Summary
我々は、現代の蛍光標識技術を用いて生細胞における膜受容体ダイナミクスを研究するために、フェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)と組み合わせた生細胞二重色蛍光相互相関分光(FCCS)を行う実験プロトコルとデータ分析ワークフローを提示する。
Abstract
我々は、現代の蛍光標識技術を用いて生細胞における膜受容体動態を研究するために、フェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)と組み合わせた生細胞二重色蛍光相互相関分光(FCCS)を行うプロトコルとワークフローを提示する。蛍光強度の変動がそれぞれの蛍光生体分子の動的な「指紋」を表すデュアルカラーFCCSでは、受容体の共拡散または結合をプローブすることができます。FRETは、分子距離に対する高感度で、分子内変化を監視する有名な「ナノルーラー」として機能します。一緒に考えて、立体構造変化と局所受容体濃度および移動性定数のような主要なパラメータは細胞の設定でアクセス可能になる。
高ノイズレベルとサンプルの脆弱性により、細胞内では定量的蛍光アプローチが困難です。ここでは、eGFPおよびSNAPタグタムラで標識された2-アドレナリン受容体(β 2 AR)を用いたデュアルカラー βを用いたキャリブレーションステップを含む、この実験の実施方法を示す。カスタマイズが容易なオープンソースソフトウェアとテンプレートを使用して、段階的なデータ分析手順を提供します。
このガイドラインにより、生細胞実験では信号対雑音レベルが限られているにもかかわらず、生体細胞内の生体分子の分子相互作用を高い信頼性 で 解明することができます。FRETの操作ウィンドウ、特に低濃度のFCCSは、生理学的条件に近い状態で定量的な分析を可能にする。
Introduction
蛍光分光法は、細胞内での摂動を最小限に抑えてタンパク質のダイナミクスとタンパク質とタンパク質相互作用を定量化する主な方法の1つです。共焦点蛍光相関分光法(FCS)は、分子動力学を単分子感受性、高選択的、および生細胞適合性1として解析する強力な方法の1つである。他のダイナミクス指向のアプローチと比較して、FCSは〜nsから〜sに及ぶより広範な測定可能な時間範囲を有し、最も重要なのは、イメージングベースの方法でアクセスできないことが多い高速時間スケールをカバーする。また、膜、細胞質、核分子動力学が容易に識別できるように空間選択性も提供する2。これにより、分子ブリンク、平均局所濃度、および拡散係数をFCSで定量的に解析することができる。結合などの分子間ダイナミクスは、二重色アプローチで蛍光相互相関分光法(FCCS)分析3、4、5における2つの分子種の共拡散を調べた場合に容易にアクセス可能になります。
相関分光法における主な根底原理は、蛍光標識された生体分子がレーザー焦点の出入りを拡散して放出する強度変動の統計分析である(図1A)。結果として得られる自動相関関数または相互相関関数は、曲線フィッティングによってさらに分析され、最終的に関心のあるレート定数を導き出すことができます。言い換えれば、FCSおよびFCCSの統計的方法は、単一粒子追跡のような単一分子トレースを提供するのではなく、高い時間分解能を有するプローブ標本の動的パターンまたは「指紋」を提供する。フェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)と組み合わせると、共焦点設定5,6において、立体構造変化などの分子内ダイナミクスを同時に監視することができる。FRETは2つのフルオロフォアの距離をプローブし、しばしば分子「ナノルーラー」と呼ばれます。エネルギー移動は、分子が近傍(<10nm)に位置する場合にのみ行われ、ドナーの発光スペクトルはアクセプター分子の吸収スペクトルと著しく重なり、ドナーとアクセプターの双極子配向が(十分に)平行である。従って、FRETとFCCSの組合せは非常に高い時空間分解能の技術を提供する。空間選択性、感度、生細胞適合性が必要な場合、FRET-FCCSは、等温滴定熱量測定(ITC)7、表面プラズモン共鳴(SPR)8、または核磁気共鳴(NMR)9、タンパク質ダイナミクスおよび相互作用を測定するための10のような他の方法よりも明らかに有利である。
デュアルカラー蛍光相互相関分光(dc-FCCS)の能力と約束にもかかわらず、ライブセルでdc-FCCSを実行することは、スペクトルブリードスルーまたはチャンネル3、4、スペクトル異なるレーザーライン3、4、11、バックグラウンド、またはノイズフォトのスペクトルに起因する共焦点ボリュームの違いにより技術的に困難です。 13、14、15。FCCSへのパルスインターリーブ励起(PIE)の導入は、チャネル16間のスペクトルクロストークを低減するための異なるレーザー励起を時間的に切り離す重要な調整であった。スペクトルブリードスルー17、18、19に対抗する他の補正方法および背景補正も17、18、19で十分に受け入れられている。FCS、PIE、FRET の詳細と基本については、読者は、次の参照先2、4、6、16、20、21、22、23、24を参照してください。
ここでは、プロトタイプGタンパク質共役受容体、β 2 -アドレナリン受容体(β 2 AR)の実験結果と共に必要なすべての較正実験および分析が提示され、(1)「緑」(eGFP)または「赤」(SNAPタグベースの標識)25フルオロフォアを持つ単一標識分子。(2)二重標識構造物で、N末端SNAPタグおよび細胞内eGFP(NT-SNAP)を有する[この場合、両方の標識が同じタンパク質である。したがって、100%の共拡散が予想される](3)二重標識サンプルで、両方の蛍光体が細胞膜の同じ側にある(CT-SNAP)。C末端のスナップタグと細胞内eGFPを搭載しています。ここで、再び両方の標識が同じタンパク質にあり、再び100%共拡散が予想される。両方のラベルが互いに非常に近く、細胞膜の同じ側に、FRETおよび反相関行動を観察する可能性を示す。全ての構成体は中国のハムスター卵巣(CHO)細胞でトランスフェクションされ、後にCT-SNAP構築物のNT-SNAP構築物に対して膜不透過性および膜透過性である赤色蛍光基質で標識された。最後に、シミュレーションデータは、FRET誘導の非相関に対する実験パラメータの影響と、タンパク質とタンパク質の相互作用が共拡散振幅に及ぼす影響を例示します。
したがって、このプロトコルは、技術的/物理的なアーティファクト、課題、および可能な解決策を認識しながら、タンパク質ダイナミクスとタンパク質とタンパク質相互作用を理解するために、生細胞で組み合わせたFRET-FCCSを実行するための完全なガイドを提供します。
Protocol
1. 実験プロトコル
- サンプル準備
注:無菌条件下で細胞の播種とトランスフェクションを行います。- 洗浄されたカバースリップを6ウェル培養プレートに入れ、滅菌リン酸緩衝生理食塩分(PBS)で3回洗浄します。
注: カバースリップクリーニングプロトコルについては、 補足ノート 1を参照してください。 - フェノールレッドを含む完全な細胞培養培地2mL(10%ウシ胎児血清(FBS)、100μg/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン)を加え、プレートを脇に置きます。
- CHO細胞を37°C及び5%CO2でフェノールレッドを含む同一培地で培養する。 5 mLのPBSで細胞を洗浄し、死んだ細胞を除去します。
- 2 mLのトリプシンを加え、室温(RT)で2分間インキュベートします。
- フェノールレッドを含む培地8mLで切り離した細胞を希釈し、ピペットで慎重に混ぜます。
- ノイバウアーチャンバー内の細胞を数え、カバーリップを含む6ウェル細胞培養プレートの1.5 x 10 5細胞/ウェルの密度で種子を入れます(ステップ1.1.1-1.1.2で作成)。
- 約80%の合流を達成するために、細胞を24時間インキュベーター(37°C、5%CO2)で増殖させます。
- 目的のベクターDNA(例えば、CT-SNAPまたはNT-SNAP)の2μgを2つの別々のチューブに希釈し、各ウェルに対して500μLの還元血清培地をそれぞれ含み、RTで5分間インキュベートする。
- 2つの溶液を混ぜ合わせてトランスフェクション混合物を得て、RTで20分間インキュベートします。
- その間に、播種したCHO細胞を滅菌PBSで一度洗います。
- 抗生物質を使わずに10%FBSを添加したフェノールの赤自由培地の1 mL/wellでPBSを交換してください。
- トランスフェクション混合物の全体を1 mLずつ各ウェルに滴下し、5%CO2で37°Cで一晩培養する。
- SNAP構成体の標識処理のために、適切なSNAP基板ストック溶液を1mLの培地に1mLで希釈し、10%FBSを加えて、1μMの最終濃度を得る。
- トランスフェクションした細胞をPBSで1回洗浄し、1 μMのSNAP基質溶液のウェルあたり1 mLを加えます。細胞を5%CO2で37°Cで20分間インキュベートする。
- 細胞をフェノールを赤く入れのない培地で3回洗い、1ウェルフェノールレッドフリー培地あたり2mLを加えます。細胞を37°Cで30分間5%CO2でインキュベートする。
- すべてのサンプルのカバーリップをイメージングチャンバーに移し、500 μLイメージングバッファで洗浄します。FRET-FCSセットアップに移動する前に、500 μLイメージングバッファを追加します。
