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Biochemistry

Ensayo continuo de metilación del ADN acoplado a endonucleasa basado en fluorescencia para detectar inhibidores de la metiltransferasa de ADN

Published: August 5, 2022 doi: 10.3791/62949
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Chemistry, Bucknell University, 2Program in Cell Biology/Biochemistry, Bucknell University

Summary

Las metiltransferasas de ADN son posibles objetivos farmacológicos contra el cáncer. Aquí, se presenta un protocolo para evaluar moléculas pequeñas para la inhibición de la metiltransferasa de ADN. Este ensayo utiliza una endonucleasa para acoplar la metilación del ADN a la generación de fluorescencia y permite monitorear la actividad enzimática en tiempo real.

Abstract

La metilación del ADN, una forma de regulación genética epigenética, es importante para la función celular normal. En las células, las proteínas llamadas metiltransferasas de ADN (DNMT) establecen y mantienen el patrón de metilación del ADN. Los cambios en el patrón normal de metilación del ADN están relacionados con el desarrollo y la progresión del cáncer, lo que hace que los DNMT sean posibles objetivos farmacológicos contra el cáncer. Por lo tanto, la identificación y caracterización de nuevos inhibidores de moléculas pequeñas de estas enzimas es de gran importancia. Este documento presenta un protocolo que se puede utilizar para detectar inhibidores de la metiltransferasa de ADN. El ensayo cinético de acoplamiento continuo permite determinar las velocidades iniciales de metilación del ADN en presencia y ausencia de posibles inhibidores de moléculas pequeñas. El ensayo utiliza la endonucleasa sensible al metilo Gla I para acoplar la metilación de un sustrato de ADN hemimetilado a la generación de fluorescencia.

Este ensayo continuo permite monitorizar la actividad enzimática en tiempo real. La realización del ensayo en pequeños volúmenes en placas de microtitulación reduce el costo de los reactivos. Usando este ensayo, se realizó una pequeña pantalla de ejemplo para inhibidores de DNMT1, la isoenzima DNMT más abundante en humanos. El producto natural de antraquinona altamente sustituido, ácido laccaico A, es un potente inhibidor competitivo del ADN de DNMT1. Aquí, examinamos tres posibles inhibidores de moléculas pequeñas: antraquinonas o moléculas similares a la antraquinona con uno a tres sustituyentes, en dos concentraciones para describir el protocolo de ensayo. Las velocidades iniciales se utilizan para calcular el porcentaje de actividad observado en presencia de cada molécula. Uno de los tres compuestos examinados exhibe inhibición dependiente de la concentración de la actividad de DNMT1, lo que indica que es un inhibidor potencial de DNMT1.

Introduction

La metilación del ADN es una marca epigenética importante que regula la expresión génica y la estructura de la cromatina. La metilación ocurre predominantemente en los dinucleótidos CpG: citosina seguida de guanosina; El grupo metilo se añade a la posición 5 de la citosina. Los patrones correctos de metilación del ADN y, por lo tanto, la expresión génica adecuada, son necesarios para el desarrollo y la función celular apropiados. Muchos estados de enfermedad se han asociado con cambios en el patrón normal de metilación 1,2,3. Por ejemplo, existe un vínculo entre el inicio y la progresión del cáncer y las alteraciones en el patrón de metilación del ADN. Por lo general, las células cancerosas exhiben niveles generales más bajos de metilcitosina, lo que contribuye a la inestabilidad del genoma. Al mismo tiempo, la metilcitosina que está presente en el genoma se concentra en las regiones promotoras de los genes supresores de tumores, lo que conduce al silenciamiento génico de estas proteínas importantes. En particular, los cambios epigenéticos son dinámicos y reversibles, a diferencia de las mutaciones del ADN asociadas con la tumorigénesis. Esto ha hecho que las proteínas implicadas en la regulación génica epigenética sean interesantes dianas farmacológicas 2,4.

Las metiltransferasas de ADN (DNMT) son las proteínas responsables de generar y mantener los patrones de metilación del ADN. Tres isoenzimas catalíticamente activas, DNMT1, DNMT3a y DNMT3b, existen en humanos. Durante el desarrollo y la diferenciación, las metiltransferasas de novo, DNMT3a y DNMT3b, establecen patrones de metilación. Ambas enzimas pueden unirse a la proteína DNMT3L catalíticamente inactiva para formar complejos que exhiben una mayor actividad 1,5. Después de la división celular, las células hijas contienen ADN hemimetilado (ADN que contiene metilcitosina en una sola hebra del dúplex) porque el ADN recién sintetizado carece de marcas de metilación. La función principal de DNMT1 es metilar este ADN hemimetilado, restableciendo así el patrón de metilación completo 1,5.

Los vínculos entre la actividad de DNMT y el cáncer están bien establecidos. La sobreexpresión de DNMT1, ya sea por mecanismos transcripcionales o postraduccionales, es una consecuencia de varias vías oncogénicas comunes 6,7,8,9. Los enfoques genéticos para disminuir la actividad de DNMT1 utilizando alelos hipomórficos dan como resultado una disminución de la formación de tumores en ratones Apc(Min)10. Los oligonucleótidos antisentido que derriban DNMT1 inhiben la neoplasia en cultivos celulares y modelos tumorales de ratón11,12. Por lo tanto, la inhibición de la actividad de DNMT1 parece un enfoque prometedor de la terapia contra el cáncer. Sin embargo, los roles que desempeñan las isoenzimas DNMT3 no son tan sencillos. Las mutaciones DNMT3a se encuentran en la leucemia mieloide aguda13 y en el síndrome mielodisplásico14. Se ha demostrado que al menos una de las mutaciones identificadas disminuye la actividad de metilación del ADN de la enzima15. Sin embargo, DNMT3b se sobreexpresa en el cáncer de mama16 y el cáncer colorrectal17. Dado que las diversas isoenzimas DNMT desempeñan diferentes funciones en la carcinogénesis, la identificación de inhibidores específicos de isoenzimas será fundamental. Estos compuestos no solo serán útiles para el desarrollo de terapias, sino que los inhibidores específicos de isoenzimas también serían una herramienta invaluable para diseccionar el papel de cada isoenzima DNMT en la etiología del cáncer.

