 °C com 5% de CO2.
- Mude a mídia a cada dois dias coletando as cápsulas em um filtro de coador de células, lavando-as com excesso de mídia e reutilizando-as para um novo poço em placas de 6 poços com mídia de 2 mL como foi feito na etapa 3.10.
- Cultue as cápsulas por pelo menos 10 dias.
- Realize o ensaio vivo/morto para determinar a viabilidade das células-tronco encapsuladas.
- Descongelar soluções de ensaio ao vivo/morto (ethidium homodimer-1 e calcein AM).
- Adicione 4 μL do homodimer-1 e 1 μL de 4 μM calcein AM a 2 mL de DPBS estéreis. Vórtice para garantir a mistura completa.
- Colete aproximadamente 100 microcápsulas em um coador de células e enxágue-as com DPBS estéreis para permitir a difusão do meio fora das cápsulas.
- Colete-os novamente em uma placa de cultura de 12 poços usando 1 mL da solução preparada na etapa 4.2.2. Incubar a 37 °C por 20 min.
- Visualize as células sob um microscópio de fluorescência.
NOTA: A viabilidade celular é quantificada pelo cálculo da porcentagem de células vivas, que são visualizadas como verdes, entre o número total de células.
- Caracterização do tamanho de spheroid.
- Quando desejar, coloque a placa do poço com microcápsulas sob o microscópio e meça o diâmetro dos esferoides mostrados no software relacionado com barras de escala adequadas.
- Meça e analise o tamanho do esferoide.
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Representative Results
Seguindo o protocolo acima mencionado, o leitor poderá fabricar dispositivos microfluidos e produzir microcápsulas portadoras de células. A Figura 3A mostra exemplos de microcápsulas ótimas e subótimas fabricadas usando geração de gotículas microfluídicas. Diferentes formulações de PEG-4-Mal resultaram em cápsulas de morfologias variadas - cápsulas enrugadas estavam associadas à má gelação, baixa integridade mecânica e não resistivam ao cultivo em um bioreator mexido. Cápsulas lisas observadas no teor peg de >6% representavam a morfologia da cápsula desejada e eram robustas o suficiente para o cultivo celular. A estrutura do núcleo-shell foi confirmada pela incorporação de microesferas no núcleo e moieties fluorescentes na concha de microcápsulas. A agregação de contas no centro das cápsulas, como visto na Figura 3B , foi usada como indicação de que o núcleo era aquoso, e as contas estavam livres para se mover. O anulo fluorescente observado na Figura 3C indicou a presença de uma concha de hidrogel e foi usado para determinar a espessura da casca. Recomendamos que os usuários empreguem incorporação de microesferas e rotulagem fluorescente nos estágios iniciais do estabelecimento do processo de encapsulamento.
Uma vez estabelecido o processo de encapsulamento, pode-se passar para o encapsulamento de hPSCs. Embora este protocolo descreva o encapsulamento de células H9, usamos uma estratégia semelhante para encapsular outra linha hESC (HUES-8) e uma linha iPSC (1016). 7
Embora o encapsulamento possa ser realizado usando apenas o dispositivo de encapsulamento, notamos que os hPSCs tendem a se agrupar no sistema, resultando em encapsulamento não uniforme ou ocupação da cápsula. Para enfrentar este desafio, projetamos um dispositivo de dissociação ou filtração e o posicionamos a montante do dispositivo de encapsulamento. Este dispositivo de dissociação compreendeu um canal de fluxo com uma matriz de postagens em forma de triângulo medidos 200 μm por lado e com tom variando de 400 μm na entrada a 30 μm na tomada de tal forma que os aglomerados são retidos ou quebrados antes de entrar no dispositivo de encapsulamento (ver Figura1D)7. O uso do dispositivo de dissociação permite melhorar significativamente a uniformidade dos esferoides e aumentar a ocupação celular de cápsulas de 57% para >90%7.