- 洗浄されたカバースリップを6ウェル培養プレートに入れ、滅菌リン酸緩衝生理食塩分(PBS)で3回洗浄します。
- キャリブレーション測定
注:FRET-FCSのセットアップは、共焦点顕微鏡の水目的、2つのレーザーライン、時間相関単一光子計数(TCSPC)システム、2つのハイブリッド光増倍管(PMT)および2つのアバランシェフォトダイオード(APD)を備えており、フォトン収集およびデータ収集ソフトウェアを提供します。ライブセル測定の前に毎回セットアップを調整することが非常に重要です。詳細なセットアップの説明は 、補足注 2を参照してください。すべての測定は同じ条件下で行う必要があるので、測定の間はレーザーおよびすべての検出器(2つのPMTおよび2つのApD)は常にONである。キャリブレーション測定では、細胞が播種されたロットと同じカバースリップを使用し、カラーリング補正の変動を減少させます。- 焦点、ピンホール、カラーリング位置を調整するには、ガラスカバースリップに2 nMグリーンキャリブレーションソリューションを配置し、485 nmと560 nmレーザーを切り替えます。パルスインターリーブ励起(PIE)モード16でレーザーを操作します。
- 溶液に焦点を合わせ、最大の分子輝度を得るために最高のカウント率と最小の共焦点量が得られるようなピンホールと襟リング位置を調整します。
- 10 nM の赤色キャリブレーション溶液と、緑と赤色のキャリブレーションソリューションの両方を混合して、赤チャネルに対してこのプロセスを繰り返します。
- ガラスカバースリップの上に10 nM DNA溶液を置き、緑と赤の検出チャネル間の相互相関が最も高い、すなわち、最も高い振幅を示すように焦点、ピンホール、および首輪リング位置を調整する。
注: 手順 1.2.1 と 1.2.4 は、最適な位置合わせを見つけるために、前後に繰り返し行く必要があります。焦点、ピンホール、およびカラーリング位置が緑と赤の検出チャネルと共焦点のオーバーラップボリュームに合わせて最適に整列した後、30 s~ 120 sの各キャリブレーションソリューションから3-5の測定を行います。 - ddH2O、撮像媒体、および非トランスフェクション細胞をそれぞれ30~120sで3~5回測定し、バックグラウンドカウント率を決定する。
- 30 s - 120 s の 3- 5 の測定で計器応答関数を収集します。これはオプションですが、強くお勧めします。
- ライブセル測定
- 水銀灯で照らして眼球を観察することで、適切な細胞を見つけます。
注:適切な細胞は、それぞれの接着細胞株の典型的な形態を示す生きている。対象となるタンパク質の蛍光は、ここで表面受容体であり、表面全体に見える。低い数の分子が焦点を合わせるときFCSのより良いコントラストのために明るい細胞より少ない明るい細胞はより適している。 - PIEモードで両方のレーザーをオンにし、毎秒最大カウントを見て膜に焦点を当てます。
メモ:レーザーパワーは、細胞サンプル(目標で5μW未満)のために減らす必要があるかもしれません。これは、使用される蛍光ホルとセットアップに依存します。 - データ収集ソフトウェアのオンラインプレビューで、β 2 ARに取り付けられたeGFPまたはラベル付きSNAPタグの自動相関曲線とクロス相関曲線を観察し、60-180秒の取得時間を持ついくつかの短い測定値(〜2-10)を収集します。
注:蛍光色素が漂白する可能性があるため、細胞を長時間連続的に励起しないでください。ただし、各セルの明るさ、測定の長さ、および合計で実行できる測定の数によって異なります。
- 水銀灯で照らして眼球を観察することで、適切な細胞を見つけます。
2. データ分析
- データエクスポート
- すべての測定値から相関曲線G(tc)とカウントレート、CRをエクスポートします。
- 「プロンプト」と「遅延」の時間枠を正しく定義し、データ相関ソフトウェアの「マイクロタイム・ギャティング」オプションを使用するように注意してください。
注:合計で、3つの異なる相関が必要です:(1)プロンプトタイムウィンドウ(ACFgp)、(2)遅延時間ウィンドウ内の赤チャネルの自己相関(ACFrd)、最後に(3)遅延時間ウィンドウの赤チャネル信号との緑色チャネル信号の相互相関(CCFPIE)データエクスポートは、補足ノート 3でさまざまなソフトウェアのステップバイステップで示されています。
- キャリブレーション測定
- 緑(ACFgp) と赤 (ACFrd) フルオロフォア溶液の自己相関関数を使用し、必要に応じて追加のトリプレット項 (eq. 1) を持つ 3D 拡散モデルに適合させ、2 つの使用カラー チャネルの共焦点検出ボリュームの形状とサイズを調整します。
eq. 1
ここで、bは曲線のベースラインであり、Nは焦点中の分子数、tD拡散時間(ms)、s=z0/w0は共焦点ボリューム要素の形状因子である。 三重項点滅または他の光物理学は、その振幅Rと緩和時間tRによって記述される。
注: プロトコル内で使用されるすべての変数とシンボルは、表 1 にリストされています。 - 緑色26と赤色のキャリブレーション規格27に対して公知の拡散係数Dを使用し、得られた形状因子の緑と赤を使用して、共焦点ボリューム要素の寸法(幅w0および高さz0)および体積Veff(eq. 2a-c)を決定する。
eq. 2a
eq. 2b
eq. 2c
注:キャリブレーションパラメータの計算のためのテンプレートは、補足ファイル(S7)として提供されています。 - 緑色蛍光信号(チャンネル0と2で収集)のスペクトルクロストーク α を、赤色検出チャネル(チャンネル番号1および3)に、背景補正(BG)信号の比(eq. 3)として計算します。
eq. 3 - ドナー励起 波長によるアク セプター蛍光δの直接励起を決定する場合、"プロンプト"タイムウィンドウにおける赤色較正測定の背景補正率(緑色レーザーによる励起)から「遅延」時間ウィンドウ(赤レーザーによる励起)におけるバックグラウンド補正されたカウントレート(eq4)
eq. 4 - 緑色と赤色の蛍光色素(eq. 5a-b)の分子明るさ B を、3D拡散フィット(eq. 1)から、背景補正された数と、得られた焦点の分子数 Nに基づいて計算します。
eq. 5a
eq. 5b - ACFgpとACFrdの両方を3D拡散モデルに合わせる(eq. 1)。取得した形状因子、緑色と赤、ACFgpとACF rdをそれぞれ一定に保ちます。CCFPIEのシェイプファクターは、通常、この 2 つの値の間にあります。
注:理想的なセットアップでは、Veff、緑、Veffの両方で、赤は同じサイズで完全に重なっています。 - 焦点の分子の見かけの数の発見値に基づいて、ゼロ相関時間(G0(tc)で振幅を決定する(N緑、N赤、NPIE)。
- 緑と赤のフルオロフォアの100%共拡散を伴うサンプルの振幅比rGRおよびrRGを計算する(eq. 6)。NPIEは、焦点を合わせて二重標識分子の数を反映するのではなく、1/G0(tc)のみを反映していることに注意してください。
および eq. 6
- 緑(ACFgp) と赤 (ACFrd) フルオロフォア溶液の自己相関関数を使用し、必要に応じて追加のトリプレット項 (eq. 1) を持つ 3D 拡散モデルに適合させ、2 つの使用カラー チャネルの共焦点検出ボリュームの形状とサイズを調整します。
- ライブセル実験
- 単一ラベル構造の場合は、セルサンプルを適切なモデルに適合させます。示された膜受容体については、拡散は短く、長い拡散時間を伴うバイモーダルな方法で起こる。さらに、蛍光体の光物理学とまばたきは考慮する必要があります:
eq. 7
ここで、td1およびtd2は、2つの必要な拡散時間であり、1は第1の拡散時間の分率である。
注:自由な色素とDNA鎖が自由にすべての方向に拡散するキャリブレーション測定とは対照的に、膜受容体は細胞膜に沿って2D拡散のみを示します。3D 拡散と 2D 拡散の違いは、2D ケースの tDが共焦点体積要素の形状係数 s に依存しない、変更された拡散項(比較 eq. 1)によって反映されます。 - 基本的な数学を使用して、それぞれのNおよびVeffから緑色または赤色の標識タンパク質の濃度cを計算します(eq. 8):
eq. 8
ここでNA = アボガドロの番号 - N末端SNAPラベルおよび細胞内eGFPの場合、2つのADF(eq.7)の単一標識構造とCCFPIEの場合と同じモデルを使用して、二重標識サンプルの2つの自己相関(ACFgpおよびACFrd)を二相拡散モデル(eq.9)を使用して適合させます。
eq. 9
注: システムのグローバルな説明では、3 つの曲線すべてを合わせてフィットする必要があります: 拡散項は 3 つのカーブすべてで同じで、唯一の違いは CCFPIEの緩和項です。2つの蛍光体の光物理学は、通常は無関係であるため、相関項は必要ありません。この緩和項の欠如は、短い相関時間でフラット CCFPIE をもたらす。しかし、ドナー蛍光色素によるアクセプターのクロストークと直接励起は、偽陽性の振幅を示す可能性があり、キャリブレーション測定を使用するために慎重にチェックする必要があります。 - 式8を用いて、それぞれのNおよびVeffから緑色または赤色標識タンパク質の濃度cを計算する。
- DNAサンプルから得られた補正因子を用いて細胞サンプルから緑色および赤色の標識タンパク質と相互作用する画分または濃度を推定し、細胞試料の振幅比rGRおよびrRGとそれぞれの得られた濃度(eq.
