Biochemistry

Espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia de doble color para estudiar la interacción proteína-proteína y la dinámica de proteínas en células vivas

Published: December 11, 2021 doi: 10.3791/62954

Katherina Hemmen*¹, Susobhan Choudhury*¹, Mike Friedrich¹, Johannes Balkenhol¹, Felix Knote¹, Martin J. Lohse², Katrin G. Heinze¹

¹Rudolf Virchow Center for Integrative and Translation Bioimaging, Julius-Maximilian University Wuerzburg, ²Max Delbrück Center for Molecular Medicine, Berlin

* These authors contributed equally

Summary

Presentamos un protocolo experimental y un flujo de trabajo de análisis de datos para realizar espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia de doble color de células vivas (FCCS) combinada con transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) para estudiar la dinámica de los receptores de membrana en células vivas utilizando técnicas modernas de etiquetado de fluorescencia.

Abstract

Presentamos un protocolo y un flujo de trabajo para realizar espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia de doble color de células vivas (FCCS) combinada con transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) para estudiar la dinámica de los receptores de membrana en células vivas utilizando técnicas modernas de etiquetado de fluorescencia. En fccs de doble color, donde las fluctuaciones en la intensidad de la fluorescencia representan la "huella digital" dinámica de la biomolécula fluorescente respectiva, podemos sondear la codifusión o la unión de los receptores. FRET, con su alta sensibilidad a las distancias moleculares, sirve como un conocido "nanoruler" para monitorear los cambios intramoleculares. En conjunto, los cambios conformacionales y los parámetros clave, como las concentraciones de receptores locales y las constantes de movilidad, se vuelven accesibles en entornos celulares.

Los enfoques de fluorescencia cuantitativa son un desafío en las células debido a los altos niveles de ruido y la vulnerabilidad de la muestra. Aquí mostramos cómo realizar este experimento, incluidos los pasos de calibración utilizando βreceptor₂-adrenérgico (β₂AR) etiquetado con eGFP y SNAP-tag-TAMRA. Se proporciona un procedimiento de análisis de datos paso a paso utilizando software de código abierto y plantillas que son fáciles de personalizar.

Nuestra guía permite a los investigadores desentrañar las interacciones moleculares de biomoléculas en células vivas in situ con alta confiabilidad a pesar de los niveles limitados de señal a ruido en experimentos con células vivas. La ventana operativa de FRET y particularmente FCCS a bajas concentraciones permite el análisis cuantitativo en condiciones casi fisiológicas.

Introduction

La espectroscopia de fluorescencia es uno de los principales métodos para cuantificar la dinámica de proteínas y las interacciones proteína-proteína con una perturbación mínima en un contexto celular. La espectroscopia de correlación de fluorescencia confocal (FCS) es uno de los métodos poderosos para analizar la dinámica molecular, ya que es sensible a una sola molécula, altamente selectiva y compatible con células vivas¹. En comparación con otros enfoques orientados a la dinámica, FCS tiene un rango de tiempo medible más amplio que abarca desde ~ ns hasta ~ s, lo más importante es que cubre las escalas de tiempo rápidas que a menudo son inaccesibles por métodos basados en imágenes. Además, también proporciona selectividad espacial para que la dinámica molecular de membrana, citoplasma y núcleo se pueda distinguir fácilmente ². Por lo tanto, el parpadeo molecular, la concentración local promedio y el coeficiente de difusión se pueden analizar cuantitativamente con FCS. La dinámica intermolecular, como la unión, se vuelve fácilmente accesible cuando se sondea la codifusión de dos especies moleculares en el análisis de espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia (FCCS)^3,^4,⁵ en un enfoque de doble color.

El principal principio subyacente en la espectroscopia de correlación es el análisis estadístico de las fluctuaciones de intensidad emitidas por biomoléculas marcados fluorescentemente que se difusen dentro y fuera de un foco láser(Figura 1A). Las funciones de correlación automática o cruzada resultantes se pueden analizar más a fondo mediante el ajuste de curvas para eventualmente derivar las constantes de tasa de interés. En otras palabras, los métodos estadísticos FCS y FCCS no proporcionan trazas de una sola molécula como en el seguimiento de una sola partícula, sino un patrón dinámico o "huella digital" de una muestra sondeada con alta resolución temporal. Cuando se combina con la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET), la dinámica intramolecular, como los cambios conformacionales, se puede monitorear al mismo tiempo en una configuración confocal común⁵^,⁶. FRET sondea la distancia de dos fluoróforos y a menudo se conoce como un "nanoruler" molecular. La transferencia de energía tiene lugar solo cuando las moléculas están muy cerca (< 10 nm), el espectro de emisión del donante se superpone significativamente con el espectro de absorción de la molécula aceptora, y la orientación dipolar del donante y el aceptor es (suficientemente) paralela. Por lo tanto, la combinación de FRET y FCCS proporciona una técnica con una resolución espacio-temporal muy alta. Cuando se requiere selectividad espacial, sensibilidad y compatibilidad con células vivas, FRET-FCCS tiene una ventaja obvia sobre otros métodos como la calorimetría de titulación isotérmica (ITC)^7,la resonancia de plasmón de superficie (SPR)⁸o la resonancia magnética nuclear (RMN)^9,¹⁰ para medir la dinámica y las interacciones de proteínas.

A pesar de las capacidades y la promesa de la espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia de doble color (dc-FCCS), la realización de dc-FCCS en células vivas es técnicamente desafiante debido al sangrado espectral o diafonía entre los canales^3,^4,la diferencia en los volúmenes confocales debido a las líneas láser espectralmentedistintas^3,^4,^11,señal de fondo y ruido o fotoestabilidad limitada de las muestras¹²^, ¹³^,¹⁴^,¹⁵. La introducción de la excitación intercalada por pulsos (PIE) en FCCS fue un ajuste importante para desacoplar temporalmente las diferentes excitaciones láser para reducir la diafonía espectral entre los canales¹⁶. Otros métodos de corrección para contrarrestar el sangrado espectral^17,^18,¹⁹ y las correcciones de fondo también han sido bien aceptados^17,^18,¹⁹. Para detalles y conceptos básicos sobre FCS, PIE o FRET, se remite al lector a las siguientes referencias^2,^4,^6,^16,^20,^21,^22,^23,^24.

Aquí, se presentan todos los experimentos y análisis de calibración necesarios junto con los resultados experimentales de un receptor prototípico acoplado a proteína G, β receptor 2-adrenérgico (β₂AR), para tres escenarios diferentes: (1) moléculas mono-etiquetadas que llevan un fluoróforo "verde" (eGFP) o "rojo" (etiquetado basado en etiqueta SNAP)^25; (2) una construcción de doble etiqueta, que lleva una etiqueta SNAP N-terminal y eGFP intracelular (NT-SNAP) [en este caso, ambas etiquetas están en la misma proteína. Por lo tanto, se espera una co-difusión del 100%]; y (3) una muestra de doble marca, donde ambos fluoróforos están en el mismo lado de la membrana celular (CT-SNAP). Lleva una etiqueta SNAP-terminal C y una eGFP intracelular. Aquí, de nuevo, ambas etiquetas están en la misma proteína con de nuevo 100% de co-difusión esperada. Como ambas etiquetas están muy cerca una de la otra, en el mismo lado de la membrana celular, muestra el potencial para observar el FRET y el comportamiento anticorrelacionado. Todos los constructos fueron transfectados en células de ovario de hámster chino (CHO) y luego etiquetados con un sustrato fluorescente rojo que es impermeable a la membrana para la construcción NT-SNAP y permeable a la membrana para la construcción CT-SNAP. Finalmente, los datos simulados ejemplifican la influencia de los parámetros experimentales en la anticorrelación inducida por FRET y el efecto de las interacciones proteína-proteína en la amplitud de co-difusión.

Por lo tanto, este protocolo proporciona una guía completa para realizar el FRET-FCCS combinado en células vivas para comprender la dinámica de las proteínas y las interacciones proteína-proteína, al tiempo que toma conciencia de los artefactos técnicos / físicos, los desafíos y las posibles soluciones.

