Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

살아있는 세포에서 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 역학을 연구하기 위한 이중 색 형광 교차 상관 분광법

Published: December 11, 2021 doi: 10.3791/62954
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 2, 1
1Rudolf Virchow Center for Integrative and Translation Bioimaging, Julius-Maximilian University Wuerzburg, 2Max Delbrück Center for Molecular Medicine, Berlin
* These authors contributed equally

Summary

우리는 현대 형광 라벨링 기술을 사용하여 살아있는 세포에서 멤브레인 수용체 역학을 연구하기 위해 Förster 공명 에너지 전송 (FRET)과 결합 된 라이브 셀 이중 색 형광 교차 상관 분광법 (FCCS)을 수행하기 위해 실험 프로토콜 및 데이터 분석 워크플로우를 제시합니다.

Abstract

우리는 현대 형광 라벨링 기술을 사용하여 살아있는 세포에서 막 수용체 역학을 연구하기 위해 Förster 공명 에너지 전송 (FRET)과 결합된 살아있는 세포 이중 색 형광 교차 상관 분광법 (FCCS)을 수행하는 프로토콜 및 워크플로우를 제시합니다. 형광 강도의 변동이 각각의 형광 생체 분자의 동적 "지문"을 나타내는 이중 색 FCCS에서, 우리는 수용체의 공동 확산 또는 결합을 조사 할 수 있습니다. FRET는 분자 거리에 대한 높은 민감도를 가지고 있으며 분자 내 변화를 모니터링하는 잘 알려진 "나노 통치자"역할을합니다. 종합하면, 세포 설정에서 현지 수용체 농도 및 이동성 상수와 같은 형성적 변화와 주요 매개 변수가 접근할 수 있게 됩니다.

정량형 형광 접근법은 높은 소음 수준과 샘플의 취약성으로 인해 세포에서 도전적입니다. 여기서 는 eGFP 및 SNAP 태그-TAMRA로 표지된 2-adrenergic 수용체(β2AR)β 이중 색 라벨을 사용한 교정 단계를 포함하여 이 실험을 수행하는 방법을 보여줍니다. 사용자 지정이 용이한 오픈 소스 소프트웨어 및 템플릿을 사용하여 단계별 데이터 분석 절차가 제공됩니다.

우리의 지침은 살아있는 세포 실험에 있는 제한된 신호-잡음 수준에도 불구하고 높은 신뢰성으로 그(것)에 있는 살아있는 세포에 있는 생체 분자의 분자 상호 작용을 해명하는 가능하게 합니다. FRET의 운영 창과 특히 낮은 농도의 FCCS는 거의 생리학적 조건에서 정량적 분석을 허용합니다.

Introduction

형광 분광법은 세포 맥락에서 최소한의 교란으로 단백질 역학 및 단백질 단백질 상호 작용을 정량화하는 주요 방법 중 하나입니다. 공초점 형광 상관 분광법 (FCS)은 단일 분자 민감성, 고도로 선택적 및 라이브 셀 호환1이기때문에 분자 역학을 분석하는 강력한 방법 중 하나입니다. 다른 역학 지향 접근법과 비교하여 FCS는 ~ ns에서 ~ s에 이르는 광범위한 측정 가능한 시간 범위를 가지며, 가장 중요한 것은 이미징 기반 방법으로 는 종종 접근할 수 없는 빠른 시간 척도를 포괄합니다. 더욱이, 또한 막, 세포질 및 핵 분자 역학이 쉽게 구별될 수 있도록 공간 선택성을 제공한다 2. 따라서, 분자 깜박임, 평균 국부 농도 및 확산 계수는 FCS로 정량적으로 분석될 수 있다. 결합과 같은 분자 역학은 이중 색 접근법에서 형광 간 상관 분광법(FCCS) 분석3,4,5에서 두 분자 종의 공동 확산을 프로빙할 때 쉽게 접근할 수 있게 된다.

상관 분광법의 주요 기본 원리는 레이저 초점 안팎에서 확산되는 형광표시 생체 분자에 의해 방출되는 강도 변동의 통계적 분석이다(도1A). 결과 자동 또는 상호 상관 함수는 곡선 피팅에 의해 더 분석하여 결국 이자율 상수를 도출할 수 있습니다. 즉, 통계적 방법 FCS 및 FCCS는 단일 입자 추적과 같은 단일 분자 추적을 제공하지 않지만, 높은 시간적 분해능을 가진 프로브 표본의 동적 패턴 또는 "지문"을 제공한다. Förster 공명 에너지 전달(FRET)과 결합될 때, 형태 변화와 같은 분자 내 역학은 공통의 공초점 설정5,6에서동시에 모니터링될 수 있다. FRET는 두 개의 형광의 거리를 탐사하고 종종 분자 "나노 통치자"라고합니다. 에너지 전달은 분자가 가까운 부근(< 10nm)에 있을 때만 이루어지며, 기증자의 방출 스펙트럼은 수용체 분자의 흡수 스펙트럼과 현저히 겹치며, 기증자 및 수용자의 편골 방향은 (충분히) 평행하다. 따라서 FRET와 FCCS의 조합은 매우 높은 스파티오-측두성 해상도를 가진 기술을 제공합니다. 공간 선택성, 감도 및 라이브 셀 호환성이 필요한 경우 FRET-FCCS는 이소레말 적정 열량량법(ITC)7,표면 플라스몬 공명(SPR)8,또는 단백질 역학 및 상호 작용을 측정하기 위한 핵 자기 공명(NMR)9,10과 같은 다른 방법에 비해 명백히 유리하다.

이중색 형광 교차 상관 분광법(dc-FCCS)의 기능과 약속에도 불구하고, 라이브 셀에서 DC-FCCS를 수행하는 것은 채널3,4 사이의 스펙트럼 출혈 또는 크로스토크로 인해 기술적으로 도전적이며, 관상구별 레이저 라인3,4,11,배경 신호 및 노이즈 또는 제한된 사진 시료의 반사적 변화 또는 노면 또는12의제한된 광시로 인한 공초점 볼륨의 차이 13,14,15. FCCS에 펄스 인터리브 된 여기 (PIE)의 도입은채널(16)사이의 스펙트럼 크로스토크를 줄이기위한 다른 레이저 여기를 일시적으로 분리하는 중요한 조정이었다. 스펙트럼 출혈을 통해17,18,19 및 배경 보정에 대응하는 다른 보정 방법도 잘 받아 들여왔다17,18,19. FCS, PIE 또는 FRET에 대한 세부 사항 및 기본사항에 대해 독자는 다음 참조2,4,6,16,20, 21,22,23,24를참조한다.

여기서, 모든 필요한 교정 실험 및 분석은 프로토타입 G 단백질 결합 수용체의 실험 결과와 함께, β 2-아드레너기수용체(β2AR)를 제시한다: (1) 단일 표지 분자는 "녹색"(eGFP) 또는 "빨강"(SNAP 태그 기반 라벨링)25 플루오포를 운반한다. (2) N 단말 SNAP 태그및 세포 내 eGFP(NT-SNAP)를 운반하는 이중 표지 된 구조 (이 경우, 두 라벨모두 동일한 단백질에 있습니다. 따라서 100% 공동 확산이 예상됩니다]; (3) 두 형광이 세포막의 동일한 측면에 있는 이중 표지된 샘플(CT-SNAP). C 단말 SNAP 태그와 세포 내 eGFP를 전달합니다. 여기서, 다시 두 라벨은 다시 100% 공동 확산이 예상되는 동일한 단백질에 있습니다. 두 라벨모두 세포막의 같은 면에서 서로 매우 가깝기 때문에 FRET 및 항상관 적 행동을 관찰 할 수있는 잠재력을 보여줍니다. 모든 구조물은 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 전염되었고, 나중에 CT-SNAP 구조에 대한 NT-SNAP 구조 및 멤브레인 투과성막에 대해 막을 침투할 수 없는 적색 형광기판으로 표지되었다. 마지막으로, 시뮬레이션된 데이터는 FRET 유도 된 항상관에 대한 실험 파라미터의 영향과 단백질 단백질 상호 작용이 공동 확산 진폭에 미치는 영향을 예시합니다.

따라서, 이 프로토콜은 기술/물리적 유물, 도전 및 가능한 해결책을 인식하면서 단백질 역학 및 단백질 단백질 상호 작용을 이해하기 위하여 살아있는 세포에 결합된 FRET-FCCS를 능력을 발휘하는 완전한 가이드를 제공합니다.