そしてeq. 10 - C末端SNAPラベルおよび細胞内eGFPの場合、FRETサンプルの2つの自己相関(ACFgp および ACFrd)を単一標識サンプル(式7)として適合し 、CCFFRET を反相関項を含む二様式拡散モデル(式11)に適合させる
eq. 11
ここでfは、全反相関の振幅を反映し、RとtRはそれぞれの振幅と緩和時間を反映する。
注:FRETによる抗相関蛍光変化の場合、1つまたは複数の反相関項が必要になる(eq. 11)、その結果、2つの自己相関の上昇と一致する低相関時間で CCFFRET の「ディップ」が生じる(ACFgp および ACFrd)。ただし、三重点滅などの光物理学は、FRET誘導の反相関を減衰させることによって、反相関項を隠す可能性があることに注意してください。フィルター処理された FCS メソッドを補完する共同分析は、反相関項のマスク解除に役立つ場合があります。さらに、ナノ秒範囲の計数エレクトロニクスの死んだ時間に起因する技術的なアーティファクトは、16を除外する必要があります。ChiSurf28 で分析を実行する方法と共焦点量または分子明るさの計算のためのテンプレートを実行する方法に関するより詳細なステップバイステップの手順は、Githubリポジトリ(https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS)と補足ファイルとして提供されています(補足ノート4 と 補足ノート6)。さらに、.ptu形式でSymphotimeソフトウェアで取得したデータを一括エクスポートするためのpythonスクリプトが見つかります。
- 単一ラベル構造の場合は、セルサンプルを適切なモデルに適合させます。示された膜受容体については、拡散は短く、長い拡散時間を伴うバイモーダルな方法で起こる。さらに、蛍光体の光物理学とまばたきは考慮する必要があります:
eq. 1
eq. 2a
eq. 2b
eq. 2c
eq. 5a
eq. 5b
および eq. 6
eq. 7
eq. 8
eq. 9
そしてeq. 10
eq. 11Representative Results
較正および生細胞測定の例示的な結果は、以下で議論される。さらに 、CCFPIE 振幅を増加させるタンパク質とタンパク質相互作用の効果に続くシミュレートされたデータに基づいて、相互相関曲線に対するFRETの効果が実証されています。
PIE ベースの FCS データエクスポート
PIE実験では、タイムタグ時間分解モード(TTTR)29,30でデータが収集されます。図1Bは、記載された設定上の二重標識DNA鎖のPIE測定のフォトン到着時間ヒストグラムを示す(補足注1)。セットアップには 4 つの検出チャネルがあります。蛍光放射は、まず「S」と「P」方向の偏光によって分割されます(光波の電界が振動している垂直および平行面を指します)。次に、検出前に偏光の方向を 2 つのカラー チャネル(緑、赤)に分割し、4 つのチャンネル(S-green、S-red、P-green、P-red)を生成します。「プロンプト」タイムウィンドウでは、緑色の蛍光素が励起され、FRETによる緑と赤の両方のチャンネルで信号が検出されます。遅延時間ウィンドウでは、赤色の蛍光素のみが表示されます( 赤チャネル内)。検出チャネルと「プロンプト」と「遅延」タイムウィンドウに基づいて、少なくとも5つの異なる相関曲線(3つの自己相関曲線(ADF)および2つの相互相関曲線(CCF))が得られる(図1C-D):(1)プロンプト時間枠(ACFgp)の緑色の信号(FRET、ACF rpの場合) (3) 遅延時間ウィンドウ内の赤色の信号 (ACFrd)これらのADFは、タンパク質移動度、光物理学(例えば、三重点滅)および蛍光性蛍光体の他の時間相関性の明るさ変化(FRETによるものなど)について報告する。(4)遅延時間ウィンドウ内の赤色信号を用いたプロンプトタイムウィンドウにおける緑色信号のPIEベースの相互相関CCFPIEにより、緑と赤色のフルオロフォア16の共拡散の割合を求める。(5)プロンプトタイムウィンドウ内の赤色信号を伴う緑色のFRETベースの相互相関CCFFRETは、FRET誘導、緑および赤色信号31、32、33における反相関輝度変化に関連している。
図1:パルスインターリーブ励起(PIE)ベース蛍光(十字)相関分光(F(C)CS)(A)において、FCSでは蛍光標識分子は、この小さな体積内で蛍光を誘発する焦点を合わせたレーザービームによって形成された(回折限定の)焦点体積に自由に拡散する。その結果、体積に出入りする分子の強度変動が相関し、分子の移動度に関する情報を提供します。(B) PIEでは、2つの異なる蛍光体(緑色」と「赤」)で標識されたサンプルを励起するために、2つの異なるレーザーライン(「プロンプト」と「遅延」)が使用されます。両方の励起パルス間の時間差は、他方が励起される前に一方が減衰するように、それぞれの蛍光の寿命に適応される。示されている二重標識サンプルでは、両方のフルオロフォアが「緑色」ドナー蛍光機から「赤」アクセプターフルオロフォアにフェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)を受けるのに十分近い。したがって、赤色蛍光発光は、緑色ドナーの励起時に「迅速な」時間枠で検出することができる。使用されるセットアップ(補足注2)では、各色に対して2つの検出器が使用され、励起ビームの向き("p"と示される)と第2の垂直("s"と示される)に平行に向けられた1つの検出器が使用されます。(C) PIE実験では、3つの異なる自己相関関数を決定することができます:i)グリーンチャネル信号の相関をプロンプトタイムウィンドウ(ACF gp)、ii)プロンプトタイムウィンドウ(ACFrp)およびiii)の赤色チャネル信号で、遅延時間ウィンドウ(ACFrd)に赤色チャンネル信号を入力します。(D) 2つの異なる相互相関関数を決定することができます: iv) 「PIE」相互相関(CCFPIE) のプロンプトタイムウィンドウの緑色のチャネル信号と、遅延ウィンドウの赤チャネル信号と相関し、この曲線の振幅がフルオロフォアの同時拡散に関連する。v) プロンプト時間枠内の緑色のチャネル信号との "FRET" 相互相関 (CCFFRET) が同じプロンプトウィンドウ内の赤チャネル信号と相関する。ここで、この曲線の形状は拡散よりも速い時にFRET誘導強度変化に関連している。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
キャリブレーション
図2A-Bは、それぞれ緑色と赤色の蛍光色素を1度拡散した検光量測定を示す。eq. 1と既知の拡散係数D緑色26及びD赤色27との適合度に基づいて、検出体積の形状(z0及びw0)及びサイズ(Veff)をeq. 2a-cを用いて算出する。赤色蛍光素から緑色蛍光素とACFrdからのACF gpからの適合結果を図2Cに要約する。両方のフルオロフォアは、それぞれ8.6 μs(18%)と36 μs(15%)の追加の緩和時間定数を示します。緑色と赤色のフルオロフォアの分子明るさ(eq. 5a-b)は、それぞれ1分子当たり12.5kHz、分子当たり2.7kHzに相当します。
共焦点の容積サイズと形状、および分子輝度の信頼性の高い推定のために、キャリブレーション実験およびすべての反復の関節(またはグローバル)適合ごとに3〜5の測定を行うことを推奨します。
この蛍光色素対のクロストークα(図2D、eq.3)と緑レーザー δによるアクセプタの直接励起(図2E、eq.4)は、それぞれ〜38%〜〜15%である。
図2:緑と赤の校正基準を自由に拡散する口径測定(A-B)2nMグリーン(A)と10nM赤色(B)の測定を行い、3D拡散モデルに適合するキャリブレーション標準測定(eq.パネルの表(C)は、eq. 2a-cおよびeq. 5a-bに基づく適合結果と派生パラメーターを示しています。*拡散係数は文献26,27から取られた。(D) 緑色信号の赤いチャネルへのクロストークαの決定 (eq. 3)緑色標準の励起スペクトルはシアンで示され、発光スペクトルは緑色である。485 nm(青)と561 nm(オレンジ)の励起レーザラインは、破線で示されています。透明な緑色およびマゼンタボックスは、収集された放出範囲を示す(補足注 2)。(E)485nmレーザーによる赤色蛍光色素の直接励起δの測定(eq. 4)。カラーコードは(D)、明るいオレンジと濃いオレンジ色と同一で、それぞれ赤色標準の励起スペクトルと発光スペクトルを示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
緑と赤色の励起体積の重なりを決定し、較正するために、上述のように二重標識DNA二重鎖(図3A)を用いる。ここで、フルオロフォアは、DNA二重鎖の末端に付着した緑色と赤色のフルオロフォアの間にFRETが発生し得ないような間隔を40bp離した。図3Bは、緑色のフルオロフォア(ACFgp)とマゼンタ(ACFrd)およびPIE-相互相関CCFPIEの両方からの自己相関をシアンで示しています。CCFPIEの場合、プロンプトタイムウィンドウの緑色チャンネルの信号は、遅延時間ウィンドウ16の赤チャンネルの信号と相関していることに注意してください。
ここで、DDNA=77μm²/sのDNA鎖に対する平均拡散係数が得られる。計算の詳細については、ステップバイステップのプロトコルである補足ノート4を参照してください。この値は、較正された緑色および赤色の検出容積サイズ(図2)と、DNA鎖のACFgpおよびACFrdのそれぞれの拡散時間(図3C)を式2aに挿入することによって得られる。次に、得られた補正値rGRおよびrRGを使用し、後でeq.6を使用して、共拡散の量、すなわち、二重標識分子(または2つの異なるタンパク質の共トランスフェクションの場合のタンパク質複合体)を細胞試料から求めることができる。
