Biochemistry

लाइव कोशिकाओं में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन और प्रोटीन गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए ड्यूल-कलर फ्लोरेसेंस क्रॉस-सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी

Published: December 11, 2021 doi: 10.3791/62954

Katherina Hemmen*¹, Susobhan Choudhury*¹, Mike Friedrich¹, Johannes Balkenhol¹, Felix Knote¹, Martin J. Lohse², Katrin G. Heinze¹

¹Rudolf Virchow Center for Integrative and Translation Bioimaging, Julius-Maximilian University Wuerzburg, ²Max Delbrück Center for Molecular Medicine, Berlin

* These authors contributed equally

Summary

हम आधुनिक फ्लोरेसेंस लेबलिंग तकनीकों का उपयोग करके लाइव कोशिकाओं में झिल्ली रिसेप्टर गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए ओपन सेल ड्यूल-कलर फ्लोरेसेंस क्रॉस सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीसीएस) का प्रदर्शन करने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल और डेटा विश्लेषण कार्यप्रवाह प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

हम आधुनिक फ्लोरेसेंस लेबलिंग तकनीकों का उपयोग करके लाइव कोशिकाओं में झिल्ली रिसेप्टर गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए फ्लोरेस्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एफआरटी) के साथ संयुक्त लाइव सेल ड्यूल-कलर फ्लोरेसेंस क्रॉस-सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीसीएस) का प्रदर्शन करने के लिए एक प्रोटोकॉल और कार्यप्रवाह प्रस्तुत करते हैं। दोहरे रंग के एफसीसीएस में, जहां फ्लोरेसेंस तीव्रता में उतार-चढ़ाव संबंधित फ्लोरोसेंट बायोमॉलिक्यूल के गतिशील "फिंगरप्रिंट" का प्रतिनिधित्व करते हैं, हम रिसेप्टर्स के सह-प्रसार या बाध्यकारी की जांच कर सकते हैं। FRET, आणविक दूरी के लिए अपनी उच्च संवेदनशीलता के साथ, इंट्रामोलिकुलर परिवर्तनों की निगरानी के लिए एक प्रसिद्ध "नैनोरूलर" के रूप में कार्य करता है । एक साथ लिया गया, अनुरूप परिवर्तन और स्थानीय रिसेप्टर सांद्रता और गतिशीलता स्थिरांक जैसे प्रमुख पैरामीटर सेलुलर सेटिंग्स में सुलभ हो जाते हैं।

मात्रात्मक फ्लोरेसेंस दृष्टिकोण उच्च शोर के स्तर और नमूने की संवेदनशीलता के कारण कोशिकाओं में चुनौतीपूर्ण हैं। यहां हम दिखाते हैं कि इस प्रयोग को कैसे किया जाए, जिसमें 2-एड्रेनेरिक रिसेप्टर (β₂एआर) β लेबल वाले दोहरे रंग वाले लेबल का उपयोग करके अंशांकन चरण शामिल हैं, जो eGFP और स्नैप-टैग-TAMRA के साथ लेबल किया गया है। ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर और टेम्पलेट्स का उपयोग करके एक कदम-दर-चरण डेटा विश्लेषण प्रक्रिया प्रदान की जाती है जो अनुकूलित करना आसान है।

हमारा दिशानिर्देश शोधकर्ताओं को लाइव सेल प्रयोगों में सीमित सिग्नल-टू-शोर स्तर के बावजूद उच्च विश्वसनीयता के साथ सीटू में लाइव कोशिकाओं में जैव अणुओं के आणविक बातचीत को जानने में सक्षम बनाता है। कम सांद्रता पर FRET और विशेष रूप से एफसीसीएस की परिचालन खिड़की लगभग शारीरिक स्थितियों पर मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देती है।

Introduction

फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रोस्कोपी एक सेलुलर संदर्भ में न्यूनतम क्षोभ के साथ प्रोटीन गतिशीलता और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की मात्रा निर्धारित करने के लिए मुख्य तरीकों में से एक है। कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस) आणविक गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए शक्तिशाली तरीकों में से एक है क्योंकि यह एकल अणु संवेदनशील, अत्यधिक चयनात्मक और लाइव-सेल संगत¹है। अन्य गतिशीलता उन्मुख दृष्टिकोणों की तुलना में, एफसीएस में ~ एनएस से ~ एस तक फैले एक व्यापक औसत दर्जे की समय सीमा है, जो सबसे महत्वपूर्ण रूप से तेजी से समय तराजू को कवर करता है जो अक्सर इमेजिंग-आधारित तरीकों से दुर्गम होते हैं। इसके अलावा, यह स्थानिक चयनशीलता भी प्रदान करता है ताकि झिल्ली, साइटोप्लाज्मिक और नाभिक आणविक गतिशीलता को आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सके ^2। इस प्रकार, आणविक निमिष, औसत स्थानीय एकाग्रता, और प्रसार गुणांक एफसीएस के साथ मात्रात्मक रूप से विश्लेषण किया जा सकता है। एक दोहरे रंग के दृष्टिकोण में फ्लोरेसेंस क्रॉस-सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीसीएस) विश्लेषण^3,^4,⁵ में दो आणविक प्रजातियों के सह-प्रसार की जांच करते समय बाध्यकारी जैसी इंटरमॉलिकुलर गतिशीलता आसानी से सुलभ हो जाती है।

सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी में मुख्य अंतर्निहित सिद्धांत फ्लोरोसेंट रूप से लेबल किए गए बायोमॉलिक्यूल्स द्वारा उत्सर्जित तीव्रता के उतार-चढ़ाव का सांख्यिकीय विश्लेषण है और लेजर फोकस(चित्रा 1 ए)में और बाहर फैलाना है। परिणामस्वरूप ऑटो-या क्रॉस-सहसंबंध कार्यों को अंततः ब्याज की दर स्थिरांक प्राप्त करने के लिए वक्र फिटिंग द्वारा आगे विश्लेषण किया जा सकता है। दूसरे शब्दों में, सांख्यिकीय तरीकों FCS और FCCS एकल कण ट्रैकिंग में की तरह एक अणु निशान प्रदान नहीं करते हैं, लेकिन एक गतिशील पैटर्न या उच्च लौकिक संकल्प के साथ एक जांच नमूना के "फिंगरप्रिंट" । जब फॉस्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एफआरटी) के साथ संयुक्त किया जाता है, तो एक सामान्य कॉन्फोकल सेटअप^{5, 6}में एक ही समय में इंट्रामोलिकुलर गतिशीलता जैसे अनुरूप^{परिवर्तनों}की निगरानी की जा सकती है। FRET दो फ्लोरोफोरस की दूरी की जांच करता है और अक्सर एक आणविक "नैनोरूलर" के रूप में जाना जाता है। ऊर्जा हस्तांतरण तभी होता है जब अणु निकट क्षेत्र (10 एनएम <) में होते हैं, दाता का उत्सर्जन स्पेक्ट्रम स्वीकारकर्ता अणु के अवशोषण स्पेक्ट्रम के साथ काफी ओवरलैप होता है, और दाता और स्वीकारकर्ता का डाइपोल अभिविन्यास (पर्याप्त रूप से) समानांतर होता है। इस प्रकार, FRET और एफसीसीएस का संयोजन बहुत उच्च स्थानिक-लौकिक संकल्प के साथ एक तकनीक प्रदान करता है। जब स्थानिक चयनशीलता, संवेदनशीलता के साथ-साथ लाइव-सेल अनुकूलता की आवश्यकता होती है, तो यूआरटी-एफसीसीएस में प्रोटीन गतिशीलता और बातचीत को मापने के लिए अन्य तरीकों जैसे आइसोथेमल टिटरेशन कैलोरिमेट्री (आईटीसी)^7,सरफेस प्लाजन अनुनाद (एसपीआर)^8,या परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर)^9,¹⁰ पर स्पष्ट लाभप्रद है।

दोहरी रंग फ्लोरेसेंस क्रॉस-सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (डीसी-एफसीसीएस) की क्षमताओं और वादे के बावजूद, लाइव कोशिकाओं में डीसी-एफसीसीएस का प्रदर्शन चैनलों^3,⁴^केबीच स्पेक्ट्रल ब्लीड-थ्रू या क्रॉसटॉक के कारण तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, स्पेक्ट्रली अलग लेजर लाइनों^3,^4,^11,पृष्ठभूमि संकेत, पृष्ठभूमि के कारण कॉन्फोकल वॉल्यूम में अंतर और शोर या नमूनों की सीमित फोटोस्थेपन¹²^, ¹³^,¹⁴^,¹⁵. पल्स इंटरलीव्ड एक्सिटेशन (पाई) का एफसीसीएस में परिचय चैनलों के बीच स्पेक्ट्रल क्रॉसटॉक को कम करने केलिए विभिन्न लेजर उत्तेजन को अस्थायी रूप से अलग करने के लिए एक महत्वपूर्ण ट्विक था। स्पेक्ट्रल ब्लीड-थ्ंड^{17 , 18}^,¹⁹ और पृष्ठभूमि सुधार का मुकाबला करने के अन्य सुधार तरीकों को भी^17,^{18, 19}के माध्यम से अच्छी^तरहसे स्वीकार किया गया है। एफसीएस, पाई या एफईटी पर विवरण और मूल बातों के लिए पाठक को निम्नलिखित संदर्भों 2,^{4, 6,}^16,^20,^21,^22,^23,²⁴के^{संदर्भों}में संदर्भित किया^जाताहै।

यहां, सभी आवश्यक अंशांकन प्रयोगों और विश्लेषण के साथ एक प्रोटोटाइप जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर के प्रयोगात्मक परिणामों के साथ, β 2-adrenergic रिसेप्टर (β₂एआर), तीन अलग परिदृश्यों के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं: (1) एकल लेबल अणुओं या तो एक "ग्रीन" (eGFP) या एक "लाल" (स्नैप टैग आधारित लेबल)²⁵ फ्लोरो (2) एक डबल लेबल निर्माण, जो एक एन टर्मिनल स्नैप टैग और इंट्रासेल्युलर eGFP (एनटी-स्नैप) किया जाता है [इस मामले में, दोनों लेबल एक ही प्रोटीन पर हैं । इस प्रकार 100% सह-प्रसार की उम्मीद है]; और (3) एक डबल लेबल नमूना है, जहां दोनों फ्लोरोफोरस कोशिका झिल्ली (सीटी-स्नैप) के एक ही पक्ष पर हैं । इसमें सी-टर्मिनल स्नैप-टैग और इंट्रासेल्युलर ईजीएफपी दिया गया है । यहां, फिर से दोनों लेबल फिर से १००% सह प्रसार की उम्मीद के साथ एक ही प्रोटीन पर हैं । चूंकि दोनों लेबल एक दूसरे के बहुत करीब हैं, सेल झिल्ली के एक ही तरफ, यह FRET और विरोधी व्यवहार का निरीक्षण करने की क्षमता दिखाता है। सभी निर्माण चीनी हम्सटर अंडाशय (चो) कोशिकाओं में संक्रमित थे और बाद में एक लाल फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट के साथ लेबल किए गए थे जो एनटी-स्नैप निर्माण और सीटी-स्नैप निर्माण के लिए झिल्ली-पारगम्य के लिए झिल्ली-अभेद्य है। अंत में, नकली डेटा FRET-प्रेरित एंटीकोरिएलेशन पर प्रयोगात्मक मापदंडों के प्रभाव और सह-प्रसार आयाम पर प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के प्रभाव का उदाहरण देता है।

इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल तकनीकी/भौतिक कलाकृतियों, चुनौतियों और संभावित समाधानों के बारे में जागरूक करते हुए प्रोटीन गतिशीलता और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन को समझने के लिए जीवित कोशिकाओं में संयुक्त FRET-एफसीसीओं का प्रदर्शन करने के लिए एक पूर्ण गाइड प्रदान करता है ।