Varios inhibidores de DNMT han sido reportados en la literatura. Los inhibidores conocidos de DNMT se pueden dividir en dos clases: nucleósidos y no nucleósidos. Los inhibidores de nucleósidos son típicamente análogos de la citidina. Estos compuestos se incorporan al ADN y atrapan covalentemente las DNMT. La 5-azacitidina y la 5-aza-2'-desoxicitidina han sido aprobadas para el tratamiento del síndrome mielodisplásico y la leucemia mieloide aguda 4,18. La alta toxicidad, la baja biodisponibilidad y la inestabilidad química de estos compuestos presentan problemas. El trabajo en curso está examinando la eficacia de la próxima generación de inhibidores de nucleósidos; SGI-110, derivado de 5-aza-2'-desoxicitidina, es un ejemplo 19,20. Los inhibidores de nucleósidos no son isozimas específicos e inactivarán cualquier isoenzima DNMT encontrada. Por lo tanto, el tratamiento con un agente desmetilante de nucleósidos resulta en el agotamiento de todas las isoenzimas DNMT 4,18. Los inhibidores no nucleósidos no necesitan ser incorporados al ADN para ejercer sus efectos inhibitorios. En cambio, estas moléculas se unen directamente a los DNMT, introduciendo la posibilidad de inhibición específica de isoenzimas. Hasta la fecha se han descubierto varios inhibidores no nucleósidos, incluyendo SGI-102721, hidralazina 22, procainamida 23, RG108 y derivados 24, y productos naturales, (-)-epigalocatequina 3-galato (EGCG)25 y ácido laccaico A 26,27. La mayoría de los inhibidores no nucleósidos descubiertos hasta la fecha no son isozimo-selectivos o muestran preferencias débiles por una isoenzima DNMT. Además, la potencia de estas moléculas necesita ser mejorada, especialmente en las células 4,18. Por lo tanto, existe la necesidad de descubrir o desarrollar inhibidores de DNMT más potentes y selectivos de isoenzimas.

Un obstáculo para descubrir nuevos inhibidores de moléculas pequeñas de DNMTs son los laboriosos ensayos tradicionalmente utilizados para examinar la actividad de DNMT28. Los ensayos suelen ser discontinuos con múltiples pasos. La actividad enzimática de las DNMT todavía se ensaya rutinariamente utilizando S-adenosil metionina radiactiva (SAM)29,30,31,32,33,34. También se han desarrollado ensayos no radiactivos para la metilación del ADN. Por ejemplo, se han descrito ensayos que utilizan endonucleasas de restricción sensibles al metilo y electroforesis para separar los productos de digestión35,36. Estos tipos de ensayos discontinuos de varios pasos no son fácilmente susceptibles de descubrimiento de fármacos. Desde mediados de la década de 2000, se han desarrollado varios ensayos de metilación del ADN con un mayor rendimiento28. Se utilizó un ensayo de proximidad de centelleo para detectar inhibidores de DNMT137. Otro ensayo que utilizó una endonucleasa de restricción sensible al metilo se utilizó para detectar inhibidores de DNMT3a25,38. Si bien ambos ensayos permitieron un mayor rendimiento que los ensayos tradicionales de metilación del ADN, los ensayos requieren múltiples pasos y no permiten la observación de la actividad de metilación en tiempo real. Más recientemente, se ha descrito un ensayo cinético continuo que acopla la formación de S-adenosilhomocisteína (SAH), un producto de la reacción de metilación, al cambio espectroscópico a 340 nm asociado con la oxidación de NADPH39. Este ensayo utiliza tres enzimas de acoplamiento para generar una señal espectroscópica.

Desarrollamos un ensayo de metilación del ADN acoplado a endonucleasa basado en fluorescencia que utiliza una sola enzima de acoplamiento disponible comercialmente y puede generar datos en tiempo real (Figura 1). Un oligonucleótido de horquilla que contiene tres metilcitosinas se utiliza como sustrato. El ADN del sustrato contiene un fluoróforo en el extremo 5' y un quencher en el extremo 3'. La metilación del sitio CpG hemimetilado genera el sitio de escisión para la endonucleasa Gla I - GCGC completamente metilado. La escisión Gla I del oligonucleótido producto libera el fluoróforo del exprimidor y genera fluorescencia en tiempo real. El ensayo se puede utilizar para examinar la actividad de cualquier isoforma de DNMT; sin embargo, se observa una mayor actividad con DNMT1 ya que esta isoenzima metila preferentemente el ADN hemimetilado 1,5. Se observa una actividad aún más robusta si el dominio autoinhibitorio Replication Foci Targeting Sequence (RFTS) se elimina de DNMT1. Este dominio, que se encuentra en la región reguladora N-terminal, se une al sitio catalítico y evita la unión del ADN. La eliminación de los primeros ~600 aminoácidos da como resultado una enzima truncada que es significativamente más activa que la enzima de longitud completa (aumento de ~640 veces en kcat / Km)40. Esta forma activada de la enzima, conocida como DNMT1 que carece de RFTS (aminoácidos 621-1616), permite la identificación más fácil de los inhibidores debido a su mayor poder catalítico. Este documento presenta un protocolo para utilizar DNMT1 que carece de RFTS en ensayos para detectar posibles inhibidores de moléculas pequeñas. Usando el ensayo continuo acoplado a endonucleasa, la velocidad inicial se determina en presencia y ausencia de unas pocas moléculas pequeñas. Cada inhibidor potencial se examina en dos concentraciones para buscar la inhibición de DNMT1 dependiente de la concentración. El porcentaje de actividad observado en presencia de las moléculas pequeñas se calculó en cada caso.