Figura 4B,C descreve resultados representativos de uma corrida de encapsulamento. Como pode ser visto a partir dessas imagens, as células H9 têm alta viabilidade com > 95% de viabilidade alcançada rotineiramente durante as corridas de encapsulamento. Comparamos a taxa de crescimento (ver Figura 4B,C) e o potencial de diferenciação dos esferoides encapsulados vs. não encapsulados7, e determinamos que o processo de encapsulamento não tem efeitos adversos sobre os hPSCs. Por outro lado, existem vários benefícios para encapsular hPSCs. Esferoides encapsulados são fáceis de manusear e podem ser dispensados/distribuídos em placas de microtiter para o desenvolvimento de protocolos de diferenciação ou terapias de teste. Nosso laboratório está interessado em usar microcápsulas como portadores de células-tronco para o cultivo de suspensão em bioreatores agitados e demonstrou que a casca de hidrogel oferece proteção contra danos causados por tesouras nessas culturas7. Este é um caminho adicional que está sendo perseguido por nós é na criação de microcápsulas bioativas onde a casca de hidrogel pode ser carregada com fatores de crescimento para a entrega local e contínua de pistas indutivas durante a diferenciação.
Figura 1: Fabricação de microcápsulas core-shell. (A) O dispositivo microfluídico para geração de cápsulas consiste em quatro canais de entrada (óleo de núcleo, concha, óleo e crosslinker) e um canal serpentino que leva a um tubo de coleta. O dispositivo é fabricado de tal forma que os canais de núcleo, concha e óleo têm 120 μm (H1), 200 μm (H2) e 300 μm (H3) de altura, respectivamente. O inset representa uma visão transversal no bocal - a junção entre fluxos aquosos e de óleo. Esta visão transversal é inclinada por 90° para dar ao leitor uma melhor visão dos canais de fluxo coaxial. Uma representação 3D do processo de fabricação de microcápsulas do núcleo-shell descreve como o fluxo coaxial é gerado a montante da junção de foco de fluxo para produzir estrutura de microcápsula de conchas do núcleo. A emulsificação é alcançada expondo gotículas aquosas a dois fluxos de óleo, a primeira delas projetada para estabilizar as gotículas, e a segunda para fornecer o crosslinker DTT, que reage com PEG-4-Mal. Este valor foi modificado a partir da referência12. Copyright 2019, American Chemical Society. (B) Configuração experimental do sistema de encapsulamento mostrando locais de bombas de seringa, tubos, dispositivos microfluidos e tubo de coleta de cápsulas. (C) Uma imagem do sistema de encapsulamento, que consiste em dispositivos de dissociação e encapsulamento em uma sequência. (D) Projeto do dispositivo de dissociação microfluidic usado para evitar grandes agregados celulares que entram no dispositivo de microencapsulação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fabricação de dispositivos microfluidos utilizados para encapsulamento. (A) Fabricação do dispositivo de encapsulamento. Três camadas de fotoresist SU-8 foram revestidas de spin,e foto padronizada para gerar núcleo, concha e canais de óleo com diferentes alturas. Os canais principais têm uma largura de 220 μm que se estreita na junção da cápsula para 135 μm. Os canais para todas as fases seguem o mesmo princípio: os canais shell e óleo começam com uma largura de 500 μm, estreitando na junção para 220 μm, e o óleo de blindagem começa em 500 μm estreitando para 270 μm. A serpentina de saída tem uma largura de 1,5 mm e um comprimento de ~55 mm. As peças de PDMS superior e inferior foram então alinhadas, e o plasma ligado. (B) Fabricação do dispositivo de dissociação. Uma camada de fotoresist SU-8 foi revestida de spin-coated, e foto padronizada para gerar canais de dissociação. A peça do PDMS foi então ligada ao plasma com lâmina de vidro. O dispositivo de dissociação consiste em uma pequena câmara com altura de 30 μm, comprimento de 16,5 mm e largura de 5 mm na entrada e 1,7 mm na tomada. Tem estruturas em forma de triângulo (200 μm, equilátero) que são separadas umas das outras por 420 μm da entrada e se aproximam no caminho para a tomada, com uma separação de 50 μm na última linha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Caracterização de microcápsulas. (A) Diferenças na morfologia da cápsula em função do conteúdo PEG-4-Mal na casca. Cápsulas lisas com bordas brilhantes estão associadas à integridade mecânica desejada. (B) Confirmação do núcleo aquoso das microcápsulas. Microesferas presas são livres para se mover no núcleo aquoso e agregar no centro de microcápsulas. (C) Confirmação da estrutura do núcleo-shell incorporando PEG rotulado por Rhodamine B na concha de microcápsulas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Encapsulamento de hPSCs. (A) As microcápsulas na fase do óleo são coletadas em um tubo cônico cheio de mídia. Depois que microcápsulas são feitas para se acomodar ao fundo do tubo, óleo e mídia são aspirados, microcápsulas são lavadas e depois transferidas para uma placa de 6 poços para cultivo. (B) Coloração viva/morta 6 h após encapsular células H9. Imagem superior foi tirada em 10x, e imagem inferior em 20x. (C) Imagens comparando tamanhos esferoides que mudam ao longo do tempo para células H9 em cápsulas e em placas de cultura 3D comerciais (imagens inferiores). (D) Quantificação do diâmetro esferoide que aumenta para hPSCs em microcápsulas e em placas de cultura 3D padrão durante 7 dias em mídia H9. Análise estatística -t-teste, p < 0,05, n = 20. Barra de escala: 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O processo de encapsulamento descrito aqui resulta na formação reprodutível de esferoides hPSC. O formato de microcápsula facilita a distribuição de esferoides em poços de uma placa de microtítiter para experimentos que visam melhorar/otimizar protocolos de diferenciação ou testar terapias. Esferoides de células-tronco encapsuladas também podem ser usados em culturas de suspensões onde a concha de hidrogel protege as células contra danos induzidos por tesoura7.