Protocol

1. प्रायोगिक प्रोटोकॉल

नमूना तैयार करना
नोट: बाँझ परिस्थितियों में सेल सीडिंग और ट्रांसफेक्शन करें।
1. एक साफ कवरलिप प्रति अच्छी तरह से एक 6 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में रखें और बाँझ फॉस्फेट-बफर खारा (PBS) के साथ तीन बार धोते हैं ।
  नोट: कवरस्लिप सफाई प्रोटोकॉल अनुपूरक नोट 1में विस्तृत है ।
2. प्रत्येक अच्छी तरह से, फिनॉल लाल युक्त पूर्ण सेल संस्कृति माध्यम के 2 एमएल जोड़ें (10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 100 माइक्रोन/एमएल पेनिसिलिन और 100 माइक्रोग्राम/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक और प्लेट को अलग रखें।
3. संस्कृति एक ही माध्यम में चो कोशिकाओं 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सह 2 पर फिनोल लाल_{युक्त।} मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए पीबीएस के 5 एमएल के साथ कोशिकाओं को धोएं।
4. कमरे के तापमान (आरटी) पर 2 मिनट के लिए ट्रिपसिन और इनक्यूबेट के 2 एमसीएल जोड़ें।
5. अलग कोशिकाओं को मध्यम युक्त फिनोल लाल के 8 एमएल के साथ पतला करें और पिपटिंग द्वारा ध्यान से मिलाएं।
6. एक Neubauer चैंबर और बीज में कोशिकाओं की गिनती १.५ x १०^{५ कोशिकाओं} के घनत्व पर/
7. कोशिकाओं को लगभग 80% संकुचन प्राप्त करने के लिए₂₄घंटे के लिए एक इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) में बढ़ने दें।
8. वांछित वेक्टर डीएनए के 2 माइक्रोन (जैसे, सीटी-स्नैप या एनटी-स्नैप) और दो अलग-अलग ट्यूबों में ट्रांसफैक्शन रीएजेंट के 6 माइक्रोन, प्रत्येक के लिए कम-सीरम माध्यम के 500 माइक्रोन युक्त और आरटी में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
9. ट्रांसफेक्शन मिश्रण प्राप्त करने के लिए दो समाधानों को एक साथ मिलाएं और इसे आरटी में 20 मिनट के लिए उगाएं।
10. इस दौरान वरीयता प्राप्त चो कोशिकाओं को बाँझ पीबीएस से एक बार धोएं।
11. पीबीएस को बिना किसी एंटीबायोटिक दवाओं के 10% एफबीएस के साथ पूरक फिनॉल रेड-फ्री मीडियम के 1 एमएल/वेल से बदलें ।
12. प्रत्येक कुएं में ट्रांसफैक्शन मिश्रण ड्रॉपवाइज के पूरे 1 मिलियन जोड़ें और 5% सीओ₂में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
13. स्नैप निर्माण की लेबलिंग के लिए, 1 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 10% एफबीएस के साथ पूरक माध्यम के 1 मिलीएल में उपयुक्त स्नैप सब्सट्रेट स्टॉक समाधान को पतला करें।
14. पीबीएस के साथ एक बार संक्रमित कोशिकाओं को धोएं और 1 माइक्रोन स्नैप सब्सट्रेट समाधान के प्रति अच्छी तरह से 1 एमएल जोड़ें। कोशिकाओं को 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर₂₀मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
15. कोशिकाओं को फिनॉल लाल मुक्त माध्यम से तीन बार धोएं और 2 एमएल प्रति कुएं फिनॉल लाल मुक्त माध्यम जोड़ें। कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए 5% सीओ₂में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
16. बाद में इमेजिंग चैंबर में सभी नमूनों के कवरस्लिप को स्थानांतरित करें और 500 माइक्रोन इमेजिंग बफर के साथ धोएं। FRET-FCS सेटअप में जाने से पहले 500 माइक्रोन इमेजिंग बफर जोड़ें।
अंशांकन माप
नोट: FRET-FCS सेटअप एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पानी उद्देश्य, दो लेजर लाइनों, एक समय सहसंबद्ध एकल फोटॉन गिनती (TCSPC) प्रणाली, दो संकर फोटोमुखिल ट्यूब (पीएमटी) और फोटॉन संग्रह और डेटा संग्रह सॉफ्टवेयर के लिए दो हिमस्खलन फोटोडायोड (एपीडी) से सुसज्जित है । लाइव सेल मापन से पहले हर बार सेटअप को संरेखित करना बहुत महत्वपूर्ण है। विस्तृत सेटअप विवरण अनुपूरक नोट 2में पाया जा सकता है । दोनों लेजर और सभी डिटेक्टरों (दो पीएमटीएस और दो APDs) माप के दौरान हमेशा पर हैं, के रूप में सभी माप समान परिस्थितियों में आयोजित करने की जरूरत है । अंशांकन माप के लिए, उसी लॉटलिप से कवरस्लिप का उपयोग करें जिस पर कोशिकाओं को वरीयता दी गई थी, यह कॉलर रिंग सुधार में भिन्नता को कम कर देता है।
1. फोकस, पिनहोल और कॉलर रिंग पोजीशन को एडजस्ट करने के लिए 2 एनएम ग्रीन कैलिब्रेशन सॉल्यूशन को ग्लास कवरलिप पर रखें और 485 एनएम और 560 एनएम लेजर पर स्विच करें। स्पंदित इंटरलीव्ड एक्सिटेशन (पाई) मोड¹⁶में लेजर संचालित करें ।
2. समाधान पर ध्यान केंद्रित करें और पिनहोल और कॉलर रिंग स्थिति को समायोजित करें ताकि अधिकतम आणविक चमक प्राप्त करने के लिए उच्चतम गिनती दर और सबसे छोटी कॉन्फोकल वॉल्यूम प्राप्त हो सके।
3. लाल चैनलों के लिए इस प्रक्रिया को 10 एनएम लाल अंशांकन समाधान और दोनों के मिश्रण, हरे और लाल अंशांकन समाधान के साथ दोहराएं।
4. 10 एनएम डीएनए समाधान को ग्लास कवरलिप पर रखें और फोकस, पिनहोल और कॉलर रिंग पोजीशन को समायोजित करें ताकि हरे और लाल रंग के डिटेक्शन चैनलों के बीच क्रॉस-सहसंबंध सबसे अधिक हो, यानी उच्चतम आयाम दिखाता है।
  नोट: कदम 1.2.1 और 1.2.4 इष्टतम संरेखण खोजने के लिए आगे पीछे दोहराया जा सकता है। ध्यान, पिनहोल और कॉलर रिंग स्थिति के बाद 30 एस - 120 एस के लिए प्रत्येक अंशांकन समाधान से 3-5 माप लें, हरे और लाल पहचान चैनलों और कॉन्फोकल ओवरलैप वॉल्यूम के लिए बेहतर गठबंधन किया गया है।
5. पृष्ठभूमि गिनती दरों को निर्धारित करने के लिए 30 एस -₁₂₀एस के लिए डीडीएच 2 ओ, इमेजिंग माध्यम, और एक गैर-संक्रमित कोशिका 3-5 बार की एक बूंद को मापें।
6. 30 एस - 120 एस के लिए 3-5 माप के साथ साधन प्रतिक्रिया समारोह ले लीजिए। यह वैकल्पिक है लेकिन अत्यधिक अनुशंसित है।
लाइव सेल माप
1. पारा दीपक के साथ रोशन और नेत्र के माध्यम से देख कर एक उपयुक्त कोशिका का पता लगाएं।
  नोट: उपयुक्त कोशिकाएं संबंधित अनुयायी सेल लाइन की विशिष्ट आकृति विज्ञान को दिखाती हुए जीवित हैं। ब्याज के प्रोटीन का फ्लोरेसेंस, यहां एक सतह रिसेप्टर, सभी सतह पर दिखाई देता है। कम उज्ज्वल कोशिकाओं को अधिक उज्जवल एफसीएस में बेहतर विपरीत जब अणुओं की एक कम संख्या में ध्यान में है के कारण लोगों की तुलना में उपयुक्त हैं ।
2. पाई मोड में दोनों लेजर पर स्विच करें और प्रति सेकंड अधिकतम गिनती को देखकर झिल्ली पर ध्यान केंद्रित करें।
  नोट: लेजर शक्ति को सेल नमूनों (उद्देश्य पर 5 μW से कम) के लिए कम करने की आवश्यकता हो सकती है। यह इस्तेमाल किए गए फ्लोरोफोरस और सेटअप पर निर्भर करता है।
3. डेटा संग्रह सॉफ्टवेयर के ऑनलाइन पूर्वावलोकन में β₂एआर से जुड़े ईजीएफपी या लेबल किए गए स्नैप-टैग के ऑटो और क्रॉस-सहसंबंध घटता का निरीक्षण करें और 60-180 एस के बीच अधिग्रहण समय के साथ कई छोटे माप (~ 2 -10) एकत्र करें।
  नोट: कोशिकाओं को लगातार लंबे समय तक उत्तेजित न करें क्योंकि फ्लोरोफोरस ब्लीच हो सकता है। हालांकि, यह प्रत्येक कोशिका की चमक पर निर्भर करेगा, माप कितनी देर तक हो सकता है, और कुल कितने माप किए जा सकते हैं।

2. डेटा विश्लेषण

डेटा निर्यात
1. सहसंबंध घटता निर्यात, जी(टी_सी),और गिनती दरों, सीआर, सभी माप से ।
2. "त्वरित" और "देरी" समय खिड़कियों को सही ढंग से परिभाषित करने और डेटा सहसंबंध सॉफ्टवेयर में "माइक्रोटाइम गेटिंग" विकल्प का उपयोग करने का ध्यान रखें।
  नोट: कुल मिलाकर, तीन अलग-अलग सहसंबंधों की आवश्यकता होती है: (1) त्वरित समय खिड़की(एसीएफ_{जीपी),}(2) विलंब समय खिड़की(एसीएफ_{आरडी)}में लाल चैनलों के ऑटोकोरिएलेशन में ग्रीन चैनल का स्वत: संबंध, और अंत में (3) विलंब समय खिड़की(सीसीएफ_पाई)में रेड चैनल सिग्नल के साथ त्वरित समय खिड़की में ग्रीन चैनल सिग्नल का क्रॉस-सहसंबंध। डेटा निर्यात अनुपूरक नोट 3में विभिन्न सॉफ्टवेयर के लिए कदम-दर-कदम दिखाया गया है ।
अंशांकन माप
1. हरे रंग(एसीएफ_{जीपी)}और लाल(एसीएफ_{आरडी)}फ्लोरोफोर समाधानों के ऑटोकोर्सेशन कार्यों का उपयोग करें, और उन्हें दो प्रयुक्त रंग चैनलों के लिए कॉन्फोकल डिटेक्शन वॉल्यूम के आकार और आकार को जांचने के लिए आवश्यक होने पर अतिरिक्त ट्रिपल शब्द (eq. 1) के साथ एक 3 डी प्रसार मॉडल में फिट करें:
  eq. 1
  यहां, बी वक्र की आधार रेखा है, एन ध्यान में अणुओं की संख्या, टी_डी प्रसार समय (एमएस में), और एस = जेड_0/w₀ कॉन्फोकल वॉल्यूम तत्व का आकार कारक है । ट्रिपल निमिष या अन्य फोटोफिजिक्स को इसके आयाम _{ए आर} और रिलैक्सेशन टाइम टी _आरद्वारा वर्णित किया गया है।
  नोट: प्रोटोकॉल के भीतर उपयोग किए जाने वाले सभी चर और प्रतीक तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं।
2. हरे रंग^{के 26} और लाल अंशांकन मानक 27 के लिए ज्ञात प्रसार गुणांक डी का उपयोग करें और प्राप्त आकार कारकों को हरे और _लाल रंग के आयामों (चौड़ाई डब्ल्यू 0 और ऊंचाई जेड₀₎ और कन्फोकल वॉल्यूम तत्व (eq. 2a-c) के वॉल्यूम वी _eff निर्धारित करने के लिए।
  eq. 2a
  eq. 2b
  eq. 2c
  नोट: अंशांकन पैरामीटर की गणना के लिए टेम्पलेट्स पूरक फ़ाइलों (S7) के रूप में प्रदान किए जाते हैं।
3. पृष्ठभूमि-सही (बीजी) संकेतों (eq. 3) के अनुपात के रूप में लाल रंग के फ्लोरेसेंस सिग्नल (चैनल संख्या 1 और 3) में ग्रीन फ्लोरेसेंस सिग्नल (चैनल संख्या 1 और 3 में एकत्र) के स्पेक्ट्रल क्रॉसटॉक α की गणना करें।
  
  ईक्यू 3
4. "विलंब" समय खिड़की (ईक्यू 4) में पृष्ठभूमि-सही गिनती दर (हरे लेजर द्वारा उत्तेजन) में लाल अंशांकन मापों की पृष्ठभूमि-सही गिनती दर के अनुपात से दाता उत्तेजन तरंगदैर्ध्य द्वारा δ स्वीकार्य फ्लोरोफोर के प्रत्यक्ष उत्तेजन का निर्धारण करें।
  