図3:DNAサンプルを用いた緑と赤色の重なり容積の較正( A) 較正に使用されるDNA鎖は、緑と赤色の校正フルオロフォアを運び、その間に40 bpの距離を持つ。この間の距離は、フルオロフォア間のFRETを除外するのに十分な大きさでなければならない。(B)10nMDNA溶液の60sの測定を代表する。緑色のフルオロフォア(ACFgp、緑色標準)とマゼンタ(ACFrd、赤色標準)およびPIE相互相関CCFPIE(青)の両方からの自己相関。パネル内の表(C)は、付加的な緩和項(eq.1)およびDNAの導出パラメータ拡散係数を含む3D拡散モデルに基づく適合結果を示し、DDNA(eq. 2a)、オーバーラップ体積の大きさと形状(eq. 2a-c)および補正比rGRおよびr RG(eq6)を含む。).緑と赤の検出ボリューム(*で示される)の値は、図2に示す個々のフルオロフォアの適合から取られたことに注意してください。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
生細胞実験
以下のセクションでは、2つのAR構成体の異なるβの生細胞実験の分析を提示する。β 2ARが膜タンパク質であるように、その拡散は、細胞膜に沿って二次元拡散(図4A)に限られる(膜との間の輸送またはリサイクルプロセスを除く) 2。2D拡散に制限がある場合、eq.1における形状係数s=z0/w0は廃止され、拡散モデルが簡略化される(eq. 9)。
シングルラベル構造: β2AR-IL3-eGFP および NT-SNAP-β2AR
図4は、単一標識構造β 2AR-IL3-eGFP(図4B)の例示的な測定を示し、そこでeGFPが細胞内ループ3に挿入され、構造NT-SNAP-β 2 AR(図4C)、スナップタグがβ 2ARのN末に結合する。SNAPタグは、膜不透過性のSNAP表面基板でラベル付けされています。代表曲線は、それぞれ120〜200sの取得時間を有する4〜6回の繰り返し測定の平均を示す。eGFPおよびSNAP信号のACFgpおよびACFrdのそれぞれの自己相関は、二相性、二次元拡散モデル(eq.9)に適合する。高速ダイナミクスの点では、eGFPはtR1〜9 μsで予想される三重項点滅のみを示し、SNAP信号は2回の緩和時間を必要とします。
生きている細胞における蛍光色素の分子明るさは、与えられた励起条件(eqs. 5a-b)の下で、1分子当たり0.8 KHz(eGFP)および1.7kHz(SNAP)である。標識β 2AR構成体の濃度は、ナノモル範囲に収まるべきであり、eq8を用いて、平均分子数(eq.9、図4C)および緑と赤色チャネルのそれぞれの共焦点体積の大きさによって決定することができる。
図4:単一標識構築物の代表的な測定を行った β。検出容積を通して自由に浮遊する検光に用いられるフルオロフォアやDNA鎖とは対照的に、膜タンパク質は主に膜に沿って横方向に拡散し、2次元拡散と呼ばれる。(B, D)シングル・ラベルのACFgpおよびACFrd は、2AR-IL3-eGFP (B) および NT-SNAP-β2AR (D) をβします。図は、120~200sで収集した4~6の測定値の平均です。パネルの表(C)は、追加の緩和項を含む二相的な2次元拡散モデルへのデータの適合結果を示す(eq. 7)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ダブルラベル構造: NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP
二重標識構造NT-SNAP-β 2AR-IL3-eGFP(短いNT-SNAP)では、eGFPが細胞内ループ3に挿入され、そして、スナップタグがβ 2ARのN末に結合した(図5A)。この構成では、eGFP は膜の内側にあり、外側のスナップは FRET の距離が長すぎます。理想的な場合には、この構成体は、緑と赤のフルオロフォアの100%の共拡散を示し、FRET信号を示さない。図5B-Dは、2つの異なる測定日における2つのセルにおけるNT-SNAPの2つの測定値を示す。図5Bに示す「より良い」測定値のACFgpとACFrdをeq.9と共にフィッティングすると、ACF gpとACFrdに焦点を当てた50~60分子が明らかになり、NアプリはCCFPIE(図5C)に1/G0(t c)~114).標識された受容体の濃度は、eq. 8で決定される〜100 nMの範囲にある。二重標識分子の平均濃度を求めるには、まず、CCFPIEのG0(tc)(1/N(app))とACF gp及びACF rdの比をそれぞれ、算出する(eq. 6)。次に、これらの値は、rGRcell=0.43およびrRGcell=0.53と、この測定日のDNA測定から得られた値(rGR,DNA=0.51およびr RG,DNA=0.79)と比較される。プロポーションの規則を用いて、eGFP信号のACFgpからのrGRcell=0.43は、0.84の共拡散(rGRcell/rGR,DNA)の一部に反映され、SNAP基板信号のACFrdの他の場合、この値は0.67に相当する。二重標識NT-SNAP構成の平均濃度は、最終的にeq. 10に基づいて計算することができます。これに対し、別の日から図5Dに示す測定では、受容体の濃度が非常に低く、データが非常に騒々しく、適合範囲が10μsまで制限される。また、少量の共拡散(15~26%)しか観察されない。
図5:二重ラベル付きNT-SNAP-β 2 AR-IL3-eGFPコンストラクト(A)二重標識構造では、eGFPが細胞内ループ3に挿入され、β 2 AR(NT-SNAP)のN末に取り付けられたSNAPタグが挿入される。(B, D)ACFgp、ACF rdおよびCCFPIEは、二重標識構造の2つの測定値を測定した。データは、二重モードの2次元拡散モデル(eq.9、CCF PIE)に適合し、追加の緩和項(eq.7、ACF gpおよびACFrd)を含む。パネル内の表(C)は、適合結果と導出されたパラメータ濃度(eq.8)、相関相関時間ゼロ(G0(tc))における相関振幅の比と共拡散分子の割合(eq. 10)を示す。測定は異なる日に取得されたので、振幅補正のためのわずかに異なる要因が使用されたことに注意してください(B:r GR、DNA = 0.51およびrRG、DNA = 0.79;D: rGR,DNA = 0.51 およびrRG,DNA = 0.56)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
FRET を受ける二重標識構造: β 2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP
二重標識構造β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP (図 6A))では、eGFP は、C 末に取り付けられた SNAP タグ付きの NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP コンストラクトと同一の細胞内ループ 3 に挿入されます。ここで、両方の標識は細胞の形質膜の同じ側にあり、蛍光体が近傍に入るようにして、FRETが焼入れeGFPの寿命で示されるように生じることとなる(補足注5)。C末流34およびGPDR35の少なくとも2つの異なるタンパク質立体構造、「高FRET」(HF)または「低FRET」(LF)のような比較的非構造化タンパク質領域の柔軟性を考慮すると、eGFP-SNAP距離変化によるFRET効率の動的変化を観察し、CCFFRETの抗相関項(図6Bのオレンジ曲線のオレンジ)によって同定することができた。).FRETの変動は、受容体がHFまたはLFのいずれかである一度に1つの状態にしかなることができないので、反相関であることが示されている。5つの相関曲線(図6B)の関節(またはグローバル)適合は、〜100 msでゆっくりと拡散分子の70%〜70%を明らかにし、残りは〜1ミリ秒で拡散する。すべての自己相関とCCFFRETは、37 μsおよび3 μsで緩和項を示します。赤信号によって支配されたこれらの相関(ACFrp、ACF rdおよびCCFFRET)は、追加の遅い成分〜50 ms(図6C)を示す。
異なる条件下でのCCFFRETのFRET誘導変化(図6D)は、LF状態とHF状態の間の変動時間が70μの2状態システムの一連のシミュレーションによって実証されています。LF から HF 状態に切り替えると、反相関信号の変化がプロンプトタイム ウィンドウで観察されます: 緑色の信号が減少し、赤信号が増加します (逆に HF-> LF スイッチングの場合も同様です)。HF-LF切り替えが拡散時間よりも速いタイムスケールで起こる場合、つまり、焦点中の分子の滞留時間中に、その速度はCCFFRET6、31、36における抗相関から導き出すことができる。FCSでは、拡散時間よりも遅い動的プロセスは観察できませんのでご注意ください。
このデモでは、2 つの異なる FRET シナリオが想定され、2 つの状態間の FRET 効率の中程度または最大の変化が示されました。シミュレーションはバービュレーター37を用いて行い、三重項点滅の不在または存在を考慮し、赤色チャネルへのドナークロストークの量を増加させる。拡散項は、tD1=1msで30%の高速拡散分子を有する双性分布としてモデル化し、残りの分子はtD2= 100msでゆっくりと拡散する。合計で、107フォトンがw 0 = 0.5 μm、z 0 = 1.5 μm、ボックスサイズ20、N FCS = 0.01の3Dガウス形のボリュームでシミュレートされました。
図6E-Fは、中程度のFRET誘発相関CCFFRET(図6E)および最大FRETコントラスト(図6F)が存在しない場合のシミュレーション結果(実線)および三重項点滅(破線)の存在を示しています。FRET誘導抗相関は図6Fで容易に見ることができる。三重化状態を追加すると「減衰」効果により、相関振幅(図6E-F)38,39 が減少する。