Protocol

1. 실험 프로토콜

  1. 샘플 준비
    참고: 멸균 조건하에서 세포 종착 및 트랜스페션을 수행합니다.
    1. 6웰 배양판에 잘 조리된 커버슬립을 넣고 멸균 인산염 완충식식염(PBS)으로 세 번 세척합니다.
      참고: 커버슬립 클리닝 프로토콜은 보충 참고 1에자세히 설명되어 있습니다.
    2. 각 우물에 페놀 레드(10% 태아소 혈청),100 μg/mL 페니실린 및 100 μg/mL 연쇄절제술을 함유한 완전한 세포 배양 배지의 2mL를 추가하고 플레이트를 제쳐두십시오.
    3. 37°C 및 5% CO 2에서 페놀 레드를 함유하는 동일한 배지에서 CHO 세포를배양한다. 죽은 세포를 제거하기 위해 PBS의 5 mL로 세포를 씻어.
    4. 트립신 2mL을 추가하고 실온 (RT)에서 2 분 동안 배양하십시오.
    5. 페놀 레드를 함유한 8mL의 배지로 분리된 세포를 희석시키고 파이펫팅으로 조심스럽게 섞는다.
    6. 노이바우어 챔버에서 세포를 카운트하고 커버립을 포함하는 6웰 세포 배양판에서1.5 x 10 5 세포의 밀도/잘 종자(1.1.1-1.1.2 단계에서 준비).
    7. 세포가 약 80%의 인플루언서(37°C, 5%CO2)에서24시간 동안 성장하게 한다.
    8. 원하는 벡터 DNA(예를 들어, CT-SNAP 또는 NT-SNAP)의 2 μg를 희석시키고 2개의 개별 튜브에서 형질 검사 시약의 6 μL을 희석하고, 각각 각 우물에 대해 500 μL의 감소된 혈청 배지를 포함하고 RT에서 5분 동안 배양한다.
    9. 두 솔루션을 함께 섞어 트랜스펙트 혼합물을 얻고 RT에서 20분 동안 배양합니다.
    10. 그 동안, 멸균 PBS로 한 번 시드 CHO 세포를 세척.
    11. PBS를 항생제 없이 10% FBS로 보충한 페놀 무자유 배지의 1mL/웰로 교체하십시오.
    12. 전체 1mL의 형질 혼합물을 각 우물에 드롭와이즈로 추가하고 세포를 37°C에서 하룻밤 동안 배양하여 5% CO2로한다.
    13. SNAP 시공물의 라벨링에 대해, 1μM의 최종 농도를 얻기 위해 10% FBS로 보충된 매체의 1mL에 적절한 SNAP 기판 스톡 솔루션을 희석한다.
    14. PBS로 감염된 세포를 한 번 세척하고 1 μM SNAP 기판 용액의 웰 당 1 mL을 추가합니다. 5% CO2에서37°C에서 20분 동안 세포를 배양한다.
    15. 페놀 무적 배지로 세 번 씻어 내고 페놀 무첨가 배지당 2mL를 추가합니다. 5% CO2에서37°C에서 30분 동안 세포를 배양한다.
    16. 이후 모든 샘플의 커버립을 이미징 챔버로 옮기고 500 μL 이미징 버퍼로 세척합니다. FRET-FCS 설정으로 이동하기 전에 500 μL 이미징 버퍼를 추가합니다.
  2. 교정 측정
    참고: FRET-FCS 설정에는 공초점 현미경 수문 목표, 두 개의 레이저 라인, 시간 상관 단일 광자 카운팅(TCSPC) 시스템, 2개의 하이브리드 광증 튜브(PMT) 및 광자 수집 및 데이터 수집 소프트웨어를 위한 2개의 눈사태 포토다이오드(APD)가 장착되어 있습니다. 라이브 셀 측정 전에 매번 설정을 정렬하는 것이 매우 중요합니다. 자세한 설정 설명은 보충 참고 2에서찾을 수 있습니다. 모든 측정은 동일한 조건에서 수행해야 하므로 레이저와 모든 검출기(PMT 2개와 APD 2개)는 항상 ON입니다. 교정 측정의 경우, 셀이 시드된 것과 동일한 로트에서 커버슬립을 사용하면 칼라 링 보정의 변동이 감소합니다.
    1. 초점, 핀홀 및 칼라 링 위치를 조정하기 위해 유리 커버슬립에 2nM 그린 교정 솔루션을 배치하고 485 nm 및 560 nm 레이저를 켭니다. 펄스 인터리브 엑시션(PIE)모드(16)에서레이저를 작동시한다.
    2. 최대의 분자 밝기를 얻기 위해 가장 높은 카운트 속도와 가장 작은 공초점 볼륨을 얻을 수 있도록 용액에 초점을 맞추고 핀홀과 칼라 링 위치를 조정합니다.
    3. 10nM 적색 보정 솔루션과 녹색 및 빨간색 교정 솔루션의 혼합물로 빨간색 채널에 대해 이 프로세스를 반복합니다.
    4. 10nM DNA 용액을 유리 커버슬립에 놓고 녹색과 적색 검출 채널 간의 상관관계가 가장 높은 초점, 핀홀 및 칼라 링 위치를 조정하여 가장 높은 진폭을 나타낸다.
      참고: 1.2.1 단계와 1.2.4 단계는 최적의 정렬을 찾기 위해 앞뒤로 반복해야 할 수 있습니다. 초점, 핀홀 및 칼라 링 위치가 녹색 및 빨간색 감지 채널 및 공초점 중첩 볼륨에 대해 최적으로 정렬된 후 30-120s의 각 교정 솔루션에서 3-5측정을 수행합니다.
    5. ddH2O, 이미징 배지 및 비-전지 30-120s에 대해 각각 3-5회 씩 드롭을 측정하여 배경 수 비율을 결정합니다.
    6. 30-120s에 대해 3-5 측정으로 계측기 응답 기능을 수집합니다. 이것은 선택 사항이지만 매우 권장됩니다.
  3. 라이브 셀 측정
    1. 수은 램프를 비추고 안구를 통해 관찰하여 적합한 셀을 찾습니다.
      참고: 적합한 세포는 각각의 부착 세포주의 전형적인 형태를 보여주는 살아 있다. 관심 있는 단백질의 형광, 여기서 표면 수용체는 표면 전체에 걸쳐 볼 수 있다. 덜 밝은 세포는 낮은 수의 분자가 초점을 맞출 때 FCS에서 더 나은 대조때문에 밝은 세포보다 더 적합합니다.
    2. PIE 모드에서 두 레이저를 모두 켜고 초당 최대 카운트를 보고 멤브레인에 집중하십시오.
      참고: 셀 샘플의 경우 레이저 전력을 줄여야 할 수 있습니다(객관적으로 5 μW 미만). 이는 사용된 형광및 설정에 따라 다릅니다.
    3. 데이터 수집 소프트웨어의 온라인 미리 보기에서 β2AR에 부착된 eGFP 또는 레이블이 지정된 SNAP 태그의 자동 및 상호 상관 곡선을 관찰하고 60-180s 사이의 획득 시간으로 몇 가지 짧은 측정(~2-10)을 수집합니다.
      참고: 형광이 표백될 수 있기 때문에 세포를 장기간 흥분시키지 마십시오. 그러나 각 셀의 밝기, 측정 횟수 및 총 측정 횟수에 따라 달라집니다.

2. 데이터 분석

  1. 데이터 내보내기
    1. 모든 측정에서 상관 관계 곡선,G(tc)및 카운트 비율, CR을 내보냅니다.
    2. "프롬프트" 및 "지연" 시간 창을 올바르게 정의하고 데이터 상관 소프트웨어에서 "마이크로타임 게이팅" 옵션을 사용합니다.
      참고: 총 3개의 상이한 상관관계가 필요합니다: (1) 프롬프트 타임윈도우(ACFgp)에서그린 채널의 자동 상관관계( 2) 지연 시간 창(ACF rd)에서 적색 채널의 자기 상관관계(ACFrd),그리고 마지막으로 (3) 지연 시간 창(CCFPIE)에서적색 채널 신호와 함께 프롬프트 창에서 녹색 채널 신호의 상호 상관관계가 필요하다. 데이터 내보내기는 보충 참고 3에서다른 소프트웨어에 대해 단계별로 표시됩니다.
  2. 교정 측정
    1. 녹색(ACFgp)및빨간색(ACFrd)플루오로포어 용액의 자가상관 기능을 사용하고, 필요한 경우 추가 삼중용어(eq. 1)를 사용하여 두 개의 사용된 컬러 채널에 대한 공초점 검출 볼륨의 모양과 크기를 보정하는 3D 확산 모델에 적합합니다.
      Equation 1 eq. 1
      여기서, b는 곡선의 기준선, N초점 분자의 수, t D확산 시간(ms), 및 s =z0/w0의 형태 인자 공초점 체량 원소의 형태 인자이다. 삼중 깜박임 또는 기타 광물리학은 진폭에 의해 R 및 휴식 시간 tR에의해 설명된다.
      참고: 프로토콜 내에서 사용되는 모든 변수와 기호가 표 1에 나열됩니다.
    2. 공지된 확산 계수 D를 녹색(26) 및 적색 보정표준(27)과 얻어진 형상 인자 s녹색 및 s레드를 사용하여 공초점 볼륨 요소(eq. 2a-c)의 치수(너비 w0 및 높이 z0)및 부피 Veff를 결정한다.
      Equation 2eq. 2a
      Equation 3eq. 2b
      Equation 4eq. 2c
      참고: 교정 매개 변수를 계산하기 위한 템플릿은 보충 파일(S7)으로 제공됩니다.
    3. 녹색 형광 신호의 스펙트럼 크로스토크 α(채널 0 및 2에서 수집)을 적색 검출 채널(채널 번호 1 및 3)에 백그라운드 보정(BG) 신호(eq. 3)의 비율로 계산한다.
      Equation 5
      eq. 3
    4. "프롬프트" 시간 창(녹색 레이저에 의한 여기)에서 적색 교정 측정의 배경 보정 카운트 비율의 비율에 의해 기증자 의 δ 동의어 형광의 직접 여기를 "지연" 시간 창(eq 4)에서 백그라운드 보정 카운트 비율로 결정한다.
      Equation 6
      eq. 4
    5. 3D 확산 적합성(eq. 1)에서 배경 보정 수율과 획득한 분자 수에 기초하여 녹색 및 빨간색 형광(eq. 5a-b)의 분자 밝기 B를 계산합니다( eq. 1):
      Equation 7eq. 5a
      Equation 8eq. 5b
    6. ACFgp와 ACFrd뿐만 아니라 이중 표지 된 DNA의 CCFPIE를 3D 확산 모델 (eq. 1)에 모두 맞춥니다. 획득한 모양 계수, 녹색 및빨간색, ACFgp 및 ACFrd의상수를 각각 유지합니다. CCFPIE,sPIE의 셰이프 요소는 일반적으로 이 두 값 사이에 있습니다.
      참고: 이상적인 설정에서 Veff,녹색 및 V eff 모두 빨간색은 동일한 크기와 완벽하게 겹칩니다.
    7. 0 상관 시간, G0(tc)에서진폭을 결정하며, 초점에서 분자의 명백한 수의 발견된 값에 기초하여(N녹색, N레드 및 NPIE).
    8. 녹색 및 빨간색 형광의 100 % 공동 확산시 샘플에 대한 진폭 비율 rGR 및 rRG를 계산합니다 (eq. 6). NPIE는 초점에 이중 표지 된 분자의 수를 반영하지 않지만 만 1 /G0(tc)을반영한다는 점에 유의하십시오.
      Equation 9및 Equation 10 eq. 6
  3. 라이브 셀 실험
    1. 단일 레이블이 지정된 구문의 경우 셀 샘플을 적절한 모델에 맞춥시게 합니다. 표시된 멤브레인 수용체의 경우, 확산은 짧고 긴 확산 시간으로 양모달 방식으로 발생합니다. 또한, 형광의 광물리학 및 깜박임은 고려되어야 합니다:
      Equation 11 eq. 7
      여기서, td1 및 td2는 두 개의 필수 확산 시간이며, 1은 첫 번째 확산 시간의 분획이다.
      참고: 자유 염료와 DNA 가닥이 모든 방향으로 자유롭게 확산되는 교정 측정과는 달리 막 수용체는 세포막을 따라 2D 확산만 을 보여줍니다. 3D와 2D 확산 의 차이는 2D 케이스의 tD가 공초점 볼륨 요소의 형상 계수에 의존하지 않는 수정된 확산 용어(eq. 1을 비교)에 의해 반영됩니다.
    2. 기본 수학(eq. 8)을 사용하여 각각의 N 및 Veff에서 녹색 또는 빨간색 표지 단백질의 농도 c를 계산합니다.
      Equation 12eq. 8
      어디 NA = 아보가드로의 번호
    3. N단 SNAP 라벨 및 세포내 eGFP의 경우, 이중 표지된 샘플의 이중 라벨링 된 샘플의 두 개의 자가상관(ACFgp 및 ACFrd)에ACF(eq. 7) 및 이중 변조 모델을 사용하는 CCFPIE에 대해 동일한 모델을 사용하여 적합합니다(eq. 9) :
      Equation 13eq. 9
      참고: 시스템의 글로벌 설명의 경우, 세 곡선 모두 공동으로 적합해야 합니다: 확산 용어는 세 곡선 모두에 대해 동일하며 유일한 차이점은 CCFPIE의완화 용어입니다. 두 형광의 광물리학은 일반적으로 관련이 없기 때문에 상관 관계가 필요하지 않습니다. 이완 용어가 없으면 짧은 상관 관계에 평평한 CCFPIE가 발생합니다. 그러나, 기증자 형광로 인한 수락자의 교차토크 및 직접 흥분은 거짓 양성 진폭을 보일 수 있으며 교정 측정을 사용하기 위해 주의 깊게 검사해야합니다.
    4. 방정식 8을 사용하여 각각의 N 및 Veff로부터 녹색 또는 빨간색 표지 단백질의 농도 c를 계산합니다.
    5. DNA 샘플로부터 수득된 교정 인자를 이용하여 세포 샘플로부터 녹색 및 적색 표지 단백질을 상호 작용하는 분획 또는 농도, cGR 또는 cRG,세포 샘플의 진폭 비 rGR 및 rRG 및 각각의 수득 농도(eq. 10)를 추정한다.
      Equation 14 및 Equation 15 eq. 10
    6. C-단말 SNAP 라벨 및 세포내 eGFP의 경우, FRET 샘플의 두자가상관(ACFgp 및 ACFrd)을단일 표지 샘플(방정식 7) 및 CCFFRET를 반상관 용어(방정식 11)를 포함하는 바이모달 확산 모델에 맞춥니다.
      Equation 16 eq. 11
      여기서f는 총 항상관 및 R 및 t R의 진폭을 각각의 진폭 및 이완 시간을 반사한다.
      참고: FRET로 인한 상관 관계가 없는 형광 변화의 경우 하나 또는 여러 가지 상관관계 방지 조건이 필요할 수 있으며, 그 결과 두 가지 상관관계가 증가하는 것과 일치하는 낮은 상관 시간에 CCFFRET의 "딥"이 발생할 수있습니다(ACFgp 및 ACFrd). 그러나, 삼중 깜박임과 같은 광물리학은 FRET 유도된 항상관관계를 약화시킴으로써 반상관 용어를 가릴 수 있다는 점에 유의하십시오. 필터링된 FCS 방법으로 보완된 조인트 분석은 상관 관계 방지 용어의 마스크를 해제하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 나노초 범위에서 계수 전자 기기의 데드 타임으로부터 유래된 기술 유물은16을제외해야 한다. ChiSurf28에서 분석을 수행하는 방법에 대한 보다 상세한 단계별 절차 및 공초점 볼륨 또는 분자 밝기 계산을 위한 템플릿은 Github 리포지토리(https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS github repository)와 보충파일(보충 주 4 및 보충 주 6)에제공됩니다. 또한 .ptu 형식으로 Symphotime 소프트웨어로 획득한 데이터의 일괄 내보내기를 위한 파이썬 스크립트를 찾을 수 있습니다.