  ईक्यू 4
5. पृष्ठभूमि-सही गिनती दरों और फोकस में अणुओं की प्राप्त संख्या, एन,3 डी प्रसार फिट (eq. 1) के आधार पर हरे और लाल फ्लोरोफोरस (eq. 5a-b) दोनों की आणविक चमक बी की गणना करें:
  eq. 5a
  eq. 5b
6. एसीएफ _जीपी और एसीएफ_आरडी दोनों के साथ-साथ डबल-लेबल डीएनए के सीसीएफ_पाई को 3डी प्रसार मॉडल (eq. 1) में फिट करें। प्राप्त आकार कारकों, एस_हरे और एस_लाल, एसीएफ_जीपी और एसीएफ_आरडीके लिए स्थिर, क्रमशः रखें । सीसीएफ_पाई,एस पाई के लिए आकार_{कारक,} आमतौर पर इन दो मूल्यों के बीच होता है।
  नोट: एक आदर्श सेटअप में, वी_{एफईफ,}_हरे और वी एफफ दोनों, लाल का आकार समान होगा और पूरी _तरह से ओवरलैप होगा।
7. शून्य सहसंबंध समय पर आयाम निर्धारित करें, जी₀(टी_सी),फोकस में अणुओं की स्पष्ट संख्या के पाए गए मूल्यों के आधार पर(एन_{ग्रीन,} एन_लाल और एन_{पाई)।}
8. हरे और लाल फ्लोरोफोरस (eq. 6) के 100% सह-प्रसार के साथ एक नमूने के लिए आयाम अनुपात आर_जीआर और आर_आरजी की गणना करें। ध्यान रखें कि एन_पाई फोकस में डबल लेबल वाले अणुओं की संख्या को प्रतिबिंबित नहीं करता है, लेकिन केवल 1/जी₀(टी_सी)को दर्शाता है।
  और eq. 6
लाइव सेल प्रयोग
1. एकल लेबल वाले निर्माणों के लिए, सेल नमूनों को एक उपयुक्त मॉडल में फिट करें। दिखाए गए झिल्ली रिसेप्टर के लिए, प्रसार एक छोटे और लंबे प्रसार समय के साथ एक द्विमॉडल फैशन में होता है। इसके अतिरिक्त, फ्लोरोफोरस के फोटोफिजिक्स और निमिष पर विचार किया जाना चाहिए:
  eq. 7
  यहां, टी_{डी 1} और टी डी₂ दो आवश्यक प्रसार समय हैं, और एक₁ पहले प्रसार समय का अंश है।
  नोट: अंशांकन मापन के विपरीत, जिसमें मुक्त रंग और डीएनए किस्में स्वतंत्र रूप से सभी दिशाओं में फैलाना, झिल्ली रिसेप्टर कोशिका झिल्ली के साथ केवल 2D प्रसार दिखाता है । 3डी और 2डी प्रसार के बीच यह अंतर संशोधित प्रसार शब्द (eq. 1 की तुलना) से परिलक्षित होता है, जहां 2डी मामले में टी_डी कॉन्फोकल वॉल्यूम तत्व के आकार कारक पर निर्भर नहीं करता है।
2. बुनियादी गणित (eq. 8) का उपयोग कर संबंधित एन और वी_eff से हरे या लाल लेबल प्रोटीन की एकाग्रता सी की गणना करें:
  eq. 8
  जहां एन_ए = एवोगाड्रो का नंबर
3. एन-टर्मिनल स्नैप लेबल और इंट्रासेलुलर ईजीएफपी के लिए, एक ही मॉडल का उपयोग करके डबल-लेबल वाले नमूने के दो ऑटोकोर्स(एसीएफ_जीपी और एसीएफ_{आरडी)}को फिट करें, जो एसीएफ (ईक्यू 7) के लिए एकल लेबल वाले निर्माणों के लिए है और सीसीएफ_पाई एक द्विmodalion प्रसार मॉडल (eq. 9): का उपयोग करके
  eq. 9
  नोट: प्रणाली के वैश्विक विवरण के लिए, सभी तीन घटता संयुक्त रूप से फिट होना चाहिए: प्रसार शब्द सभी तीन घटता के लिए समान है और एकमात्र अंतर सीसीएफ_पाईके लिए विश्राम शब्द है । चूंकि दो फ्लोरोफोरस के फोटोफिजिक्स आमतौर पर असंबंधित होते हैं, इसलिए किसी सहसंबंध शब्द की आवश्यकता नहीं होती है। छूट शर्तों के इस अभाव में कम सहसंबंध समय पर एक फ्लैट सीसीएफ_पाई में परिणाम होता है। हालांकि, दाता फ्लोरोफोर के कारण स्वीकारकर्ता का क्रॉसटॉक और प्रत्यक्ष उत्तेजन झूठी-सकारात्मक आयाम दिखा सकता है और अंशांकन माप का उपयोग करने के लिए सावधानीपूर्वक जांच की जानी चाहिए।
4. समीकरण 8 का उपयोग कर संबंधित एन और वी_eff से हरे या लाल लेबल प्रोटीन की एकाग्रता सी की गणना करें।
5. डीएनए नमूनों से प्राप्त सुधार कारकों का उपयोग करते हुए सेल नमूनों से हरे और लाल लेबल वाले प्रोटीन को बातचीत करने के अंश या एकाग्रता, सी_जीआर या सी_आरजीका अनुमान लगाएं, एम्पलिट्यूड अनुपात आर_जीआर और सेल नमूने के आर आर और_उनके संबंधित प्राप्त सांद्रता (eq. 10) ।
  और eq. 10
6. सी-टर्मिनल स्नैप लेबल और इंट्रासेलुलर ईजीएफपी के लिए, एफईआरटी नमूने के दो ऑटोऑर्र्सेशन(एसीएफ_जीपी और एसीएफ_{आरडी)}को एकल-लेबल नमूनों (समीकरण 7) और सीसीएफ_{एफईआरटी} को एक द्वि-शब्द प्रसार मॉडल के रूप में फिट करें जिसमें एक एंटी-टर्म सहसंबंध (समीकरण 11) शामिल है
  eq. 11
  जहां एक_एफ कुल विरोधी सहसंबंध के आयाम और एक आर और टी _आर संबंधित आयाम और विश्राम समय को दर्शाता है ।
  नोट: FRET के कारण विरोधी सहसंबद्ध फ्लोरेसेंस परिवर्तन के मामले में, एक या कई विरोधी सहसंबंध शर्तों (eq. 11) की आवश्यकता हो सकती है, जिसके परिणामस्वरूप दो ऑटोकोरिसेशन(एसीएफ_जीपी और एसीएफ_{आरडी)}में वृद्धि के साथ कम सहसंबंध समय पर सीसीएफ_FRET की "डुबकी" हो सकती है। हालांकि, ध्यान रखें कि ट्रिपल निमिष जैसे फोटोफिजिक्स FRET-प्रेरित विरोधी सहसंबंध को गीला करके विरोधी सहसंबंध शब्द को मुखौटा कर सकते हैं। फ़िल्टर किए गए एफसीएस विधियों के साथ पूरक एक संयुक्त विश्लेषण विरोधी सहसंबंध शब्द को अनमास्क करने में मदद कर सकता है। इसके अतिरिक्त, नैनोसेकंड रेंज में गिनती इलेक्ट्रॉनिक्स में मृत समय से उपजी तकनीकी कलाकृतियों को¹⁶से बाहर रखा जाना चाहिए। चिसर्फ²⁸ में विश्लेषण करने के तरीके और कॉन्फोकल वॉल्यूम या आणविक चमक की गणना के लिए टेम्पलेट्स पर एक अधिक विस्तृत कदम-दर-कदम प्रक्रिया गिथब रिपॉजिटरी (https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS) और अनुपूरक फाइलों(अनुपूरक नोट 4 और अनुपूरक नोट 6)के रूप में प्रदान की जाती है। इसके अतिरिक्त, .ptu प्रारूप में सिम्फोटाइम सॉफ्टवेयर के साथ प्राप्त डेटा के बैच निर्यात के लिए अजगर-लिपियों वहां पाया जा सकता है ।

Representative Results

अंशांकन और लाइव-सेल मापन के अनुकरणीय परिणामों पर नीचे चर्चा की जाती है। इसके अतिरिक्त, क्रॉस-सहसंबंध घटता पर FRET के प्रभाव को प्रोटीन-प्रोटीन-इंटरैक्शन के प्रभाव के बगल में नकली डेटा के आधार पर प्रदर्शित किया जाता है जो सीसीएफ_पाई आयाम को बढ़ाता है।

पाई-आधारित एफसीएस डेटा निर्यात
पाई प्रयोगों में, डेटा समय-टैग समय-हल मोड (टीटीटीआर)^{29, 30}में एकत्र किया^जाताहै। चित्रा 1B वर्णित सेटअप(अनुपूरक नोट 1)पर एक डबल लेबल डीएनए स्ट्रैंड के एक पाई माप के फोटॉन आगमन समय हिस्टोग्राम से पता चलता है । सेटअप में चार डिटेक्शन चैनल हैं। फ्लोरेसेंस उत्सर्जन पहले "एस" और "पी" दिशाओं में ध्रुवीकरण से विभाजित है (लंबवत और समानांतर विमान की चर्चा करते हुए जिसमें प्रकाश तरंग का विद्युत क्षेत्र दोलन है)। दूसरे, प्रत्येक ध्रुवीकरण दिशा को पता लगाने से पहले दो रंग चैनलों (हरे, लाल) में विभाजित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप चार चैनल (एस-ग्रीन, एस-लाल, पी-ग्रीन, पी-रेड)। "त्वरित" समय खिड़की में, हरी फ्लोरोफोर उत्तेजित हो जाता है, और संकेत दोनों हरे और लाल चैनलों में FRET के कारण पता चला है । देरी के समय खिड़की में, केवल लाल फ्लोरोफोर (लाल चैनल में) दिखाई देता है। डिटेक्शन चैनलों और "प्रॉम्प्ट" बनाम "विलंबित" समय खिड़कियों के आधार पर, कम से कम पांच अलग-अलग सहसंबंध घटता (3 ऑटोकोर्लिएलेशन वक्र्स (एसीएफ) और 2 क्रॉस-सहसंबंध घटता (सीसीएफ)) प्राप्त किया जा सकता है(चित्रा 1C-D):(1) त्वरित समय खिड़की में हरी झंडी(एसीएफ_{जीपी),}(2) त्वरित समय खिड़की में लाल संकेत (FRET, ACF के मामले में), _{आरपीएफ), आरपीएफ),} और (3) विलंब समय खिड़की(एसीएफ_{आरडी)}में रेड सिग्नल । प्रोटीन गतिशीलता, फोटोफिजिक्स (जैसे, ट्रिपल निमिष) और अन्य समय-सहसंबद्ध चमक में फ्लोरोफोर (उदाहरण के लिए, FRET के कारण) पर ये एसीएफ रिपोर्ट करते हैं। (4) देरी समय खिड़की में लाल संकेत के साथ त्वरित समय खिड़की में हरी झंडी के पाई आधारित क्रॉस-सहसंबंध CCF_पाई हरे और लाल फ्लोरोफोर¹⁶के सह-प्रसार के अंश का निर्धारण करने की अनुमति देता है । (5) प्रॉम्प्ट टाइम विंडो में रेड सिग्नल के साथ ग्रीन का FRET-आधारित क्रॉस-सहसंबंध सीसीएफ_{एफईआरटी} एफईआरटी-प्रेरित, एंटीकोरिनेटेड ब्राइटनेस परिवर्तन से संबंधित है, जो हरे और लाल^{संकेतों में परिवर्तन 31,}^32,³³है।

चित्रा 1:स्पंदित-इंटरलेव्ड एक्सिटेशन (पाई) आधारित फ्लोरेसेंस (क्रॉस) सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफ (सी)सीएस) ( ए)एफसीएस फ्लोरोसेंटी में एक केंद्रित लेजर बीम द्वारा आकार के अणुओं को स्वतंत्र रूप से और बाहर फैलाना। मात्रा में प्रवेश करने और छोड़ने वाले अणुओं के परिणामस्वरूप तीव्रता में उतार-चढ़ाव सहसंबद्ध होते हैं और अणुओं की गतिशीलता के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं। (ख)पाई में, दो अलग-अलग लेजर लाइनों ("त्वरित" और "देरी") का उपयोग दो अलग-अलग फ्लोरोफोरस ("हरे" और "लाल" के साथ लेबल किए गए नमूने को उत्तेजित करने के लिए किया जाता है।) दोनों उत्तेजन दालों के बीच समय अंतर संबंधित फ्लोरोफोरस के फ्लोरेसेंस जीवनकाल के लिए अनुकूलित किया जाता है ताकि एक दूसरे के उत्साहित होने से पहले सड़ गया हो। दिखाए गए डबल-लेबल वाले नमूने में, दोनों फ्लोरोफोरस "ग्रीन" दाता फ्लोरोफोर से "लाल" स्वीकार्य फ्लोरोफोर तक फॉस्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एफईआरटी) से गुजरने के लिए पर्याप्त रूप से बंद हैं। इस प्रकार, हरे दाता के उत्तेजन पर "त्वरित" समय-खिड़की में लाल फ्लोरेसेंस उत्सर्जन का पता लगाया जा सकता है। उपयोग किए गए सेटअप(अनुपूरक नोट 2)में, प्रत्येक रंग के लिए दो डिटेक्टरों का उपयोग किया जाता है, एक उत्तेजन बीम अभिविन्यास (निरूपित "पी") और दूसरा लंबवत (निरूपित "एस") के समानांतर एक उन्मुख। (ग) एक पाई प्रयोग में तीन अलग-अलग ऑटोकोरिएलेशन कार्यों का निर्धारण किया जा सकता है: त्वरित समय खिड़की में ग्रीन चैनल सिग्नल(एसीएफ_{जीपी),}ii) रेड चैनल सिग्नल में प्रॉम्प्ट टाइम विंडो(एसीएफ_{आरपी)}और iii) रेड चैनल सिग्नल्स में विलंब समय खिड़की(एसीएफ_{आरडी)}में। (घ) दो अलग-अलग क्रॉस-सहसंबंध कार्यों का निर्धारण किया जा सकता है: iv) विलंब खिड़की में रेड चैनल संकेतों के साथ सहसंबद्ध त्वरित समय खिड़की में हरे चैनल संकेतों के साथ "पाई" क्रॉस-सहसंबंध(सीसीएफ_पाई)जहां इस वक्र का आयाम फ्लोरोफोरस के सह-प्रसार से संबंधित है; और v) एक ही त्वरित खिड़की में लाल चैनल संकेतों के साथ सहसंबद्ध त्वरित समय खिड़की में हरे चैनल संकेतों के साथ "FRET" क्रॉस-सहसंबंध_{(सीसीएफ FRET);} यहां प्रसार की तुलना में तेजी से कई बार इस वक्र का आकार FRET-प्रेरित तीव्रता परिवर्तन से संबंधित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अंशांकन
चित्रा 2A-B क्रमशः अकेले फैलाना हरे और लाल फ्लोरोफोरस का एक अंशांकन माप से पता चलता है । eq. 1 और ज्ञात प्रसार गुणांक डी ग्रीन²⁶ और डी_लाल27 आकार (जेड 0 और डब्ल्यू₀₎ और पता लगाने की मात्रा के आकार(V_eff)eq. 2a-c का उपयोग कर गणना कर रहे हैं के साथ एक फिट के आधार पर। लाल फ्लोरोफोर से ग्रीन फ्लोरोफोर और एसीएफ_आरडी से एसीएफ_जीपी से फिट परिणाम चित्रा 2Cमें संक्षेप में प्रस्तुत कर रहे हैं । दोनों फ्लोरोफोरस क्रमशः 8.6 माइक्रोन (18%) और 36 माइक्रोन (15%) का एक अतिरिक्त छूट समय दिखाते हैं। हरे और लाल फ्लोरोफोर की आणविक चमक (ईक्यू 5ए-बी) क्रमशः 12.5 किलोहर्ट्ज प्रति अणु और 2.7 किलोहर्ट्ज प्रति अणु की राशि है।