Figure 1
Figura 1: Ensayo de metilación del ADN. Se utiliza como sustrato un ADN de horquilla hemimetilada con un fluoróforo en el extremo 5' y un quencher en el extremo 3'. DNMT1 cataliza la transferencia del grupo metilo de S-adenosilmetionina al sitio CpG no metilado, generando S-adenosilhomocisteína y ADN completamente metilado. El producto de ADN contiene el sitio de escisión de la endonucleasa Gla I, que escinde los sitios GCGC completamente metilados. La escisión del ADN del producto libera el fluoróforo 5' del enfriador 3', generando fluorescencia. Abreviaturas: Fl = fluoróforo; Q = enfriador; DNMT1 = ADN metiltransferasa 1; SAM = S-adenosilmetionina; HSA = S-adenosilhomocisteína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocol

1. Prepare soluciones de ensayo para la pantalla

NOTA: Las concentraciones de sustratos utilizados en este ensayo pueden ser adaptadas. Para DNMT1 que carece de RFTS, los valores de Km determinados experimentalmente para el sustrato de ADN de horquilla y SAM son 1–2 nM y 2 μM, respectivamente26,40.

  1. Preparar 600 μL de cada condición de ensayo que se esté probando en tubos de microcentrífuga sobre hielo.
    NOTA: El volumen total de solución de ensayo necesaria depende del número de réplicas que se realicen. Cada condición de ensayo se ejecutó por triplicado para este protocolo.
    1. Agregue ddH 2O y tampón de metilación 5x (250 mM Tris pH 7.5, 5 mM MgCl2, 500 mM glutamato de potasio, 5 mM de ditiothreitol (DTT), 25% de glicerol) a cada tubo para lograr una concentración final de 1x tampón. Para los ensayos que contengan 20 μM de compuesto, añadir 472 μL deddH2Oy 120 μL de tampón 5x. Para los ensayos que contengan un compuesto de 50 μM, añadir 470 μL deddH2Oy 120 μL de tampón 5x.
    2. Añadir 3,15 μL de 20 mg/ml de albúmina sérica bovina (ASC) a cada muestra.
    3. Añadir 2 μL de sustrato de ADN de horquilla de 3,15 μM y 1,33 μL de SAM de 4,75 mM a cada muestra.
      NOTA: La concentración de sustratos en la mezcla de solución de ensayo es 1,05 veces las concentraciones finales deseadas.
    4. Añadir inhibidor a una concentración final de 21 μM (1,26 μL de 10 mM) o 52,5 μM (3,15 μL de 10 mM) a las muestras apropiadas. Agregue una cantidad equivalente de dimetilsulfóxido (DMSO) a una muestra de control.
      NOTA: La concentración del inhibidor utilizado en la pantalla puede variar. La concentración final máxima de DMSO debe ser del ≤5% (v/v). Las concentraciones de DMSO de hasta 5% (v/v) no tienen efecto sobre la actividad observada en el ensayo26.
  2. Mezclar las soluciones por vórtice (3.000 rpm) durante 3 s. Girar las muestras durante unos segundos en una mini centrífuga de mesa (1.200 × g) para asegurarse de que la solución se recoge en el fondo del tubo.
  3. Alícuota 95 μL de cada solución de ensayo en 6 pocillos consecutivos en una placa negra de 96 pocillos de media área (figura 2).
    NOTA: Estos ensayos de selección se realizaron en dos lotes. Primero, se examinaron muestras de inhibidores de 20 μM (4 condiciones totales), seguidas de las muestras de inhibidores de 50 μM (4 condiciones totales).

Figure 2
Figura 2: Configuración de la placa de ensayo. Cada solución de ensayo se alicita en seis pocillos en la placa negra de 96 pocillos: control DMSO (azul), compuesto 1 (verde), compuesto 2 (rojo) y compuesto 3 (amarillo). Tanto DNMT1 como Gla I, que carecen de RFTS, se agregarán a tres pozos. Como control, solo Gla I se agregará a los otros tres pozos. Abreviaturas: RFTS = Replication Foci Targeting Sequence; DNMT1 = ADN metiltransferasa 1; DMSO = dimetilsulfóxido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Preparar soluciones enzimáticas para la detección

NOTA: DNMT1 que carece de RFTS puede expresarse en E. coli y purificarse a homogeneidad. Los procedimientos de expresión y purificación para DNMT1 que carece de RFTS se han descrito previamente41. El volumen de enzima necesario depende del número de ensayos que se realizan. Aquí, se realizan cuatro ensayos diferentes en cada conjunto; Cada ensayo se completa por triplicado.

  1. Preparar 75 μL de cada solución enzimática en tubos de microcentrífuga sobre hielo.
    NOTA: Se necesitarán dos soluciones enzimáticas. Una solución contendrá DNMT1 y Gla I; el otro contendrá solo Gla I.
    1. Agregue ddH 2O y tampón de metilación 5x (250 mM Tris pH 7.5, 5 mM MgCl2, 500 mM glutamato de potasio, 5 mM DTT, 25% glicerol) a cada tubo para lograr una concentración final de 1x tampón. Para la solución enzimática Gla I, añadir 15 μL de tampón 5x y 58,8 μLddH2O. Para la solución enzimática DNMT1+Gla I, añadir 15 μL de tampón 5x y 58,2 μLddH2O.
    2. Añadir 1,2 μL de 10 U/μL Gla I a cada solución para obtener una concentración final de 0,16 U/μL.
    3. Agregue 0.6 μL de DNMT1 que carece de RFTS de 5 μM para una concentración final de 40 nM a la solución DNMT1 + Gla I.
  2. Golpee suavemente para mezclar las soluciones. Gire las muestras durante unos segundos en una mini centrífuga de mesa (1.200 × g) para asegurarse de que la solución se recoge en el fondo del tubo.
  3. Alícuota 12 μL de cada solución enzimática en 6 pocillos en una placa de fondo cónico de 96 pocillos (Figura 3).