Representative Results

교정 및 라이브 셀 측정의 모범적인 결과는 아래에서 논의됩니다. 또한 FRET가 상호 상관 관계 곡선에 미치는 영향은 단백질 단백질-상호 작용이 CCFPIE 진폭을 증가시면 다음의 시뮬레이션 된 데이터를 기반으로 입증됩니다.

PIE 기반 FCS 데이터 내보내기
PIE 실험에서 데이터는 시간 태그 시간 해결 모드(TTTR)29,30에서수집됩니다. 도 1B는 설명된설정(보충 주 1)에서이중 표지된 DNA 가닥의 PIE 측정의 광자 도착 시간 히스토그램을 나타낸다. 설치에는 4개의 검색 채널이 있습니다. 형광 방출은 먼저 "S"와 "P"방향의 편광에 의해 분할됩니다 (광파의 전기장이 진동되는 수직 및 병렬 평면을 참조). 둘째, 각 편광 방향은 감지하기 전에 두 개의 색상 채널(녹색, 빨간색)으로 분할되어 4개의 채널(S-Green, S-Red, P-green, P-빨간색)이 생성됩니다. "프롬프트" 시간 창에서 녹색 불소호가 흥분되고 FRET로 인해 녹색 채널과 빨간색 채널 모두에서 신호가 감지됩니다. 지연 시간 창에서 빨간색 불소호레(빨간색 채널)만 표시됩니다. 검출 채널 및 "프롬프트" 대 "지연" 시간 창에 기초하여, 적어도 5개의 상이한 상관관계 곡선(3개의 자기상관 곡선(ACFs) 및 2개의 상호 상관 곡선(CCF)))을 얻을 수있습니다(도 1C-D): (도 1)프롬프트 윈도우에서 녹색신호(ACFgp),(2) 적신호(FRET의 경우) 및 (3) 지연 시간창(ACFrd)에서적색 신호. 이러한 ACFs는 단백질 이동성, 광물리학(예를 들어, 삼중 깜박임) 및 형광구의 기타 시간 상관 밝기 변화(예: FRET로 인한)에 대해 보고합니다. (4) 지연 시간 창에서 빨간색 신호와 함께 프롬프트 시간 창에서 녹색 신호의 PIE 계 상호 상관 CCFPIE는 녹색 및 빨간색 플루오로포어(16)의 공동 확산의 분수를 결정할 수 있다. (5) 프롬프트 타임 윈도우에서 빨간색 신호와 녹색의 FRET 계 상호 상관 CCFFRET는 녹색 및 빨간색신호(31,32,33)의FRET 유도, 항상관 밝기 변화와 관련이 있다.

Figure 1
도 1: 펄스 인터리브 된 여기 (PIE) 기반 형광 (크로스) 상관 분광 (F(C)CS). (A)FCS 형광 표지 분자에서 이 작은 부피 내에서 형광을 유도하는 집중 레이저 빔에 의해 형성된 초점 부피 안팎에서 자유롭게 확산된다. 부피를 입력하고 떠나는 분자의 결과 강도 변동은 상관 관계가 있고 분자의 이동성에 대한 정보를 제공합니다. (B)PIE에서는 두 개의 서로 다른 레이저 라인("프롬프트"및 "지연")이 두 개의 서로 다른 형광("녹색" 및 "빨간색")으로 표시된 샘플을 자극하는 데 사용됩니다. 두 흥분 펄스 사이의 시차는 각각의 형광의 형광 수명에 적응되어 다른 하나는 흥분되기 전에 부패합니다. 표시된 이중 표지 샘플에서, 두 형광은 "녹색"기증자 형광에서 "빨간색"수용자 형광에 Förster 공명 에너지 전송 (FRET)을 받아야 하기에 충분히 가깝습니다. 따라서, 적색 형광 방출은 녹색 기증자의 여기에 따라 "프롬프트"시간 창에서 검출될 수 있다. 중고설정(보충 주 2)에서각 색상에 대해 두 개의 검출기가 사용되며, 하나는 각 색상에 평행하여 각 광선 방향("p"로 표시됨)과 두 번째 수직("s"표시)에 대해 배합합니다. (C) 3개의 상이한 자가상관 기능은 파이 실험에서 결정될 수 있다: i) 녹색 채널 신호의 프롬프트 타임윈도우(ACFgp),ii) 빨간색 채널신호(ACFrp)및 iii) 지연 시간창(ACFrd)에서적색 채널 신호. (D) 두 가지 상이한 상호 상관 기능 결정 될 수있다: iv) "PIE" 교차 상관 관계(CCFPIE)지연 창에서 빨간색 채널 신호와 상관 관계 프롬프트 시간 창에서 녹색 채널 신호와, 여기서 이 곡선의 진폭은 형광의 공동 확산과 관련이; v) 동일한 프롬프트 창에서 빨간색 채널 신호와 상관관계가 있는 프롬프트 타임 윈도우에서 녹색 채널 신호와 "FRET" 교차상관관계(CCFFRET); 여기서 확산보다 빠른 시간에 이 곡선의 형상은 FRET 유도 강도 변화와 관련이 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

교정
도2A-B는 각각 녹색 및 빨간색 형광을 분산시키는 교정 측정을 나타낸다. eq. 1및 알려진 확산 계수 D그린(26)과 D레드(27)와 함께 장착된 핏을 기반으로 검출 부피의 형상(z0 및 w0)및크기(Veff)를사용하여 eq.2a-c를 사용하여 계산된다. 적색 불소에서 녹색 불소와 ACFrd로부터의 ACFgp의 적합성 결과는 도 2C로요약된다. 두 형광은 각각 8.6 μs (18%)와 36 μs (15%)의 추가 휴식 시간 상수를 보여줍니다. 녹색 및 적색 형광의 분자 밝기 (eq. 5a-b)는 분자 당 12.5 kHz 및 분자 당 2.7 kHz에 각각 해당합니다.

분자 밝기뿐만 아니라 공초점 볼륨 크기와 모양의 신뢰할 수 있는 추정을 위해 교정 실험당 3-5 측정을 수행하고 모든 반복의 조인트(또는 글로벌)에 맞는 것이 좋습니다.

이 불소조 쌍에 대한 크로스토크α(도 2D,eq. 3)과 그린 레이저 δ(도2E,eq. 4)에 의한 수락자의 직접 외발은 각각 ~15% 및 ~38%로 나타났다.

Figure 2
도 2: 자유롭게 확산 녹색및 적색 보정 표준의 교정 측정. (A-B)대표 60 의 측정 2 nM 녹색(A)및 10 nM 빨간색(B)추가 휴식 시간(eq. 1)을포함하는 3D 확산 모델에 장착 된 교정 표준 측정. 패널(C)의표는 eq. 2a-c 및 eq. 5a-b를기반으로 한 맞춤 결과 및 유래 파라미터를 나타낸다. *확산 계수는 문학26,27에서채취되었다. (D)녹색 신호의 α 크로스토크의판정(eq. 3). 녹색 표준의 흥분 스펙트럼은 녹색의 방출 스펙트럼인 시안으로 나타낸다. 485 nm (파란색) 및 561 nm (주황색)의 흥분 레이저 라인은 대시 라인으로 표시됩니다. 투명 녹색 및 마젠타 상자는 수집 된 방출 범위(보충 참고 2)를보여줍니다. (E)485 nm 레이저 (eq. 4)에 의해 적색 플루오로포어의 직접 여기 δ 결정. 색상 코드는(D)및 어두운 주황색과 동일하며 빨간색 표준의 발산 및 방출 스펙트럼을 각각 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

녹색 과 적 의 중복을 확인하고 보정하기 위해, 이중 표지 된 DNA 이중 가닥(그림 3A)이위에서 설명한 바와 같이 사용된다. 여기서, 형광은 DNA 이중 가닥의 끝에 부착된 녹색과 적색 형광사이에 FRET가 발생할 수 없다는 것을 40 bp 간격으로 간격을 두는다. 도 3B는 녹색(ACFgp)및 마젠타(ACFrd)및 파이 크로스 상관관계, CCFPIE,시안에서 두 형광소로부터의 자기 상관관계를 나타낸다. CCFPIE의 경우 프롬프트 타임 윈도우의 녹색 채널의 신호가 지연 시간창(16)의빨간색 채널의 신호와 상관관계가 있습니다.