図6:動的FRETを示す二重標識サンプルのシミュレーション(A)細胞内ループ3に挿入βされたeGFPとC末端SNAPタグを有する2ARのダブルラベル付き。両方のフルオロフォアはFRETを受け、受容体がタンパク質ダイナミクスを受けた場合、FRET効率の変化を示すのに十分近いです。(B) 自己相関 (ACFgp, ACFrpおよびACFrd) eq. 7) と交差相関曲線(CCFFRET (eq. 7) およびCCFPIE (eq. 9) の測定例を示す。パネルの表(C)は、適合結果を示しています。(D-F)実験パラメータが予想されるに及ぼす影響を示すために、FRET誘発性非相関項、12のシミュレーションを実施し、FRET効率の変化(小さいまたは大)、アクセプターチャネルへのドナークロストークの異なる量(0%、1%または10%)および三重瞬きの不在および存在をモデル化した。両方のFRET状態の平衡分率は50:50と仮定され、それらの為替レートは得られた緩和時間t R = 70 μsになるように調整した。シミュレーションの詳細はテキストに表示されます。(E) CCFFRETのシミュレーション結果は、適度なFRETコントラストを有し、クロストーク(ダークオレンジ)、クロストーク(オレンジ)1%、クロストーク10%(ライトオレンジ)がない場合。実線は、トリプレットの存在下で三重線、破線が存在しない結果を示す。(F)最大のFRETコントラストを有するシミュレーション結果のCCF FRET。カラーコードは(E)と同じです。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
しかし、実験条件に最も類似したシミュレーション(α=10%、15%の三重線点滅および中程度のFRETコントラスト、図6Eの黄色の破線)では、非相関項はほぼ減少する。図7は、蛍光寿命相関分光法(FLCS)17、19または種フィルタFCS(fFCS)18を用いて、光子到着時間ヒストグラムに符号化された情報(すなわち蛍光寿命)を用いてこの模擬データを分析した結果を示す。ここで、既知のHFおよびLF種の蛍光寿命(図7A)は、相関手順中に適用される重み又は「フィルタ」(図7B)を生成するために使用される。得られた種-自己相関曲線と交差相関曲線(図7C-D)では、この非相関性が明確に観察される。
図7:寿命フィルタFCSは、CCFFRETにおけるFRET誘導抗相関をマスキングする高いクロストーク、有意な三重項まばたきまたは他の光物理学的または実験的特性を有するサンプルにおけるFRET効率のタンパクダイナミクスベースの変動を明らかにするのに役立つ。ここで、10%クロストークと5%三重点滅を含むシミュレーションに対して図6Eに示すデータに対するアプローチを例示する。(A)2つのFRET種(それぞれ高低FRETの光と濃緑色)およびIRF(グレー)の蛍光強度減衰パターンを正規化した。並列検出チャネルのパターンは、垂直検出チャネルの実線、破線で示されます。(B)(A)に示すパターンに基づいて重み付け関数または「フィルタ」が生成されたのは、カラーコードが(A)と同一である。緑検出チャネルの信号のみ、したがってFRET誘発ドナーの消音のみが考慮されることに注意してください。(C)4つの種選択的相関が得られる:低FRET状態(sACFLF-LF、濃緑色)と高いFRET状態(sACFHF-HF、ライトグリーン)の種自己相関と、低FRETと高FRET状態(sCCF LF-HF、濃橙色)と(sCCF HF-LF)の間の2種の相互相関(sCCFLF-LF-LF-LF)および逆(sCCF HF-LF-LF) 、オレンジ色)。sCCF は μs 範囲の反相関を明確に示しています。黒い破線はフィット感を示します。sACF はeq. 9および sCCF とeq. 11と合わせていました。パネルの表 (D) に適合結果が示されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
タンパク質とタンパク質の相互作用(PPI)を研究するためのCCFPIE振幅
最後に、生細胞におけるPIEベースのFCSの一般的な使用例は、2つの異なるタンパク質間の相互作用を研究することです。ここで、読み出しパラメータは、CCFPIEの振幅、またはCCF PIEの振幅に対する自己相関振幅ACFgpおよびACF rdの比である。CCFPIEに対する共拡散の増加の効果を示すために、2つのAR-IL3-eGFPとNT-SNAP-β 2 AR β 2つの単一標識構造に基づいてシミュレーションが行われている(図8A)。図8Bは、共拡散分子の分画が0%から100%に変化した場合にCCFPIEの振幅がどのように増加するかを示す。遅延時間ウィンドウの赤チャネルに緑色の信号の1%のクロストークが追加され、上記のようにモデル化された拡散成分が追加されました。
図8: CCFPIEを用いて2つのタンパク質の相互作用を研究することができるが、ここでは、NT-SNAP-β 2 AR("赤"SNAP-ラベルを持つ)を用いたβ 2AR-IL3-eGFPの共同トランスフェクション研究を模擬した。(B)共拡散分子の増加量(0%(濃い青色)->100%(水色))の振幅G(tc)が増加する。拡散項は、tD1=1msで30%の高速拡散分子を有する双性分布として再びモデル化され、残りの分子はtD2=100msでゆっくりと拡散した。さらに、赤遅延時間ウィンドウに緑色信号の1%クロストークが追加されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 記号 | 意味 (共通単位) | |||
| α | 緑色の発励後の緑色蛍光色素のクロストーク (%) | |||
| a 1 | 膜受容体のバイモーダル拡散モデルにおける第1拡散成分の分画 | |||
| f | 非相関項の総振幅 | |||
| A R | 光物理学/三重点滅の振幅 | |||
| b | 相関曲線のベースライン/オフセット | |||
| B | フルオロフォアの分子明るさ((キロ)数/分子数と秒 | |||
| BG | 背景(例えば、適切な参照サンプルから:ddH2O、バッファ、未感染細胞など) | |||
| c | 濃度 | |||
| CR | カウントレート(KHzまたは(キロ)カウント/秒 | |||
| δ | 緑色の励起後の赤色蛍光色素の直接励起(%) | |||
| D | 拡散係数(μm²/秒) | |||
| G(tc) | 相関関数 | |||
| N | 焦点を合わせる分子の数 | |||
| NA | アボガドロの番号 (6.022*1023 Mol-1) | |||
| rGR、rRG | PIEベースの相互相関関数に対する緑または赤の自己相関関数の振幅比 | |||
| s | 共焦点体積要素の形状因子 | |||
| tc | 相関時間 (通常はミリ秒) | |||
| tD | 拡散時間(通常はミリ秒またはマイクロ秒) | |||
| tR | 光物理学の緩和時間(通常はマイクロ秒) | |||
| tT | トリプレット点滅の緩和時間(通常はマイクロ秒) | |||
| w0 | 共焦点体積要素(μm)の半幅 | |||
| z0 | 共焦点体積要素の半高さ(μm) | |||
表1:変数と略語のリスト 蛍光およびFRET実験におけるシンボルおよび定義の使用については、FRETコミュニティ40 のガイドラインが推奨される。
補助ファイル:
SuppNote1_Coverslipクリーニング.docxこのファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。
SuppNote2_Confocalセットアップ.docxこのファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。
SuppNote3_Dataエクスポート.docx このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。
SuppNote4_FCCSのキャリブレーション分析は、ChiSurfを使用して.docxこのファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
SuppNote5_Fluorescence生涯ヒストグラム.docxこのファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。
S6_Scripts.zip このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
S7_Excel_templates.zip このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
GPCRsにおけるFCS技術は、生細胞内の受容体の移動性および相互作用を評価することを可能にする41.FRET-FCS技術の利点は、モビリティとともに、GPCRsの立体構造ダイナミクスを調査できることです。しかし、生きた細胞でFRET-FCSを行うことは困難であり、対象となる蛍光標識タンパク質の低い(または最大中程度の)発現を示す細胞、十分に較正されたセットアップ、データを分析するための良好なパイプラインが必要です。ここでは、まず、試料調製および実験手順における重要な点について、生物学的、分光的、および技術的観点に関して議論される。
重要な実験ステップには、バックグラウンドおよび自己蛍光を最小限に抑える(広範囲に洗浄されたカバーリップとフェノールレッドフリーメディアを使用すること)、トランスフェクション条件の最適化(例えば、プラスミドDNAの量およびトランスフェクション後の時間)を低発現レベルおよび効率的な標識を達成する。もちろん、標識タンパク質の機能が妨げられないようにすることも重要です。したがって、生細胞実験において、標識戦略および標識位置の決定は、多くの場合、フレキシブルN末語またはC末語42、43に結合した蛍光タンパク質またはSNAP/CLIPタグを支持して行われる。有機フルオロフォアで標識するための反応性側鎖を持つ非天然アミノ酸を挿入するような代替標識戦略は、ここ44年で出現している。