Figure 3
Figura 3: Configuración de la placa enzimática. Las soluciones Gla I (gris) y DNMT1+Gla I (azul) se alicitan en seis pocillos en la placa de 96 pocillos. Usando una pipeta multicanal, la enzima se puede agregar a una fila de soluciones de ensayo simultáneamente. Para cada condición de ensayo (seis pozos), tres pozos recibirán DNMT1 + Gla I, y tres pozos recibirán Gla I solo. Abreviatura: DNMT1 = ADN metiltransferasa 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Ejecute el ensayo y analice los datos.

  1. Precaliente el lector de placas a 37 °C. Inserte la placa negra que contiene las soluciones de ensayo. Agitar la placa (doble orbital a 425 cpm durante 5 s) y leer la fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 528 nm. Incubar la placa a 37 °C durante 5 min.
    NOTA: Alternativamente, se pueden usar filtros con cortes de longitud de onda adecuados para las lecturas de fluorescencia.
  2. Retire la placa de ensayo. Añadir 5 μL de solución enzimática a cada pocillo y mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
    NOTA: Utilice pipetas multicanal para que se pueda iniciar simultáneamente una fila de muestras.
  3. Inserte la placa en el lector de placas. Registre fluorescencia cada 53 s durante 30 min. Agitar la placa (orbital doble a 425 cpm durante 4 s) antes de cada lectura.
  4. Promedio triplicado de ensayos de control de Gla I para cada condición. Reste la traza de reacción de control promedio que contiene Gla I de las trazas triplicadas obtenidas en presencia de DNMT1 que carece de RFTS. Determine el error promedio y estándar de la media para las réplicas corregidas.
  5. Trazar la traza de reacción corregida promedio y ajustar la porción lineal inicial a una línea para determinar la velocidad inicial.
  6. Determine el porcentaje de actividad dividiendo la velocidad observada en presencia de un compuesto por la velocidad observada en la reacción de control que contiene DMSO y multiplicando por 100.

4. Control adicional del ensayo: adición secuencial de enzimas

  1. Preparar 550 μL de solución de ensayo en un tubo de microcentrífuga sobre hielo. Agregue 110 μL de tampón de metilación 5x, 3.88 μL de sustrato de ADN de horquilla de 3.15 μM, 6.43 μL de SAM de 47.5 mM, 3.06 μL de BSA de 20 mg / ml y 426.6 μL de ddH2O.
  2. Mezclar la solución por vórtice (3.000 rpm) durante 3 s. Gire las muestras durante unos segundos en una mini centrífuga de mesa (1.200 × g) para asegurarse de que la solución se recoge en el fondo del tubo.
  3. Alícuota 90 μL de la solución de ensayo en 6 pocillos consecutivos en una placa negra de 96 pocillos de media área.
  4. Prepare las soluciones enzimáticas DNMT1 en hielo. Agregue 4 μL de tampón de metilación 5x, 0.76 μL de 5 μM que carecen de DNMT1 y 15.24 μL de ddH2O a un tubo. Añadir 4 μL de tampón de metilación 5x y 16 μL deddH2Oa otro tubo.
  5. Golpee suavemente para mezclar las soluciones. Gire las muestras durante unos segundos en una mini centrífuga de mesa (1.200 × g) para asegurarse de que la solución se recoge en el fondo del tubo.
  6. Agregue 5 μL de la solución que contiene DNMT1 a tres pocillos en la placa negra de 96 pocillos de media área. Añadir 5 μL de la solución de control tampón a los otros tres pocillos.
  7. Coloque la placa de microtitulación en el lector de placas precalentado a 37 °C. Agitar la placa (orbital doble a 425 cpm durante 3 s) y leer la fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 528 nm. Repetir el batido y leer cada 60 s durante 30 min.
  8. Mientras la placa de ensayo está en el lector de placas, prepare la solución de Gla I en hielo. Añadir 8 μL de tampón de metilación 5x, 0,64 μL de 10 U/μL Gla I y 31,4 μL deddH2Oa un tubo de microcentrífuga. Golpee suavemente para mezclar la solución. Gire la muestra durante unos segundos en una mini centrífuga de mesa (1.200 × g) para asegurarse de que la solución se recoge en el fondo del tubo.
  9. Alícuota 6 μL de la solución de Gla I en 6 pocillos en una placa de 96 pocillos de fondo cónico.
  10. Después de la lectura inicial de 30 minutos, retire la placa negra del lector de placas. Agregue 5 μL de solución de Gla I a los 6 pocillos y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
    NOTA: Utilice una pipeta multicanal para que todos los pozos puedan iniciarse simultáneamente.
  11. Vuelva a colocar la placa negra en el lector de placas. Registre fluorescencia cada 35 s durante 35 min. Agitar la placa (orbital doble a 425 cpm durante 3 s) antes de cada lectura.

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Representative Results

DNMT1 activo es un requisito previo para este análisis. La DNMT1 que carece de RFTS se expresó en E. coli y se purificó a homogeneidad siguiendo procedimientos previamente publicados41. Para asegurar que la enzima purificada estaba activa, se utilizó un ensayo discontinuo acoplado a endonucleasa para examinar la actividad de metilación del ADN36. Este ensayo utiliza un ADN dúplex de 32 pares de bases con una sola CpG hemimetilada posicionada en un sitio de escisión Sau3A1. Sau3A1 puede escindir el ADN del sustrato hemimetilado; sin embargo, la escisión se bloquea cuando el ADN está completamente metilado. Se agregó DNMT1 que carecía de RFTS a los ensayos que contenían ADN de 1 μM y SAM de 0,5 mM, y las alícuotas se eliminaron y se congelaron rápidamente durante 30 minutos. Las muestras se digirieron posteriormente con Sau3A1, y los productos se separaron mediante electroforesis en gel. Como se muestra en la Figura 4, el ADN está protegido de la escisión a medida que aumenta el tiempo de reacción, lo que indica que DNMT1 que carece de RFTS está metilando el ADN hemimetilado. La mayor parte del ADN de sustrato de 1 μM originalmente presente en el ensayo se ha convertido en producto en el transcurso de 30 minutos.