कॉन्फोकल वॉल्यूम आकार और आकार के साथ-साथ आणविक चमक के विश्वसनीय अनुमान के लिए, अंशांकन प्रयोगों के अनुसार 3-5 माप करने की सिफारिश की जाती है और सभी दोहराता के संयुक्त (या वैश्विक) फिट होते हैं।

क्रॉसटॉक α(चित्रा 2D,eq. 3) और इस फ्लोरोफोर जोड़ी के लिए ग्रीन लेजर δ(चित्रा 2E,eq. 4) द्वारा स्वीकार्यकर्ता की सीधी उत्तेजन क्रमशः ~ 15% और ~ 38% पर झूठ बोलते हैं।

चित्र 2:स्वतंत्र रूप से फैलाव हरे और लाल अंशांकन मानक के अंशांकन माप । (ए-बी)प्रतिनिधि ६० एस माप एक 2 एनएम हरे(ए)और एक 10 एनएम लाल(बी)अंशांकन मानक माप 3D प्रसार मॉडल के लिए फिट एक अतिरिक्त छूट समय(eq.1)सहित । पैनल(सी)में तालिका में फिट परिणाम और ईक्यू के आधार पर व्युत्पन्न पैरामीटर दिखाया गया है। 2ए-सी और ईक्यू 5ए-बी। * प्रसार गुणांक साहित्य²⁶^,²⁷से लिया गया था । (घ)रेड चैनलों में हरी झंडी के क्रॉसटॉक α का निर्धारण(eq. 3)। हरित मानक का उत्तेजन स्पेक्ट्रम सियान में दिखाया गया है, हरे रंग में उत्सर्जन स्पेक्ट्रम। 485 एनएम (नीला) और 561 एनएम (नारंगी) पर उत्तेजन लेजर लाइनों को धराशायी लाइनों के रूप में दिखाया गया है। पारदर्शी हरे और मजेंटा बक्से एकत्र उत्सर्जन रेंज(अनुपूरक नोट 2)दिखाते हैं । (ई)485 एनएम लेजर (eq. 4) द्वारा लाल फ्लोरोफोर के δ प्रत्यक्ष उमंग का निर्धारण। रंग कोड(डी),प्रकाश और गहरे नारंगी के समान है, क्रमशः लाल मानक के उत्तेजन और उत्सर्जन स्पेक्ट्रम दिखाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

हरे और लाल उत्तेजन की मात्रा के ओवरलैप को निर्धारित करने और जांचने के लिए, एक डबल-लेबल डीएनए डबल स्ट्रैंड का उपयोग ऊपर वर्णित(चित्रा 3A)किया जाता है। यहां, फ्लोरोफोरेस को 40 बीपी के अलावा इस तरह से दूरी दी जाती है कि डीएनए डबल किस्में के सिरों से जुड़े हरे और लाल फ्लोरोफोरस के बीच कोई भी FRET नहीं हो सकता है। चित्रा 3B हरे रंग में दोनों फ्लोरोफोरस(एसीएफ_{जीपी)}और मजेंटा(एसीएफ_{आरडी)}और पाई-क्रॉस सहसंबंध, सीसीएफ_पाई,सियान में से ऑटोकोर्स को दिखाता है। कृपया ध्यान दें कि सीसीएफ_पाई के लिए , त्वरित समय खिड़की में हरे चैनलों में संकेत देरी समय खिड़की¹⁶में लाल चैनलों में संकेत के साथ सहसंबद्ध है ।

यहां, डी_{डीएनए} = 77 μm²/s के डीएनए कतरा के लिए एक औसत प्रसार गुणांक प्राप्त किया जाता है । गणना के बारे में अधिक जानकारी कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल, अनुपूरक नोट 4में पाया जा सकता है । यह मूल्य अंशांकित हरे और लाल पहचान खंड आकार(चित्रा 2)और एसीएफ_जीपी और डीएनए स्ट्रैंड(चित्रा 3C)के एसीएफ_आरडी के संबंधित प्रसार समय को समीकरण 2a में डालकर प्राप्त किया जाता है। इसके बाद, प्राप्त सुधार मूल्यों आर_जीआर और आर आर_आरजी का उपयोग करके और eq का उपयोग करके। 6 बाद में, सह-प्रसार की मात्रा, यानी, डबल-लेबल वाले अणुओं (या दो अलग-अलग प्रोटीन के सह-ट्रांसफेक्शन के मामले में प्रोटीन परिसर) सेल नमूनों से निर्धारित किया जा सकता है।

चित्र 3:डीएनए नमूने का उपयोग करके हरे-लाल ओवरलैप वॉल्यूम का अंशांकन। (क)अंशांकन के लिए उपयोग किए जाने वाले डीएनए स्ट्रैंड में एक हरे और लाल अंशांकन फ्लोरोफोर होते हैं, जिनकी दूरी बीच में 40 बीपी होती है। फ्लोरोफोरस के बीच FRET को बाहर करने के लिए इंटरडाय दूरी पर्याप्त रूप से बड़ी होनी चाहिए। }प्रतिनिधि 60 एस माप 10 एनएम डीएनए समाधान। हरे रंग में दोनों फ्लोरोफोरस से ऑटोकोर्स(एसीएफ_{जीपी,}ग्रीन स्टैंडर्ड) और मैजेंटा(एसीएफ_{आरडी,}लाल मानक) और पाई-क्रॉसकोर्स, सीसीएफ_पाई,नीले रंग में। पैनल(सी)में तालिका 3 डी प्रसार मॉडल के आधार पर फिट परिणाम दिखाती है जिसमें एक अतिरिक्त छूट अवधि(eq. 1)और डीएनए, डी_{डीएनए} (eq. 2a)का व्युत्पन्न पैरामीटर प्रसार गुणांक, ओवरलैप वॉल्यूम(eq. 2a-c)और सुधार अनुपात आर_जीआर और आर आर(eq 6) शामिल हैं । ). कृपया ध्यान दें कि हरे और लाल पहचान की मात्रा के लिए मूल्य (*के साथ लेबल) चित्र 2में दिखाए गए व्यक्तिगत फ्लोरोफोरस के फिट से लिए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

लाइव-सेल प्रयोग
निम्नलिखित अनुभाग में, विभिन्न β₂एआर निर्माणों के लिए लाइव-सेल प्रयोगों का विश्लेषण प्रस्तुत किया गया है। जैसा कि_{β 2}एआर एक झिल्ली प्रोटीन है, इसका प्रसार काफी हद तक कोशिका झिल्ली के साथ दो आयामी प्रसार(चित्रा 4 ए)तक सीमित है (परिवहन या रीसाइक्लिंग प्रक्रियाओं को छोड़कर या झिल्ली से) ^2। 2डी प्रसार पर प्रतिबंध के साथ आकार कारक एस = जेड₀/डब्ल्यू₀ eq. 1 अप्रचलित हो जाता है जिसके परिणामस्वरूप एक सरलीकृत प्रसार मॉडल (eq. 9)।

एकल लेबल निर्माण: β₂AR-IL3-eGFP और NT-स्नैप-β₂एआर
चित्रा 4 एकल लेबल निर्माण β₂एआर-IL3-eGFP(चित्रा 4B),जहां eGFP इंट्रासेलुलर लूप 3 में डाला जाता है, और निर्माण एनटी-स्नैप-β₂एआर(चित्रा 4C),जहां स्नैप टैग β₂एआर के एन-टर्मिनस के लिए संयुग्मित है । स्नैप टैग एक झिल्ली-अभेद्य स्नैप सतह सब्सट्रेट के साथ लेबल है । प्रतिनिधि घटता 120 - 200 एस प्रत्येक के अधिग्रहण समय के साथ 4-6 दोहराया माप का औसत दिखाते हैं। ईजीएफपी और स्नैप सिग्नल के संबंधित ऑटोसंक्शन एसीएफ_जीपी और एसीएफ_आरडी को एक द्विमॉडल, द्वि-आयामी प्रसार मॉडल (eq. 9) में फिट किया जाता है। तेजी से गतिशीलता के संदर्भ में, eGFP टी_R1 ~ 9 μs पर केवल अपेक्षित ट्रिपल निमिष दिखाता है, जबकि स्नैप सिग्नल को दो विश्राम समय की आवश्यकता होती है, एक टी_R1 ~ 5 μs के ठेठ ट्रिपल निमिष समय पर और टी_R2 ~ 180 μs पर एक दूसरे को।

जीवित कोशिकाओं में फ्लोरोफोरस की आणविक चमक दी गई उत्तेजन स्थितियों (eqs. 5a-b) के तहत प्रति अणु 0.8 KHz (eGFP) और 1.7 kHz (स्नैप) है। कोशिका झिल्ली में शामिल लेबल β₂एआर निर्माणों की एकाग्रता नैनो-मोलर रेंज में होनी चाहिए और इसे अणुओं की औसत संख्या (eq. 9, चित्रा 4C)और ईक्यू 8 का उपयोग करके हरे और लाल चैनल(चित्रा 2)के लिए संबंधित कॉन्फोकल वॉल्यूम के आकार से निर्धारित किया जा सकता है।

चित्र 4:एकल लेबल निर्माणों का प्रतिनिधि माप। (क)इस अध्ययन में झिल्ली रिसेप्टर β₂एआर का उपयोग उदाहरण के रूप में किया गया था । कैलिब्रेशन के लिए उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोफोरस और डीएनए स्ट्रैंड के विपरीत, जो स्वतंत्र रूप से पता लगाने की मात्रा के माध्यम से तैर सकता है, झिल्ली प्रोटीन मुख्य रूप से झिल्ली के साथ फैलता है, जिसे 2-आयामी प्रसार के रूप में वर्णित किया जाता है। (B, D) एकल लेबल के एसीएफ_जीपी और एसीएफ_आरडी ₂एआर-आईएल3-ईजीएफपी(बी)और एनटी-स्नैप-β₂एआर(डी)β निर्माण करते हैं। दिखाया गया है कि 120 - 200 एस के लिए एकत्र किए गए 4-6 मापों का औसत है। पैनल(सी)में तालिका अतिरिक्त छूट शर्तों(eq. 7)सहित द्विमोडल द्वि-आयामी प्रसार मॉडल को डेटा के फिट परिणामों को दर्शाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

डबल लेबल निर्माण: NT-स्नैप-β₂AR-IL3-eGFP
डबल लेबल निर्माण एनटी-स्नैप-β₂एआर-IL3-eGFP (शॉर्ट एनटी-स्नैप) में, eGFP को इंट्रासेलुलर लूप 3 में डाला जाता है, और, स्नैप टैग β₂एआर(चित्रा 5A)के एन-टर्मिनस के लिए संयुग्मित है। इस विन्यास में, eGFP झिल्ली के भीतरी तरफ है और FRET के लिए बहुत बड़ी दूरी के साथ बाहरी तरफ तस्वीर । एक आदर्श मामले में, यह निर्माण हरे और लाल फ्लोरोफोर का 100% सह-प्रसार दिखाएगा, और कोई FRET सिग्नल नहीं होगा। चित्रा 5B-डी दो अलग माप दिनों पर दो कोशिकाओं में एनटी-स्नैप के दो माप से पता चलता है । ईक्यू 7 और ईक्यू 9 के साथ चित्रा 5B में दिखाए गए "बेहतर" माप के एसीएफ_जीपी और एसीएफ_आरडी को फिट करना, एसीएफ_जीपी और एसीएफ_आरडीके लिए फोकस में 50-60 अणुओं का पता चलता है, जबकि एन_ऐप,इस प्रकार सीसीएफ_पाई के लिए 1/जी₀(टी_सी)~ 114(चित्रा 5C) के लिए ). लेबल रिसेप्टर्स की एकाग्रता ~ 100 एनएम रेंज में निहित है जैसा कि eq. 8 के साथ निर्धारित किया गया है। डबल लेबल वाले अणुओं की औसत एकाग्रता निर्धारित करने के लिए, सबसे पहले, सीसीएफ_पाई के जी₀(टी_सी)(1/एन_(ऐप)द्वारा प्रतिनिधित्व किए गए अनुपात को क्रमशः एसीएफ_जीपी और एसीएफ_आरडीमें गणना की जाती है (ईक्यू 6)। इसके बाद, इन मूल्यों, आर_GRcell= 0.43 और आर_RGcell = 0.53 डीएनए माप से प्राप्त मूल्यों की तुलना में कर रहे हैं(आर_{जीआर, डीएनए}= 0.51 और आर_{आरजी, डीएनए} = 0.79 इस माप दिवस पर). अनुपात के नियम का उपयोग करना, eGFP संकेत के एसीएफ_जीपी से एक आर _GRcell= 0.43 सह प्रसार के एक अंश को दर्शाता है(आर_GRcell/ डबल लेबल एनटी-स्नैप निर्माण की औसत एकाग्रता अंततः eq. 10 के आधार पर गणना की जा सकती है । इसके विपरीत, एक अलग दिन से चित्रा 5D में दिखाए गए माप में, रिसेप्टर्स की एकाग्रता काफी कम है और डेटा बहुत शोर है कि फिट रेंज ~ 10 माइक्रोन तक सीमित है। इसके अलावा, केवल कम मात्रा में सह-प्रसार (15 - 26%) मनाया जाता है।