여기서, DDNA =77 μm²/s의 DNA 가닥에 대한 평균 확산 계수가 얻어진다. 계산에 대한 자세한 내용은 단계별 프로토콜인 보충 주 4에서찾을 수 있습니다. 이 값은 보정된 녹색 및 적색 검출 볼륨크기(도 2)와DNA 가닥(도3C)의 ACFgp 및 ACFrd의 각각의 확산 시간을 방정식 2a에 삽입하여 얻어진다. 다음으로, 얻어진 교정값 rGR 및 rRG를 이용하여 나중에 eq.6을 사용하며, 공동 확산의 양, 즉 이중 표지분자(또는 2개의 상이한 단백질의 공동 배칭시 단백질 복합체)는 세포 샘플로부터 결정될 수 있다.

Figure 3
도 3: DNA 샘플을 사용하여 녹색-빨간색 중첩 부피의 보정. (A)교정에 사용되는 DNA 가닥은 녹색 및 적색 교정 형광을 전달하며, 그 사이에 40 bp의 거리가 있다. 인터디드 거리는 형광사이의 FRET를 제외하기에 충분히 커야 합니다. (B)대표 60 s 측정 10 nM DNA 용액. 녹색(ACFgp,녹색 표준) 및 마젠타(ACFrd,빨간색 표준)와 파이 크로스 상관, CCFPIE모두에서 자가 상관 관계, 파란색. 패널(C)의표는 추가 이완기간(eq. 1)과DNA, D DNA(eq. 2a), 중첩 부피(eq.2a-c)의 크기 및 형상및 교정비율 rGR 및 RG(eq 6eq 6)의 유래 파라미터 확산 계수를 포함하는 3D 확산 모델에 기반한 적합성 결과를 나타낸다. ). 녹색 및 빨간색 검출 볼륨(*로 표시)의 값은 도 2에표시된 개별 형광의 적합성에서 가져온 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

라이브 셀 실험
다음 섹션에서는, 상이한 β2AR구문에 대한 라이브 셀 실험의 분석이 제시된다. β2AR은 멤브레인 단백질이기 때문에, 그 확산은 주로 세포막을 따라 2차원확산(도 4A)으로제한된다(멤브레인을 통해 또는 로부터의 운송 또는 재활용 공정 제외) 2. 2D 확산에 대한 제한과 함께 형상계수 s =z0/w0eq. 1은 단순화된 확산 모델(eq. 9)의 결과로 사용되지 않게 된다.

단일 레이블 구조: β2AR-IL3-eGFP 및 NT-SNAP-β2AR
도 4는 eGFP가 세포내 루프 3에 삽입되는 단일 라벨 컨스트럭터 β2AR-IL3-eGFP(도4B)와Β2AR의 N-종자에 게공되는 NT-SNAP-β2AR(도4C)의예시적인 측정을 나타낸다. SNAP 태그는 멤브레인 불투과성 SNAP 표면 기판으로 레이블이 지정됩니다. 대표 곡선은 획득 시간 당 120 ~200s로 4-6 반복 측정의 평균을 보여줍니다. eGFP 및 SNAP 신호의 각각의 자가상관 ACFgp 및 ACFrd는 바이모달, 2차원 확산 모델(eq. 9)에 장착된다. 빠른 역학의 관점에서, eGFP는 TR1 ~ 9 μs에서 예상되는 삼중 깜박임만 나타내며 SNAP 신호는 두 개의 이완 시간을 필요로 하며, 하나는 tR1 ~ 5 μs의 전형적인 삼중 깜박임 시간에 하나, tR2 ~ 180 μs에서 두 번째 가합니다.

살아있는 세포에서 형광의 분자 밝기는 주어진 흥분 조건(eqs. 5a-b)하에서 분자당 0.8KHz(eGFP) 및 1.7kHz(SNAP)이다. 세포막에 통합된 표지된 β2개의AR 구문체의 농도는 나노-어어 범위에 있어야 하며, eq8을 이용하여 녹색 및 적색채널(그림 2)에대한 분자의 평균 수(eq. 9, 도 4C)와각각의 공초점 부피의 크기에 의해 결정될 수 있다.

Figure 4
도 4: 단일 라벨 구조의 대표적인 측정. (A)본 연구에서막 수용체 β2AR이 예로 사용되었다. 검출 부피를 자유롭게 플로팅할 수 있는 교정에 사용되는 형광및 DNA 가닥과 는 달리 멤브레인 단백질은 주로 2차원 확산으로 묘사되는 멤브레인을 따라 주로 확산됩니다. (B, D) 단일 레이블 의 ACFgp 및 ACFrd는 β 2AR-IL3-eGFP(B)및 NT-SNAP-β2AR(D). 120-200s에 대해 각각 수집된 4-6측정값의 평균이다. 패널(C)의표는 추가 이완조건(eq. 7)을포함하는 바이모달 2차원 확산 모델에 대한 데이터의 적합성 결과를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이중 레이블 구조: NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP
이중 표지 된 구조NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP (짧은 NT-SNAP)에서, eGFP는 세포 내 루프 3에 삽입되고, Β2AR(그림 5A)의N 종자로 공각 된 SNAP 태그. 이 구성에서, eGFP는 FRET에 대한 너무 큰 거리를 가진 외부 측의 멤브레인과 SNAP의 내부 쪽에 있다. 이상적인 경우,이 구조는 녹색과 빨간색 불소 호레의 100 % 공동 확산을 표시하고 FRET 신호가 없습니다. 도5B-D는 두 개의 서로 다른 측정 일에 두 개의 셀에서 NT-SNAP의 두 가지 측정을 나타낸다. Eq. 7및 CCFPIE와 함께 도 5B에 도시된 "더 나은" 측정의 ACFgp 및 ACFrd를 피팅하면 ACFgp 및 ACFrd에초점을 맞춘 50-60 분자를 나타내고, 반면 N앱은 CCFPIE(도 5C)에 대해 1/G 0(t c) 114를 제시합니다(그림 5C)에 대한 1/G0(tc)114 ). 표지된 수용체의 농도는 eq. 8로 결정된 대로 ~100 nM 범위에 속한다. 이중 표지 된 분자의 평균 농도를 결정하기 위해, 먼저, CCFPIE의 G0(tc)의비율 (1/N(앱)으로표현되고 ACFgp 및 ACFrd,각각 계산 (eq. 6). 다음으로, 이러한 값, rGRcell= 0.43 및 rRGcell = 0.53은 DNA 측정(rGR, DNA= 0.51 및rR, DNA = 0.79)에서 얻은 값과 비교된다. 비율의 규칙을 사용하여, eGFP 신호의 ACFgp로부터 rGRcell= 0.43은 0.84의 공동 확산(rGRcell/rGR, DNA)의분수로 반사하며, 여기서 SNAP 기판 신호의 ACFrd의 다른 경우에는 0.67에 달한다. 이중 레이블NT-SNAP 구조의 평균 농도는 마지막으로 eq. 10을 기준으로 계산될 수 있습니다. 대조적으로, 다른 날로부터 도 5D에 도시된 측정에서, 수용체의 농도는 매우 낮으며, 매우 시끄러운 데이터로서 의 착용 범위가 최대 ~10 μs까지 제한됩니다. 또한, 소량의 공동 확산만 관찰된다(15 -26%).

Figure 5
그림 5: 이중 레이블NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP 구조. (A)이중 라벨링 된 구조에서, eGFP는 세포 내 루프 3 및 β2AR (NT-SNAP)의 N 종착에 부착 된 SNAP 태그에 삽입된다. (B, D) 더블 라벨 구조의 두 측정의 ACFgp, ACFrd 및 CCFPIE. 데이터는 이중모달 2차원 확산모델(eq. 9, CCFPIE)에적합하며 추가 이완 조건(eq.7, ACFgp 및 ACFrd)을포함한다. 패널(C)의표는 0 상관시간(G0(tc)에서의 상관 진폭의 적합성 결과 및 유래 파라미터 농도(eq.8),상관 관계 진폭의비율(eq. 10)을나타낸다. 측정은 다른 날에 획득되었기 때문에 진폭 보정을위한 약간 다른 인자가 사용되었습니다 (B : rGR, DNA = 0.51 및 r RG, DNA = 0.79; D: rGR, DNA = 0.51 및 r RG, DNA = 0.56). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

FRET 진행 중인 이중 레이블 구조: β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP
이중 표지 된 구조β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP(도 6A),eGFP는 C-종래에 부착 된 SNAP 태그와 NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP 구조와 동일한 세포 내 루프 3에 삽입된다. 여기서, 두 라벨은 세포의 혈장 멤브레인의 동일한 측면에 있으므로 형광은 가까운 부근에 있으므로 FRET는 담금질 eGFP 수명(보충 참고 5)에의해 표시된 대로 발생합니다. C-terminus34 와 GPCRs35의적어도 두 개의 상이한 단백질 적합성, "높은 FRET" (HF) 또는 "낮은 FRET"(LF)와 같은 비교적 비정형 단백질 영역의 유연성을 고려할 때, eGFP-SNAP 거리 변화로 인한 FRET 효율의 동적 변화를 관찰하고 CCF FRET(6B피량의 주황색 곡선)에서 성상관 용어로 식별할 수 있었습니다. ). FRET 변동은 수용체가 한 번에 하나의 상태, HF 또는 LF에있을 수 있기 때문에 항상관성 것으로 나타났습니다. 5개의 상관관계곡선(도 6B)의조인트(또는 글로벌)는 ~100ms에서 천천히 확산되는 분자의 ~70%를 드러내고 나머지는 ~ 1ms로 확산된다. 모든 자기 상관 관계 및 CCFFRET는 37 μs 및 3 μs에서 완화 조건을 보여줍니다; 적색신호(ACFrp, ACFrd 및 CCFFRET)가지배하는 상관관계는 추가 느린 구성요소 ~ 50ms(도6C)를나타낸다.

상이한 조건하에서 CCFFRET에 대한 FRET 유도 된 변화는(도 6D)LF와 HF 상태 사이의 70 μs의 변동 시간을 갖는 2 상태 시스템의 일련의 시뮬레이션에 의해 입증된다. LF에서 HF 상태로 전환하면 프롬프트 타임 윈도우에서 항상관 성 신호의 변화가 관찰됩니다: 녹색 신호가 감소하고 적신호가 증가합니다(HF-> LF 스위칭의 경우 그 반대의 경우도 마찬가지입니다). HF-LF 스위칭이 확산 시간보다 더 빠른 시간 척도에서 발생하는 경우, 즉 초점 중분자의 체류 시간 동안, 속도는 CCFFRET6,31,36에서의 항상관으로부터 유래될 수 있다. 확산 시간보다 느린 동적 공정은 FCS에서 관찰할 수 없습니다.

이 데모에서는 두 가지 주 간의 FRET 효율성이 중등도또는 최대변경된 것으로 가정되었습니다. 시뮬레이션은 Burbulator(37)를 사용하여 수행되었으며, 삼중 깜박임의 부재 또는 존재를 고려하고 빨간색 채널로 기증자 크로스토크의 양을 증가. 확산 용어는 tD1 = 1 ms및 나머지 분자가 tD2 = 100 ms로 천천히 확산되는 빠른 확산 분자의 30%를 가진 바이모달 분포로 모델링되었다. 총107개의 광자가 w = 0=0.5 μm 및 z0 = 1.5 μm, 상자 크기 20 및 NFCS = 0.01을 가진 3D 가우시안 형 부피로 시뮬레이션되었습니다.