El ensayo acoplado a endonucleasa descrito en este trabajo permite la observación de la actividad de metilación del ADN en tiempo real como un aumento de la fluorescencia. La clave del éxito de este ensayo es la sensibilidad metílico de la endonucleasa Gla I. Gla I no escinde eficientemente el ADN del sustrato hemimetilado, pero escinde el ADN del producto completamente metilado (Figura 1). Se requiere escisión del ADN de la horquilla para liberar el fluoróforo del enfriador y generar un aumento en la fluorescencia. Para demostrar que las enzimas están funcionando como se esperaba, se realizó una reacción de control en la que las enzimas, que carecen de RFTS, DNMT1 y Gla I, se agregaron secuencialmente en lugar de simultáneamente. Si el ensayo acoplado funciona correctamente, la adición de DNMT1 no debería afectar la fluorescencia, ya que no se espera que la metilación del sustrato de ADN afecte la fluorescencia de fondo del ADN de horquilla apagado internamente. Sin embargo, la adición posterior de Gla I a los ensayos que contenían la metiltransferasa debería dar lugar a la generación de fluorescencia debido a la escisión del ADN de horquilla completamente metilado. El sustrato de ADN de horquilla hemimetilada en sí tiene fluorescencia de fondo (Figura 5); estos ensayos contenían 20 nM de ADN horquillado y 500 μM de SAM. Se agregó DNMT1 o tampón que carecía de RFTS a los ensayos, y se siguió la fluorescencia durante 30 minutos.

Como se ve en la Figura 5, la fluorescencia no se ve afectada por DNMT1 que carece de RFTS en ausencia de la enzima de acoplamiento (los tonos azules contenían 10 nM que carecen de DNMT1 de RFTS, mientras que los tonos rojos son el control del amortiguador). Por lo tanto, la metilación del sitio CpG hemimetilado por DNMT1 no cambia apreciablemente la señal de fluorescencia. Sin embargo, cuando se agregó Gla I a todos los pocillos, se observó una generación de fluorescencia robusta solo en los ensayos que contenían DNMT1 que carecía de RFTS (Figura 5). Esto muestra que la metilación del ADN del sustrato hemimetilado por DNMT1 es necesaria para la escisión de Gla I y la generación de fluorescencia. Cabe señalar que el aumento de fluorescencia observado en este ensayo de control refleja la actividad de Gla I ya que las enzimas se agregaron secuencialmente. Alternativamente, estas mezclas de reacción podrían digerirse con Gla I, y los oligonucleótidos resultantes podrían separarse mediante electroforesis para visualizar la escisión y garantizar que las enzimas funcionen como se espera.

Para utilizar este ensayo acoplado para determinar directamente las velocidades iniciales de DNMT1, ambas enzimas, DNMT1 y Gla I, que carecen de RFTS, deben agregarse simultáneamente. Mientras la velocidad de escisión de Gla I del ADN del producto sea más rápida que la tasa de metilación del ADN por DNMT1, la señal de fluorescencia generada reflejará la actividad de metilación del ADN. Para garantizar que la actividad de DNMT1 limite la velocidad, la concentración de DNMT1 se puede variar mientras se mantienen constantes todas las demás condiciones de ensayo. La tasa de generación de fluorescencia debe ser proporcional a la concentración de DNMT1. Esto se ha demostrado previamente para DNMT1 que carece de RFTS en las condiciones utilizadas aquí40. Cuando se utiliza este ensayo acoplado para examinar la actividad de DNMT, se realiza una reacción de control que contiene Gla I además de la reacción que contiene DNMT1 y Gla I (Figura 6A). El control Gla I tiene varias funciones. Restar la traza de reacción de control Gla I de la traza de reacción que contiene DNMT permite tener en cuenta tanto la escisión lenta del sustrato de ADN hemimetilado como la fluorescencia de fondo. Las trazas de reacción corregidas generadas reflejan la actividad de metilación del ADN de DNMT1. El ajuste de la porción lineal inicial de la traza de reacción corregida permite determinar la velocidad inicial (Figura 6B). Con sustrato de ADN horquilla de 10 nM y SAM de 10 μM, se obtuvo una velocidad inicial de 113 ± 2 RFU/min.

Se ha demostrado previamente que las antraquinonas sustituidas inhiben la actividad de DNMT1. El producto natural, ácido laccaico A, una antraquinona altamente sustituida, es un potente inhibidor competitivo del ADN de DNMT127. Algunos compuestos con estructuras más simples, uno o dos sustituyentes en el núcleo de antraquinona, siendo uno de ellos un sustituyente aromático voluminoso, también han demostrado inhibir DNMT1 de una manera competitiva para el ADN41. Aquí, se examinó la capacidad de tres antraquinonas sustituidas o moléculas similares a la antraquinona para inhibir la actividad DNMT1 que carece de RFTS en el ensayo acoplado a Gla I como un ejemplo de cómo realizar estos ensayos de detección. Estos compuestos contenían de uno a tres sustituyentes, todos en un lado del núcleo de antraquinona (Tabla 1). Las concentraciones de sustrato (10 nM ADN y 10 μM SAM) utilizadas para estos ensayos son ~5 veces más altas que el Km para cada sustrato. La señal generada en el ensayo proviene directamente del ADN del sustrato. Debido a esto, es difícil de evaluar en concentraciones cercanas o inferiores a Km; Simplemente no hay suficiente señal para detectar. Estas concentraciones de sustrato se eligieron porque se observa una actividad robusta en estas condiciones en ausencia de inhibidores (Figura 6B). Otras concentraciones de sustrato podrían utilizarse en los ensayos de cribado. Por ejemplo, la realización de un cribado para saturar las concentraciones de SAM podría usarse como una estrategia para sesgar la búsqueda contra los inhibidores competitivos de SAM.