चित्रा 5:डबल लेबल एनटी-स्नैप-β₂एआर-IL3-eGFP निर्माण । (क)डबल लेबल वाले निर्माण में ईजीएफपी को इंट्रासेल्युलर लूप 3 और β 2 एआर (एनटी-स्नैप) के एन-टर्मिनस से जुड़े स्नैप टैग में डाला_जाताहै । (बी, डी) एसीएफ_{जीपी,} एसीएफ_आरडी और सीसीएफ_पाई डबल लेबल वाले निर्माण के दो मापों के। डेटा एक द्विमॉडल द्वि-आयामी प्रसार मॉडल(eq. 9, CCF_पाई)के लिए फिट है और अतिरिक्त छूट शर्तों(eq. 7, एसीएफ_जीपी और एसीएफ_{आरडी)}सहित । पैनल(सी)में तालिका फिट परिणामों और व्युत्पन्न पैरामीटर एकाग्रता(eq. 8),शून्य सहसंबंध समय (जी₀(टी_सी))पर सहसंबंध आयाम का अनुपात और सह-फैलाना अणुओं(eq. 10)के अंश को दर्शाता है । कृपया ध्यान दें कि माप अलग-अलग दिनों में प्राप्त किए गए थे, इस प्रकार आयाम सुधार के लिए थोड़ा अलग कारक का उपयोग किया गया था (बी: आर_{जीआर, डीएनए} = 0.51 और आर आर _{आरजी, डीएनए} = 0.79; D: आर_{जीआर, डीएनए} = 0.51 और आर _{आरजी, डीएनए} = 0.56).201.56.. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

डबल लेबल FRET के दौर से गुजर निर्माण: β₂AR-IL3-eGFP-सीटी-स्नैप
डबल लेबल निर्माण β₂एआर-आईएल3-eGFP-सीटी-स्नैप(चित्रा 6A)में, eGFP को एनटी-स्नैप-β₂एआर-आईएल3-ईजीएफपी निर्माण के समान इंट्रासेल्युलर लूप 3 में डाला गया है, जो सी-टर्मिनस से जुड़े स्नैप टैग के साथ है । यहां, दोनों लेबल कोशिकाओं की प्लाज्मा झिल्ली के एक ही तरफ हैं, ताकि फ्लोरोफोरस निकट के क्षेत्र में हों ताकि एफईआरटी के रूप में शमन eGFP जीवनकाल(अनुपूरक नोट 5)द्वारा इंगित किया जाता है । सी-टर्मिनस³⁴ जैसे अपेक्षाकृत असंरचित प्रोटीन क्षेत्रों के लचीलेपन को ध्यान में रखते हुए और जीपीसीआर^35,"हाई एफईआरटी" (एचएफ) या "कम एफईआरटी" (एलएफ) के कम से कम दो अलग-अलग प्रोटीन संरचनाएं, ईजीएफपी-स्नैप दूरी परिवर्तन के कारण FRET दक्षता में गतिशील परिवर्तन देखा जा सकता है और सीसीएफ_FRET (चित्रा में नारंगी वक्र में नारंगी वक्र) ). FRET उतार-चढ़ाव को विरोधी दिखाया गया है क्योंकि रिसेप्टर केवल एक समय में एक राज्य में हो सकता है, या तो एचएफ या वामो। संयुक्त (या वैश्विक) सभी पांच सहसंबंध घटता के फिट(चित्रा 6B)~ 100 एमएस पर धीरे से फैलाना अणुओं के ~ 70% से पता चलता है, जबकि बाकी ~ 1 एमएस के साथ फैलाना। सभी ऑटोसंबंध और _{सीसीएफ एफईआरटी} 37 माइक्रोन और 3 माइक्रोन पर छूट की शर्तें दिखाते हैं; रेड सिग्नल(एसीएफ_{आरपी,}एसीएफ _आरडी और सीसीएफ_{एफईआरटी)}के प्रभुत्व वाले सहसंबंध एक अतिरिक्त धीमी घटक ~ 50 एमएस(चित्रा 6 सी) दिखाते हैं।

विभिन्न परिस्थितियों(चित्रा 6 डी)के तहत सीसीएफ एफआरटी पर_{FRET-प्रेरित} परिवर्तन वामो और एचएफ राज्यों के बीच 70 माइक्रोन के उतार-चढ़ाव के समय के साथ दो-राज्य प्रणाली के सिमुलेशन की एक श्रृंखला द्वारा प्रदर्शित किए जाते हैं। वामो से एचएफ राज्य में स्विच करने पर, एंटीकोरिनेटेड सिग्नल में परिवर्तन त्वरित समय खिड़की में मनाया जाता है: ग्रीन सिग्नल कम हो जाता है और रेड सिग्नल बढ़ जाता है (एचएफ-> एलएफ स्विचिंग के लिए इसके विपरीत)। यदि एचएफ-एलएफ स्विचिंग प्रसार समय की तुलना में तेजी से टाइमस्केल पर होता है, तो दूसरे शब्दों में ध्यान में अणु के निवास समय के दौरान, दर सीसीएफ_{एफईआरटी}^6,^{31, 36}में एंटीकोरिएलेशन से प्राप्त की जा सकती है। कृपया ध्यान दें कि गतिशील प्रक्रियाओं प्रसार समय की तुलना में धीमी FCS में नहीं देखा जा सकता है ।

इस प्रदर्शन में, दो अलग-अलग एफवाईटी परिदृश्यों को ग्रहण किया गया, जिसमें दोनों राज्यों के बीच FRET दक्षता में या तो एक उदारवादी या अधिकतम परिवर्तन दिखाया गया था। सिमुलेशन बर्बुलेटर³⁷ का उपयोग करके किए गए थे और लाल चैनलों में ट्रिपल निमिष और दाता क्रॉसटॉक की बढ़ती मात्रा की अनुपस्थिति या उपस्थिति पर विचार करते हैं। प्रसार शब्द टी_D1 = 1 एमएस में तेजी से फैलाना अणुओं के 30% के साथ एक द्विमॉडल वितरण के रूप में मॉडलिंग किया गया था और अणुओं के बाकी टी_D2 = 100 एमएस के साथ धीरे से फैलाना । कुल मिलाकर, 10⁷ फोटॉन डब्ल्यू 0 = _0.5 माइक्रोन और जेड 0 = 1.5 माइक्रोन, 20 के एक बॉक्स आकार, और एन_FCS = _0.01 के साथ एक 3 डी गॉसियन के आकार की मात्रा में नकली थे।

चित्रा 6E-F एफ के लिए सिमुलेशन परिणामों से पता चलता है FRET प्रेरित पार सहसंबंध CCF_FRET के लिए मध्यम(चित्रा 6E)और अधिकतम FRET विपरीत(चित्रा 6F)अनुपस्थिति में (ठोस लाइनों) और ट्रिपल निमिष (धराशायी लाइनों) की उपस्थिति । FRET-प्रेरित विरोधी सहसंबंध आसानी से चित्रा 6Fमें देखा जा सकता है । अतिरिक्त ट्रिपल स्टेट जोड़ने पर "गीला" प्रभाव सहसंबंध आयाम(चित्र 6E-F)^{38, 39}को कम कर^देताहै।

चित्रा 6:डबल-लेबल वाले नमूने का सिमुलेशन जो गतिशील FRET दिखाता है। (ए)डबल-लेबल β₂एआर के साथ इंट्रासेल्युलर लूप 3 और सी-टर्मिनल स्नैप टैग में डाला गया एक ईजीएफपी के साथ। दोनों फ्लोरोफोरस काफी करीब हैं FRET से गुजरना और FRET दक्षता में परिवर्तन दिखाने के लिए अगर रिसेप्टर प्रोटीन गतिशीलता से गुजरता है । (B)ऑटोकोरिएलेशन(एसीएफ_{जीपी,}एसीएफ आरपी और एसीएफ _{आरडी,} ईक्यू 7के साथ फिट) और क्रॉस-सहसंबंध वक्र्स(ईक्यू 7)और सीसीएफ_पाई (ईक्यू 9))एक उदाहरण माप के। पैनल में तालिका(सी)फिट परिणाम दिखाता है। (D-F) अपेक्षित, FRET-प्रेरित एंटीकोरिएलेशन शब्द पर प्रयोगात्मक पैरामीटर के प्रभाव को दिखाने के लिए, 12 सिमुलेशन किए गए थे, जिसमें एफपीटी दक्षता (छोटे या बड़े), विभिन्न मात्रा में दाता क्रॉसटॉक को स्वीकारकर्ता चैनलों (0%, 1% या 10%) में बदल दिया गया था और ट्रिपल ब्लिंकिंग की अनुपस्थिति और उपस्थिति मॉडलिंग की गई थी। दोनों FRET राज्यों के संतुलन अंश 50:50 को ग्रहण किया गया था और उनकी विनिमय दरों को समायोजित किया गया था जैसे कि प्राप्त विश्राम समय टी_आर = ७० μs । सिमुलेशन पर अधिक जानकारी पाठ में देखते हैं। (ई)सिमुलेशन के सीसीएफ_FRET एक मध्यम FRET विपरीत के साथ परिणाम और क्रॉसटॉक (डार्क ऑरेंज), 1% क्रॉसटॉक (नारंगी) और 10% क्रॉसटॉक (हल्के नारंगी) की अनुपस्थिति में। ठोस लाइनें ट्रिपल की उपस्थिति में ट्रिपल, धराशायी लाइनों के अभाव में परिणाम दिखाते हैं। (एफ)सिमुलेशन के सीसीएफ_FRET अधिकतम FRET विपरीत के साथ परिणाम। रंग कोड(ई)के समान है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

हालांकि, सिमुलेशन में सबसे अधिक प्रयोगात्मक स्थितियों के समान (α = 10%, 15% ट्रिपल निमिष और मध्यम FRET विपरीत, चित्रा 6Eमें धराशायी पीली रेखा), एंटीकोशन शब्द लगभग कम हो गया है। चित्रा 7 फोटॉन आगमन समय हिस्टोग्राम (यानी फ्लोरेसेंस लाइफटाइम) में एन्कोडेड जानकारी का उपयोग करके इस नकली डेटा का विश्लेषण करने का परिणाम दिखाता है फ्लोरेसेंस लाइफटाइम सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (FLCS)^17,¹⁹ या प्रजातियों-फ़िल्टर एफसीएस (एफएफसी)¹⁸के माध्यम से। यहां, ज्ञात एचएफ और वामो प्रजातियों(चित्रा 7A)के फ्लोरेसेंस जीवनकाल का उपयोग सहसंबंध प्रक्रिया के दौरान लागू होने वाले वजन या "फिल्टर"(चित्रा 7B)उत्पन्न करने के लिए किया जाता है। प्राप्त प्रजातियों में- ऑटो- और क्रॉस-सहसंबंध घटता(चित्रा 7C-D)में एंटीकोरिबंध स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है।

चित्रा 7:लाइफटाइम-फ़िल्टर किए गए एफसीएस सीसीएफ_{एफआरटी}में FRET-प्रेरित एंटीकोरिएलेशन को मास्क करने वाले उच्च क्रॉसटॉक, महत्वपूर्ण ट्रिपल निमिष या अन्य फोटोफिजिकल या प्रयोगात्मक गुणों के साथ नमूनों में FRET दक्षता में प्रोटीन गतिशीलता आधारित उतार-चढ़ाव को उजागर करने में मदद कर सकते हैं। यहां, दृष्टिकोण को 10% क्रॉसटॉक और 5% ट्रिपल निमिष युक्त सिमुलेशन के लिए चित्रा 6E में दिखाए गए डेटा के लिए अनुकरणीय दिखाया गया है। (ए)दो FRET-प्रजातियों (क्रमशः उच्च और निम्न FRET के लिए हल्के और गहरे हरे रंग) और आईआरएफ (ग्रे) के लिए सामान्यीकृत फ्लोरेसेंस तीव्रता क्षय पैटर्न। समानांतर डिटेक्शन चैनल के लिए पैटर्न ठोस लाइनों में दिखाया गया है, लंबवत डिटेक्शन चैनल के लिए धराशायी लाइनें। (ख)भार समारोह या "फिल्टर" में दिखाए गए पैटर्न के आधार पर उत्पन्न किया गया(ए),रंग कोड(ए)के समान है। कृपया ध्यान दें कि केवल ग्रीन डिटेक्शन चैनलों में संकेत है, और इस तरह FRET प्रेरित दाता शमन, यहां माना जाता है । (C)चार विभिन्न प्रजातियों-चयनात्मक सहसंबंध प्राप्त कर रहे हैं: प्रजातियों-कम FRET राज्य के autocorrelations(SACF_{एलएफ-वामो,}गहरे हरे) और उच्च FRET राज्य(SACF_{एचएफ-एचएफ,}हल्के हरे), और दो प्रजातियों-उच्च FRET राज्य के लिए कम FRET राज्य के बीच क्रॉसकोर्लेशन(SCCF_{एलएफ,}डार्क ऑरेंज) और वाइस वर्सा_{(एसएफएफ} , नारंगी। एससीएफ स्पष्ट रूप से μs-रेंज में विरोधी संबंध दिखाता है। धराशायी काली लाइनें फिट बैठता है दिखाओ । SACF eq. 9 और sCCF के साथ eq. 11के साथ फिट थे । टेबल इन पैनल(डी)फिट परिणाम दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) का अध्ययन करने के लिए सीसीएफ_पाई आयाम
अंत में, लाइव कोशिकाओं में पाई-आधारित एफसीएस के लिए एक आम उपयोग मामला दो अलग-अलग प्रोटीन के बीच बातचीत का अध्ययन करना है। यहां, रीड-आउट पैरामीटर सीसीएफ_पाईका आयाम है, या अधिक सटीक रूप से ऑटोसंबंध आयाम का अनुपात एसीएफ_जीई और एसीएफ_आरडी का आयाम सीसीएफ_पाईके आयाम के लिए है। सीसीएफ_पाईपर बढ़ते सह-प्रसार के प्रभाव को दिखाने के लिए, सिमुलेशन दो एकल लेबल वाले निर्माणों, β 2 एआर-आईएल3-ईजीएफपी और एनटी-स्नैप-β₂एआर(चित्रा 8A)के आधार पर किया गया है। चित्रा 8B से पता चलता है कि सीसीएफ_पाई का आयाम कैसे बढ़ता है जब सह-फैलाना अणुओं का अंश 0% से १००% तक बदलता है । कृपया ध्यान दें कि देरी समय खिड़की में लाल चैनलों में हरी झंडी का 1% क्रॉसटॉक प्रसार घटकों के साथ जोड़ा गया था अन्यथा ऊपर दिखाए गए रूप में मॉडलिंग की गई थी।