도6E-F는 중간(도 6E)에대한 FRET 유도 교차 상관 CCFFRET 및 최대 FRET 대비(도6F)에대한 시뮬레이션 결과를 나타내며, 부재 중(단선) 및 삼중 깜박임(dashed 라인)의 존재가 존재한다. FRET 유도 된 항 상관 관계는 도 6F에서쉽게 볼 수 있습니다. 추가 삼중 상태를 추가하면 "감쇠" 효과는 상관 관계 진폭을 감소시킵니다(도6E-F)38,39.

Figure 6
그림 6: 동적 FRET를 보여주는 이중 표지 된 샘플의 시뮬레이션 (A) 세포 내 루프 3 및 C 단말 SNAP 태그에 삽입 된 eGFP와 함께 β2AR을 이중 라벨. 두 형광은 FRET를 겪고 수용체가 단백질 역학을 겪는 경우 FRET 효율의 변화를 보여줄 만큼 가깝습니다. (B)자율상관(ACFgp, ACFrp 및 ACFrd, eq.7)와교차 상관 곡선(CCFFRET(eq. 7) 및 CCF PIE(eq.9)와함께 실시하였다. 패널(C)의테이블은 적합성 결과를 보여줍니다. (D-F) 예상, FRET 유도 항상관 용어, 12개의 시뮬레이션이 수행되었으며, FRET 효율(작거나 큰), 다른 양의 기증자 크로스토크가 수용채널로 의한(0%, 1% 또는 10%) 및 삼중 깜박임의 부재 및 존재를 모델링하였다. FRET-상태의 평형 분획은 50:50으로 추정되고 그들의 환율은 얻어진 휴식 시간 tR = 70 μs가 조정되었다. 시뮬레이션에 대한 자세한 내용은 텍스트에서 볼 수 있습니다. (E) 시뮬레이션의 CCFFRET는 적당한 FRET 대비와 크로스토크(다크 오렌지), 1% 크로스토크(오렌지) 및 10% 크로스토크(라이트 오렌지)가 없는 경우 결과를 낳는다. 솔리드 라인은 트리플렛이 있는 상태에서 트리플렛, 파선선이 없는 결과를 보여줍니다. (F)최대 FRET 대비시뮬레이션 결과의 CCFFRET. 색상 코드는(E)와동일합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그러나 실험 조건(α = 10%, 15% 트리플 깜박임 및 적당한 FRET 대비, 도 6E의파선 노란색 선)과 가장 유사한 시뮬레이션에서 반상관 용어가 거의 감소된다. 도 7은 광자 도착 시간 히스토그램(즉, 형광 수명)에 인코딩된 정보를 이 시뮬레이션된 데이터를 분석한 결과를 나타내며, 형광수 상관분광(FLCS)17,19 또는 종 여과FCS(fFCS)18을통해. 여기서, 알려진 HF 및 LF종(도 7A)의형광 수명은 상관 관계 절차 중에 적용되는 가중치 또는 "필터"(도7B)를생성하는 데 사용된다. 얻어진 종-자동 및 교차 상관 곡선(도7C-D)에서항상관은 명확하게 관찰될 수 있다.

Figure 7
그림 7: 평생 여과된 FCS는 CCFFRET에서FRET 유도 된 항상관을 마스킹하는 높은 크로스토크, 중요한 삼중 깜박임 또는 기타 광물리 또는 실험적 특성을 가진 샘플에서 FRET 효율의 단백질 역학 기반 변동을 발견하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기서, 접근 방식은 10% 크로스토크 및 5% 삼중 깜박임이 포함된 시뮬레이션에 대해 도 6E에 도시된 데이터에 대한 예시적인 것으로 나타났다. (A)두 FRET 종(각각 높고 낮은 FRET용 밝고 어두운 녹색) 및 IRF(회색)에 대한 정규화된 형광 강도 붕괴 패턴을 정규화하였다. 병렬 검출 채널의 패턴은 수직 검출 채널에 대한 단선, 파선선으로 표시됩니다. (B)가중치 함수 또는 "필터"는(A)에표시된 패턴에 기초하여 생성되었으며, 색상 코드는(A)와동일하다. 녹색 검출 채널의 신호만, 따라서 FRET 유도 기증자 담금질, 여기에 고려된다. (C)4개의 다른 종 선택적 상관관계가 얻어진다: 낮은 FRET 상태(sACFLF-LF,다크 그린)와 높은 FRET 상태(sACF HF-HF, 밝은 녹색)와 높은 FRET상태(sACFHF-HF,light Green)의 종-자기 상관관계, 그리고 높은 FRET상태(sCCFLF-HF,오렌지)에 대한 낮은 FRET 사이의 두 종-교차상관 , 오렌지). sCCF는 μs 범위의 항상관을 명확하게 보여줍니다. 파선 된 검은 색 라인은 적합을 보여줍니다. sACF는 eq. 9 및 sCCF와 eq. 11에적합했습니다. 패널(D)의테이블은 적합성 결과를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

단백질 단백질 상호 작용(PPI)을 연구하는 CCFPIE 진폭
마지막으로, 살아있는 세포에 있는 PIE 기지를 둔 FCS를 위한 일반적인 사용 케이스는 2개의 다른 단백질 사이 상호 작용을 공부하는 것입니다. 여기서, 판독 파라미터는 CCFPIE의진폭, 또는 보다 정밀하게 CCFPIE의진폭에 대한 자기 상관 진폭 ACFgp 및 ACFrd의 비율이다. CCFPIE에대한 공동 확산증가 효과를 보여주기 위해, 시뮬레이션은2개의AR-IL3-eGFP 및 NT-SNAP-β2AR(그림8A)을β 두 개의 단일 레이블 구조에 기초하여 수행되었다. 도 8B는 공동 확산 분자의 분획이 0%에서 100%로 변할 때 CCFPIE의 진폭이 어떻게 증가하는지를 보여줍니다. 지연 시간 창의 빨간색 채널에 녹색 신호의 1 % 교차 토크가 확산 성분과 함께 추가된 다른 쪽과 같이 모델링된 경우 유의하시기 바랍니다.

Figure 8
도 8: CCFPIE는 2개의 단백질의 상호작용을 연구하기 위하여 이용될 수 있다. (A)여기에서, NT-SNAP-β2AR을 가진 β 2AR-IL3-eGFP의 공동 형질 전환 연구 ("빨간" SNAP 라벨을 운반)를 시뮬레이션하였다. (b)증가량의 공동 확산 분자(0%(다크 블루) -> 100% (연한 파란색)) 진폭 G(tc)가증가한다. 확산 용어는 tD1 = 1 ms에서 빠른 확산 분자의 30 %와 다른 분자가 tD2 = 100 ms로 천천히 확산되는 비모달 분포로 다시 모델링되었습니다. 또한 빨간색 지연 시간 창에 녹색 신호의 1 % 교차 토크가 추가되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

상징 의미(공통 단위)
α 녹색 불소의 크로스토크 후 녹색 흥분후 적색 검출 채널로 (%)
a 1 막 수용체의 이중 모달 확산 모델에서 첫 번째 확산 성분의 분수
a f 반상관 용어의 총 진폭
A R 광물리학/삼중깜박이진 진폭
b 상관 곡선의 기준/오프셋
B 불소로포(킬로-)의 분자 밝기(분자당 킬로-카운트 및 초)
BG 배경(예: 적절한 참조 샘플: ddH2O, 버퍼, 감염되지 않은 셀 등)
c 농도
CR 카운트 비율(KHz 또는 초당 킬로 수)
δ 녹색 흥분 후 붉은 불소의 직접 흥분 (%)
D 확산 계수(μm²/s)
G(tc) 상관 기능
N 초점에 있는 분자의 수
NA 아보가드로의 번호 (6.022*1023 몰-1)
rGR,r RG PIE 기반 상호 상관 함수에 대한 녹색 또는 빨간색 자기 상관 기능의 진폭 비율
s 공초점 볼륨 요소의 형상 계수
tc 상관 관계 시간(일반적으로 밀리초)
tD 확산 시간(보통 밀리초 또는 마이크로초)
tR 광물리학의 휴식 시간 (보통 마이크로초)
tT 삼중 깜박임의 휴식 시간 (일반적으로 마이크로 초)
w0 공초점 볼륨 요소의 절반 폭 (μm)
z0 공초점 부피 요소의 반 높이 (μm)

표 1: 변수 및 약어 목록입니다. 형광 및 FRET 실험에서 기호와 정의를 사용하기 위해 FRET 커뮤니티40의 지침을 권장합니다.

보충 파일:

SuppNote1_Coverslip 청소.docx 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

SuppNote2_Confocal 설정.docx 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

SuppNote3_Data 내보내기.docx 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

SuppNote4_FCCS 치서프를 이용한 교정 분석.docx 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

SuppNote5_Fluorescence 평생 히스토그램.docx 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

S6_Scripts.zip 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

S7_Excel_templates.zip 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

GPCRs에 있는 FCS 기술은 살아있는 세포 안쪽에 수용체의 이동성 그리고 상호 작용이 평가될 수 있습니다41. FRET-FCS 기술의 장점은 이동성과 함께 GPCR의 형성 역학을 조사 할 수 있다는 것입니다. 그러나, 살아있는 세포에서 FRET-FCS를 수행하는 것은 도전적이고 이해의 형광 표지 단백질, 잘 보정된 설정 및 데이터를 분석하기 위하여 좋은 파이프라인의 낮은 (또는 최대 온건한) 발현을 표시하는 세포를 요구합니다. 여기서, 먼저 샘플 제제 및 실험 절차의 임계점은 생물학적, 분광및 기술적 관점에 대해 논의된다.

중요한 실험 단계에는 배경 및 자동 불발(광범위하게 세척된 커버립 및 페놀-레드 프리 미디어를 사용하여), 경질 조건의 최적화(예: 플라스미드 DNA 및 트랜스페션 후 시간)를 최소화하여 낮은 발현 수준과 효율적인 라벨링을 달성하는 것이 포함됩니다. 물론 라벨이 부착된 단백질의 기능이 방해받지 않도록 하는 것도 중요합니다. 따라서, 라이브 셀 실험에서, 라벨링 전략 및 라벨 위치에 대한 결정은 종종 유연한 N-또는 C-종자(42)및43에부착된 형광 단백질 또는 SNAP/CLIP 태그에 찬성하여 이루어진다. 유기 형광소로 라벨링에 대한 반응성 측면 체인과 부자연스러운 아미노산을 삽입하는 것과 같은 대체 라벨링 전략은 지난 몇 년 동안44년에등장하고있다.