Cada ensayo contenía el sustrato de ADN de horquilla, el cofactor SAM de donación de metilo y un inhibidor potencial o DMSO como control para la pantalla. Generamos rutinariamente soluciones de 10 mM de compuestos de cribado en DMSO para su uso en ensayos. Las antraquinonas como las examinadas aquí exhiben poca solubilidad en soluciones acuosas. Por lo tanto, para generar existencias concentradas, DMSO se utiliza como disolvente. La adición de DMSO hasta un 5% (v/v) de concentración final no afecta la actividad en el ensayo26. Sin embargo, cuando se trata de compuestos con baja solubilidad en solución acuosa, se debe tener cuidado para garantizar que el compuesto sea soluble en la(s) concentración(es) final(es) de cribado elegida(s).

Para cada condición examinada en la pantalla, se realiza un ensayo de control que contiene Gla I. Además de tener en cuenta la fluorescencia de fondo y la lenta escisión del ADN de la horquilla del sustrato, este control permite determinar si el inhibidor potencial interfiere con la señal espectroscópica (por ejemplo, es fluorescente). Después de iniciar la reacción mediante la adición de enzimas, la fluorescencia se midió durante 30 min con un intervalo de tiempo de 53 s en los datos de cribado. Este es el intervalo de tiempo más rápido disponible en el lector de placas en este laboratorio cuando se lee una placa completa de 96 pocillos. Se podrían usar otros intervalos de tiempo para generar las trazas de reacción. Un intervalo de tiempo apropiado dependerá del instrumento que se utilice y del número de pozos que se lean. Para garantizar la reproducibilidad, cada ensayo se realiza por triplicado. La traza de control promedio que contiene Gla I se resta de las trazas de reacción observadas en presencia de DNMT1 que carece de RFTS. La velocidad inicial de la reacción puede determinarse ajustando la porción lineal inicial de las trazas de reacción corregidas.

Inicialmente, se examinó el impacto de tres inhibidores potenciales en la generación de fluorescencia a una concentración final de 20 μM. Se eligieron concentraciones más altas de los inhibidores potenciales para el cribado por dos razones. En primer lugar, las concentraciones de sustrato en el ensayo están por encima de sus respectivos valoresde K m . Esto puede hacer que sea más difícil detectar la inhibición en los ensayos cinéticos, particularmente si los inhibidores son competitivos. En segundo lugar, los compuestos similares a la antraquinona utilizados en esta pantalla son significativamente más simples en estructura que el inhibidor conocido, el ácido laccaico A. Como estas moléculas contienen solo unos pocos sustituyentes alrededor de la estructura central, anticipamos interacciones más débiles. En el ensayo de control que contiene DMSO, se obtuvo una velocidad inicial de 111 ± 5 RFU/min (Figura 7A). Tenga en cuenta que esto es muy similar a la tasa informada anteriormente en ausencia de DMSO y confirma que la adición de cantidades bajas de DMSO no afecta la actividad observada. La adición de dos compuestos disminuyó la velocidad inicial observada, mientras que la adición del tercer compuesto no tuvo ningún efecto sobre la actividad. Las velocidades iniciales se utilizaron para determinar el porcentaje de actividad observado en presencia de cada compuesto. A 20 μM, la adición de compuestos 1 y 2 resultó en un porcentaje de actividad de ~ 80%, mientras que se observó una actividad porcentual del 100% en presencia del compuesto 3, lo que indica que esta molécula no inhibe la enzima (Tabla 1).

Se espera que los inhibidores presenten inhibición dependiente de la concentración. A continuación, estas moléculas se volvieron a examinar a una concentración aún mayor de 50 μM. Para este conjunto de ensayos, el ensayo de control que contiene DMSO tuvo una velocidad inicial de 125 ± 7 RFU/min (Figura 7B). Esta velocidad es ligeramente superior a las tasas determinadas anteriormente; Sin embargo, todas estas velocidades están relativamente cerca del error. Una vez más, el compuesto 3 tuvo poco efecto sobre la velocidad inicial, mientras que la adición de los compuestos 1 y 2 disminuyó la velocidad inicial observada. Como era de esperar, en la concentración más alta, el compuesto 1 tuvo un mayor impacto en la actividad. A 50 μM, la adición del compuesto 1 resultó en un porcentaje de actividad de ~60% (Tabla 1). Sin embargo, la adición de una mayor concentración del compuesto 2 no resultó en una inhibición más robusta. El porcentaje de actividad observado en presencia de 50 μM del compuesto 2 fue de nuevo cercano al 80%.

Como se puede ver en los datos presentados, el ensayo de metilación del ADN basado en fluorescencia acoplada a endonucleasa se puede utilizar para detectar posibles inhibidores de DNMT. Los datos indican que el compuesto 1 y el compuesto 2 son inhibidores potenciales, mientras que el compuesto 3 no lo es. Se requieren estudios adicionales para validar los inhibidores potenciales como verdaderos inhibidores de DNMT1.