Há vários passos críticos dentro do protocolo. É importante manter as taxas de fluxo de correntes de núcleo, concha e óleo dentro do intervalo descrito na seção Protocolo. Se a vazão da concha for muito baixa, o fluxo se torna instável, resultando em cápsulas distorcidas e mecanicamente instáveis. Um encapsulamento celular bem sucedido deve ser semelhante às microcápsulas mostradas na Figura 4C. As microcápsulas devem ter diâmetro semelhante e ter um número comparável de células presas no núcleo. A agregação de células únicas em esferoides normalmente ocorre dentro de 48 h e a falta de formação de esferoides a 72 h é um sinal de alerta. Uma das razões para a falta de formação de esferoides pode ser que moléculas viscosas no núcleo não estão se lixiviando rapidamente o suficiente através da concha de hidrogel. Encontramos esse cenário ao ajustar a viscosidade da solução central utilizando polímeros de alto peso molecular, como celulose carboximetil (MW 250 kD). Pode-se encapsular microesferas (ver Figura 3B) para testar se esses objetos do tamanho de células são livres para se mover em todo o núcleo e quão rapidamente componentes do núcleo lixiviação para fora. A falta de formação de esferoides também foi encontrada por nós ao usar concentrações PEG-4-Mal de >8% c/v. Nesse cenário, a porosidade e a difusividade da casca de hidrogel são diminuídas e elementos de alta viscosidade no núcleo não lixiviam rapidamente o suficiente para permitir que as células se formem em agregados. É concebível que a qualidade do PEG-4-Mal possa variar de lote para lote ou fabricante. Portanto, pode ser necessário algum ajuste da concentração de polímero na casca. Mais uma vez, o método de incorporação de contas deve revelar o quão rapidamente os componentes viscosos no núcleo são deslocados por moléculas de água. Em nossa experiência, isso deve ocorrer dentro de 3h após a transferência de microcápsulas para o ambiente aquoso.
O protocolo de encapsulamento descrito aqui funcionou bem para várias linhas hPSC7, hepatócitos primários10 e múltiplas linhas de células cancerígenas (resultados inéditos). No entanto, encontramos dificuldades na formação de esferoides após o encapsulamento de células-tronco derivadas (sc)-hepatócitos e células sc-β. A solução de problemas com microesferas encapsuladas revelou que os componentes viscosos foram rapidamente eludidos do núcleo e que as células estavam livres para se mover e formar contatos célula-células. A solução adicional de problemas envolveu a concentração titulante do di-thiol crosslinker DTT (presente na fase de óleo) de 66 mM para 10 mM. A formação esferoide para sc-hepatócitos e células β ocorreu nesta menor concentração de DTT. Portanto, o usuário pode querer considerar a otimização da concentração do crosslinker, mas apenas se outras etapas de solução de problemas listadas acima não tiverem sido bem sucedidas. Descobrimos que a concentração de DTT é fundamental para manter a integridade mecânica de microcápsulas com 66 mM DTT resultando em microcápsulas mecanicamente robustas e não sendo tóxica para a grande maioria dos tipos de células usadas até hoje.
Uma série de estratégias para a criação de construtos de células-tronco 3D foram descritas na literatura. Os benefícios da formação de construções de células-tronco dentro de microcápsulas de conchas são múltiplos. Uma vez encapsulados, os esferoides podem ser manuseados com facilidade com cápsulas de hidrogel que fornecem proteção contra danos causados pela tesoura. Esferoides encapsulados podem ser cultivados em suspensão com agitação vigorosa sem danificar células-tronco.