चित्रा 8: CCF_पाई दो प्रोटीन की बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । (ए)यहां, एनटी-स्नैप-β₂एआर (एक "लाल" स्नैप लेबल ले जाने) के साथ β₂AR-IL3-eGFP के एक सह-ट्रांसफेक्शन अध्ययन नकली था । (ख)सह-प्रसारित अणुओं की बढ़ती मात्रा (0% (गहरा नीला) -> 100% (हल्का नीला)) आयाम जी(टी_सी)बढ़ जाता है। प्रसार शब्द फिर से टी_D1 = 1 एमएस में तेजी से फैलाना अणुओं के 30% के साथ एक द्विमॉडल वितरण के रूप में मॉडलिंग की गई थी और बाकी अणु टी _D2 = 100 ms के साथ धीरे-धीरे फैलाना। इसके अतिरिक्त, रेड देरी समय खिड़की में ग्रीन सिग्नल का 1% क्रॉसटॉक जोड़ा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चिह्न	अर्थ (सामान्य इकाई)
α	लाल पहचान चैनलों में हरे रंग की उमंग के बाद हरे रंग के फ्लोरोफोर का क्रॉसटॉक (%)
एक₁	झिल्ली रिसेप्टर्स के द्विमोडल प्रसार मॉडल में पहले प्रसार घटक का अंश
एक_च	एंटीकोरिएलेशन शब्द का कुल आयाम
एक_आर	फोटोफिजिक्स /ट्रिपल निमिष का आयाम
b	एक सहसंबंध वक्र का आधारभूत/ऑफसेट
B	एक फ्लोरोफोर की आणविक चमक ((किलो-) प्रति अणु और दूसरा मायने रखता है)
बीजी	पृष्ठभूमि (उदाहरण के लिए एक उपयुक्त संदर्भ नमूने से: ddH2O, बफर, असंक्रमित कोशिका आदि)
c	एकाग्रता
सीआर	गिनती दर (KHz या (किलो-) प्रति सेकंड मायने रखता है)
δ	हरी उत्तेजन के बाद लाल फ्लोरोफोर की सीधी उमंग (%)
D	प्रसार गुणांक (μm²/s)
जी (टी_सी)	सहसंबंध समारोह
N	फोकस में अणुओं की संख्या
एन_ए	एवोगाड्रो का नंबर (6.022*10²³ मोल^-1)
आर_{जीआर,}आर_आर	पाई-आधारित क्रॉस-सहसंबंध समारोह में हरे या लाल ऑटोकोरिएलेशन फ़ंक्शन का आयाम अनुपात
s	कॉन्फोकल वॉल्यूम तत्व का आकार कारक
टी_सी	सहसंबंध समय (आमतौर पर मिलीसेकंड में)
टी_डी	प्रसार समय (आमतौर पर मिलीसेकंड या माइक्रोसेकंड में)
टी_आर	फोटोफिजिक्स का विश्राम समय (आमतौर पर माइक्रोसेकंड में)
टी_टी	ट्रिपल निमिष का विश्राम समय (आमतौर पर माइक्रोसेकंड में)
डब्ल्यू₀	कॉन्फोकल वॉल्यूम तत्व (माइक्रोन) की आधी चौड़ाई
z₀	कॉन्फोकल वॉल्यूम तत्व (माइक्रोन) की आधी ऊंचाई

तालिका 1: चर और संक्षिप्त नाम की सूची। फ्लोरेसेंस और FRET प्रयोगों में प्रतीकों और परिभाषा के उपयोग के लिए, FRET समुदाय⁴⁰ के दिशानिर्देशों की सिफारिश की जाती है।

अनुपूरक फाइलें:

सफाई SuppNote1_Coverslip.docx कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

सेटअप SuppNote2_Confocal.docx कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

निर्यात SuppNote3_Data.docx कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

चिसर्फ का उपयोग करके अंशांकन विश्लेषण SuppNote4_FCCS.docx कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

लाइफटाइम हिस्टोग्राम SuppNote5_Fluorescence.docx कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

जीपीसीआर में एफसीएस तकनीक जीवित कोशिकाओं के अंदर रिसेप्टर्स की गतिशीलता और बातचीत को⁴¹का आकलन करने की अनुमति देती है । FRET-FCS तकनीक का लाभ यह है कि, गतिशीलता के साथ, जीपीसीआर की संरचना गतिशीलता की जांच की जा सकती है। हालांकि, लाइव कोशिकाओं में FRET-FCS प्रदर्शन चुनौतीपूर्ण है और कोशिकाओं जो कम (या अधिकतम मध्यम) ब्याज की फ्लोरोसेंटली लेबल प्रोटीन, एक अच्छी तरह से अंशांकित सेटअप और डेटा का विश्लेषण करने के लिए एक अच्छी पाइपलाइन की अभिव्यक्ति दिखाने की आवश्यकता है । यहां, पहले नमूना तैयारी और प्रयोगात्मक प्रक्रिया में महत्वपूर्ण बिंदुओं पर जैविक, स्पेक्ट्रोस्कोपिक और तकनीकी दृष्टिकोण के विषय में चर्चा की जाती है।

महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक चरणों में पृष्ठभूमि और ऑटोफ्लोरेसेंस को कम करना (बड़े पैमाने पर साफ किए गए कवरस्लिप और फिनोल-रेड फ्री मीडिया का उपयोग करके), ट्रांसफैक्शन स्थितियों का अनुकूलन (उदाहरण के लिए, प्लाज्मिड डीएनए की मात्रा और ट्रांसफैक्शन के बाद का समय) कम अभिव्यक्ति के स्तर और कुशल लेबलिंग को प्राप्त करने के लिए शामिल है। बेशक, यह सुनिश्चित करना भी महत्वपूर्ण है कि लेबल प्रोटीन का कार्य बाधित न हो। इस प्रकार, लाइव-सेल प्रयोगों में, लेबलिंग रणनीति और लेबल स्थिति के लिए निर्णय अक्सर फ्लोरोसेंट प्रोटीन या स्नैप/क्लिप टैग के पक्ष में किया जाता है जो लचीले एन-या सी-टर्मिनस^४२,^४३से जुड़ा होता है । ऑर्गेनिक फ्लोरोफोर के साथ लेबलिंग के लिए एक प्रतिक्रियाशील साइड चेन के साथ अप्राकृतिक अमीनो एसिड डालने जैसी वैकल्पिक लेबलिंग रणनीतियां पिछले^{वर्षों}में उभर रही हैं ।

दोहरे रंग पाई-एफसीएस के लिए, जहां केवल ब्याज के दो अणुओं की बातचीत की जांच की जानी है, फ्लोरोफोरेस को स्थापित फ्लोरोसेंट प्रोटीन या स्नैप/क्लिप सब्सट्रेट्स की एक बड़ी विविधता से चुना जा सकता है । यहां, स्पेक्ट्रोस्कोपी-वार लक्ष्य एक जोड़ी का चयन करना होना चाहिए जैसे कि थोड़ा क्रॉसटॉक या प्रत्यक्ष स्वीकार्य उत्तेजन हो। इसके अतिरिक्त, चयनित फ्लोरोफोरेस फोटोस्टेबल होना चाहिए और चुने हुए प्रयोगात्मक परिस्थितियों में कम या कोई ब्लीचिंग नहीं दिखाना चाहिए। लाल स्पेक्ट्रल रेंज में फ्लोरोफोरस का चयन करने की सिफारिश की जाती है क्योंकि (1) कोशिका से ऑटोफ्लोरेसेंस पृष्ठभूमि कम हो जाती है और (2) उत्तेजन प्रकाश लंबी तरंगदैर्ध्य का होता है, इस प्रकार कम फोटोटॉक्सिक^14। फोटोब्लेचिंग को पहले तथाकथित "पावर सीरीज" आयोजित करके कम किया जा सकता है, जिसमें लेजर शक्ति को स्टेपवाइज बढ़ाया जाता है, और आणविक चमक देखी जाती है। इष्टतम उत्तेजन तीव्रता सीमा परिणामों की रैखिक सीमा⁴⁵में निहित है।

यदि दो लेबल FRET के माध्यम से प्रोटीन अनुरूप गतिशीलता पर भी रिपोर्ट करने के लिए माना जाता है तो उपलब्ध फ्लोरोफोरेस की पसंद अधिक प्रतिबंधित है । यहां, दो फ्लोरोफोरस के बीच संभावित न्यूनतम/अधिकतम दूरी का अनुमान पहले से ही लगाया जाना चाहिए, उदाहरण के लिए, उपलब्ध संरचनाओं या आणविक आकार के आधार पर, और एक फ्लोरोफोर जोड़ी जिसे उचित फॉस्टर त्रिज्या आर₀ के साथ चुना गया है, जैसे कि FRET वास्तव में²⁰हो सकता है।

यहां, eGFP और एक स्नैप टैग लेबलिंग के लिए चुना गया था, और स्नैप टैग या तो एक इंट्रासेल्युलर या एक झिल्ली अभेद्य सतह सब्सट्रेट के साथ लेबल किया गया था । स्पेक्ट्रा चित्रा 2C-Dमें दिखाए गए लोगोंकेसमान हैं । फ्लोरोफोरस का यह संयोजन रेड डिटेक्शन चैनलों में ईजीएफपी के उच्च क्रॉसटॉक और त्वरित समय खिड़की में हरे रंग की उत्तेजन द्वारा स्नैप सब्सट्रेट के प्रत्यक्ष स्वीकार्यता को दर्शाता है और परिणामस्वरूप त्वरित समय खिड़की में लाल चैनलों में एक महत्वपूर्ण "झूठी" संकेत होता है। आदर्श रूप से, दोनों मूल्य, क्रॉस टॉक और प्रत्यक्ष स्वीकार्यता, 5% 5,^6,³⁸से अधिक नहीं होना चाहिए। हालांकि, 57 Å के एक Förster त्रिज्या के साथ, यह आदर्श_{β 2}AR-IL3-eGFP-सीटी-स्नैप निर्माण में लेबल के बीच की दूरी की जांच करने के लिए अनुकूल है के रूप में quenched eGFP आजीवन (अनुपूरक नोट 5) से मूल्यांकन किया जा सकता है ।

तकनीकी रूप से, किसी भी फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रयोग के लिए, डिवाइस को अच्छी तरह से गठबंधन किया जाना चाहिए और इसमें उपयुक्त उत्तेजन स्रोत, उत्सर्जन फ़िल्टर और संवेदनशील डिटेक्टर होने चाहिए। μs टाइमस्केल पर डिटेक्टर afterpulsing से कलाकृतियों से बचने के लिए, प्रत्येक रंग के कम से कम दो डिटेक्टरों मौजूद होना चाहिए, जो पार सहसंबद्ध किया जा सकता है। आधुनिक समय सहसंबद्ध एकल फोटॉन गिनती इलेक्ट्रॉनिक्स में, एनएस समय सीमा में पता लगाने वाले कार्ड का मृत समय स्वतंत्र रूटिंग चैनलों के कारण शायद ही कोई भूमिका निभाता है, हालांकि, इसे मुलर एट अल ¹⁶ द्वारा प्रस्तावित के रूप में जांचा जा सकता है ब्याज की समय सीमा उप-μs/ns समय सीमा में निहित है । इसके अतिरिक्त, पीएस रेंज में भी अधिक समय के संकल्पों के लिए, प्रत्येक डिटेक्शन चैनल को दोगुना किया जाना चाहिए, यानी, प्रति रंग चार डिटेक्टरों का उपयोग किया जाना चाहिए, ताकि डिटेक्टरडेड टाइम्स^{2, 15,}^29,⁴⁶को भी बाईपास किया जा सके। जबकि औसत फ्लोरेसेंस जीवनकाल का अनुमान गैर-ध्रुवीकृत फ्लोरेसेंस डिटेक्शन का उपयोग करके लगाया जा सकता है, फ्लोरोफोरस के बीच दूरी (~ वितरण) के विश्लेषण के लिए उत्सर्जन को ध्रुवीकरण-निर्भर एकत्र किया जाना चाहिए। यह इस तथ्य के कारण है कि FRET में ऊर्जा हस्तांतरण की दक्षता दो फ्लोरोफोरस के अभिविन्यास पर निर्भर करती है। अधिक विस्तृत जानकारी यहां²⁰,²⁸^,⁴⁷प्राप्त की जा सकती है . अंत में, पाई प्रयोगों में, त्वरित और देरी नाड़ी के बीच की दूरी महत्वपूर्ण है और इसे इस तरह चुना जाना चाहिए कि फ्लोरोफोरस की फ्लोरोसेंस तीव्रता काफी हद तक क्षय हो गई है(चित्रा 1 बी)। एक आम नियम यह है कि दो दालों को फ्लोरेसेंस लाइफटाइम के अलावा रखा जाए, यानी 2.5 एनएस के फ्लोरेसेंस लाइफटाइम के साथ ईजीएफपी के लिए दूरी न्यूनतम 22 पर^{12.5 एनएस}होनी चाहिए।