Figure 4
Figura 4: Control de actividad DNMT1. La metilación del ADN dúplex hemimetilado protege contra la escisión de Sau3A1. Se agregó DNMT1 que carecía de RFTS a las mezclas de ensayos que contenían 1 μM de ADN y 500 μM de SAM. Las muestras se recogieron en los puntos de tiempo indicados durante una incubación de 30 min a 37 °C, se digirieron con Sau3A1 y se resolvieron mediante electroforesis en gel en PAGE al 18%. Aquí se muestran muestras de 5, 10, 15 y 30 minutos. El primer carril es un control que carece de DNMT1. Abreviaturas: DNMT1 = ADN metiltransferasa 1; RFTS = Secuencia de focalización de focos de replicación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Control de ensayos basados en fluorescencia. DNMT1 (concentración final de 10 nM) y Gla I (0,8 U) que carecen de RFTS se agregaron secuencialmente a ensayos triplicados que contenían 20 nM de sustrato de ADN de horquilla y 500 μM SAM. La adición de DNMT1 (círculos azules) o amortiguador (círculos rojos) por sí sola no tuvo efecto sobre la fluorescencia de fondo. La adición de Gla I a todos los ensayos da como resultado la generación de fluorescencia en ensayos que contenían DNMT1, pero no en ensayos que no lo contienen. Abreviaturas: DNMT1 = ADN metiltransferasa 1; RFTS = secuencia de focalización de focos de replicación; RFU = unidades de fluorescencia relativa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Trazas de reacción de fluorescencia. Los ensayos de triplicados contenían 10 nM de sustrato de ADN de horquilla y 10 μM de SAM. (A) DNMT1 (2 nM) y Gla I (0,8 U) que carecen de RFTS se agregaron a tres ensayos (azul), y Gla I (0,8 U) solo se agregó a tres ensayos (rojo). La generación de fluorescencia robusta se observa solo en los ensayos que contienen ambas enzimas. (B) La traza de reacción Gla I promedio se restó de las trazas de reacción DNMT1 + Gla I. Se muestra el error promedio y estándar de la media de los datos triplicados. El ajuste de la porción lineal de la traza da una velocidad inicial de 113 ± 2 RFU/min. Abreviaturas: DNMT1 = ADN metiltransferasa 1; RFTS = secuencia de focalización de focos de replicación; RFU = unidades de fluorescencia relativa; SAM = S-adenosilmetionina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Actividad de metilación del ADN en presencia de potenciales inhibidores. La actividad de metilación del ADN de DNMT1 que carece de RFTS se examinó en presencia de DMSO (negro), compuesto 1 (rojo), compuesto 2 (azul) o compuesto 3 (verde). Se ajustaron trazas de reacción corregidas a 20 μM compuesto (A) y 50 μM compuesto (B) para determinar la velocidad inicial. La adición de los compuestos 1 y 2 disminuyó la velocidad observada, mientras que el compuesto 3 tuvo poco impacto en la actividad. Se muestra el error promedio y estándar de la media para los ensayos triplicados. Abreviaturas: DNMT1 = ADN metiltransferasa 1; RFTS = secuencia de focalización de focos de replicación; RFU = unidades de fluorescencia relativa; DMSO = dimetilsulfóxido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Velocidades iniciales y porcentaje de actividades observadas en presencia de potenciales inhibidores de moléculas pequeñas. La velocidad inicial se determinó ajustando la porción lineal inicial de las trazas de reacción corregidas a una línea; Se informa del error asociado con el ajuste. El porcentaje de actividad se determinó dividiendo la velocidad determinada en presencia de compuesto por la velocidad determinada en la reacción de control DMSO y multiplicando por 100; Se propagó el error asociado. Abreviaturas: Cmpd = compuesto; DMSO = dimetilsulfóxido; RFU = unidades de fluorescencia relativa. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Discussion

Para identificar y caracterizar los inhibidores de las metiltransferasas del ADN, se debe medir la actividad de la enzima. Existen varios métodos para examinar la actividad de la metiltransferasa del ADN. La actividad se controla comúnmente mediante radiactividad; La transferencia del grupo metilo marcado de SAM se puede cuantificar 29,30,31,32,33,34. También se han descrito ensayos basados en gel que utilizan endonucleasas sensibles al metilo35,36. Estos ensayos suelen ser discontinuos y requieren múltiples pasos para examinar la actividad. Aquí, se describe un ensayo de metilación del ADN acoplado a endonucleasa para detectar posibles inhibidores de la metiltransferasa de ADN. Esta técnica tiene varias ventajas. El ensayo es relativamente simple. No requiere técnicas de separación (por ejemplo, electroforesis, unión de filtros) para obtener una señal. Además, el ensayo es continuo, lo que permite la recopilación de datos en tiempo real. Recientemente se describió un ensayo cinético continuo diferente para la actividad de metilación39. Sin embargo, este ensayo requiere tres enzimas de acoplamiento para generar una señal espectroscópica. El ensayo descrito aquí requiere una sola enzima de acoplamiento.

Estos ensayos de actividad DNMT se realizan generando primero una solución de ensayo que contiene todos los componentes del ensayo excepto las enzimas. Las soluciones de ensayo contienen los sustratos, el ADN de horquilla y SAM; 0.1 mg / ml BSA también se incluye rutinariamente en los ensayos. Con las concentraciones extremadamente bajas (en el rango nanomolar) de ADN y DNMT1 utilizadas en el ensayo, el BSA aumenta la concentración general de proteínas para ayudar a prevenir la adhesión a puntas de pipetas, tubos y placas de microtitulación e insultos ambientales que podrían afectar la actividad enzimática. La reacción se inicia entonces añadiendo enzimas a las soluciones de ensayo. Estas diluciones deben tenerse en cuenta al determinar las concentraciones finales de todos los componentes del ensayo. Las reacciones se inician añadiendo 5 μL de solución enzimática a 95 μL de solución de ensayo. Por lo tanto, las concentraciones de ADN, SAM y BSA en las soluciones de ensayo son 1,05 veces la concentración final deseada. Por ejemplo, si se desea ADN de 10 nM, las soluciones de ensayo se generan con ADN de 10,5 nM. La concentración de DNMT1 que carece de RFTS en la solución enzimática es 20 veces la concentración final deseada. Aquí, se utilizaron 40 nM que carecían de DNMT1 en la solución enzimática de modo que la concentración final de DNMT1 en cada ensayo fue de 2 nM.

Como Gla I es una enzima disponible comercialmente, su cantidad se da en unidades (U) según lo proporcionado por el fabricante. Las soluciones enzimáticas generadas contienen 0,16 U/μL de Gla I, de modo que se añade un total de 0,8 U de Gla I a cada pocillo. Para ahorrar en costos de reactivos, se preparan pequeños volúmenes de las soluciones enzimáticas apropiadas, y esas soluciones se alicitan en placas de 96 pocillos de fondo cónico. Utilizando pipetas multicanal, se transfieren 5 μL de soluciones enzimáticas de la placa de fondo cónico a las soluciones de ensayo en la placa negra de 96 pocillos de media área. Este proceso permite iniciar simultáneamente una fila de ensayos. Alternativamente, con una configuración de placa de ensayo diferente, las soluciones enzimáticas podrían colocarse en depósitos de reactivos, y luego se podrían usar pipetas multicanal para agregar enzima a las soluciones de ensayo. Sin embargo, este enfoque requerirá mayores volúmenes de solución enzimática debido a los residuos de recuperación de líquidos en los depósitos. Realizamos los ensayos en placas de media área de 96 pocillos; el tamaño más pequeño del pocillo en estas placas permite un volumen total de ensayo más pequeño (100 μL) que las placas tradicionales de 96 pocillos, lo que nuevamente ahorra en costos de reactivos.