Existem vários caminhos para expandir as capacidades de microcápsulas. Nossa equipe descreveu anteriormente o uso de hidrogéis contendo heparina para encapsulamento de hepatócitos e células-tronco 8,12, e está atualmente desenvolvendo microcapsulas bioativas que servem como depósitos para armazenamento e liberação local de pistas indutivas (GFs) para células-tronco. Essas microcápsulas podem ajudar a diminuir o uso de GFs caros, melhorando os resultados de diferenciação. As microcápsulas podem ser melhoradas incorporando proteínas ECM no núcleo, modulando assim o microambiente de células-tronco. As microcápsulas de conchas-núcleo podem ser degradáveis para facilitar a recuperação de esferoides hPSC13,14. No geral, as microcápsulas de conchas-núcleo representam uma tecnologia de plataforma que pode ser modificada e aprimorada para atender às necessidades de um protocolo específico de diferenciação de células-tronco.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado em parte pelas bolsas do Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, J. W. Kieckhefer Foundation, Al Nahyan Foundation, Regenerative Medicine Minnesota (RMM 101617 TR 004) e NIH (DK107255).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe Filters | Genesee Scientific | 25-244 | |
| 1 ml syringe luer-lock tip | BD | 309628 | |
| 1x DPBS | Corning | 23220003 | |
| 4-arm PEG maleimide, 10kDa | Laysan Inc. | 164-68 | |
| 5 ml syringe luer-lock tip | BD | 309646 | |
| 6-WELL NON-TREATED PLATE | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Aquapel Applicator Pack | Aquapel Glass Treatment | 47100 | |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD v2020 | |
| CELL STRAINER 100 µm pore size | cardinal | 335583 | |
| Chlorotrimethylsilane | Aldrich | 386529-100mL | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Life technology | A27974 | |
| Digital hot plate | Dataplate | ||
| Digital vortex mixer | Fisher Scientific | 215370 | |
| Distilled water | Gibco | 15230-162 | |
| Dithiotheritol (DTT) | Sigma | D0632-10G | |
| DMEM/F12 media | gibco | 11320-033 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge | live | 13-100-675 | |
| HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Inverted Fluorescence Motorized Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Laurell Spin Coaters | Laurell Technologies | WS-650MZ-23NPPB | |
| Live/Dead mammalian staining kit | Fisher | L3224 | |
| Magic tape | Staples | 483535 | |
| Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.) | Scientific Commodities, Inc | BB31695-PE/2 | |
| Micro stir bar | Daigger Scientific | EF3288E | |
| MilliporeSigma Filter Forceps | Fisher scientific | XX6200006P | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | |
| mTeSR 1 Basal Medium | STEMCELL TECHNOLOGY | 85850 | |
| Needles-Stainless Steel 14 Gauge | CML supply | 901-14-025 | |
| Needles-Stainless Steel 15 Gauge | CML supply | 901-15-050 | |
| OptiPrep | STEMCELL TECHNOLOGY | 7820 | |
| Oven | Thermo Scientific | HERA THERM Oven | |
| Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin) | Gemini | 400-109 | |
| Petri Dish 150X20 Sterile Vent | Sarstedt, Inc. | 82.1184.500 | |
| Plasma Cleaning System | Yield Engineering System, Inc. | YES-G500 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| Poly(ethylene glycol) 35kDa | Sigma | 94646-250G-F | |
| PrecisionGlide Needle 27G | BD | 305109 | |
| Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride | SELLECK CHEM | S1049-10mg | |
| Silicon wafer 100mm | University Wafer | 452 | |
| Slide glass (75mm ´ 25mm) | CardinalHealth | M6146 | |
| Span 80 | Sigma | S6760-250ML | |
| SpeedMixer | Thinky | ARE-310 | |
| Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm) | Costar | 8160 | |
| SU-8 2025 | Kayaku Advanced Materials | Y111069 0500L1GL | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials | Y020100 4000L1PE | |
| Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades | fisher scientific | 22-079-684 | |
| SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 2065622 | |
| Syringe pump | New Era Pump System, Inc | NE-4000 | |
| Triethanolamine | Sigma-aldrich | T58300-25G | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-01 | |
| Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-04 | |
| Ultrasonic cleaner FS20D | Fisher Scientific | CPN-962-152R | |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42025-0000 | |
| Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x | ZEISS | 435421-0000-000 | |
| μPG 101 laser writer | Heidelberg Instruments | HI 1128 |
References
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