प्रायोगिक प्रक्रिया के लिए सभी विचारों को विस्तृत करने के बाद, डेटा और उसके विश्लेषण पर अधिक विस्तार से चर्चा की जाती है । जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग में उल्लेख किया गया है, सेटअप के संरेखण की दैनिक जांच की जानी चाहिए, जिसमें अंशांकन मापों का विश्लेषण शामिल है। चित्रा 2A-C में दिखाया गया डेटा, उदाहरण के लिए, 8-40 माइक्रोन रेंज में एक अतिरिक्त छूट घटक दिखाता है। हरे अंशांकन फ्लोरोफोर की विशिष्ट ट्रिपल पलक 2-10 माइक्रोस रेंज^{13 , 15}^,⁴⁸में होने के लिए जाना^जाताहै। डीएनए नमूने(चित्रा 3C)के सभी घटता में आवश्यक धीमी गति से छूट घटक, वास्तविक ट्रिपल निमिष के लिए बहुत धीमा, फ्लोरोफोरेस³⁹के साथ डीएनए की बातचीत से स्टेम हो सकता है। हालांकि, सीसीएफ_पाईमें इस घटक की उम्मीद नहीं की जाएगी, और सबसे अधिक संभावना अवशिष्ट क्रॉसटॉक से उपजी है। इस प्रकार, दिन के संरेखण की गुणवत्ता का न्याय करने के लिए सेल प्रयोगों पर आगे बढ़ने से पहले सीधे अंशांकन नमूनों का विश्लेषण करना अत्यधिक उचित है।

कॉन्फोकल ओवरलैप वॉल्यूम के उचित अंशांकन के लिए हरे और लाल लेबल के 100% सह-प्रसार के साथ एक नमूना की आवश्यकता होती है। यहां फ्लोरोसेंटी लेबल डबल फंसे डीएनए का इस्तेमाल किया जाता है । दोनों डीएनए किस्में एक दूसरे से आवश्यक दूरी पर वांछित फ्लोरोफोरस के अनुरूप किया जा सकता है । डिजाइन की गई किस्में उच्च उपज के साथ एनील्ड की जा सकती हैं। हालांकि, अच्छी प्रयोगशाला अभ्यास एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा डीएनए किस्में की अखंडता और लेबलिंग डिग्री की जांच करने और अवशोषण स्पेक्ट्रम को मापने की सलाह देता है। इसके अलावा, डबल-फंसे असेंबली की उपज की जांच की जानी चाहिए क्योंकि यह अंशांकन माप गंभीर रूप से इस धारणा पर निर्भर करता है कि लाल लेबल के साथ हरे रंग का 100% सह-प्रसार है। यदि धारणा मान्य नहीं है, तो सुधार कारकों को^16,²²लागू करना पड़ सकता है। चित्रा 2 और चित्रा 3में दिखाए गए अंशांकन मापों में, हरे और लाल चैनल में क्रमशः 1.4 एमएल और 1.9 एमएल की पहचान की मात्रा प्राप्त की गई थी। यह आकार अंतर लगभग विवर्तन-सीमित एक्सिटेशन वॉल्यूम(अनुपूरक नोट 2)के साथ एक सेटअप के लिए अपेक्षित है। इस शर्त के तहत, उत्तेजन तरंगदैर्ध्य के साथ उत्तेजन मात्रा तराजू का आकार। इसके बदले में चित्र 3बीमें देखे गए विभिन्न सहसंबंध आयामों के बारे में बताया गया है । व्युत्पन्न सुधार कारक आर_जीआर = 0.56 और आर आर_आरजी = 0.72 सही इस आकार विसंगति और संभावित गैर सही दो उत्तेजन मात्रा^3,⁴के ओवरलैप के लिए सही है।

चित्रा 4, चित्रा 5, चित्रा 6,और चित्रा 7 एक पाई-एफ (सी) सीएस आधारित अध्ययन के कार्यप्रवाह का प्रदर्शन अनुरूप प्रोटीन गतिशीलता को समझने की दिशा में उद्देश्य । सबसे पहले, दो एकल लेबल निर्माण β₂एआर-IL3-eGFP और एनटी-स्नैप-β₂एआर संबंधित अन्य फ्लोरोफोर(चित्रा 4)की अनुपस्थिति में कोशिकाओं में फ्लोरोफोर गुणों की विशेषता के लिए नियंत्रण के रूप में काम करते हैं। इसके बाद, डबल-लेबल निर्माण एनटी-स्नैप-β₂एआर-आईएल3-ईजीएफपी एक स्नैप-टैग को ले जा रहा है जो सेल बाहरी और साइटोप्लाज्मिक पक्ष पर एक eGFP का सामना कर रहा है जो "100% सह-प्रसार" नियंत्रण(चित्रा 5)के रूप में कार्य करता है। पिछले निर्माण,_{β 2}एआर-IL3-eGFP-सीटी-स्नैप, साइटोप्लाज्मिक पक्ष पर दोनों फ्लोरोफोरस किया जाता है और काफी करीब एक साथ FRET से गुजरना । यहां, फिर से एक 100% सह-प्रसार की उम्मीद की जाएगी, जो त्वरित समय खिड़की में हरे और लाल चैनलों के संकेत में विरोधी सह-सहसंबद्ध तीव्रता के उतार-चढ़ाव के साथ मिलकर, यानी दाता उत्तेजना के बाद, FRET दक्षता^31,^{32, 33}को प्रभावित करने वाली प्रोटीन गतिशीलता के कारण। यह गतिशीलता सीसीएफ_{एफईआरटी} (चित्रा 6-7)में विरोधी सहसंबंध के रूप में दिखाई दे सकती है।

सभी जीपीसीआर β₂एआर स्ट्रक्स्ट्रेशन सेल झिल्ली(चित्रा 4A)पर बिमोडल प्रसार दिखाते हैं। जबकि β₂एआर-IL3-eGFP केवल अपेक्षित ट्रिपल निमिष(चित्रा 5B)^13,^15,एनटी-स्नैप-β₂एआर एक अतिरिक्त धीमी छूट समय(चित्रा 5C-D)दिखाता है । यह संभावना है कि टी_R2 अनबाउंड स्नैप सब्सट्रेट से स्टेम हो सकता है । यह आगे के प्रयोगों द्वारा स्पष्ट किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, एक जलीय समाधान में उपयोग किए गए स्नैप सब्सट्रेट के प्रसार और फोटोफिजिकल गुणों को भी मापकर। ध्यान दें, प्रसार और विश्राम के समय के बीच अंतर करने के लिए एक सीधा प्रयोग कॉन्फोकल सेटअप के पिनहोल को बदलना है, यानी, प्रभावी मात्रा में वृद्धि: जबकि प्रसार के समय में प्रभावी मात्रा में वृद्धि होती है, विश्राम की शर्तें अनछुए¹³हैं। फिट परिणामों के आधार पर फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपी) की एकाग्रता का निर्धारण करते समय, ध्यान रखें कि सामान्य रूप से एफपीएस एक परिपक्वता प्रक्रिया से गुजरता है, जिसमें अंत में क्रोमोफोर¹²का गठन होता है। यह परिपक्वता का समय एफपी से एफपी तक हो सकता है और इसके अलावा फोटोफिजिक्स भी हो सकते हैं जो स्थानीय रासायनिक वातावरण पर निर्भर करता है¹³^,¹⁵. इस प्रकार, एफसीएस द्वारा सूचित नमूने में मौजूद वास्तविक प्रोटीन एकाग्रता को आमतौर पर कम करके आंका जाता है, जिसे सही किया जा सकता है यदि प्रयोग में गैर-फ्लोरोसेंट एफपीएस का अंश निर्धारित किया जा सकता है। अंत में, यदि आवश्यक हो तो α और δ के लिए मूल्यों को सही करने के लिए जीवित कोशिकाओं में फ्लोरोफोर स्पेक्ट्रा की जांच करने की सलाह दी जाती है, क्योंकि अधिकांश फ्लोरोफोरस अपने पर्यावरण^13,^15,⁴⁸के प्रति संवेदनशील प्रतिक्रिया करते हैं। घटाना करने के लिए पृष्ठभूमि गैर संक्रमित कोशिकाओं में एकत्र संकेत द्वारा निर्धारित किया जाता है। इसके अतिरिक्त, संबंधित अन्य रंग चैनल और सीसीएफ_पाई के ऑटोकोरिएलेशन की जांच की जानी चाहिए ताकि झूठे संकेतों(अनुपूरक नोट 4 - चित्रा 30)की पहचान कर सके।

एनटी-स्नैप-β₂एआर-आईएल3-ईजीएफपी(चित्रा 5डी)से दो माप, जहां फ्लोरोफोरस झिल्ली के विभिन्न किनारों पर स्थित हैं, विभिन्न दिनों पर अधिग्रहीत किए गए थे और समय-हल एकल अणु फ्लोरेसेंस में आंकड़ों के महत्व को दर्शाते हैं । यहां, विभिन्न परिणाम लेबलिंग की विभिन्न डिग्री के कारण हो सकते हैं: एक सेल में लेबलिंग की उच्च डिग्री और माप के औसत के परिणामस्वरूप अपेक्षाकृत कम शोर(चित्रा 5B)हुआ, जबकि अन्य सेल से, केवल दो माप(चित्रा 5A)एकत्र किए जा सकते हैं। पर्याप्त मात्रा में डेटा एकत्र करने के अलावा, परिणामों का समय पर मूल्यांकन करना महत्वपूर्ण है, और शायद लेबलिंग रणनीति को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है। प्रयोगों को डिजाइन करते समय, यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि FRET संवेदनशील है, लेकिन 10 एनएम तक की दूरी तक सीमित है और अन्यथा "अंधा" है। हमारे मामले में, यह "अंधापन" अनछुए eGFP फ्लोरेसेंस लाइफटाइम (अनुपूरक नोट 5) द्वारा इंगित किया गया है। β₂AR-IL3-eGFP-सीटी-स्नैप निर्माण(चित्रा 6A),FRET शमन eGFP आजीवन (अनुपूरक नोट 5) से इंगित किया जा सकता है । हालांकि, कोई एंटीकोरिएलेशन शब्द(चित्रा 6 बी)नहीं देखा जाता है, जिसका अर्थ है कि FRET या तो उतार-चढ़ाव नहीं है या प्रसार समय की तुलना में धीमी गति से समय पैमाने पर है। एसीएफ_{जीपी,} एसीएफ_{आरपी,}एसीएफ _आरडी और _{सीसीएफ एफईआरटी} (चित्रा 6 सी)में तीन अतिरिक्त छूट शर्तों की आवश्यकता होती है । एसीएफ_{आरपी,} एसीएफ_आरडी और सीसीएफ_{एफईआरटी} में धीमा घटक स्वीकार्य ब्लीचिंग के कारण हो सकता है और निश्चित रूप से, इन घटता में पाए जाने वाले धीमे प्रसार के प्राप्त मूल्य को प्रभावित करता है (एसीएफ_जीपीमें 117 एमएस की तुलना में ~ 350 एमएस)। लाल चैनल में टी_डी को अलग आकार के कॉन्फोकल वॉल्यूम(चित्रा 2)के कारण हरे चैनल की तुलना में थोड़ा बड़ा माना जाता है - लेकिन केवल आकार के अंतर के बराबर कारक से। 3 माइक्रोस का बहुत तेज़ छूट का समयफ्लोरोफोरस^{13, 15,}⁴⁸के ट्रिपल निमिष को दर्शाता है, जबकि 37 माइक्रोन की धीमी छूट का समय एफईआरटी के कारण हो सकता है: इसी तरह, जैसा कि एफईआरटी सीसीएफ_{एफईआरटी}में एक एंटीकॉरिएलेशन लाती है,^31,^32,³³के स्वत: संबंधों में सकारात्मक सहसंबंधों की उम्मीद है। सीसीएफ_{एफआरटी} में "सकारात्मक" के रूप में इस शब्द की उपस्थिति और एसीएफ_आरडी में इसकी उपस्थिति को उच्च क्रॉसटॉक के साथ समझाया जा सकता है और इसे और स्पष्ट किया जाना चाहिए। ध्यान दें कि सीसीएफ_पाई अपेक्षा के अनुसार कम सहसंबंध समय पर सपाट है।