이중 색 PIE-FCS의 경우, 관심있는 두 분자의 상호 작용만을 조사해야하며, 형광은 다양한 확립 된 형광 단백질 또는 SNAP /CLIP 기판에서 선택 될 수 있습니다. 여기서, 분광법 현명한 목표는 작은 크로스토크 또는 직접 수락자 여기가 발생하는 쌍을 선택하는 것입니다. 또한, 선택된 형광은 포토스터블이어야 하며 선택한 실험 조건 하에서 표백을 거의 또는 전혀 표시하지 않아야 합니다. (1) 세포로부터의 자동 형광 배경이 감소되고 (2) 흥분광이 더 긴 파장의 경우, 따라서 더 적은광독성(14)으로적색 스펙트럼 범위에서 형광을 선택하는 것이 좋습니다. 레이저 전력이 단계적으로 증가하고 분자 밝기가 관찰되는 이른바 "파워 시리즈"를 먼저 수행하여 광표백을 최소화할 수 있습니다. 최적의 흥분 강도 범위는결과(45)의선형 범위에 있습니다.

두 라벨이 FRET를 통해 단백질 형성 역학에 대해서도 보고해야 하는 경우 사용 가능한 형광의 선택이 더 제한됩니다. 여기서, 두 형광호 사이의 가능한 최소/최대 거리는 예를 들어, 사용 가능한 구조 또는 분자 크기에 기초하여 미리 추정되어야 하며, 합리적인 Förster 반경 R0으로 선택된 형광쌍은 FRET가 실제로20을발생할 수 있도록 한다.

여기서, eGFP와 SNAP 태그는 라벨링을 위해 선택되었고, SNAP 태그는 세포내 또는 멤브레인 불투과성 표면 기판으로 레이블이 지정되었습니다. 스펙트럼은 도2C-D에표시된 것과 유사합니다. 이러한 형광의 조합은 eGFP의 높은 교차토크를 프롬프트 타임 윈도우에서 녹색 여기에 의한 SNAP 기판의 적색 검출 채널 및 직접 수락자 여기를 나타내며 프롬프트 타임 윈도우의 빨간색 채널에서 중요한 "거짓"신호를 초래한다. 이상적으로, 두 값, 크로스 토크 및 직접 수락자 여기, 5 %5,6,38을초과해서는 안됩니다. 그러나 Förster 반경이 57Å인 경우 담금질된 eGFP 수명(보충 주 5)에서 평가할 수 있는 β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP 구조에서 라벨 사이의 거리를 조사하는 것이 이상적입니다.

기술적으로, 어떤 형광 분광 실험에 관해서는, 장치는 잘 정렬되어야하며 적절한 흥분 소스, 방출 필터 및 민감한 검출기를 보유해야합니다. μs 시간 척도에서 검출기의 검출기를 피하려면 각 색상의 적어도 두 개의 검출기가 존재해야 하며, 이는 상호 상관관계가 있을 수 있습니다. 현대의 시간 상관 단일 광자 카운팅 전자에서, NS 시간 범위에서 검출 카드의 데드 타임은 독립적 인 라우팅 채널로 인해 거의 역할을하지 않지만, 관심의 시간 범위가 하위 μs / ns 시간 범위에 있는 경우 Müller et al 16에 의해 제안 된 바와 같이 확인 될 수 있습니다. 또한, ps 범위에서 더 높은 시간 해상도를 위해, 각 검출 채널은 두 배가되어야하며, 즉 색상당 4 개의검출기를 사용해야하며, 검출기를 데드 타임2,15,29,46을우회합니다. 평균 형광 수명은 비편광 검출을 사용하여 추정될 수 있지만, 형광 사이의 거리(~분포)의 분석을 위해 방출은 편광에 의존하여 수집되어야 한다. 이는 FRET의 에너지 전달 효율이 두 형광의 방향에 의존하기 때문입니다. 자세한 내용은 여기에서 찾을 수 있습니다20,28,47. 마지막으로, PIE 실험에서, 프롬프트와 지연 펄스 사이의 거리가 중요하며 형광의 형광 강도가 크게 부패하도록 선택되어야한다(도 1B). 일반적인 규칙은 2개의 펄스를 5배 떨어져 둘 것입니다, 즉 형광 수명을 가진 eGFP의 경우 2.5ns의 거리는 최소22에서12.5 ns이어야 한다.

실험 절차에 대한 모든 고려 사항을 자세히 고려한 후 데이터와 분석이 보다 자세하게 설명됩니다. 프로토콜 섹션에서 언급했듯이 교정 측정의 분석을 포함하여 매일 설정의 정렬을 확인해야 합니다. 도 2A-C에도시된 데이터는 예를 들어,8-40 μs 범위에서 추가 이완 성분을 나타낸다. 녹색 교정 형광의 전형적인 삼중 깜박이는 2-10 μs 범위13,15,48에서발생하는 것으로 알려져 있다. DNA 샘플의 모든 곡선에 필요한 느린 이완성분(도 3C)실제 트리플깜박임에 대해 너무 느리고, 형광구(39)와의 DNA의 상호작용으로부터 유래할 수 있다. 그러나 이 구성 요소는 CCFPIE에서예상되지 않으며 대부분 잔여 크로스토크에서 비롯될 가능성이 높습니다. 따라서, 하루의 정렬의 품질을 판단하기 위해 세포 실험을 진행하기 전에 교정 샘플의 분석을 직접 수행하는 것이 매우 바람직하다.

공초점 중첩 볼륨의 적절한 보정은 녹색 과 빨간색 라벨의 100 % 공동 확산샘플이 필요합니다. 여기서, 형광 표지된 이중 좌초 DNA가 사용됩니다. 두 DNA 가닥은 서로 필요한 거리에서 원하는 형광을 갖도록 맞춤화될 수 있다. 설계 된 가닥은 높은 수율로 어닐 수 있습니다. 그러나, 좋은 실험실 사례는 아가로즈 젤 전기포진에 의한 DNA 가닥의 무결성 및 라벨링 정도를 확인하고 흡수 스펙트럼을 측정하는 것이 좋습니다. 또한, 이중 가닥 어셈블리의 수율은 이 보정 측정이 빨간색 라벨과 녹색의 100% 공동 확산이 있다는 가정에 비판적으로 의존하기 때문에 확인되어야 한다. 가정이 유효하지 않은 경우 수정 요소를16,22로적용해야 할 수 있습니다. 도 2 및 도 3에도시된 교정 측정에서, 녹색 및 빨간색 채널에서 1.4 fL 및 1.9fL의 검출 부피를 각각 획득하였다. 이 크기 차이는 거의 회절 제한 흥분 볼륨(보충 주 2)와설정에 대한 예상된다. 이 조건하에서, 여기 부피의 크기는 흥분 파장을 가진 비늘. 이것은 차례로 도 3B에서관찰된 상이한 상관 관계 진폭을 설명합니다. 파생 보정 인자 rGR = 0.56 및 rRG = 0.72 이 크기 불일치 및 두 개의 여기 볼륨3,4의잠재적 비완벽한 중첩에 대해 올바른.

도 4, 도5, 도 6,및 도 7은 형성 단백질 역학을 이해하기 위한 PIE-F(C)CS 기반 연구의 워크플로우를 선보이고 있다. 먼저, 2개의 단일 라벨구조는 β2개의AR-IL3-eGFP 및 NT-SNAP-β2AR이 각각의 다른 플루오로포어(도4)가없는 상태에서 세포내형불소류 특성을 특성화하는 대조군역할을 한다. 다음으로, 이중 표지된 NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP는 세포 외부를 향한 SNAP 태그를 탑재하고 세포질 측에 eGFP를 탑재하여 "100% 공동 확산" 제어(도5)의역할을 한다. 마지막 구조인Β 2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP은 세포질 측에 형광을 모두 운반하고 FRET를 받을 수 있을 만큼 충분히 가까이 있습니다. 여기서도, 다시 100% 공동 확산은 프롬프트 타임 윈도우에서 녹색 및 빨간색 채널 신호의 항 상관 성 강도 변동과 함께 예상될 것이다, 즉, 기증자 여기 후, FRET 효율에 영향을 미치는 단백질 역학으로 인해 FRET 효율31,32,33. 이 역학은 CCFFRET(그림 6-7)에서상관 관계 반대로 나타날 수 있습니다.

모든 GPCR β2AR 구문은 세포막에 바이모달 확산을 나타낸다(도4A). 반면 β2AR-IL3-eGFP는 예상 트리플깜박임(도5B)13,15,NT-SNAP-β2AR만을 나타내며, 추가적인 느린 휴식 시간(도5C-D)을나타낸다. tR2가 언바운드 SNAP 기판에서 비롯될 수 있습니다. 이는 수성 용액에서 사용된 SNAP 기판의 확산 및 광물리적 특성을 측정함으로써 추가 실험, 예를 들어 추가 실험에 의해 해명될 수 있다. 참고로, 확산과 휴식 시간을 구별하는 간단한 실험은 공초점 설정의 핀홀을 변경하는 것입니다, 즉, 효과적인 볼륨을 증가: 확산 시간이 증가하면서 유효 볼륨이 증가하면서, 이완 용어는 변경되지 않습니다13. 적합성 결과에 기초하여 형광 단백질(FP)의 농도를 결정할 때, 일반적으로 FPs가 성숙 과정을 거치며, 마침내 염색체가 형성되는12. 이 성숙 시간은 지역 화학 환경에 의존하는 광물리학 이외에 FP에 FP로 다를 수있습니다(13,15). 따라서 FCS에 의해 보고된 샘플에 존재하는 실제 단백질 농도는 일반적으로 과소 평가되며, 비형광 FPs의 분획이 실험에서 결정될 수 있는 경우 교정될 수 있다. 마지막으로, 대부분의 형광이 환경에 민감하게 반응하기 때문에, 대부분의 형광이 환경에 민감반응하기 때문에, 필요한 경우, α 및 δ 대한 값을 수정하기 위해 살아있는 세포에서 형광 스펙트럼을 확인하는 것이 좋습니다13,15,48. 빼기 배경은 비형감염 된 세포에서 수집 된 신호에 의해 결정됩니다. 또한, 각각의 다른 컬러 채널과 CCFPIE의 자가상관은 거짓 신호를 식별할 수 있도록 검사되어야 한다(보충참고 4 - 그림 30).