El ensayo de metilación del ADN descrito aquí requiere un ADN de sustrato hemimetilado debido a la especificidad de la endonucleasa de acoplamiento Gla I. Esto hace que el ensayo sea especialmente bueno para examinar la actividad de DNMT1, ya que esta isoenzima metila preferentemente el ADN hemimetilado1. Las isoenzimas DNMT3 no muestran preferencia entre ADN no metilado y hemimetilado1. Por lo tanto, este ensayo también se puede utilizar para examinar la actividad de las isoenzimas DNMT3. De hecho, la inhibición de DNMT3a por moléculas pequeñas se ha evaluado utilizando este ensayo26,27,41. El requisito de un ADN de sustrato hemimetilado significa que este ensayo no se puede utilizar para examinar la especificidad del sustrato o la preferencia entre los sitios CpG no metilados y hemimetilados.

Este ensayo se basa en una señal espectroscópica: el aumento de la fluorescencia cuando el fluoróforo y el enfriador se separan. Por lo tanto, las moléculas pequeñas que emiten fluorescencia o apagan la fluorescencia pueden interferir con el ensayo. Una razón para llevar a cabo el control que contiene Gla I para cada condición de ensayo es verificar esta posibilidad. Las propiedades espectroscópicas de la molécula pequeña podrían explicarse simplemente utilizando los datos de control de Gla I (por ejemplo, si la molécula tiene una señal de fluorescencia débil). Sin embargo, si la molécula es fuertemente fluorescente o un fuerte extintor, este ensayo no se puede utilizar para detectar la actividad de metilación del ADN.

La pantalla descrita aquí es un ensayo inicial para detectar posibles inhibidores de DNMT. Los compuestos que son "hits" en la pantalla inicial deben validarse en ensayos secundarios para garantizar que sean verdaderos inhibidores de DNMT. Debido a que este ensayo es un ensayo cinético acoplado, simplemente observar una disminución en la generación de fluorescencia en presencia de una molécula pequeña en particular no significa necesariamente que el compuesto esté inhibiendo la metiltransferasa. Una pequeña molécula capaz de inhibir la enzima de acoplamiento Gla I también daría lugar a una disminución observada en la generación de fluorescencia. Una pantalla secundaria simple implica determinar la actividad de Gla I en presencia y ausencia de los inhibidores potenciales. Para este ensayo, el ADN de horquilla enfriado internamente completamente metilado se utiliza como sustrato26,41. Los ensayos adicionales diseñados para examinar la inhibición dependiente de la agregación y la intercalación del ADN también pueden usarse como ensayos secundarios para validar aún más los inhibidores potenciales26,41. En los datos presentados aquí, el compuesto 1 y el compuesto 2 se identificaron como posibles inhibidores de DNMT1. Utilizando una variedad de ensayos secundarios, el compuesto 1 ha sido validado como un inhibidor directo de DNMT141. Este trabajo publicado anteriormente mostró que los compuestos que contienen sustituyentes voluminosos en la posición C2 del núcleo de antraquinona parecían ser inhibidores más efectivos de DNMT1. Sin embargo, se necesitan más estudios para comprender completamente los determinantes estructurales de la inhibición de DNMT1.

El ensayo acoplado descrito aquí tiene varios usos potenciales. El ensayo se puede utilizar para experimentos cinéticos de estado estacionario. Debido a que el ensayo es continuo, determinar las velocidades iniciales es sencillo. Este ensayo se ha utilizado previamente para examinar parámetros cinéticos macroscópicos (es decir, Km, Vmax y kcat) de varias proteínas DNMT1 truncadas40. El ensayo se ha utilizado para examinar un pequeño conjunto de moléculas para la inhibición de DNMT141 y evaluar la especificidad de la isoenzima de los inhibidores identificados mediante el examen de su impacto en la actividad de DNMT3a26,27,41. El ensayo también se ha utilizado para caracterizar inhibidores. El mecanismo de inhibición y potencia (por ejemplo, Ki, IC50) tanto de los dominios proteicos inhibidores36,40 como de las nuevas moléculas pequeñas 27,41 se han determinado utilizando este ensayo cinético acoplado. El ensayo también se ha adaptado para su uso en una campaña de HTS. En este caso, el ensayo se miniaturizó a un formato de 384 pocillos y se utilizó como un ensayo de punto final para la pantalla inicial26. Por lo tanto, el ensayo de metilación del ADN acoplado a endonucleasa basado en fluorescencia descrito aquí es un ensayo versátil que se puede utilizar para examinar la actividad de las metiltransferasas de ADN y permite la identificación y caracterización de inhibidores de moléculas pequeñas de estos importantes modificadores epigenéticos.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen a la Universidad de Bucknell y al Departamento de Química por su apoyo a este trabajo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well Half Area Black Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate Corning 3694
96-Well Polystyrene Conical Bottom Plates ThermoFisher 249570
Bovine Serum Albumin NEB B9000S
compound 1 ChemBridge 5812086 screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
compound 2 ChemBridge 6722175 screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
compound 3 ChemBridge 5249376 screening compound; resuspended in DMSO to 10 mM
Dithiothreitol Sigma D0632
Gla I SibEnzyme E494 methyl-sensitive endonuclease
Glycerol RPI G22025
Magnesium Chloride Sigma M0250
Oligonucleotide (5'-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3'-Iowa Black Quencher) IDT custom synthesized internally quenched hairpin DNA (substrate)
Potassium Glutamate Sigma G1501
S-adenosylmethionine Sigma A4377 methyl-donating co-factor (substrate)
Tris Base RPI T60040

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