Protocol

1. Protocolo experimental

Preparación de muestras
NOTA: Realizar siembra y transfección celular en condiciones estériles.
1. Coloque un cubrebosques limpio por pozo en una placa de cultivo de 6 pozos y lávese tres veces con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).
  NOTA: El protocolo de limpieza de la cubierta se detalla en la Nota complementaria 1.
2. A cada pozo, agregue 2 ml del medio de cultivo celular completo que contenga rojo fenol (complementado con suero fetal bovino al 10% (FBS), 100 μg / ml de penicilina y 100 μg / ml de estreptomicina) y mantenga la placa a un lado.
3. Culta las células CHO en el mismo medio que contenga rojo fenol a 37 °C y 5% CO_2. Lave las células con 5 ml de PBS para eliminar las células muertas.
4. Añadir 2 ml de tripsina e incubar durante 2 min a temperatura ambiente (RT).
5. Diluir las células desprendidas con 8 ml de medio que contenga rojo fenol y mezclar cuidadosamente mediante pipeteo.
6. Contar las células en una cámara de Neubauer y sembrar a una densidad de 1,5 x 10⁵ células/pozo en la placa de cultivo celular de 6 pozos que contiene las cubiertas (preparado en la etapa 1.1.1-1.1.2).
7. Deje que las células crezcan en una incubadora (37 °C, 5% CO₂₎durante 24 h para lograr aproximadamente un 80% de confluencia.
8. Diluir 2 μg del ADN vectorial deseado (por ejemplo, CT-SNAP o NT-SNAP) y 6 μL del reactivo de transfección en dos tubos separados, cada uno con 500 μL del medio sérico reducido para cada pozo e incubar durante 5 min a RT.
9. Mezcle las dos soluciones para obtener la mezcla de transfección e incube durante 20 minutos en RT.
10. Mientras tanto, lave las células CHO secuedradas una vez con PBS estéril.
11. Reemplace el PBS con 1 ml / pozo de medio libre de fenol rojo suplementado con 10% de FBS sin antibióticos.
12. Agregue todo el 1 ml de mezcla de transfección gota a gota a cada pozo e incube las células durante la noche a 37 ° C, en 5% de CO_2.
13. Para el etiquetado de la construcción SNAP, diluya la solución de material de sustrato SNAP adecuada en 1 ml del medio suplementado con FBS al 10% para obtener una concentración final de 1 μM.
14. Lave las células transfectadas una vez con PBS y agregue 1 ml por pozo de solución de sustrato SNAP de 1 μM. Incubar las células durante 20 min a 37 °C en 5% CO_2.
15. Lave las células tres veces con fenol medio libre de rojo y agregue 2 ml por medio libre de rojo de fenol de pozo. Incubar las células durante 30 min a 37 °C en 5% CO₂.
16. Transfiera las cubiertas de todas las muestras posteriormente a la cámara de imágenes y lávese con un tampón de imágenes de 500 μL. Agregue un búfer de imágenes de 500 μL antes de pasar a la configuración de FRET-FCS.
Mediciones de calibración
NOTA: La configuración fret-FCS está equipada con un objetivo de agua de microscopio confocal, dos líneas láser, un sistema de conteo de fotón único correlacionado en el tiempo (TCSPC), dos tubos fotomultiplicadores híbridos (PMT) y dos fotodiodos de avalancha (APD) para la recolección de fotones y el software de recopilación de datos. Es muy importante alinear la configuración cada vez antes de las mediciones de células vivas. La descripción detallada de la configuración se puede encontrar en la Nota complementaria 2. Tanto los láseres como todos los detectores (dos PMT y dos ADP) están siempre ENCENDIDOS durante las mediciones, ya que todas las mediciones deben realizarse en condiciones idénticas. Para las mediciones de calibración, use un coverslip del mismo lote en el que se sembraron las células, esto disminuye la variación en la corrección del anillo del collar.
1. Para ajustar el enfoque, el agujero de alfiler y la posición del anillo del collar, coloque la solución de calibración verde de 2 nM en una cubierta de vidrio y encienda el láser de 485 nm y 560 nm. Opere con láser en modo de excitación intercalada pulsada (PIE)¹⁶.
2. Concéntrese en la solución y ajuste la posición del orificio y el anillo del collar de tal manera que se obtenga la tasa de recuento más alta y el volumen confocal más pequeño para obtener el máximo brillo molecular.
3. Repita este proceso para los canales rojos con una solución de calibración roja de 10 nM y una mezcla de la solución de calibración verde y roja.
4. Coloque la solución de ADN de 10 nM en una cubierta de vidrio y ajuste la posición del foco, el agujero de alfiler y el anillo del collar de modo que la correlación cruzada entre los canales de detección verde y rojo sea más alta, es decir, muestre la mayor amplitud.
  NOTA: Es posible que los pasos 1.2.1 y 1.2.4 deberán repetirse de un lado a otro para encontrar la alineación óptima. Tome de 3 a 5 mediciones de cada solución de calibración durante 30 s - 120 s después de que la posición del foco, el agujero de alfiler y el anillo del collar se hayan alineado de manera óptima para los canales de detección verde y rojo y el volumen de superposición confocal.
5. Mida una gota de ddH₂O, el medio de imagen, y una célula no transfectada de 3 a 5 veces cada una durante 30 s a 120 s para determinar las tasas de recuento de fondo.
6. Recoja la función de respuesta del instrumento con 3-5 mediciones durante 30 s - 120 s. Esto es opcional pero muy recomendable.
Mediciones de células vivas
1. Encuentra una célula adecuada iluminando con la lámpara de mercurio y observando a través del ocular.
  NOTA: Las células adecuadas están vivas mostrando la morfología típica de la respectiva línea celular adherente. La fluorescencia de la proteína de interés, aquí un receptor de superficie, es visible en toda la superficie. Las células menos brillantes son más adecuadas que las más brillantes debido al mejor contraste en FCS cuando un bajo número de moléculas están enfocadas.
2. Encienda ambos láseres en modo PIE y concéntrese en la membrana observando los recuentos máximos por segundo.
  NOTA: Es posible que sea necesario reducir la potencia del láser para las muestras de células (menos de 5 μW en el objetivo). Esto depende de los fluoróforos utilizados y la configuración.
3. Observe las curvas de correlación automática y cruzada de la eGFP o etiqueta SNAP etiquetada adjunta a la AR β₂en la vista previa en línea del software de recopilación de datos y recopile varias mediciones cortas (~ 2 -10) con un tiempo de adquisición entre 60 -180 s.
  NOTA: No excite las células durante mucho tiempo de forma continua, ya que los fluoróforos pueden blanquearse. Sin embargo, dependerá del brillo de cada celda, cuánto tiempo pueden ser las mediciones y cuántas mediciones en total se pueden realizar.

2. Análisis de datos

Exportación de datos
1. Exporte las curvas de correlación, G(t_c), y las tasas de conteo, CR, de todas las mediciones.
2. Tenga cuidado de definir correctamente las ventanas de tiempo "prompt" y "delay" y use la opción "microtime gating" en el software de correlación de datos.
  NOTA: En total, se requieren tres correlaciones diferentes: (1) autocorrelación del canal verde en la ventana de tiempo rápida (ACF_gp), (2) autocorrelación de los canales rojos en la ventana de tiempo de retardo (ACF_rd), y finalmente (3) la correlación cruzada de la señal del canal verde en la ventana de tiempo de aviso con la señal de canal rojo en la ventana de tiempo de retardo (CCF_PIE). La exportación de datos se muestra paso a paso para diferentes programas en la Nota complementaria 3.
Mediciones de calibración
1. Utilice las funciones de autocorrelación de las soluciones de fluoróforo verde(ACF_gp)y rojo(ACF_rd),y ajústelas a un modelo de difusión 3D con un término triplete adicional si es necesario (eq. 1) para calibrar la forma y el tamaño del volumen de detección confocal para los dos canales de color utilizados:
  eq. 1
  Aquí, b es la línea de base de la curva, N el número de moléculas en foco, t_D el tiempo de difusión (en ms), y s = z₀/w₀ el factor de forma del elemento de volumen confocal. El triplete parpadeante u otra fotofísica se describe por su amplitud a_R y tiempo de relajación t_R.
  NOTA: Todas las variables y símbolos utilizados dentro del protocolo se enumeran en la Tabla 1.
2. Utilice los coeficientes de difusión conocidos D para el estándar de calibración verde²⁶ y rojo²⁷ y los factores de forma obtenidos s_verde y s_rojo para determinar las dimensiones (ancho w₀ y alto z₀) y el volumen V_eff del elemento de volumen confocal (eq. 2a-c).
  eq. 2a
  eq. 2b
  eq. 2c
  NOTA: Las plantillas para el cálculo del parámetro de calibración se proporcionan como archivos complementarios (S7).
3. Calcule la diafonía espectral α de la señal de fluorescencia verde (recogida en los canales 0 y 2) en los canales de detección rojos (canal número 1 y 3) como una relación de las señales corregidas en segundo plano (BG) (eq. 3).
  
  eq. 3
4. Determinar la excitación directa del fluoróforo aceptor δ por la longitud de onda de excitación del donante por la relación entre la tasa de recuento corregida en segundo plano de las mediciones de calibración en rojo en la ventana de tiempo "rápida" (excitación por láser verde) y la tasa de recuento corregida en segundo plano en la ventana de tiempo de "retraso" (excitación por láser rojo) (eq. 4).
  