दूसरी ओर, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ब्याज की प्रणाली में FRET की घटना सहसंबंध घटता 6 पर गैर-रैखिक प्रभाव की ओर^जाताहै। आणविक चमक जैसे, एक अणु तराजू के सहसंबंध आयाम चुकता और प्रत्येक FRET राज्य (और हमेशा एक सक्रिय रिसेप्टर के बिना वर्तमान अणुओं) में अलग आणविक चमक से पता चलता है । दरअसल, FRET हरे अणुओं का पता लगाया की स्पष्ट एकाग्रता कम हो जाती है (यानी, एसीएफ_जीपी आयाम बढ़ जाती है) और लाल अणुओं की संख्या (लाल-प्रॉम्प्ट से निर्धारित)⁵अधिक अनुमानित है। दोनों प्रभाव सीसीएफ_{एफईआरटी} और सीसीएफ पाई दोनों से प्राप्त बातचीत की मात्रा को प्रभावित _{करते हैं}। हालांकि, वैश्विक विश्लेषण जैसा कि दिखाया गया है जैसे कि कैल्मोडुलिन ^{31, 32}या सिंटैक्सिन³³ की इंट्रामोॉलिकुलर गतिशीलता के लिए प्रोटीन गतिशीलता प्रकट कर सकता है। जब सावधानीपूर्वक कैलिब्रेट किया जाता है, तो सापेक्ष सीसीएफ_पाई और एसीएफ आयाम²²से औसत एफआरटी दक्षता निकाली जा सकती है, जबकि सीमित राज्यों का निर्धारण दाता फ्लोरेसेंस लाइफटाइम डिस्ट्रीब्यूशन³³के विश्लेषण से किया जा सकता है।

इस तथ्य को ध्यान में रखते हुए कि ईजीएफपी जैसे बड़े फ्लोरोफोरस के साथ लाइव सेल प्रयोगों में FRET कंट्रास्ट चित्र 6 में दिखाए गए सिमुलेशन के लिए ग्रहण की तुलना में भी कम होने की संभावना है और यह कि स्वीकारकर्ता की सीधी उत्तेजन सिमुलेशन में नहीं जोड़ी गई थी, यह समझा सकता है कि लाइव सेल प्रयोगों में एंटीकोरेशन की पहचान बहुत चुनौतीपूर्ण क्यों है। एक आशाजनक विश्लेषण विकल्प फोटॉन आगमन समय हिस्टोग्राम(चित्रा 1B)में एन्कोडेड जानकारी को संचयन करने पर निर्भर करता है, जो समय-सहसंबद्ध एकल फोटॉन गिनती डेटा संग्रह^29,³⁰के कारण सुलभ है। यदि नमूने के अंदर दो (या अधिक) (FRET) प्रजातियों के फ्लोरेसेंस लाइफटाइम (~ पैटर्न) को जाना जाता है(चित्रा 7 ए),"फ़िल्टर" या वजन चुना जा सकता है जो सहसंबंधप्रक्रिया(चित्रा 7B)^17,^{18, 19}के दौरान लागू होते हैं। इस प्रकार सहसंबंध घटता प्राप्त होता है, अब पता लगाने वाले चैनलों के सहसंबंध का प्रतिनिधित्व नहीं करता बल्कि दो अलग-अलग (FRET) प्रजातियों के बीच ऑटो-या क्रॉस-सहसंबंध, इस प्रकार प्रजातियों-एसीएफ (एसएसीएफ) या प्रजातियों-सीसीएफ (एससीसीएफ) में बदल दिया गया है। मॉडरेट FRET कंट्रास्ट, हाई क्रॉसटॉक और ट्रिपल निमिष के साथ नकली डेटा के लिए इस दृष्टिकोण को लागू करने से एंटीकोरेलेशन शब्द(चित्रा 7C-D)ठीक हो जाता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि विश्राम समय प्राप्त किया जा सकता है लेकिन आयाम के लिए संबंध¹⁸खो दिया है । यह दृष्टिकोण पहले लाइव सेल प्रयोगों में लागू किया गया है जैसे ईजीएफआर की बातचीत का अध्ययन करने के लिए इसके विरोधी⁴⁹ के साथ या असाधारण रूप से छोटे और लंबे फ्लोरेसेंस लाइफटाइम⁵⁰के साथ ईजीएफपी वेरिएंट से जुड़े प्रोटीन से फ्लोरेसेंस को अलग करने के लिए।

जबकि शुद्ध प्रोटीन में पाई आधारित FRET माप काफी हद तक प्रोटीन गतिशीलता^३६^२२का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है, जीवित कोशिकाओं में यह प्रोटीन प्रोटीन बातचीत को समझने पर केंद्रित है । यह दृष्टिकोण खमीर⁵¹ में एमएपी किनेज़ गतिविधि के विनियमन का अध्ययन करने या झिल्ली प्रोटीन की बातचीत को उनके साइटोसोलिक बाध्यकारी साथी के साथ हल करने के लिए लागू किया गया है जैसा कि इस हालिया अनुच्छेद⁵²में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। यहां, जटिलताएं तब उत्पन्न हो सकती हैं जब ग्रीन फ्लोरोफोरस का महत्वपूर्ण क्रॉसटॉक अभी भी लाल चैनलों की देरी समय खिड़की या त्वरित समय खिड़की में हरे चैनलों में लाल संकेत में मौजूद है। पूर्व हरी नाड़ी के संबंध में लाल नाड़ी की अपर्याप्त देरी के कारण हो सकता है, जबकि दोनों प्रभाव भी दृढ़ता से अतिव्यापी उत्तेजन और चुने हुए फ्लोरोफोरस के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा से स्टेम होते हैं । झूठे-सकारात्मक सीसीएफ_पाई आयामों के लिए संबंधित एकल लेबल वाले निर्माणों को ध्यान से और सही करने की सिफारिश की जाती है, विशेष रूप से कोशिकाओं में जहां बहुत कम फ्लोरेसेंस लाइफटाइम के साथ ऑटोफ्लोरेसेंस एक और जटिल कारक हो सकता है^22।

समाप्त करने के लिए, यहां वर्णित FRET-FCS दृष्टिकोण में निकट शारीरिक सांद्रता पर जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन और प्रोटीन गतिशीलता को समझने की अपार क्षमता है। इस प्रोटोकॉल में, लाइव सेल माप के दौरान आवश्यक अंशांकन माप और आवश्यक मात्रात्मक विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित किया गया था। इस उद्देश्य के लिए, सिमुलेशन के साथ विभिन्न लाइव सेल माप दिखाए गए थे। सिमुलेशन यहां सामान्य समझ प्रदान करते हैं क्योंकि पैरामीटर को अनुरूप फिट मॉडल के साथ व्यवस्थित रूप से भिन्न किया जा सकता है जो संबंधित डेटा के विशिष्ट गतिशीलता और फोटोफिजिकल गुणों का वर्णन करते हैं। विश्लेषण एक व्यापक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल और आसान-से-अनुकूलन टेम्पलेट्स के साथ ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर टूल के साथ किया गया था। अंत में, तकनीकी प्रगति, और इस प्रकार डेटा विश्लेषण के लिए ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर के प्रसार के साथ-साथ तैयार-टू-बाय स्थिर पाई-एफसीएस सिस्टम की उपलब्धता इस तकनीक को एक बड़े अनुसंधान समुदाय के लिए अधिक से अधिक सुलभ बना देगी ताकि अंततः उच्चतम संवेदनशीलता के साथ जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन इंटरैक्शन और गतिशीलता को सुलझाया जा सके।

Disclosures

लेखकों को घोषित करने के लिए कोई संघर्ष नहीं है ।

Acknowledgments

इस परियोजना को ड्यूश फोर्स्चुंग्सजेमीसचैफ्ट (एसएफबी/टीआर २४०, परियोजना संख्या 374031971, परियोजना आईएनएफ) द्वारा जे.B और केजीएच को समर्थन दिया गया था ।

हम तकनीकी सहायता के लिए वित्तीय सहायता और कोर यूनिट फ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए रुडोल्फ विर्को सेंटर का शुक्रिया अदा करते हैं। इसके अतिरिक्त, हम अश्विन बालाकृष्णन को पूरी तरह से सबूत पढ़ने के लिए धन्यवाद देते हैं ।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Telescope in 4f configuration with five lenses	Qioptiq, Rhyl, UK	G063126000	Optics
2x Band pass filters Brightline	AHF, Tübingen, Germany	HC 525/50 and HC 600/52	Filter
2x Dichroic beam splitter	AHF, Tübingen, Germany	HC BS F38-573	Filter
6-well culture plate Nunc	Thermo Scientific (Waltham, USA)	140675	Reagent
Alexa Fluor 488 NHS Ester (green calibration standard)	Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)	A20000	Reagent
Alexa Fluor 568 NHS Eater (red calibration standard)	Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)	A20003	Reagent
ASI stage PZ-2000 XYZ	Visitron Systems GmbH, Puchheim, Germany	WK-XYB-PZ-IX71	Microscope Parts
Attofluor Cell Chamber, 35 mm diameter for 25 mm round coverslips	Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)	A7816	Glass coverslip holder
Avalanche photodiode Perkin Elmer (SPCM-AQR-14)	Laser Components GmbH, Olching, Germany	SPCM-AQR-14	Single photon counting detector
Beamsplitter	Newport, Darmstadt, Germany	10FC16PB.3	Filter
Biorender (Software)	Science Suite Inc - o/a BioRender (Toronto, Canada)	---	Software used to create GPCR sketch, https://app.biorender.com/
Chinese hamster ovary (CHO) cell line	ATCC	CCL-61	Cell lines
ChiSurf (Data analysis Software)	Thomas-Otavio Peulen, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, USA	---	tttrlib-based software to analyze fluorescence correlation data and fluorescence decay histograms, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf Tutorial: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&t=2s Ref: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017)
Chloroform	Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)	472476-2.5L	Reagent
DMSO	AppliChem GmbH (Darmstadt, Germany)	A3672,0250	Reagent
DNA strand (40 bp fluorophore distance)	IBA Lifesciences GmbH (Göttingen, Germany)	---	Reagent, 5’ CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3’, 3’ GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5’
Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (with and without phenol red)	GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)	P04-41250, P04-41650	Reagent
Ethanol (absolute)	Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)	34852-1L-M	Reagent
Erythrosin B,Dye content >=95 %	Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)	200964-5G	Reagent, Instrument Response function, solve in EtOH to 10 mg/mL
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biochrom (Berlin, Germany)	S 0615	Reagent
Fluorescence Light Source X-Cite 120 Q	Excelitas Technologies, Ontario, Canada	XI120-Q-5060	Microscope Parts
Fluorescent SNAP-substrate cell : SNAP Cell TMR- STAR	New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany)	S9105S	Reagent
Fluorescent SNAP-substrate surface : DY-549	New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany)	S9112S	Reagent
Glass coverslips (Dimensions: diameter 24 mm, thickness 0.13 - 0.16 mm)	Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany)	111640	Reagent
Laser Controller	Picoquant, Berlin, Germany	910020 (PDL 828-S "SEPIA II")	Optics
Laser lines (480 nm and 560 nm)	Picoquant, Berlin, Germany	912485 (LDH-D-C-485), 912561 (LDH-D-TA-560)	Optics
Lipofectamine 2000	Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)	11668-019	Reagent
MFD suite (Software)	AG Seidel, Heinrich-Heine-University Duesseldorf, Germany	---	Software package for analysis of single-molecule fluorescence experiments including e.g. Kristine (correlation of tttr data), Burbulator (simulation of single-molecule experiment), https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis
Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25.4 mm	Thorlabs, Bergkirchen, Germany	AC254-150-A-ML	Second part of Beam expander
Neubauer Chamber (deepness 0.1 mm)	Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany)	640110	Reagent
Olympus IX 71 stand	Olympus, Hamburg, Germany	IX2-ILL100	Microscope Parts
Opti-MEM (Reduced-Serum Medium)	GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)	31985-047	Reagent
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)	049M4857V	Reagent
Phosphate-buffered Saline (PBS)	GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)	14190144	Reagent
Pinhole (50 µM)	Newport, Darmstadt, Germany	PNH-50	Pinhole
PMT Hybrid-40	Picoquant, Berlin, Germany	932200 (PMA Hybrid 40)	Single photon counting detector
Python scripts (Software)	Katherina Hemmen, Rudolf-Virchow Center for Integrative and Translational Imaging, University Wuerzburg, Germany	---	Collection of self-written Python scripts based on tttrlib (https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib) used to (1) determine the average count rates, (2) correlate the data and (3) build fluorescence decay histograms, https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS
Quad band beamsplitter (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1)	AHF, Tübingen, Germany	F73-421PH	Filter
Single mode fiber polarization keeping, NA = 0.08 with collimator	Picoquant, Berlin, Germany	02126	Optics
Sodium Hydroxide (NaOH)	Carl Roth (Karlsruhe, Germany)	6771.1	Reagent
SymPhotime x64 Software (Data collection and data export software)	Picoquant, Berlin, Germany	931073 (SPT64-1+2 single user )	Time-tag time-resolved (tttr) data collection at the self-built FCCS setup, data export
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system Hydraharp 400	Picoquant, Berlin, Germany	930010 (Hydraharp 400)	Optics
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)	T4299-100ml	Reagent
Unmounted Achromatic Doublets, ARC: 400 - 700 nm, D=12.7 mm, F=-20 mm	Thorlabs, Bergkirchen, Germany	ACN127-020-A	First part of Beam expander
Water immersion objective (UPlanSApo 60x/1.20 W)	Olympus, Hamburg, Germany	UPLSAPO60XW	Objective

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References

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Biochemistry

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Protocol

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