目的の2つの分子の相互作用のみを調査するデュアルカラーPIE-FCSの場合、蛍光色体は、確立された蛍光タンパク質またはSNAP/ CLIP基質の多種多様から選択することができます。ここで分光法的には、クロストークや直接アクセプター励起が生じるペアを選択することが目標となるべきである。さらに、選択された蛍光色素は写真が撮れ可能で、選択された実験条件下で漂白をほとんどまたは全く示さないべきである。赤色スペクトル範囲の蛍光体を(1)細胞からの自己蛍光背景が減少し、(2)励起光がより長い波長であり、したがって光毒性が少ない14として選択することが推奨される。光の輝きは、レーザーパワーを段階的に増加させ、分子の明るさが観察される、いわゆる「パワーシリーズ」を最初に行うことで最小化することができます。最適な励起強度範囲は、結果45の線形範囲にあります。
2つの標識がFRETを通じてタンパク質の立体構造ダイナミクスについても報告することになっている場合、利用可能なフルオロフォアの選択はより制限されます。ここでは、2つのフルオロフォア間の可能な最小/最大距離は、事前に、利用可能な構造または分子サイズに基づいて、FRETが実際に20を発生するように合理的なフェルスター半径R0で選択されたフルオロフォア対と推定されるべきである。
ここで、標識用にeGFPとSNAPタグを選択し、SNAPタグを細胞内または膜不透過性表面基板のいずれかで標識した。スペクトルは図2C-Dに示されているものと似ています。このフルオロフォアの組み合わせは、eGFPの赤い検出チャネルへの高いクロストークを示し、迅速な時間枠で緑色の励起によるSNAP基板の直接アクセプタ励起を示し、プロンプトタイムウィンドウの赤色チャネルに有意な「偽」信号をもたらす。理想的には、両方の値、クロストークと直接アクソクサイクリック励起は、5%5、6、38を超えてはならない。しかし、57 Åのフェルスター半径を使用すると、2 AR-IL3-eGFP-CT-SNAP 構築物βのラベル間の距離を、クエンチ eGFP の寿命から評価できるプローブに最適です (補足注 5)。
技術的には、蛍光分光法の実験に関しては、デバイスは十分に整列し、適切な励起源、排出フィルタ、および敏感な検出器を所有する必要があります。μs タイムスケールでの検出器からのアーティファクトを避けるために、各色の少なくとも 2 つの検出器が存在し、相互相関が発生する可能性があります。現代の時間相関単一光子カウントエレクトロニクスでは、ns時間範囲内の検出カードのデッドタイムは独立したルーティングチャネルのためにほとんど役割を果たしませんが、関心のある時間範囲がサブμs/ns時間範囲にある場合、Müllerら 16が提案したようにチェックされる可能性があります。さらに、ps範囲においてさらに高い時間分解能のために、各検出チャネルは、2倍にする必要があり、すなわち、色当たり4検出器を使用する必要があり、また、検出器のデッドタイム2、15、29、46をバイパスする。蛍光寿命の平均は非偏光蛍光検出を用いて推定できるが、蛍光と蛍光間の距離(〜分布)の分析のために発光は偏光依存性を収集しなければならない。これは、FRETにおけるエネルギー伝達の効率が2つの蛍光ホルの向きに依存しているという事実によるものです。詳細については、20,28,47を参照してください。最後に、PIE実験では、迅速パルスと遅延パルスの間の距離が重要であり、蛍光の強度が大きく減衰するように選択する必要があります(図1B)。一般的なルールは、2つのパルスを5倍の蛍光寿命に置く、すなわち2.5nsの蛍光寿命を持つeGFPの場合、距離は最低22で12.5nsでなければならない。
実験手順に関する全ての考察を詳述した後、データとその分析についてより詳細に説明する。プロトコルセクションで述べたように、キャリブレーション測定の分析を含め、セットアップのアライメントを毎日チェックする必要があります。図2A-Cに示すデータは、例えば、8〜40μsの範囲で追加の緩和成分を示す。緑色のキャリブレーションフルオロフォアの典型的なトリプレット点滅は、2-10 μs範囲13、15、48で発生することが知られている。DNAサンプルの全ての曲線に必要な緩やかな緩和成分(図3C)は、実際の三重項点滅には遅すぎると、フルオロフォア39とDNAの相互作用に由来する可能性がある。しかし、このコンポーネントはCCFPIEでは期待されず、残留クロストークに由来する可能性が高い。したがって、その日のアライメントの品質を判断するために細胞実験に進む前に、キャリブレーションサンプルの分析を直接行うことを強くお勧めします。
共焦点のオーバーラップボリュームの適切なキャリブレーションには、緑と赤のラベルの100%共拡散を伴うサンプルが必要です。ここで、蛍光標識された二本鎖DNAが用いられる。両方のDNA鎖は、所望のフルオロフォアを互いに必要な距離に合わせて調整することができる。設計された鎖は高い収率と焼き付けることができる。しかし、グッドラボラトリープラクティスは、アガロースゲル電気泳動によるDNA鎖の完全性と標識度合いをチェックし、吸収スペクトルを測定することを推奨します。また、このキャリブレーション測定は、緑色と赤のラベルの100%の共拡散があるという仮定に大きく依存するため、二本鎖アセンブリの歩留まりをチェックする必要があります。仮定が有効でない場合、補正係数を16、22に適用する必要があります。図2と図3に示すキャリブレーション測定では、緑と赤のチャネルでそれぞれ1.4 fLと1.9 fLの検出体積が得られました。このサイズの違いは、ほぼ回折制限された励起量を持つセットアップに期待される(補足注 2)。この条件下では、励起体積の大きさは励起波長に合わせてスケールします。これは、図3Bで観察される異なる相関振幅を次に説明する。導出された補正因子rGR = 0.56およびrRG = 0.72は、このサイズの不一致と、2つの励起ボリューム3,4の潜在的な非完全な重複に対して正しい。
図4、図5、図6、図7は、立体構造タンパク質のダイナミクスを理解することを目的としたPIE-F(C)CSベースの研究のワークフローを示しています。まず、2つのAR-IL3-eGFPとNT-SNAP-β 2 AR β 2つの単一標識構造は、他の蛍光泳動が存在しない場合に細胞内の蛍光素特性を特徴付けるコントロールとして機能する(図4)。次に、二重標識構造NT-SNAP-β 2 AR-IL3-eGFPは細胞外装に面したSNAPタグと細胞質側のeGFPを持ち、「100%共拡散」制御として機能する(図5)。最後の構造は、2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP β、細胞質側に両方のフルオロフォアを運び、FRETを受けるのに十分なほど近い。ここでも、100%の共拡散が、迅速なタイムウィンドウにおける緑と赤のチャネル信号の反相関強度変動、すなわちドナー励起後、FRET効率31、32、33に影響を与えるタンパク質ダイナミクスに起因する、反相関強度変動と並行して予想されるであろう。このダイナミクスは、CCFFRETで反相関として表示される可能性があります (図 6-7)。
全てのGPCR β 2 AR構築物は、細胞膜上のバイモーダル拡散を示す(図4A)。β2AR-IL3-eGFP は、期待されるトリプレット点滅のみを示していますが (図 5B)13、15、NT-SNAP-β2AR は、さらなる緩やかな緩和時間を示しています (図 5C-D)。tR2は非結合のSNAP基板に由来する可能性があります。これは、更なる実験によって解明され得る、例えば、水溶液中の使用されたSNAP基質の拡散および光物性も測定することによっても可能である。注意は、拡散と緩和時間を区別する簡単な実験は、共焦点セットアップのピンホールを変更すること、すなわち、有効体積を増加させることである:拡散時間は有効体積の増加に伴って増加する一方で、緩和項は変化していない13。適合結果に基づいて蛍光タンパク質(FP)の濃度を決定する際には、FPは一般的に成熟プロセスを経て、最終的に発色器が形成される12に注意する。この成熟時間は、地域の化学環境13、15に依存する光物理学に加えて、FPからFPに異なる場合があります。従って、FCSによって報告されたサンプル中に存在する実際のタンパク質濃度は、通常過小評価され、非蛍光のフップの割合が実験で決定できる場合に補正することができる。最後に、ほとんどのフルオロフォアが環境13、15、48に敏感に反応するので、必要に応じて、αとδの値を修正するために生細胞のフルオロフォアスペクトルをチェックすることをお勧めします。減算する背景は、非トランスフェクトされた細胞で収集されたシグナルによって決定されます。さらに、他の各カラーチャンネルとCCFPIEの自己相関をチェックして、偽信号を識別できるようにする必要があります(補足ノート4 - 図30)。
この2つの測定結果は、膜の異なる側面に蛍光体が位置するNT-SNAP-β 2 AR-IL3-eGFP(図5D)で、異なる日に取得され、時間分解された単一分子蛍光における統計の重要性を示しています。ここで、異なる結果は、異なるラベルの程度に起因する可能性があります:1つのセルでは、測定の標識と平均の度合いが比較的低いノイズをもたらした(図5B)、他のセルからは2つの測定値しか収集できなかった(図5A)。十分な量のデータを収集するだけでなく、結果をタイムリーに評価し、ラベル付け戦略を最適化することが重要です。実験を設計する際には、FRETは敏感であるが、10 nmまでの距離に限定され、そうでない場合は「ブラインド」に制限されることを覚えておくことが重要です。我々の場合、この「失明」は、変化していないeGFP蛍光寿命(補足注5)によって示される。β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP コンストラクト (図 6A)では、FRET を eGFP の消し込み寿命から特定できます (補足注 5)。しかし、非相関項(図6B)は、FRETが変動しないか、拡散時間よりも時間スケールが遅いことを意味する。ACFgp、ACF rp、ACF rd、CCF FRETには最大3つの追加緩和条件が必要です(図6C)。ACFrp、ACF rdおよびCCFFRETの遅い成分は、アクセプタ漂白によるものかもしれないし、もちろん、これらの曲線に見られる遅い拡散の得られた値に影響を与える(ACFgpの117 msと比較して〜350 ms)。赤チャンネルのtDは、異なるサイズの共焦点ボリューム(図2)が、サイズ差に匹敵する係数だけであるため、緑色のチャネルよりもわずかに大きいと考えられています。3 μsの非常に高速な緩和時間は、フルオロフォア13、15、48の三重瞬きを反映していますが、37μsの緩和時間はFRETによるものかもしれません:同様に、FRETがCCFFRETで反相関を誘発するので、正の相関は自己相関31、32、33で期待されます。CCFFRETにおける「陽性」としてのこの用語の存在とACFrdでのその存在は、高いクロストークで説明され、さらに解明されるべきである。CCFPIEは、予想通りの短い相関時間でフラットであることに注意してください。