형광이 멤브레인의 다른 측면에 위치한 NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP(도5D)의두 측정은 다른 날에 획득되었으며 시간 해결된 단일 분자 형광에서 통계의 중요성을 보여줍니다. 여기서, 상이한 결과는 라벨링의 다른 정도 때문일 수 있다: 한 셀에서 상대적으로 낮은 잡음(도5B)을초래한 측정의 높은 정도에서, 다른 셀에서, 단 2개의 측정만 수집될 수있었다(그림 5A). 충분한 양의 데이터를 수집하는 것 외에도 결과를 적시에 평가하고 라벨링 전략을 최적화하는 것이 중요합니다. 실험을 설계할 때 FRET는 민감하지만 최대 10nm 및 "블라인드"로 제한된다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 우리의 경우,이 "실명"은 변경되지 않은 eGFP 형광 수명 (보충 주 5)에 의해 표시됩니다. β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP 구조(도6A)에서FRET는 담금질된 eGFP 수명(보충 주 5)에서 정확히 파악할 수 있다. 그러나, 어떤 항상관 용어가 관찰되지않음(도 6B)은FRET가 변동하지 않거나 확산 시간보다 한 번에 더 느리다는 것을 의미한다. ACFgp,ACF rp,ACF rd 및 CCFFRET(그림 6C)에는최대 3개의 추가 이완 조건이 필요합니다. ACFrp, ACFrd 및 CCFFRET의 느린 구성 요소는 수용자 표백 때문일 수 있으며, 물론 이러한 곡선에서 발견되는 느린 확산의 얻은 값에 영향을 미칩니다 (ACFgp의117 ms에 비해 ~ 350 ms). 빨간색 채널의 tD는 크기가 다르기 때문에 녹색 채널(그림2)보다약간 크어야 하지만 크기 차이에 필적하는 요인에 의해서만 가능합니다. 3 μs의 매우 빠른 휴식 시간은형광13,15,48의삼중 깜박임을 반영하는 반면, 37 μs의 느린 휴식 시간은 FRET 때문일 수 있습니다: 마찬가지로 FRET는 CCFFRET에서항상관을 유도함에 따라, 양성 상관관계는31,32,33에서예상된다. CCFFRET에서 "긍정적"으로이 용어의 존재와 ACFRD에서의 존재는 높은 크로스 토크로 설명 될 수 있으며 더 해명해야합니다. CCFPIE는 예상대로 짧은 상관 관계 시간에 평평합니다.

한편, 관심 체계에서 FRET가 발생하면 상관 곡선6에비선형 효과가 초래된다는 점에 유의해야 한다. 분자 밝기 예를 들어, 분자의 저울은 상관 진폭 제곱및 각 FRET-상태(및 활성 수용체가 없는 항상 존재하는 분자)로 확장되어 다른 분자 밝기를 나타낸다. 실제로 FRET는 검출된 녹색 분자의 명백한 농도(즉, ACFgp 진폭증가)를 감소시키고 적색 분자(적색 프롬프트에서 결정)의 수가 과대평가된다 5. 두 효과 모두 CCFFRET 및 CCFPIE에서파생된 상호 작용의 양에 영향을 미칩니다. 그러나, 칼모둘린(31)또는32 또는 구문신(33)의 분자 내역학에 대해 예를 들어, 전 세계적으로 분석되면 단백질 역학을 나타낼 수 있다. 신중하게 보정될 때, 평균 FRET 효율은 상대 CCFPIE 및 ACF진폭(22)으로부터추출될 수 있고, 반면 제한 상태는 기증자 형광 수명분포(33)의분석으로부터 결정될 수 있다.

eGFP와 같은 대형 형광을 가진 살아있는 세포 실험에서 FRET 대비가 도 6에 표시된 시뮬레이션에 대해 가정보다 훨씬 낮을 가능성이 있으며, 시뮬레이션에 수용자의 직접적인 흥분이 추가되지 않았다는 사실을 고려할 때, 살아있는 세포 실험에서 의 반상관의 식별이 매우 어려운 이유를 설명할 수 있다. 유망한 분석 대안은 시간 상관 단일 광자 계수 데이터 수집29,30으로인해 광자 도착 시간 히스토그램(도1B)에인코딩된 정보를 수확하는 데의존한다. 시료 내부의 2종(또는 FRET) 종(또는 FRET)종(도 7A)또는 가중치의 형광 수명(~패턴)이 공지되는 경우(도 7B) 또는 가중치가 상관 과정 동안 적용될 수있다(도 7B)17,18,19. 따라서 얻은 상관 관계 곡선은 검출 채널의 상관 관계를 더 이상 나타내지 않고 오히려 두 개의 서로 다른 (FRET) 종 사이의 자동 또는 교차 상관관계를 나타내지 않으므로 종-ACF (sACF) 또는 종-CCF (sCCF)로 이름이 바뀝니다. 적당한 FRET 대비를 가진 시뮬레이션된 데이터에 이 접근 방식을 적용하면, 높은 크로스토크 및 삼중 깜박임은 반상관 용어(도7C-D)를회복한다. 그러나, 휴식 시간을 얻을 수 있지만 진폭과의 관계는18손실된다는 점에 유의해야합니다. 이러한 접근법은 이전에 살아있는 세포 실험에서 적용되어길항제(49)와 EGFR의 상호 작용을 연구하거나 eGFP 변이체에 부착된 단백질과 형광을 분리하여 매우 짧고 긴 형광 수명50을가진 것으로 나타났습니다.

정제된 단백질의 PIE 기반 FRET 측정은 주로 단백질 역학 을 연구하는 데 사용되지만3622,살아있는 세포에서 단백질 단백질 상호 작용을 이해하는 데 중점을 둡니다. 이러한 접근법은효모(51)에서 MAP 키나아제 활성의 조절을 연구하거나 최근 기사에서 요약된 세포성 결합 파트너와막 단백질의 상호 작용을 해결하기 위해 적용되었다52. 여기서, 녹색 형광의 중요한 크로스토크가 여전히 프롬프트 시간 창에서 녹색 채널또는 빨간색 신호의 지연 시간 창에 존재할 때 합병증이 발생할 수 있다. 전자는 녹색 펄스에 대하여 적색 펄스의 불충분 한 지연에 의해 발생할 수 있습니다 두 효과 선택 된 형광의 너무 강하게 겹치는 흥분 및 방출 스펙트럼에서 유래 하는 동안. 특히 매우 짧은 형광 수명을 가진 자가 형광이 또 다른 복잡한요인(22)이될 수 있는 세포에서, 특히 거짓 양성 CCFPIE 진폭에 대해 각각의 단일 표지된 구조를 주의 깊게 확인하고 올바른 지확인하는 것이 좋습니다.

결론적으로, 여기에서 기술된 FRET-FCS 접근은 거의 생리적인 농도에 살아있는 세포에 있는 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 역학을 이해하는 중대한 잠재력을 가지고 있습니다. 이 프로토콜에서, 살아있는 세포 측정 중에 수행해야 할 필요한 교정 측정 및 필요한 정량 적 분석에 초점을 맞추어졌다. 이를 위해 다양한 라이브 셀 측정이 시뮬레이션으로 보완된 것으로 나타났습니다. 시뮬레이션은 매개 변수가 각 데이터의 특정 이동성 및 광물리적 특성을 설명하는 맞춤형 맞춤 모델로 체계적으로 다양할 수 있기 때문에 여기에서 일반적인 이해를 제공합니다. 이 분석은 광범위한 단계별 프로토콜과 적응하기 쉬운 템플릿을 갖춘 오픈 소스 소프트웨어 도구로 수행되었습니다. 마지막으로, 기술 발전, 따라서 데이터 분석을위한 오픈 소스 소프트웨어의 확산과 함께 즉시 구매 할 수있는 안정적인 PIE-FCS 시스템의 가용성은 결국 높은 감도라이브 셀에서 단백질 상호 작용과 역학을 해명하기 위해 더 큰 연구 커뮤니티에 대한이 기술을 점점 더 쉽게 접근 할 수 있습니다.

Disclosures

저자는 선언할 충돌이 없습니다.

Acknowledgments

이 프로젝트는 도이치 포르충스게마인샤프트(SFB/TR 240, 프로젝트 번호 374031971, 프로젝트 INF)에서 J.B. 및 K.G.H.에 의해 지원되었다.

루돌프 버차우 센터의 재무 지원 및 기술 지원을 위한 핵심 유닛 형광 이미징에 감사드립니다. 또한, 우리는 철저한 증거 독서애쉬윈 발라크리슈난감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Telescope in 4f configuration with five lenses Qioptiq, Rhyl, UK G063126000 Optics
2x Band pass filters Brightline AHF, Tübingen, Germany HC 525/50 and HC 600/52 Filter
2x Dichroic beam splitter AHF, Tübingen, Germany HC BS F38-573 Filter
6-well culture plate Nunc Thermo Scientific (Waltham, USA) 140675 Reagent
Alexa Fluor 488 NHS Ester (green calibration standard) Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) A20000 Reagent
Alexa Fluor 568 NHS Eater (red calibration standard) Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) A20003 Reagent
ASI stage PZ-2000 XYZ Visitron Systems GmbH, Puchheim, Germany WK-XYB-PZ-IX71 Microscope Parts
Attofluor Cell Chamber, 35 mm diameter for  25 mm round coverslips Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) A7816 Glass coverslip holder
Avalanche photodiode Perkin Elmer (SPCM-AQR-14) Laser Components GmbH, Olching, Germany SPCM-AQR-14 Single photon counting detector
Beamsplitter Newport, Darmstadt, Germany 10FC16PB.3 Filter
Biorender (Software) Science Suite Inc - o/a BioRender (Toronto, Canada) --- Software used to create GPCR sketch, https://app.biorender.com/
Chinese hamster ovary (CHO) cell line ATCC CCL-61 Cell lines
ChiSurf (Data analysis Software) Thomas-Otavio Peulen, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, USA --- tttrlib-based software to analyze fluorescence correlation data and fluorescence decay histograms, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf
Tutorial: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&t=2s
Ref: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017)
Chloroform Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) 472476-2.5L Reagent
DMSO AppliChem GmbH (Darmstadt, Germany) A3672,0250 Reagent
DNA strand (40 bp fluorophore distance) IBA Lifesciences GmbH (Göttingen, Germany) --- Reagent, 5’ CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3’, 3’ GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5’
Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (with and without phenol red) GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) P04-41250, P04-41650 Reagent
Ethanol (absolute) Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) 34852-1L-M Reagent
Erythrosin B,Dye content >=95 % Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) 200964-5G Reagent, Instrument Response function, solve in EtOH to 10 mg/mL
Fetal Bovine Serum (FBS) Biochrom  (Berlin, Germany) S 0615 Reagent
Fluorescence Light Source X-Cite 120 Q Excelitas Technologies, Ontario, Canada XI120-Q-5060 Microscope Parts
Fluorescent SNAP-substrate cell : SNAP Cell TMR- STAR New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany) S9105S Reagent
Fluorescent SNAP-substrate surface : DY-549 New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany) S9112S Reagent
Glass coverslips (Dimensions: diameter 24 mm, thickness 0.13 - 0.16 mm) Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany) 111640 Reagent
Laser Controller Picoquant, Berlin, Germany 910020 (PDL 828-S "SEPIA II") Optics
Laser lines (480 nm and 560 nm) Picoquant, Berlin, Germany 912485 (LDH-D-C-485), 912561 (LDH-D-TA-560) Optics
Lipofectamine 2000 Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) 11668-019 Reagent
MFD suite (Software) AG Seidel, Heinrich-Heine-University Duesseldorf, Germany --- Software package for analysis of single-molecule fluorescence experiments including e.g. Kristine (correlation of tttr data), Burbulator (simulation of single-molecule experiment), https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis
Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25.4 mm Thorlabs, Bergkirchen, Germany AC254-150-A-ML Second part of Beam expander
Neubauer Chamber (deepness 0.1 mm) Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany) 640110 Reagent
Olympus IX 71 stand Olympus, Hamburg, Germany IX2-ILL100 Microscope Parts
Opti-MEM (Reduced-Serum Medium) GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) 31985-047 Reagent
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) 049M4857V Reagent
Phosphate-buffered Saline (PBS) GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) 14190144 Reagent
Pinhole (50 µM) Newport, Darmstadt, Germany PNH-50 Pinhole
PMT Hybrid-40 Picoquant, Berlin, Germany 932200 (PMA Hybrid 40) Single photon counting detector
Python scripts (Software) Katherina Hemmen, Rudolf-Virchow Center for Integrative and Translational Imaging, University Wuerzburg, Germany --- Collection of self-written Python scripts based on tttrlib (https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib) used to (1) determine the average count rates, (2) correlate the data and (3) build fluorescence decay histograms, https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS
Quad band beamsplitter (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1) AHF, Tübingen, Germany F73-421PH Filter
Single mode fiber polarization keeping, NA = 0.08 with collimator Picoquant, Berlin, Germany 02126 Optics
Sodium Hydroxide (NaOH) Carl Roth (Karlsruhe, Germany) 6771.1 Reagent
SymPhotime x64 Software (Data collection and data export software) Picoquant, Berlin, Germany 931073 (SPT64-1+2 single user ) Time-tag time-resolved (tttr) data collection at the self-built FCCS setup, data export
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system Hydraharp 400 Picoquant, Berlin, Germany 930010 (Hydraharp 400) Optics
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) T4299-100ml Reagent
Unmounted Achromatic Doublets, ARC: 400 - 700 nm, D=12.7 mm, F=-20 mm Thorlabs, Bergkirchen, Germany ACN127-020-A First part of Beam expander
Water immersion objective (UPlanSApo 60x/1.20 W) Olympus, Hamburg, Germany UPLSAPO60XW Objective