  eq. 4
5. Calcular el brillo molecular B de los fluoróforos verde y rojo (eq. 5a-b) en función de las tasas de recuento corregidas de fondo y el número obtenido de moléculas en foco, N,a partir del ajuste de difusión 3D (eq. 1):
  eq. 5a
  eq. 5b
6. Ajuste tanto ACF_gp como ACF_rd, así como CCF_PIE del ADN de doble etiqueta al modelo de difusión 3D (eq. 1). Mantenga los factores de forma obtenidos, s verde y s_rojo,constantes para ACF_gp y ACF_rd,respectivamente. El factor de forma para el _{CCF PIE,}s_PIE, generalmente se encuentra entre estos dos valores.
  NOTA: En una configuración ideal, tanto V_eff,_verde como V_{eff, el rojo} tendría el mismo tamaño y se superpondría perfectamente.
7. Determinar la amplitud en tiempo de correlación cero, G₀(t_c), basado en los valores encontrados del número aparente de moléculas en foco(N_verde, N_rojo y N_PIE).
8. Calcular la relación de amplitud r_GR y r_RG para una muestra con co-difusión del 100% de fluoróforos verdes y rojos (eq. 6). Tenga en cuenta que N_PIE no refleja el número de moléculas de doble etiqueta en foco, sino que refleja solo el 1 /G₀(t_c).
  y eq. 6
Experimentos con células vivas
1. Para construcciones de una sola etiqueta, ajuste las muestras de celda a un modelo apropiado. Para el receptor de membrana mostrado, la difusión ocurre de manera bimodal con un tiempo de difusión corto y largo. Además, la fotofísica y el parpadeo de los fluoróforos deben tenerse en cuenta:
  eq. 7
  Aquí, t_d1 y t_d2 son los dos tiempos de difusión requeridos, y un₁ es la fracción del primer tiempo de difusión.
  NOTA: A diferencia de las mediciones de calibración, en las que los colorantes libres y las hebras de ADN se difunden libremente en todas las direcciones, el receptor de membrana muestra solo difusión 2D a lo largo de las membranas celulares. Esta diferencia entre la difusión 3D y 2D se refleja en el término de difusión modificado (comparar eq. 1), donde t_D en el caso 2D no depende del factor de forma s del elemento de volumen confocal.
2. Calcule la concentración c de proteínas etiquetadas con verde o rojo a partir de los respectivos N y V_eff utilizando matemáticas básicas (eq. 8):
  eq. 8
  donde N_A = número de Avogadro
3. Para la etiqueta SNAP N-terminal y la eGFP intracelular, ajuste las dos autocorrelaciones(ACF_gp y ACF_rd)de la muestra de doble etiqueta utilizando el mismo modelo que para las construcciones de etiqueta única para los ACF (eq. 7) y el _{CCF PIE} utilizando un modelo de difusión bimodal (eq. 9):
  eq. 9
  NOTA: Para una descripción global del sistema, las tres curvas deben ajustarse conjuntamente: el término de difusión es idéntico para las tres curvas y la única diferencia es el término de relajación para el _{CCF PIE.} Como la fotofísica de dos fluoróforos generalmente no está relacionada, no se requiere un término de correlación. Esta ausencia de términos de relajación da como resultado un PIE plano del_CCF en tiempos de correlación cortos. Sin embargo, la diafonía y la excitación directa del aceptor debido al fluoróforo del donante pueden mostrar amplitudes falsas positivas y deben verificarse cuidadosamente para usar las mediciones de calibración.
4. Calcule la concentración c de proteínas etiquetadas verdes o rojas a partir de los respectivos N y V_eff utilizando la ecuación 8.
5. Estimar la fracción o concentración, c_GR o c_RG,de proteínas rojas y verdes que interactúan a partir de las muestras celulares utilizando los factores de corrección obtenidos de las muestras de ADN, las relaciones de amplitud r_GR y r_RG de la muestra celular y sus respectivas concentraciones obtenidas (eq. 10).
  y eq. 10
6. Para la etiqueta SNAP C-terminal y la eGFP intracelular, ajuste las dos autocorrelaciones(ACF_gp y ACF_rd)de la muestra FRET como muestras monoetiquetadas (ecuación 7) y el _FRET CCF a un modelo de difusión bimodal que contenga un término anticorrelación (ecuación 11)
  eq. 11
  donde a_f refleja la amplitud de la anticorre correlación total y a_R y t_R la amplitud respectiva y el tiempo de relajación.
  NOTA: En caso de cambios de fluorescencia anticorrelacionados debidos a FRET, se pueden requerir uno o varios términos de anticorrelación (eq. 11), lo que resulta en una "caída" de CCF_FRET en tiempos de correlación bajos que coinciden con un aumento en las dos autocorrelaciones(ACF_gp y ACF_rd). Sin embargo, tenga en cuenta que la fotofísica, como el parpadeo de tripletes, podría enmascarar el término anticorre correlación al amortiguar la anticorre correlación inducida por FRET. Un análisis conjunto complementado con métodos FCS filtrados podría ayudar a desenmascarar el término anticorre correlación. Además, los artefactos técnicos derivados de tiempos muertos en la electrónica de conteo en el rango de nanosegundos deben excluirse¹⁶. Un procedimiento paso a paso más detallado sobre cómo realizar el análisis en ChiSurf²⁸ y plantillas para el cálculo del volumen confocal o el brillo molecular se proporcionan en el repositorio de Github (https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS) y como archivos complementarios(Nota suplementaria 4 y Nota complementaria 6). Además, los scripts de Python para la exportación por lotes de datos adquiridos con el software Symphotime en formato .ptu se pueden encontrar allí.

Representative Results

A continuación se analizan los resultados ejemplares de la calibración y las mediciones de células vivas. Además, el efecto de FRET en las curvas de correlación cruzada se demuestra en base a datos simulados junto al efecto de la interacción proteína-proteína que aumenta la amplitud de CCF_PIE.

Exportación de datos FCS basada en PIE
En los experimentos PIE, los datos se recopilan en el modo de tiempo resuelto en tiempo (TTTR)²⁹^,³⁰. La Figura 1B muestra los histogramas de tiempo de llegada de fotones de una medición PIE de una hebra de ADN de doble etiqueta en la configuración descrita (Nota suplementaria 1). La configuración tiene cuatro canales de detección. La emisión de fluorescencia se divide primero por polarización en direcciones "S" y "P" (refiriéndose al plano perpendicular y paralelo en el que oscila el campo eléctrico de una onda de luz). En segundo lugar, cada dirección de polarización se divide en dos canales de color (verde, rojo) antes de la detección, lo que resulta en cuatro canales (S-verde, S-rojo, P-verde, P-rojo). En la ventana de tiempo "prompt", el fluoróforo verde se excita y la señal se detecta en los canales verde y rojo debido a FRET. En la ventana de tiempo de retardo, solo el fluoróforo rojo (en el canal rojo) es visible. Sobre la base de los canales de detección y las ventanas de tiempo "prompt" versus "retardado", se pueden obtener al menos cinco curvas de correlación diferentes (3 curvas de autocorrelación (ACF) y 2 curvas de correlación cruzada (CCF)) (Figura 1C-D): (1) señal verde en la ventana de tiempo de aviso (ACF_gp), (2) señal roja en la ventana de tiempo de aviso (en caso de FRET, ACF_rp), y (3) señal roja en la ventana de tiempo de retardo (ACF_rd). Estos ACR informan sobre la movilidad de las proteínas, la fotofísica (por ejemplo, el parpadeo del triplete) y otros cambios de brillo correlacionados en el tiempo en los fluoróforos (por ejemplo, debido a FRET). (4) El CCF_PIE de correlación cruzada basado en PIE de la señal verde en la ventana de tiempo rápida con la señal roja en la ventana de tiempo de retardo permite determinar la fracción de co-difusión del fluoróforo verde y rojo¹⁶. (5) El FRET CCF de correlación cruzada basado en _FRET del verde con la señal roja en la ventana de tiempo rápida está relacionado con los cambios de brillo anticorrelacionados inducidos por FRET en las señales verde y roja³¹^,³²^,³³.

Figura 1: Espectroscopia de correlación de fluorescencia (cruzada) basada en excitación pulsada intercalada (PIE) (F(C)CS). (A) En FCS las moléculas marcados fluorescentemente difunden libremente dentro y fuera de un volumen focal (limitado por difracción) formado por un rayo láser enfocado que induce fluorescencia dentro de este pequeño volumen. Las fluctuaciones de intensidad resultantes de las moléculas que entran y salen del volumen están correlacionadas y proporcionan información sobre la movilidad de las moléculas. (B) En PIE, se utilizan dos líneas láser diferentes ("prompt" y "delay") para excitar la muestra etiquetada con dos fluoróforos diferentes ("verde" y "rojo"). La diferencia de tiempo entre ambos pulsos de excitación se adapta a las vidas de fluorescencia de los fluoróforos respectivos, de modo que uno se ha descompuesto antes de que el otro se exclame. En la muestra de doble etiqueta que se muestra, ambos fluoróforos están lo suficientemente cerca como para someterse a la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) desde el fluoróforo donante "verde" al fluoróforo aceptor "rojo". Por lo tanto, la emisión de fluorescencia roja se puede detectar en la ventana de tiempo "rápida" tras la excitación del donante verde. En la configuración utilizada(Nota complementaria 2),se utilizan dos detectores para cada color, uno orientado paralelo a la orientación del haz de excitación (denotado "p") y el segundo perpendicular (denotado "s"). (C) Se pueden determinar tres funciones de autocorrelación diferentes en un experimento PIE: Correlación de i) señales de canal verde en la ventana de tiempo de aviso(ACF_gp),ii) señales de canal rojo en la ventana de tiempo de aviso(ACF_rp)y iii) señales de canal rojo en la ventana de tiempo de retardo(ACF_rd). (D) Se pueden determinar dos funciones de correlación cruzada diferentes: iv) La correlación cruzada "PIE"(CCF_PIE)con señales de canal verde en la ventana de tiempo rápida correlacionada con las señales de canal rojo en la ventana de retardo, donde la amplitud de esta curva está relacionada con la co-difusión de fluoróforos; y v) la correlación cruzada "FRET"(CCF_FRET)con las señales del canal verde en la ventana de tiempo rápida correlacionada con las señales del canal rojo en la misma ventana de aviso; aquí la forma de esta curva a veces más rápida que la difusión está relacionada con los cambios de intensidad inducidos por FRET. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Calibración
La Figura 2A-B muestra una medida de calibración de los fluoróforos verdes y rojos que se difusan por sí solos, respectivamente. Sobre la base de un ajuste con eq. 1 y el coeficiente de difusión conocido D_verde²⁶ y D_rojo²⁷ la forma ( z₀ y w ₀) y el tamaño ( V_eff) del volumen de detección se calculan utilizando eq. 2a-c. Los resultados de ajuste del ACF_gp del fluoróforo verde y ACF_rd del fluoróforo rojo se resumen en la Figura 2C. Ambos fluoróforos muestran una constante de tiempo de relajación adicional de 8,6 μs (18%) y 36 μs (15%), respectivamente. El brillo molecular (eq. 5a-b) del fluoróforo verde y rojo asciende a 12,5 kHz por molécula y 2,7 kHz por molécula, respectivamente.

Para una estimación confiable del tamaño y la forma del volumen confocal, así como el brillo molecular, se recomienda realizar de 3 a 5 mediciones por experimento de calibración y un ajuste conjunto (o global) de todas las repeticiones.

La diafonía α(Figura 2D,eq. 3) y la excitación directa del aceptor por el láser verde δ(Figura 2E,eq. 4) para este par de fluoróforos se encuentran en ~ 15% y ~ 38%, respectivamente.

Figura 2: Mediciones de calibración del estándar de calibración verde y rojo de libre difusión. (A-B) Medición representativa de 60 s de una medición estándar de calibración de 2 nM verde (A) y 10 nM rojo (B) ajustada al modelo de difusión 3D que incluye un tiempo de relajación adicional (eq. 1). La tabla en el panel (C) muestra los resultados de ajuste y el parámetro derivado basado en eq. 2a-c y eq. 5a-b. *Los coeficientes de difusión fueron tomados de la literatura^26,^27. (D) Determinación de la diafonía α de la señal verde en los canales rojos (eq. 3). El espectro de excitación del estándar verde se muestra en cian, el espectro de emisión en verde. Las líneas láser de excitación a 485 nm (azul) y 561 nm (naranja) se muestran como líneas discontinuas. Las casillas transparentes de color verde y magenta muestran el rango de emisión recogido (Nota complementaria 2). (E) Determinación de la excitación directa δ del fluoróforo rojo por el láser de 485 nm (eq. 4). El código de color es idéntico a(D),el naranja claro y oscuro muestran el espectro de excitación y emisión del estándar rojo, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para determinar y calibrar la superposición del volumen de excitación verde y rojo, se utiliza una doble hebra de ADN doblemente etiquetada(Figura 3A)como se describió anteriormente. Aquí, los fluoróforos están espaciados 40 pb de tal manera que no puede ocurrir FRET entre los fluoróforos verdes y rojos unidos a los extremos de las hebras dobles de ADN. La Figura 3B muestra las autocorrelaciones de ambos fluoróforos en verde(ACF_gp)y magenta(ACF_rd)y la correlación PIE-cross, CCF_PIE,en cian. Tenga en cuenta que para CCF_PIE, la señal en los canales verdes en la ventana de tiempo de aviso se correlaciona con la señal en los canales rojos en la ventana de tiempo de retardo¹⁶.

Aquí, se obtiene un coeficiente de difusión promedio para la cadena de ADN de _ADN D = 77 μm²/s. Se pueden encontrar más detalles sobre el cálculo en el protocolo paso a paso, Nota complementaria 4. Este valor se obtiene insertando el tamaño de los volúmenes de detección verdes y rojos calibrados (Figura 2) y los respectivos tiempos de difusión de ACF_gp y ACF_rd de la cadena de ADN (Figura 3C) en la ecuación 2a. A continuación, utilizando los valores de corrección obtenidos r_GR y r_RG y utilizando eq. 6 más adelante, se puede determinar la cantidad de codifusión, es decir, moléculas de doble etiqueta (o complejos de proteínas en caso de co-transfección de dos proteínas diferentes) a partir de las muestras celulares.

Figura 3: Calibración del volumen de superposición verde-rojo utilizando una muestra de ADN. (A) La hebra de ADN utilizada para la calibración lleva un fluoróforo de calibración verde y rojo, con una distancia de 40 pb en el medio. La distancia entre ellos debe ser lo suficientemente grande como para excluir fret entre los fluoróforos. (B) Medición representativa de 60 s de una solución de ADN de 10 nM. Autocorrelaciones tanto de fluoróforos en verde(ACF_gp,verde estándar) y magenta(ACF_rd,estándar rojo) como de la PIE-crosscorrelation, CCF_PIE,en azul. La tabla en el panel (C) muestra los resultados de ajuste basados en el modelo de difusión 3D incluyendo un término de relajación adicional (eq. 1) y el parámetro derivado coeficiente de difusión de ADN, _ADN D (eq. 2a), el tamaño y la forma del volumen de superposición (eq. 2a-c) y las relaciones de corrección r_GR y r_RG (eq. 6 ). Tenga en cuenta que los valores para el volumen de detección verde y rojo (etiquetado con *) se tomaron del ajuste de los fluoróforos individuales que se muestran en la Figura 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Experimentos con células vivas
En la siguiente sección, se presenta el análisis de experimentos de células vivas para diferentes β₂construcciones de AR. Como β₂AR es una proteína de membrana, su difusión se limita en gran medida a una difusión bidimensional(Figura 4A)a lo largo de la membrana celular (excepto para procesos de transporte o reciclaje hacia o desde la membrana) ². Con la restricción a la difusión 2D el factor de forma s = z₀/w₀ en eq. 1 se vuelve obsoleto dando como resultado un modelo de difusión simplificado (eq. 9).

Construcciones monoeticadas: β₂AR-IL3-eGFP y NT-SNAP-β₂AR
La Figura 4 muestra mediciones ejemplares del constructo de etiqueta única β₂AR-IL3-eGFP(Figura 4B),donde eGFP se inserta en el bucle intracelular 3, y el constructo NT-SNAP-β₂AR(Figura 4C),donde la etiqueta SNAP se conjuga con el N-terminal de β₂AR. La etiqueta SNAP está etiquetada con un sustrato de superficie SNAP impermeable a la membrana. Las curvas representativas muestran el promedio de 4-6 mediciones repetidas con tiempos de adquisición de 120 - 200 s cada una. Las respectivas autocorrelaciones ACF_gp y ACF_rd de la señal eGFP y SNAP se ajustan a un modelo de difusión bimodal y bidimensional (eq. 9). En términos de dinámica rápida, eGFP muestra solo el triplete esperado parpadeando a t_R1 ~ 9 μs, mientras que la señal SNAP requiere dos tiempos de relajación, uno en el tiempo típico de parpadeo del triplete de t_R1 ~ 5 μs y un segundo en t_R2 ~ 180 μs.

El brillo molecular de los fluoróforos en las células vivas es de 0,8 KHz (eGFP) y 1,7 kHz (SNAP) por molécula bajo las condiciones de excitación dadas (eqs. 5a-b). La concentración de las construcciones AR etiquetadas β₂incorporadas en la membrana celular debe estar en el rango nanomolar y puede determinarse por el número promedio de moléculas (eq. 9, Figura 4C)y el tamaño del volumen confocal respectivo para el canal verde y rojo(Figura 2)utilizando eq. 8.

Figura 4: Medición representativa de constructos de una sola etiqueta. (A) En este estudio, se utilizó como ejemplo el receptor de membrana β₂AR. En contraste con los fluoróforos y la hebra de ADN utilizada para la calibración, que podrían flotar libremente a través del volumen de detección, las proteínas de membrana se difunden principalmente lateralmente a lo largo de la membrana, descrita como difusión en 2 dimensiones. (B, D) ACF_gp y ACF_rd de los constructos de etiqueta única β₂AR-IL3-eGFP (B) y NT-SNAP-β₂AR (D). Se muestra el promedio de 4-6 mediciones cada una recolectada durante 120 - 200 s. La tabla en el panel (C) muestra los resultados de ajuste de los datos al modelo de difusión bimodal bidimensional incluyendo términos de relajación adicionales (eq. 7). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Construcción de doble etiqueta: NT-SNAP-β₂AR-IL3-eGFP
En el constructo de doble etiqueta NT-SNAP-β₂AR-IL3-eGFP (corto NT-SNAP), eGFP se inserta en el bucle intracelular 3, y, la etiqueta SNAP se conjuga con el N-terminal de β₂AR(Figura 5A). En esta configuración, el eGFP está en el lado interno de la membrana y el SNAP en el lado exterior con distancias demasiado grandes para FRET. En un caso ideal, esta construcción mostraría 100% de codifusión del fluoróforo verde y rojo, y ninguna señal FRET. La Figura 5B-D muestra dos mediciones del NT-SNAP en dos celdas en dos días de medición diferentes. El ajuste del ACF_gp y el ACF_rd de la medición "mejor" que se muestra en la Figura 5B con eq. 7 y el CCF_PIE con eq. 9, revela 50-60 moléculas en foco para el ACF_gp y ACF_rd,mientras que N_app,por lo tanto 1/G₀(t_c) ~ 114 para el CCF_PIE (Figura 5C ). La concentración de receptores etiquetados se encuentra en el rango de ~100 nM según lo determinado con eq. 8. Para determinar la concentración media de moléculas doblemente etiquetadas, en primer lugar, se calcula la relación de G₀(t_c) (representada por 1 /N_(app)) del CCF_PIE a ACF_gp y ACF_rd, respectivamente, (eq. 6). A continuación, estos valores, r_GRcell= 0.43 y r_RGcell = 0.53 se comparan con los valores obtenidos de la medición de ADN (r_{GR, DNA}= 0.51 y r_{RG, DNA} = 0.79 en este día de medición). Usando la regla de proporciones, un r_GRcell= 0.43 del ACF_gp de la señal eGFP refleja una fracción de co-difusión (r_GRcell/r_GR,DNA) de 0.84, donde para el otro caso de ACF_rd de la señal de sustrato SNAP, este valor asciende a 0.67. La concentración promedio de la construcción NT-SNAP de doble etiqueta finalmente se puede calcular en base a eq. 10. En contraste, en la medición que se muestra en la Figura 5D de un día diferente, la concentración de receptores es bastante baja y los datos muy ruidosos, de modo que el rango de ajuste está limitado hasta ~ 10 μs. Además, solo se observa una baja cantidad de co-difusión (15 - 26%).

Figura 5: Construcción NT-SNAP-β₂AR-IL3-eGFP de doble etiqueta. (A) En la construcción de doble etiqueta, el eGFP se inserta en el bucle intracelular 3 y la etiqueta SNAP unida al extremo N de β₂AR (NT-SNAP). (B, D) ACF_gp, ACF_rd y CCF_PIE de dos medidas del constructo de doble etiqueta. Los datos se ajustan a un modelo de difusión bimodal bidimensional(eq. 9, CCF_PIE)e incluyen términos de relajación adicionales(eq. 7, ACF_gp y ACF_rd). La tabla en el panel (C) muestra los resultados de ajuste y la concentración del parámetro derivado (eq. 8), la relación de la amplitud de correlación en el tiempo de correlación cero (G₀(t_c)) y la fracción de moléculas co-difusora (eq. 10). Tenga en cuenta que las mediciones se adquirieron en días diferentes, por lo que se utilizó un factor ligeramente diferente para la corrección de amplitud (B: r_{GR, ADN} = 0.51 y r _{RG, ADN} = 0.79; D: r_GR,ADN = 0,51 y r_RG,ADN = 0,56). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Construcción de doble etiqueta sometida a FRET: β₂AR-IL3-eGFP-CT-SNAP
En la construcción de doble etiqueta β₂AR-IL3-eGFP-CT-SNAP (Figura 6A), el eGFP se inserta en el bucle intracelular 3 idéntico al NT-SNAP-β₂AR-IL3-eGFP con la etiqueta SNAP adjunta al extremo C. Aquí, ambas etiquetas están en el mismo lado de la membrana plasmática de las células, de modo que los fluoróforos están muy cerca para que freT ocurra según lo indicado por la vida útil de eGFP apagada(Nota suplementaria 5). Teniendo en cuenta la flexibilidad de regiones proteicas relativamente no estructuradas como la C-terminal³⁴ y al menos dos conformaciones proteicas diferentes de GPCR^35,"FRET alto" (HF) o "FRET bajo" (LF), los cambios dinámicos en la eficiencia de FRET debido a los cambios de distancia eGFP-SNAP podrían observarse e identificarse mediante un término de anticorrelación en el _FRET CCF (curva naranja en la Figura 6B ). Se ha demostrado que las fluctuaciones de FRET son anticorrelacionadas, ya que el receptor solo puede estar en un estado a la vez, ya sea HF o LF. El ajuste conjunto (o global) de las cinco curvas de correlación(Figura 6B)revela ~ 70% de moléculas que se difunden lentamente a ~ 100 ms, mientras que el resto se difunde con ~ 1 ms. Todas las autocorrelaciones y CCF_FRET muestran términos de relajación a 37 μs y 3 μs; las correlaciones dominadas por la señal roja(ACF_rp, ACF_rd y CCF_FRET)muestran un componente lento adicional ~ 50 ms(Figura 6C).

Los cambios inducidos por FRET en el _FRET CCF bajo diferentes condiciones (Figura 6D) se demuestran mediante una serie de simulaciones de un sistema de dos estados con un tiempo de fluctuación de 70 μs entre los estados LF y HF. Al cambiar del estado LF al HF, se observan cambios en la señal anticorrelacionada en la ventana de tiempo rápida: la señal verde disminuye y la señal roja aumenta (viceversa para la conmutación HF -> LF). Si la conmutación HF-LF ocurre en escalas de tiempo más rápidas que el tiempo de difusión, en otras palabras, durante el tiempo de residencia de la molécula en el foco, la velocidad se puede derivar de la anticorrelación en el CCF_FRET⁶^,³¹^,³⁶. Tenga en cuenta que los procesos dinámicos más lentos que el tiempo de difusión no se pueden observar en FCS.

En esta demostración, se asumieron dos escenarios FRET diferentes, mostrando un cambio moderado o máximo en la eficiencia FRET entre los dos estados. Las simulaciones se realizaron utilizando Burbulator³⁷ y consideraron la ausencia o presencia de parpadeo de tripletes y el aumento de la cantidad de diafonía del donante en los canales rojos. El término difusión se modeló como una distribución bimodal con un 30% de moléculas de difusión rápida a t_D1 = 1 ms y el resto de moléculas difundiendo lentamente con t_D2 = 100 ms. En total, se simularon^{10 7} fotones en un volumen 3D en forma de gaussiano con w₀ = 0,5 μm y z₀ = 1,5 μm, un tamaño de caja de 20, y N_FCS = 0,01.

La Figura 6E-F muestra los resultados de la simulación para el _FRET CCF de correlación cruzada inducido por FRET para contraste FRET moderado(Figura 6E)y máximo(Figura 6F)en ausencia (líneas sólidas) y presencia de parpadeo triplete (líneas discontinuas). La anticorre correlación inducida por FRET se puede ver fácilmente en la Figura 6F. El efecto de "amortiguación" al agregar un estado de triplete adicional reduce la amplitud de correlación(Figura 6E-F)³⁸^,³⁹.

Figura 6: Simulación de muestra de doble etiquetado que muestra FRET dinámico. (A) Doble etiquetado β₂AR con un eGFP insertado en el bucle intracelular 3 y una etiqueta SNAP C-terminal. Ambos fluoróforos están lo suficientemente cerca como para someterse a FRET y muestran cambios en la eficiencia de FRET si el receptor experimenta dinámica de proteínas. (B) Autocorrelación (ACF_gp, ACF_rp y ACF_rd, ajuste con eq. 7) y curvas de correlación cruzada (CCF_FRET (eq. 7) y CCF_PIE (eq. 9)) de una medición de ejemplo. La tabla del panel (C) muestra los resultados de ajuste. (D-F) Para mostrar la influencia del parámetro experimental en el término esperado de anticorrelación inducido por FRET, se realizaron 12 simulaciones, en las que se modeló el cambio en la eficiencia de FRET (pequeña o grande), diferente cantidad de diafonía del donante en los canales aceptores (0%, 1% o 10%) y la ausencia y presencia de parpadeo triplete. La fracción de equilibrio de ambos estados FRET se asumió a 50:50 y sus tipos de cambio se ajustaron de tal manera que el tiempo de relajación obtenido t_R = 70 μs. Más detalles sobre las simulaciones ver en el texto. (E) CCF_FRET de la simulación resulta con un contraste FRET moderado y en ausencia de diafonía (naranja oscuro), diafonía al 1% (naranja) y diafonía al 10% (naranja claro). Las líneas sólidas muestran resultados en ausencia de triplete, líneas discontinuas en presencia de triplete. (F) CCF_FRET de los resultados de la simulación con contraste FRET máximo. El código de color es idéntico a (E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Sin embargo, en la simulación más similar a las condiciones experimentales (α = 10%, 15% de parpadeo triplete y contraste FRET moderado, línea amarilla discontinua en la Figura 6E),el término anticorrelación está casi disminuido. La Figura 7 muestra el resultado del análisis de estos datos simulados utilizando la información codificada en los histogramas de tiempo de llegada de fotones (es decir, la vida útil de la fluorescencia) mediante espectroscopia de correlación de vida útil de fluorescencia (FLCS)¹⁷^,¹⁹ o FCS filtrado por especies (fFCS)¹⁸. Aquí, las vidas de fluorescencia de las especies conocidas de HF y LF(Figura 7A)se utilizan para generar pesos o "filtros"(Figura 7B)que se aplican durante el procedimiento de correlación. En las curvas de autocorrelación de especies y cruzadas obtenidas (Figura 7C-D) se puede observar claramente la anticorrelación.

Figura 7:FCS filtrado de por vida puede ayudar a descubrir las fluctuaciones basadas en la dinámica de proteínas en la eficiencia de FRET en muestras con alta diafonía, parpadeo significativo de tripletes u otras propiedades fotofísicas o experimentales que enmascaran la anticorrelación inducida por FRET en el CCF_FRET. Aquí, el enfoque se muestra ejemplar para los datos mostrados en la Figura 6E para la simulación que contiene 10% de diafonía y 5% de parpadeo de tripletes. (A) Patrones normalizados de desintegración de la intensidad de la fluorescencia para las dos especies de FRET (verde claro y verde oscuro para FRET alto y bajo, respectivamente) y el IRF (gris). El patrón para el canal de detección paralelo se muestra en líneas sólidas, líneas discontinuas para el canal de detección perpendicular. (B) La función de ponderación o "filtro" se generaron en base a los patrones mostrados en (A), el código de color es idéntico a (A). Tenga en cuenta que aquí solo se considera la señal en los canales de detección verdes y, por lo tanto, el enfriamiento del donante inducido por FRET. (C) Se obtienen cuatro correlaciones diferentes entre especies selectivas: autocorrelaciones de especies del estado FRET bajo(sACF_LF-LF,verde oscuro) y el estado FRET alto(sACF_HF-HF,verde claro), y las dos especies-corre correlaciones cruzadas entre el estado FRET bajo al estado FRET alto(sCCF_LF-HF,naranja oscuro) y viceversa(sCCF_HF-LF , naranja). El CCCC muestra claramente la anticorrelación en el rango de μs. Las líneas negras discontinuas muestran los ajustes. sACF se ajustaron con eq. 9 y sCCF con eq. 11. La tabla del panel (D) muestra los resultados de ajuste. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Amplitud DE CCF_PIE para estudiar la Interacción Proteína-Proteína (PPI)
Finalmente, un caso de uso común para FCS basado en PIE en células vivas es estudiar la interacción entre dos proteínas diferentes. Aquí, el parámetro de lectura es la amplitud del CCF_PIE,o más precisamente la relación entre las amplitudes de autocorrelación ACF_gp y ACF_rd con la amplitud del CCF_PIE. Para mostrar el efecto del aumento de la co-difusión en CCF_PIE,se han realizado simulaciones basadas en los dos constructos de una sola etiqueta, β₂AR-IL3-eGFP y NT-SNAP-β₂AR(Figura 8A). La Figura 8B muestra cómo la amplitud de CCF_PIE aumenta cuando la fracción de moléculas co-difusores cambia de 0% a 100%. Tenga en cuenta que se agregó una diafonía del 1% de señal verde en los canales rojos en la ventana de tiempo de retardo con los componentes de difusión modelados como se muestra arriba.

Figura 8: El _{CCF PIE} se puede utilizar para estudiar la interacción de dos proteínas. (A) Aquí, se simuló un estudio de co-transfección de β₂AR-IL3-eGFP con NT-SNAP-β₂AR (que lleva una etiqueta SNAP "roja"). (B) Para una cantidad creciente de moléculas co-difusores (0% (azul oscuro) -> 100% (azul claro)) la amplitud G(t_c) aumenta. El término difusión se modeló nuevamente como una distribución bimodal con un 30% de moléculas de difusión rápida en t_D1 = 1 ms y el resto de las moléculas difundiendo lentamente con t_D2 = 100 ms. Además, se agregó una diafonía del 1% de la señal verde en la ventana de tiempo de retardo roja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Símbolo	Significado (unidad común)
α	diafonía del fluoróforo verde después de la excitación verde en los canales de detección rojos (%)
a₁	fracción del primer componente de difusión en el modelo de difusión bimodal de receptores de membrana
_{a f}	amplitud total del término anticorrelación
_{a R}	amplitud de la fotofísica / triplete parpadeando
b	línea de base / desplazamiento de una curva de correlación
B	brillo molecular de un fluoróforo ((kilo-)recuentos por molécula y segundo)
BG	antecedentes (por ejemplo, de una muestra de referencia apropiada: ddH2O, tampón, celda no transfectada, etc.)
c	concentración
CR	tasa de recuento (KHz o (kilo-) recuentos por segundo)
δ	excitación directa del fluoróforo rojo después de la excitación verde (%)
D	coeficiente de difusión (μm²/s)
G(t_c)	función de correlación
N	número de moléculas en foco
N_A	Número de Avogadro (6.022*10²³ Mol^-1)
r_GR, r_RG	relación de amplitud de la función de autocorrelación verde o roja con respecto a la función de correlación cruzada basada en PIE
s	factor de forma del elemento de volumen confocal
t_c	tiempo de correlación (generalmente en milisegundos)
t_D	tiempo de difusión (generalmente en milisegundos o microsegundos)
t_R	tiempo de relajación de la fotofísica (generalmente en microsegundos)
t_T	tiempo de relajación del parpadeo del triplete (generalmente en microsegundos)
w₀	anchura media del elemento de volumen confocal (μm)
z₀	media altura del elemento de volumen confocal (μm)

Tabla 1: Lista de variables y abreviaturas. Para el uso de símbolos y definición en experimentos de fluorescencia y FRET, se recomiendan las directrices de la comunidad FRET^40.

EXPEDIENTES COMPLEMENTARIOS:

SuppNote1_Coverslip limpieza.docx Haga clic aquí para descargar este archivo.

SuppNote2_Confocal Configuración.docx Haga clic aquí para descargar este archivo.

SuppNote3_Data exportar.docx Haga clic aquí para descargar este archivo.

SuppNote4_FCCS análisis de calibración utilizando ChiSurf.docx Haga clic aquí para descargar este archivo.

SuppNote5_Fluorescence histogramas de por vida.docx Haga clic aquí para descargar este archivo.

S6_Scripts.zip Haga clic aquí para descargar este archivo.

S7_Excel_templates.zip Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Las técnicas FCS en GPCRs permiten evaluar la movilidad e interacciones de los receptores dentro de las células vivas⁴¹. La ventaja de la técnica FRET-FCS es que, junto con la movilidad, se puede investigar la dinámica conformacional de los GPCR. Sin embargo, realizar FRET-FCS en células vivas es un desafío y requiere células que muestren una expresión baja (o máxima moderada) de la proteína de interés etiquetada fluorescentemente, una configuración bien calibrada y una buena tubería para analizar los datos. Aquí, primero se discuten los puntos críticos en la preparación de la muestra y el procedimiento experimental con respecto a los puntos de vista biológicos, espectroscópicos y técnicos.

Los pasos experimentales críticos incluyen minimizar el fondo y la autofluorescencia (mediante el uso de cubiertas ampliamente limpias y medios libres de rojo fenol), la optimización de las condiciones de transfección (por ejemplo, la cantidad de ADN plásmido y el tiempo después de la transfección) para lograr bajos niveles de expresión y un etiquetado eficiente. Por supuesto, también es vital asegurarse de que la función de la proteína etiquetada no se vea obstaculizada. Por lo tanto, en experimentos con células vivas, la decisión de la estrategia de etiquetado y la posición de la etiqueta a menudo se toma a favor de las proteínas fluorescentes o la etiqueta SNAP / CLIP unida al extremo flexible N o C⁴²^,⁴³. Estrategias alternativas de etiquetado como la inserción de un aminoácido no natural con una cadena lateral reactiva para el etiquetado con un fluoróforo orgánico han ido surgiendo en los últimos años⁴⁴.

Para PIE-FCS de doble color, donde solo se debe investigar la interacción de dos moléculas de interés, los fluoróforos se pueden seleccionar de una gran variedad de proteínas fluorescentes establecidas o sustratos SNAP / CLIP. Aquí, en cuanto a la espectroscopia, el objetivo debe ser seleccionar un par de tal manera que se produzca poca diafonía o excitación aceptora directa. Además, los fluoróforos seleccionados deben ser fotoestables y mostrar poco o ningún blanqueamiento en las condiciones experimentales elegidas. Se recomienda seleccionar fluoróforos en el rango espectral rojo ya que (1) el fondo de autofluorescencia de la célula se reduce y (2) la luz de excitación es de longitud de onda más larga, por lo tanto menos fototóxica¹⁴. El fotobleaching se puede minimizar realizando primero una llamada "serie de potencia", en la que la potencia del láser se incrementa paso a paso y se observa el brillo molecular. El rango óptimo de intensidad de excitación se encuentra en el rango lineal de los resultados⁴⁵.

Si se supone que las dos etiquetas informan también sobre la dinámica conformacional de las proteínas a través de FRET, entonces la elección de los fluoróforos disponibles es más restringida. Aquí, la posible distancia mínima /máxima entre los dos fluoróforos debe estimarse de antemano, por ejemplo, en función de las estructuras disponibles o el tamaño molecular, y un par de fluoróforos seleccionado con un radio de Förster R ₀ razonable tal que FRET pueda ocurrir realmente²⁰.

Aquí, se eligió eGFP y una etiqueta SNAP para el etiquetado, y la etiqueta SNAP se etiquetó con un sustrato de superficie intracelular o impermeable a la membrana. Los espectros son similares a los que se muestran en la Figura 2C-D. Esta combinación de fluoróforos muestra una alta diafonía del eGFP en los canales de detección rojos y la excitación aceptora directa del sustrato SNAP por la excitación verde en la ventana de tiempo rápida y da como resultado una señal "falsa" significativa en los canales rojos en la ventana de tiempo rápida. Idealmente, ambos valores, la diafonía y la excitación del aceptor directo, no deben exceder el 5%^5,^6,^38. Sin embargo, con un radio de Förster de 57 Å, es ideal para sondear la distancia entre las etiquetas en el β₂AR-IL3-eGFP-CT-SNAP como se puede evaluar a partir de la vida útil de eGFP apagada (Nota suplementaria 5).

Técnicamente, como para cualquier experimento de espectroscopia de fluorescencia, el dispositivo debe estar bien alineado y debe poseer fuentes de excitación adecuadas, filtro de emisión y detectores sensibles. Para evitar artefactos del postpulso del detector en la escala de tiempo μs, deben estar presentes al menos dos detectores de cada color, que pueden estar correlacionados entre sí. En la electrónica moderna de conteo de fotón único correlacionada con el tiempo, el tiempo muerto de la tarjeta de detección en el rango de tiempo ns apenas juega un papel debido a los canales de enrutamiento independientes, sin embargo, podría verificarse como lo proponeN Müller et al ¹⁶ siempre que el rango de tiempo de interés se encuentre en el rango de tiempo sub-μs / ns. Además, para resoluciones de tiempo aún más altas en el rango ps, cada canal de detección debe duplicarse, es decir, se deben usar cuatro detectores por color, para evitar también los tiempos muertos del detector^2,^15,^29,^46. Si bien la vida útil promedio de la fluorescencia se puede estimar utilizando la detección de fluorescencia no polarizada, para el análisis de la distancia (~ distribución) entre los fluoróforos, la emisión debe recogerse dependiendo de la polarización. Esto se debe al hecho de que la eficiencia de la transferencia de energía en FRET se basa en la orientación de los dos fluoróforos. Información más detallada se puede encontrar aquí²⁰^,²⁸^,⁴⁷. Finalmente, en los experimentos PIE, la distancia entre el pulso de aviso y retardo es crítica y debe elegirse de tal manera que la intensidad de fluorescencia de los fluoróforos se haya descompuesto en gran medida(Figura 1B). Una regla común es colocar los dos pulsos 5 veces la vida útil de fluorescencia aparte, es decir, para eGFP con una vida útil de fluorescencia de 2.5 ns la distancia debe ser de 12.5 ns como mínimo²².

Después de haber detallado todas las consideraciones para el procedimiento experimental, los datos y su análisis se discuten con más detalle. Como se mencionó en la sección de protocolo, la alineación de la configuración debe verificarse diariamente, incluido el análisis de las mediciones de calibración. Los datos mostrados en la Figura 2A-C, por ejemplo, muestran un componente de relajación adicional en el rango de 8-40 μs. Se sabe que el parpadeo típico del fluoróforo de calibración verde ocurre en el rango de 2-10^{μs 13}^,¹⁵^,⁴⁸. El componente de relajación lenta requerido en todas las curvas de la muestra de ADN(Figura 3C),demasiado lento para el parpadeo real del triplete, podría provenir de las interacciones del ADN con los fluoróforos³⁹. Sin embargo, este componente no se esperaría en CCF_PIE,y lo más probable es que provena de la diafonía residual. Por lo tanto, es muy recomendable realizar el análisis de las muestras de calibración directamente antes de proceder a los experimentos celulares para juzgar la calidad de la alineación del día.

La calibración adecuada del volumen de superposición confocal requiere una muestra con 100% de co-difusión de la etiqueta verde y roja. Aquí, se utiliza ADN de doble cadena etiquetado fluorescentemente. Ambas hebras de ADN se pueden adaptar para tener los fluoróforos deseados a la distancia requerida entre sí. Las hebras diseñadas se pueden reconar con alto rendimiento. Sin embargo, Good Laboratory Practice aconseja verificar la integridad y el grado de etiquetado de las hebras de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa y medir el espectro de absorción. Además, se debe verificar el rendimiento del conjunto de doble cadena, ya que esta medición de calibración se basa críticamente en la suposición de que hay una co-difusión del 100% del verde con la etiqueta roja. En caso de que el supuesto no sea válido, los factores de corrección podrían tener que aplicarse¹⁶^,²². En las mediciones de calibración mostradas en la Figura 2 y figura 3,se obtuvo un volumen de detección de 1,4 fL y 1,9 fL en el canal verde y rojo, respectivamente. Esta diferencia de tamaño se espera para una configuración con volúmenes de excitación casi limitados por difracción (Nota suplementaria 2). Bajo esta condición, el tamaño del volumen de excitación escala con la longitud de onda de excitación. Esto a su vez explica las diferentes amplitudes de correlación observadas en la Figura 3B. Los factores de corrección _derivados r GR = 0,56 y r_RG = 0,72 corrigen esta discrepancia de tamaño y posible superposición no perfecta de los dos volúmenes de excitación³^,⁴.

La Figura 4, la Figura 5, la Figura 6y la Figura 7 muestran el flujo de trabajo de un estudio basado en PIE-F(C)CS destinado a comprender la dinámica de proteínas conformacionales. En primer lugar, las dos construcciones monoeticadas β₂AR-IL3-eGFP y NT-SNAP-β₂AR sirven como controles para caracterizar las propiedades del fluoróforo en las células en ausencia del otro fluoróforo respectivo(Figura 4). A continuación, la construcción de doble etiqueta NT-SNAP-β₂AR-IL3-eGFP que lleva una etiqueta SNAP frente al exterior de la célula y una eGFP en el lado citoplasmático sirve como un control de "co-difusión del 100%"(Figura 5). El último constructo, β₂AR-IL3-eGFP-CT-SNAP, lleva ambos fluoróforos en el lado citoplasmático y lo suficientemente juntos como para someterse a FRET. Aquí, nuevamente se esperaría una co-difusión del 100% en conjunto con fluctuaciones de intensidad anti-correlacionadas en la señal de los canales verde y rojo en la ventana de tiempo rápida, es decir, después de la excitación del donante, debido a la dinámica de la proteína que influye en la eficiencia FRET³¹^,³²^,³³. Esta dinámica podría aparecer como anticorre correlación en el FRET del _CCF (Figura 6-7).

Todos los constructos GPCR β₂AR muestran difusión bimodal en la membrana celular(Figura 4A). Mientras que el β₂AR-IL3-eGFP muestra solo el parpadeo del triplete esperado(Figura 5B)¹³^,¹⁵, NT-SNAP-β₂AR muestra un tiempo de relajación lento adicional (Figura 5C-D). Es probable que t_{R2 pueda} provenir de un sustrato SNAP no unido. Esto podría dilucidarse mediante experimentos adicionales, por ejemplo, midiendo también la difusión y las propiedades fotofísicas del sustrato SNAP utilizado en una solución acuosa. Cabe destacar que un experimento sencillo para diferenciar entre tiempos de difusión y relajación es cambiar el agujero de alfiler de la configuración confocal, es decir, aumentar el volumen efectivo: mientras que los tiempos de difusión aumentan con el aumento de los volúmenes efectivos, los términos de relajación no se modifican¹³. A la hora de determinar la concentración de proteína fluorescente (FP) en base a los resultados de ajuste, tenga en cuenta que los FP en general se someten a un proceso de maduración, en el que finalmente se forma el cromóforo¹². Este tiempo de maduración puede diferir de FP a FP además de la fotofísica que depende del entorno químico local¹³^,¹⁵. Por lo tanto, la concentración real de proteínas presente en la muestra reportada por FCS generalmente se subestima, lo que puede corregirse si se puede determinar la fracción de FP no fluorescentes en el experimento. Por último, es recomendable comprobar los espectros de fluoróforos en células vivas para corregir los valores de α y δ, si es necesario, ya que la mayoría de los fluoróforos reaccionan sensibles a su entorno^13,^15,^48. El fondo a restar está determinado por la señal recogida en células no transfectadas. Además, se debe verificar la autocorrelación del otro canal de color respectivo y el _{CCF PIE} para poder identificar señales falsas(Nota complementaria 4 - Figura 30).

Las dos mediciones del NT-SNAP-β₂AR-IL3-eGFP(Figura 5D),donde los fluoróforos se encuentran en diferentes lados de la membrana, se adquirieron en diferentes días y muestran la importancia de la estadística en la fluorescencia de molécula única resuelta en el tiempo. Aquí, los diferentes resultados pueden deberse al diferente grado de etiquetado: en una celda, el mayor grado de etiquetado y promedio de las mediciones resultó en un ruido relativamente bajo(Figura 5B),mientras que en la otra celda, solo se pudieron recopilar dos mediciones(Figura 5A). Más allá de recopilar una cantidad suficiente de datos, es fundamental evaluar los resultados a tiempo y tal vez optimizar la estrategia de etiquetado. Al diseñar los experimentos, es importante recordar que FRET es sensible, pero limitado a distancias de hasta 10 nm y "ciego" de lo contrario. En nuestro caso, esta "ceguera" está indicada por la vida útil de fluorescencia eGFP inalterada (Nota complementaria 5). En la construcción β₂AR-IL3-eGFP-CT-SNAP(Figura 6A),FRET se puede identificar a partir de la vida útil de eGFP apagada (Nota complementaria 5). Sin embargo, no se observa ningún término de anticorrelación(Figura 6B),lo que significa que FRET no fluctúa o en una escala de tiempo más lenta que el tiempo de difusión. Se requieren hasta tres términos de relajación adicionales en ACF_gp, ACF_rp, ACF_rd y CCF_FRET (Figura 6C). El componente lento en ACF_rp, ACF_rd y CCF_FRET podría deberse al blanqueamiento del aceptor y, por supuesto, influye en el valor obtenido de la difusión lenta que se encuentra en estas curvas (~350 ms en comparación con 117 ms en ACF_gp). Se supone que t_D en el canal rojo es ligeramente más grande que en el canal verde debido a los volúmenes confocales de diferentes tamaños (Figura 2), pero solo por un factor comparable a la diferencia de tamaño. El tiempo de relajación muy rápido de 3 μs refleja el parpadeo triplete de los fluoróforos^13,^15,^48,mientras que el tiempo de relajación más lento de 37 μs podría deberse a FRET: Del mismo modo, como FRET induce una anticorrelación en el _FRETCCF,se esperan correlaciones positivas en las autocorrelaciones^31,^32,^33. La presencia de este término como "positivo" en el_FRET del CCF y su presencia en el ACF_rd podría explicarse con la diafonía alta y debería dilucidarse más a fondo. Tenga en cuenta que el PIE del CCF es plano en tiempos de correlación cortos como se esperaba.

Por otro lado, cabe señalar que la ocurrencia de FRET en un sistema de interés conduce a efectos no lineales sobre las curvas de correlación⁶. El brillo molecular, por ejemplo, de una molécula escala en la amplitud de correlación al cuadrado y cada estado FRET (y las moléculas siempre presentes sin un receptor activo) muestra un brillo molecular diferente. De hecho, FRET disminuye la concentración aparente de moléculas verdes detectadas (es decir, aumenta la amplitud de ACF_gp) y el número de moléculas rojas (determinado a partir de la indicación roja) se sobreestima⁵. Ambos efectos influyen en la cantidad de interacción derivada tanto de CCF_FRET como de CCF_PIE. Sin embargo, el análisis global como se muestra, por ejemplo, para la dinámica intramolecular de Calmodulina ^31,³² o Sintaxina³³ puede revelar la dinámica de la proteína. Cuando se calibra cuidadosamente, la eficiencia media de FRET puede extraerse de las amplitudes relativas CCF_PIE y ACF²², mientras que los estados limitantes pueden determinarse a partir del análisis de la distribución de la vida útil de la fluorescencia del donante³³.

Teniendo en cuenta el hecho de que en experimentos de células vivas con fluoróforos grandes como eGFP es probable que el contraste FRET sea incluso más bajo de lo que se supone para las simulaciones mostradas en la Figura 6 y que la excitación directa del aceptor no se agregó en la simulación, podría explicar por qué la identificación de la anticorrelación en experimentos con células vivas es muy desafiante. Una alternativa de análisis prometedora se basa en la recolección de la información codificada en los histogramas de tiempo de llegada de fotones(Figura 1B)accesibles debido a la recopilación de datos de conteo de fotón único correlacionados en el tiempo²⁹^,³⁰. Si se conoce la vida útil de fluorescencia (~patrones) de las dos (o más) especies (FRET) dentro de la muestra(Figura 7A),se puede elegir "filtro" o pesos que se aplican durante el proceso de correlación(Figura 7B)¹⁷^,¹⁸^,¹⁹. Las curvas de correlación así obtenidas, ya no representan la correlación de los canales de detección, sino más bien las correlaciones automáticas o cruzadas entre dos especies diferentes (FRET), por lo que se renombran a especie-ACF (sACF) o especie-CCF (sCCF). Aplicando este enfoque a los datos simulados con contraste FRET moderado, diafonía alta y parpadeo triplete recupera el término anticorrelación(Figura 7C-D). Sin embargo, cabe destacar que se pueden obtener tiempos de relajación pero se pierde la relación con la amplitud¹⁸. Este enfoque se ha aplicado previamente en experimentos de células vivas, por ejemplo, para estudiar la interacción de EGFR con su antagonista⁴⁹ o para separar la fluorescencia de las proteínas unidas a variantes de eGFP con vidas de fluorescencia excepcionalmente cortas y largas⁵⁰.

Mientras que las mediciones FRET basadas en PIE en proteínas purificadas se utilizan en gran medida para estudiar la dinámica de^{proteínas 36}²², en células vivas se centra en comprender las interacciones proteína-proteína. Este enfoque se ha aplicado para estudiar la regulación de la actividad de la MAP quinasa en^{levaduras 51} o para resolver la interacción de las proteínas de membrana con su compañero de unión citosólica como se resume en este reciente artículo^52. Aquí, pueden surgir complicaciones cuando la diafonía significativa de fluoróforos verdes todavía está presente en la ventana de tiempo de retraso de los canales rojos o la señal roja en los canales verdes en la ventana de tiempo rápida. El primero podría ser causado por un retraso insuficiente del pulso rojo con respecto al pulso verde, mientras que ambos efectos se derivan de espectros de excitación y emisión demasiado fuertemente superpuestos de los fluoróforos elegidos. Se recomienda verificar cuidadosamente las respectivas construcciones de una sola etiqueta y corregir las amplitudes _PIE de CCF falsos positivos, especialmente en células donde la autofluorescencia con una vida útil de fluorescencia muy corta podría ser otro factor complicado²².

Para concluir, el enfoque FRET-FCS descrito aquí tiene un gran potencial para comprender las interacciones proteína-proteína y la dinámica de proteínas en células vivas a concentraciones casi fisiológicas. En este protocolo, se centró en las mediciones de calibración requeridas y el análisis cuantitativo necesario que se realizará durante las mediciones de células vivas. Con este fin, se mostraron diferentes mediciones de células vivas complementadas con simulaciones. Las simulaciones proporcionan la comprensión general aquí, ya que el parámetro podría variarse sistemáticamente con modelos de ajuste personalizados que describen la movilidad específica y las propiedades fotofísicas de los datos respectivos. El análisis se realizó con herramientas de software de código abierto con un extenso protocolo paso a paso y plantillas fáciles de adaptar. Finalmente, los avances técnicos y, por lo tanto, la disponibilidad de sistemas PIE-FCS estables listos para comprar, junto con la difusión de software de código abierto para el análisis de datos, harán que esta técnica sea cada vez más accesible para una comunidad de investigación más grande para eventualmente desentrañar la interacción y la dinámica de las proteínas en células vivas con la mayor sensibilidad.

Disclosures

Los autores no tienen conflictos que declarar.

Acknowledgments

Este proyecto fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB/TR 240, número de proyecto 374031971, Proyecto INF) a J.B. y K.G.H.

Agradecemos al Centro Rudolf Virchow por el apoyo financiero y a Core Unit Fluorescence Imaging por el apoyo técnico. Además, agradecemos a Ashwin Balakrishnan por una completa revisión.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Telescope in 4f configuration with five lenses	Qioptiq, Rhyl, UK	G063126000	Optics
2x Band pass filters Brightline	AHF, Tübingen, Germany	HC 525/50 and HC 600/52	Filter
2x Dichroic beam splitter	AHF, Tübingen, Germany	HC BS F38-573	Filter
6-well culture plate Nunc	Thermo Scientific (Waltham, USA)	140675	Reagent
Alexa Fluor 488 NHS Ester (green calibration standard)	Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)	A20000	Reagent
Alexa Fluor 568 NHS Eater (red calibration standard)	Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)	A20003	Reagent
ASI stage PZ-2000 XYZ	Visitron Systems GmbH, Puchheim, Germany	WK-XYB-PZ-IX71	Microscope Parts
Attofluor Cell Chamber, 35 mm diameter for 25 mm round coverslips	Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)	A7816	Glass coverslip holder
Avalanche photodiode Perkin Elmer (SPCM-AQR-14)	Laser Components GmbH, Olching, Germany	SPCM-AQR-14	Single photon counting detector
Beamsplitter	Newport, Darmstadt, Germany	10FC16PB.3	Filter
Biorender (Software)	Science Suite Inc - o/a BioRender (Toronto, Canada)	---	Software used to create GPCR sketch, https://app.biorender.com/
Chinese hamster ovary (CHO) cell line	ATCC	CCL-61	Cell lines
ChiSurf (Data analysis Software)	Thomas-Otavio Peulen, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, USA	---	tttrlib-based software to analyze fluorescence correlation data and fluorescence decay histograms, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf Tutorial: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&t=2s Ref: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017)
Chloroform	Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)	472476-2.5L	Reagent
DMSO	AppliChem GmbH (Darmstadt, Germany)	A3672,0250	Reagent
DNA strand (40 bp fluorophore distance)	IBA Lifesciences GmbH (Göttingen, Germany)	---	Reagent, 5’ CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3’, 3’ GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5’
Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (with and without phenol red)	GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)	P04-41250, P04-41650	Reagent
Ethanol (absolute)	Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)	34852-1L-M	Reagent
Erythrosin B,Dye content >=95 %	Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)	200964-5G	Reagent, Instrument Response function, solve in EtOH to 10 mg/mL
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biochrom (Berlin, Germany)	S 0615	Reagent
Fluorescence Light Source X-Cite 120 Q	Excelitas Technologies, Ontario, Canada	XI120-Q-5060	Microscope Parts
Fluorescent SNAP-substrate cell : SNAP Cell TMR- STAR	New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany)	S9105S	Reagent
Fluorescent SNAP-substrate surface : DY-549	New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany)	S9112S	Reagent
Glass coverslips (Dimensions: diameter 24 mm, thickness 0.13 - 0.16 mm)	Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany)	111640	Reagent
Laser Controller	Picoquant, Berlin, Germany	910020 (PDL 828-S "SEPIA II")	Optics
Laser lines (480 nm and 560 nm)	Picoquant, Berlin, Germany	912485 (LDH-D-C-485), 912561 (LDH-D-TA-560)	Optics
Lipofectamine 2000	Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)	11668-019	Reagent
MFD suite (Software)	AG Seidel, Heinrich-Heine-University Duesseldorf, Germany	---	Software package for analysis of single-molecule fluorescence experiments including e.g. Kristine (correlation of tttr data), Burbulator (simulation of single-molecule experiment), https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis
Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25.4 mm	Thorlabs, Bergkirchen, Germany	AC254-150-A-ML	Second part of Beam expander
Neubauer Chamber (deepness 0.1 mm)	Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany)	640110	Reagent
Olympus IX 71 stand	Olympus, Hamburg, Germany	IX2-ILL100	Microscope Parts
Opti-MEM (Reduced-Serum Medium)	GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)	31985-047	Reagent
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)	049M4857V	Reagent
Phosphate-buffered Saline (PBS)	GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)	14190144	Reagent
Pinhole (50 µM)	Newport, Darmstadt, Germany	PNH-50	Pinhole
PMT Hybrid-40	Picoquant, Berlin, Germany	932200 (PMA Hybrid 40)	Single photon counting detector
Python scripts (Software)	Katherina Hemmen, Rudolf-Virchow Center for Integrative and Translational Imaging, University Wuerzburg, Germany	---	Collection of self-written Python scripts based on tttrlib (https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib) used to (1) determine the average count rates, (2) correlate the data and (3) build fluorescence decay histograms, https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS
Quad band beamsplitter (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1)	AHF, Tübingen, Germany	F73-421PH	Filter
Single mode fiber polarization keeping, NA = 0.08 with collimator	Picoquant, Berlin, Germany	02126	Optics
Sodium Hydroxide (NaOH)	Carl Roth (Karlsruhe, Germany)	6771.1	Reagent
SymPhotime x64 Software (Data collection and data export software)	Picoquant, Berlin, Germany	931073 (SPT64-1+2 single user )	Time-tag time-resolved (tttr) data collection at the self-built FCCS setup, data export
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system Hydraharp 400	Picoquant, Berlin, Germany	930010 (Hydraharp 400)	Optics
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)	T4299-100ml	Reagent
Unmounted Achromatic Doublets, ARC: 400 - 700 nm, D=12.7 mm, F=-20 mm	Thorlabs, Bergkirchen, Germany	ACN127-020-A	First part of Beam expander
Water immersion objective (UPlanSApo 60x/1.20 W)	Olympus, Hamburg, Germany	UPLSAPO60XW	Objective

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Biochemistry

Espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia de doble color para estudiar la interacción proteína-proteína y la dinámica de proteínas en células vivas

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

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