一方、対象系におけるFRETの発生は、相関曲線6に対する非線形効果を導く点に留意すべきである。分子の明るさは、例えば、分子の二乗と各FRET状態(および常に活性な受容体を持たない存在分子)にスケールする相関の明るさを示す。実際、FRETは検出された緑色分子の見かけの濃度を減少させ(すなわち、ACFgp振幅を増加させる)、そして赤色分子の数(赤いプロンプトから決定される)は5を過大評価する。両方の効果は、CCFFRETとCCF PIEの両方から得られる相互作用の量に影響を与えます。しかし、カルモジュリン31、32またはシンタックスイン33の分子内ダイナミクスに関して例示したグローバル分析は、タンパク質ダイナミクスを明らかにすることができる。慎重に較正する場合、平均FRET効率は、相対的なCCFPIEおよびACF振幅22から抽出され得るが、一方、制限状態はドナー蛍光寿命分布33の分析から決定され得る。
eGFPのような大きな蛍光色素を用いた生細胞実験では、FRETコントラストが図6に示すシミュレーションで想定されるよりもさらに低くなる可能性があり、アクセプタの直接励起がシミュレーションに追加されなかったことを考えると、ライブ細胞実験における抗相関の同定が非常に困難である理由を説明する可能性があります。有望な分析代替手段は、時間相関単一光子計数データ収集29,30によりアクセス可能な光子到着時間ヒストグラム(図1B)にコードされた情報の収集に依存する。サンプル内の2種(またはそれ以上)(FRET)種の蛍光寿命(〜パターン)が既知である場合(図7A)、相関過程で適用される「フィルタ」または重みを選択することができる(図7B)17、18、19。このようにして得られた相関曲線は、もはや検出チャネルの相関を表すのではなく、2つの異なる(FRET)種間の自動相関または相互相関を表し、こうして種ACF(sACF)または種CCF(sCCF)に改名される。このアプローチを、中程度のFRETコントラスト、高いクロストーク、三重点滅を用いてシミュレートされたデータに適用すると、非相関項が回復する(図7C-D)。しかし、緩和時間は得られるが振幅との関係は18と失われていることに留意すべきである。このアプローチは、EGFRとそのアンタゴニスト49との相互作用を研究するために、または蛍光をeGFP変異体に結合したタンパク質から分離するために、例えば、生細胞実験で以前に適用されてきた50の非常に短く、長い蛍光寿命を有するタンパク質から蛍光を分離する。
精製タンパク質のPIEベースのFRET測定は、タンパク質ダイナミクス3622を研究するために主に使用されますが、生細胞ではタンパク質とタンパク質の相互作用を理解することに焦点を当てています。このアプローチは、酵母51におけるMAPキナーゼ活性の調節を研究するために適用されたか、この最近の記事52に要約されるように、それらの細胞質結合パートナーと膜タンパク質の相互作用を解決するために適用されている。ここで、緑色のフルオロフォアの有意なクロストークが、プロンプトタイムウィンドウの緑色チャネルの遅延時間ウィンドウまたは赤色信号に依然として存在する場合に合併症が生じることがある。前者は緑色のパルスに対する赤いパルスの遅延が不十分であることが原因である可能性がありますが、両方の効果は選択されたフルオロフォアの励起と発光スペクトルが過度に重なることによって生じます。蛍光寿命が非常に短い自己蛍光が別の複雑な因子である可能性がある細胞において特に、それぞれの単一標識構造を慎重にチェックし、偽陽性CCFPIE振幅を補正することが推奨される。
結論として、ここで説明するFRET-FCSアプローチは、生理学的濃度に近い生細胞におけるタンパク質相互作用およびタンパク質ダイナミクスを理解する大きな可能性を秘めています。このプロトコルでは、必要なキャリブレーション測定と、生細胞測定中に実行される必要な定量分析に焦点を当てた。このため、異なる生細胞測定値がシミュレーションと相補的に示された。シミュレーションは、それぞれのデータの特定の移動性と光物理特性を記述する合体適合モデルを使用して、パラメータを体系的に変化させることができるので、ここで一般的な理解を提供します。この分析は、広範なステップバイステップのプロトコルと適応しやすいテンプレートを備えたオープンソースソフトウェアツールで実行されました。最後に、技術的な進歩、したがって、すぐに購入できる安定したPIE-FCSシステムの可用性とデータ分析のためのオープンソースソフトウェアの普及により、この技術は、最終的に最も感度の高い生細胞のタンパク質相互作用とダイナミクスを解明するために、より大きな研究コミュニティのためにますますアクセスしやすくなります。
Disclosures
著者には宣言する競合はありません。
Acknowledgments
このプロジェクトは、ドイツ・フォルシュングスゲミンシャフト(SFB/TR 240、プロジェクト番号374031971、プロジェクトINF)によってJ.BとK.G.Hに支援されました。
ルドルフ・ビルチョウ・センターの財政支援とコアユニット蛍光イメージングに対し、技術サポートに感謝します。さらに、アシュウィン・バラクリシュナンの徹底的な校正に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Telescope in 4f configuration with five lenses | Qioptiq, Rhyl, UK | G063126000 | Optics |
| 2x Band pass filters Brightline | AHF, Tübingen, Germany | HC 525/50 and HC 600/52 | Filter |
| 2x Dichroic beam splitter | AHF, Tübingen, Germany | HC BS F38-573 | Filter |
| 6-well culture plate Nunc | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 140675 | Reagent |
| Alexa Fluor 488 NHS Ester (green calibration standard) | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | A20000 | Reagent |
| Alexa Fluor 568 NHS Eater (red calibration standard) | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | A20003 | Reagent |
| ASI stage PZ-2000 XYZ | Visitron Systems GmbH, Puchheim, Germany | WK-XYB-PZ-IX71 | Microscope Parts |
| Attofluor Cell Chamber, 35 mm diameter for 25 mm round coverslips | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | A7816 | Glass coverslip holder |
| Avalanche photodiode Perkin Elmer (SPCM-AQR-14) | Laser Components GmbH, Olching, Germany | SPCM-AQR-14 | Single photon counting detector |
| Beamsplitter | Newport, Darmstadt, Germany | 10FC16PB.3 | Filter |
| Biorender (Software) | Science Suite Inc - o/a BioRender (Toronto, Canada) | --- | Software used to create GPCR sketch, https://app.biorender.com/ |
| Chinese hamster ovary (CHO) cell line | ATCC | CCL-61 | Cell lines |
| ChiSurf (Data analysis Software) | Thomas-Otavio Peulen, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, USA | --- | tttrlib-based software to analyze fluorescence correlation data and fluorescence decay histograms, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf Tutorial: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&t=2s Ref: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017) |
| Chloroform | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 472476-2.5L | Reagent |
| DMSO | AppliChem GmbH (Darmstadt, Germany) | A3672,0250 | Reagent |
| DNA strand (40 bp fluorophore distance) | IBA Lifesciences GmbH (Göttingen, Germany) | --- | Reagent, 5’ CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3’, 3’ GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5’ |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (with and without phenol red) | GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) | P04-41250, P04-41650 | Reagent |
| Ethanol (absolute) | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 34852-1L-M | Reagent |
| Erythrosin B,Dye content >=95 % | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 200964-5G | Reagent, Instrument Response function, solve in EtOH to 10 mg/mL |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S 0615 | Reagent |
| Fluorescence Light Source X-Cite 120 Q | Excelitas Technologies, Ontario, Canada | XI120-Q-5060 | Microscope Parts |
| Fluorescent SNAP-substrate cell : SNAP Cell TMR- STAR | New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany) | S9105S | Reagent |
| Fluorescent SNAP-substrate surface : DY-549 | New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany) | S9112S | Reagent |
| Glass coverslips (Dimensions: diameter 24 mm, thickness 0.13 - 0.16 mm) | Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany) | 111640 | Reagent |
| Laser Controller | Picoquant, Berlin, Germany | 910020 (PDL 828-S "SEPIA II") | Optics |
| Laser lines (480 nm and 560 nm) | Picoquant, Berlin, Germany | 912485 (LDH-D-C-485), 912561 (LDH-D-TA-560) | Optics |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | 11668-019 | Reagent |
| MFD suite (Software) | AG Seidel, Heinrich-Heine-University Duesseldorf, Germany | --- | Software package for analysis of single-molecule fluorescence experiments including e.g. Kristine (correlation of tttr data), Burbulator (simulation of single-molecule experiment), https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis |
| Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25.4 mm | Thorlabs, Bergkirchen, Germany | AC254-150-A-ML | Second part of Beam expander |
| Neubauer Chamber (deepness 0.1 mm) | Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany) | 640110 | Reagent |
| Olympus IX 71 stand | Olympus, Hamburg, Germany | IX2-ILL100 | Microscope Parts |
| Opti-MEM (Reduced-Serum Medium) | GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) | 31985-047 | Reagent |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 049M4857V | Reagent |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) | 14190144 | Reagent |
| Pinhole (50 µM) | Newport, Darmstadt, Germany | PNH-50 | Pinhole |
| PMT Hybrid-40 | Picoquant, Berlin, Germany | 932200 (PMA Hybrid 40) | Single photon counting detector |
| Python scripts (Software) | Katherina Hemmen, Rudolf-Virchow Center for Integrative and Translational Imaging, University Wuerzburg, Germany | --- | Collection of self-written Python scripts based on tttrlib (https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib) used to (1) determine the average count rates, (2) correlate the data and (3) build fluorescence decay histograms, https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS |
| Quad band beamsplitter (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1) | AHF, Tübingen, Germany | F73-421PH | Filter |
| Single mode fiber polarization keeping, NA = 0.08 with collimator | Picoquant, Berlin, Germany | 02126 | Optics |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 6771.1 | Reagent |
| SymPhotime x64 Software (Data collection and data export software) | Picoquant, Berlin, Germany | 931073 (SPT64-1+2 single user ) | Time-tag time-resolved (tttr) data collection at the self-built FCCS setup, data export |
| Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system Hydraharp 400 | Picoquant, Berlin, Germany | 930010 (Hydraharp 400) | Optics |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | T4299-100ml | Reagent |
| Unmounted Achromatic Doublets, ARC: 400 - 700 nm, D=12.7 mm, F=-20 mm | Thorlabs, Bergkirchen, Germany | ACN127-020-A | First part of Beam expander |
| Water immersion objective (UPlanSApo 60x/1.20 W) | Olympus, Hamburg, Germany | UPLSAPO60XW | Objective |
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