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hess, S. T., Huang, S. H., Heikal, A. A., Webb, W. W. Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: A review. Biochemistry. 41 (3), 697-705 (2002).
  2. Haustein, E., Schwille, P. Ultrasensitive investigations of biological systems by fluorescence correlation spectroscopy. Methods. 29 (2), 153-166 (2003).
  3. Bacia, K., Kim, S. A., Schwille, P. Fluorescence cross-correlation spectroscopy in living cells. Nature Methods. 3 (2), 83-89 (2006).
  4. Bacia, K., Schwille, P. Practical guidelines for dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nature Protocols. 2 (11), 2842-2856 (2007).
  5. Kohl, T., Heinze, K. G., Kuhlemann, R., Koltermann, A., Schwille, P. A protease assay for two-photon crosscorrelation and FRET analysis based solely on fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (19), 12161-12166 (2002).
  6. Sahoo, H., Schwille, P. FRET and FCS--friends or foes. Chemphyschem. 12 (3), 532-541 (2011).
  7. Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. Enzyme Kinetics by Isothermal Titration Calorimetry: Allostery, Inhibition, and Dynamics. Frontiers in Molecular Bioscience. 7, 583826 (2020).
  8. Yanase, Y., et al. Surface plasmon resonance for cell-based clinical diagnosis. Sensors (Basel). 14 (3), 4948-4959 (2014).
  9. Freedberg, D. I., Selenko, P. Live cell NMR. Annual Review of Biophysics. 43, 171-192 (2014).
  10. Nishida, N., Ito, Y., Shimada, I. In situ structural biology using in-cell NMR. Biochimica et Biophysica Acta General Subjects. 1864 (2), 129364 (2020).
  11. Schwille, P., Meyer-Almes, F. J., Rigler, R. Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy for multicomponent diffusional analysis in solution. Biophysical Journal. 72 (4), 1878-1886 (1997).
  12. Balleza, E., Kim, J. M., Cluzel, P. Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells. Nature Methods. 15 (1), 47-51 (2018).
  13. Haupts, U., Maiti, S., Schwille, P., Webb, W. W. Dynamics of fluorescence fluctuations in green fluorescent protein observed by fluorescence correlation spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (23), 13573-13578 (1998).
  14. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
  15. Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. Photodynamic properties of green fluorescent proteins investigated by fluorescence correlation spectroscopy. Chemical Physics. 250 (2), 171-186 (1999).
  16. Müller, B. K., Zaychikov, E., Bräuchle, C., Lamb, D. C. Pulsed interleaved excitation. Biophysical Journal. 89 (5), 3508-3522 (2005).
  17. Böhmer, M., Wahl, M., Rahn, H. -J., Erdmann, R., Enderlein, J. Time-resolved fluorescence correlation spectroscopy. Chemical Physics Letters. 353 (5), 439-445 (2002).
  18. Felekyan, S., Kalinin, S., Sanabria, H., Valeri, A., Seidel, C. A. M. Filtered FCS: Species Auto- and Cross-Correlation Functions Highlight Binding and Dynamics in Biomolecules. Chemphyschem. 13 (4), 1036-1053 (2012).
  19. Kapusta, P., Wahl, M., Benda, A., Hof, M., Enderlein, J. Fluorescence lifetime correlation spectroscopy. Journal of Fluorescence. 17 (1), 43-48 (2007).
  20. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool-understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  21. Elson, E. L., Magde, D. Fluorescence Correlation Spectroscopy .1. Conceptual Basis and Theory. Biopolymers. 13 (1), 1-27 (1974).
  22. Hendrix, J., Lamb, D. C. Pulsed interleaved excitation: principles and applications. Methods Enzymol. 518, 205-243 (2013).
  23. Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization. Biopolymers. 13 (1), 29-61 (1974).
  24. Thompson, N. L. Topics in Fluorescence Spectroscopy. Lakowicz, J. R. , Plenum Press. 337-378 (1991).
  25. Cole, N. B. Site-specific protein labeling with SNAP-tags. Current protocols in protein science. 73, 1-16 (2013).
  26. Petrásek, Z., Schwille, P. Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical Journal. 94 (4), 1437-1448 (2008).
  27. Siegel, A. P., Baird, M. A., Davidson, M. W., Day, R. N. Strengths and Weaknesses of Recently Engineered Red Fluorescent Proteins Evaluated in Live Cells Using Fluorescence Correlation Spectroscopy. International Journal of Molecular Sciences. 14 (10), 20340-20358 (2013).
  28. Peulen, T. O., Opanasyuk, O., Seidel, C. A. M. Combining Graphical and Analytical Methods with Molecular Simulations To Analyze Time-Resolved FRET Measurements of Labeled Macromolecules Accurately. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (35), 8211-8241 (2017).
  29. Wahl, M., Rahn, H. J., Gregor, I., Erdmann, R., Enderlein, J. Dead-time optimized time-correlated photon counting instrument with synchronized, independent timing channels. Review of Scientific Instruments. 78 (3), 033106 (2007).
  30. Wahl, M., et al. Scalable time-correlated photon counting system with multiple independent input channels. Review of Scientific Instruments. 79 (12), 123113 (2008).
  31. Price, E. S., Aleksiejew, M., Johnson, C. K. FRET-FCS Detection of Intralobe Dynamics in Calmodulin. The Journal of Physical Chemistry B. 115 (29), 9320-9326 (2011).
  32. Price, E. S., DeVore, M. S., Johnson, C. K. Detecting intramolecular dynamics and multiple Forster resonance energy transfer states by fluorescence correlation spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (17), 5895-5902 (2010).
  33. Margittai, M., et al. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (26), 15516-15521 (2003).
  34. Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318 (5854), 1258-1265 (2007).
  35. Manglik, A., et al. Structural Insights into the Dynamic Process of beta2-Adrenergic Receptor Signaling. Cell. 161 (5), 1101-1111 (2015).
  36. Olofsson, L., et al. Fine tuning of sub-millisecond conformational dynamics controls metabotropic glutamate receptors agonist efficacy. Nature Communications. 5 (1), 5206 (2014).
  37. Kalinin, S., Valeri, A., Antonik, M., Felekyan, S., Seidel, C. A. Detection of structural dynamics by FRET: a photon distribution and fluorescence lifetime analysis of systems with multiple states. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (23), 7983-7995 (2010).
  38. Hom, E. F. Y., Verkman, A. S. Analysis of coupled bimolecular reaction kinetics and diffusion by two-color fluorescence correlation spectroscopy: Enhanced resolution of kinetics by resonance energy transfer. Biophysical Journal. 83 (1), 533-546 (2002).
  39. Widengren, J., Schweinberger, E., Berger, S., Seidel, C. A. M. Two new concepts to measure fluorescence resonance energy transfer via fluorescence correlation spectroscopy: Theory and experimental realizations. Journal of Physical Chemistry A. 105 (28), 6851-6866 (2001).
  40. Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
  41. Briddon, S. J., Kilpatrick, L. E., Hill, S. J. Studying GPCR Pharmacology in Membrane Microdomains: Fluorescence Correlation Spectroscopy Comes of Age. Trends in Pharmacological Sciences. 39 (2), 158-174 (2018).
  42. Barak, L. S., et al. Internal trafficking and surface mobility of a functionally intact beta2-adrenergic receptor-green fluorescent protein conjugate. Molecular Pharmacology. 51 (2), 177-184 (1997).
  43. Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (2), 743 (2013).
  44. Nikić, I., Kang, J. H., Girona, G. E., Aramburu, I. V., Lemke, E. A. Labeling proteins on live mammalian cells using click chemistry. Nature Protocols. 10 (5), 780-791 (2015).
  45. Robert, T. Y., Haibing, T. Measuring protein dynamics in live cells: protocols and practical considerations for fluorescence fluctuation microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (9), 1-24 (2014).
  46. Felekyan, S., et al. Full correlation from picoseconds to seconds by time-resolved and time-correlated single photon detection. Review of Scientific Instruments. 76 (8), 083104 (2005).
  47. Forster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung Und Fluoreszenz. Annalen Der Physik. 2 (1-2), 55-75 (1948).
  48. Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. Fluorescence Correlation Spectroscopy of Triplet-States in Solution - a Theoretical and Experimental-Study. Journal of Physical Chemistry. 99 (36), 13368-13379 (1995).
  49. Chen, J., Irudayaraj, J. Fluorescence lifetime cross correlation spectroscopy resolves EGFR and antagonist interaction in live cells. Analytical Chemistry. 82 (15), 6415-6421 (2010).
  50. Stefl, M., Herbst, K., Rubsam, M., Benda, A., Knop, M. Single-Color Fluorescence Lifetime Cross-Correlation Spectroscopy In Vivo. Biophysical Journal. 119 (7), 1359-1370 (2020).
  51. Maeder, C. I., et al. Spatial regulation of Fus3 MAP kinase activity through a reaction-diffusion mechanism in yeast pheromone signalling. Nature Cell Biololy. 9 (11), 1319-1326 (2007).
  52. Christie, S., Shi, X., Smith, A. W. Resolving Membrane Protein-Protein Interactions in Live Cells with Pulsed Interleaved Excitation Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 53 (4), 792-799 (2020).

Tags

생화학 제178
살아있는 세포에서 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 역학을 연구하기 위한 이중 색 형광 교차 상관 분광법
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hemmen, K., Choudhury, S.,… More

Hemmen, K., Choudhury, S., Friedrich, M., Balkenhol, J., Knote, F., Lohse, M. J., Heinze, K. G. Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells. J. Vis. Exp. (178), e62954, doi:10.3791/62954 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter