Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Fluorescens spektroskopi med dubbla färger för att studera protein-proteininteraktion och proteindynamik i levande celler

Published: December 11, 2021 doi: 10.3791/62954
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 2, 1
1Rudolf Virchow Center for Integrative and Translation Bioimaging, Julius-Maximilian University Wuerzburg, 2Max Delbrück Center for Molecular Medicine, Berlin
* These authors contributed equally

Summary

Vi presenterar ett experimentellt protokoll och dataanalysarbetsflöde för att utföra levande cell dual-color fluorescence cross correlation spektroskopi (FCCS) kombinerat med Förster Resonance Energy transfer (FRET) för att studera membranreceptordynamik i levande celler med hjälp av moderna fluorescensmärkningstekniker.

Abstract

Vi presenterar ett protokoll och arbetsflöde för att utföra levande cell dual-color fluorescence cross-correlation spektroskopi (FCCS) kombinerat med Förster Resonance Energy transfer (FRET) för att studera membranreceptordynamik i levande celler med hjälp av moderna fluorescensmärkningstekniker. I dubbelfärgs-FCCS, där fluktuationerna i fluorescensintensitet representerar det dynamiska "fingeravtrycket" av respektive fluorescerande biomolekyl, kan vi undersöka samdiffusion eller bindning av receptorerna. FRET, med sin höga känslighet för molekylära avstånd, fungerar som en välkänd "nanoruler" för att övervaka intramolekylära förändringar. Sammantaget blir konformationella förändringar och nyckelparametrar som lokala receptorkoncentrationer och rörlighetskonstanter tillgängliga i cellulära inställningar.

Kvantitativa fluorescensmetoder är utmanande i celler på grund av höga ljudnivåer och provets sårbarhet. Här visar vi hur du utför detta experiment, inklusive kalibreringsstegen med dubbelfärgsmärkta β2-adrenerga receptor (β2AR) märkt med eGFP och SNAP-tag-TAMRA. En steg-för-steg-dataanalysprocedur tillhandahålls med hjälp av programvara och mallar med öppen källkod som är enkla att anpassa.

Vår riktlinje gör det möjligt för forskare att nysta upp molekylära interaktioner av biomolekyler i levande celler på plats med hög tillförlitlighet trots de begränsade signal-till-brus-nivåerna i levande cellexperiment. Frets operativa fönster och särskilt FCCS vid låga koncentrationer möjliggör kvantitativ analys vid nästan fysiologiska förhållanden.

Introduction

Fluorescensspektroskopi är en av de viktigaste metoderna för att kvantifiera proteindynamik och protein-proteininteraktioner med minimal störning i cellulärt sammanhang. Konfokal fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) är en av de kraftfulla metoderna för att analysera molekylär dynamik eftersom den är enmolekylär känslig, mycket selektiv och livecellskompatibel1. Jämfört med andra dynamikorienterade metoder har FCS ett bredare mätbart tidsintervall som sträcker sig från ~ ns till ~ s, viktigast av allt täcker de snabba tidsskalor som ofta är otillgängliga med bildbaserade metoder. Dessutom ger det också rumslig selektivitet så att membran, cytoplasmisk och kärnans molekylära dynamik lätt kan särskiljas 2. Således molekylär blinkning, den genomsnittliga lokala koncentrationen och diffusionskoefficienten kan kvantitativt analyseras med FCS. Intermolekylär dynamik som bindning blir lättillgänglig när man undersöker samdiffusion av två molekylära arter i fluorescens cross-korrelationsspektroskopi (FCCS) analys3,4,5 i en dubbelfärgsmetod.

Den huvudsakliga underliggande principen i korrelationsspektroskopi är den statistiska analysen av intensitetsfluktuationer som avges av fluorescerande märkta biomolekyler som sprider sig in och ut ur ett laserfokus (figur 1A). De resulterande auto- eller korskorrelationsfunktionerna kan sedan analyseras ytterligare genom kurvpassning för att så småningom härleda räntekonstanterna av intresse. Med andra ord ger de statistiska metoderna FCS och FCCS inte enstaka molekylspår som i en enda partikelspårning, utan ett dynamiskt mönster eller "fingeravtryck" av ett undersökt exemplar med hög temporal upplösning. I kombination med Förster resonansenergiöverföring (FRET) kan intramolekylär dynamik som konformationsförändringar övervakas samtidigt i en gemensam konfokal inställning5,6. FRET undersöker avståndet mellan två fluoroforer och kallas ofta för en molekylär "nanoruler". Energiöverföring sker endast när molekylerna är i närheten (< 10 nm), givarens emissionsspektrum överlappar signifikant absorptionsspektrumet hos acceptormolekylen och givarens och acceptorns dipolorientering är (tillräckligt) parallell. Således ger kombinationen av FRET och FCCS en teknik med mycket hög spatio-temporal upplösning. När rumslig selektivitet, känslighet såväl som live-cellkompatibilitet krävs, har FRET-FCCS uppenbara fördelaktiga jämfört med andra metoder som Isothermal Titration Calorimetry (ITC)7,Surface Plasmon Resonance (SPR)8eller Nuclear Magnetic Resonance (NMR)9,10 för mätning av proteindynamik och interaktioner.

Trots kapaciteten och löftet om dubbelfärgsfluorescens tvärkorrelationsspektroskopi (dc-FCCS), är det tekniskt utmanande att utföra dc-FCCS i levande celler på grund av spektralblödnings- eller korstalk mellan kanalerna3,4, skillnaden i konfokala volymer på grund av de spektralmässigt distinkta laserlinjerna3,4,11, bakgrundssignal och brus eller begränsad fotostabilitet hos proverna12, 13,14,15. Införandet av puls interfolierad excitation (PIE) till FCCS var en viktig tweak för att tidsmässigt frikoppla de olika laser excitationerna för att minska spektral crosstalk mellan kanalerna16. Andra korrigeringsmetoder för att motverka spektralblödning17,18,19 och bakgrundskorrigeringar har också godtagits17,18,19. För detaljer och grunderna om FCS, PIE eller FRET hänvisas läsaren till följande referenser2,4,6,16,20,21,22,23,24.

Här presenteras alla nödvändiga kalibreringsexperiment och analyser tillsammans med experimentella resultaten av en prototypisk G-proteinkopplad receptor, β 2-adrenerga receptor (β2AR), för tre olika scenarier: (1) enkelmärkta molekyler som bär antingen en "grön" (eGFP) eller en "röd" (SNAP-taggbaserad märkning)25 fluorofre; (2) En dubbelmärkt konstruktion som har en N-terminal SNAP-tagg och intracellulär eGFP (NT-SNAP) [i detta fall är båda etiketterna i samma protein. Således förväntas 100% co-diffusion]; och (3) ett dubbelmärkt prov, där båda fluoroforerna finns på samma sida av cellmembranet (CT-SNAP). Den har en C-terminal SNAP-tagg och en intracellulär eGFP. Här är båda etiketterna återigen på samma protein med igen 100% co-diffusion förväntas. Eftersom båda etiketterna är mycket nära varandra, på samma sida av cellmembranet, visar det potentialen att observera FRET och antikorband relaterat beteende. Alla konstruktioner transfected i kinesiska hamster äggstock (CHO) celler och senare märkt med ett rött fluorescerande substrat som är membran-ogenomträngligt för NT-SNAP konstruktion och membran-genomsläppliga för CT-SNAP konstruktion. Slutligen exemplifierar simulerade data påverkan av experimentella parametrar på FRET-inducerad antikorrelation och effekten av protein-protein interaktioner på co-diffusion amplitud.

Således ger detta protokoll en komplett guide till att utföra den kombinerade FRET-FCCS i levande celler för att förstå proteindynamik och protein-proteininteraktioner samtidigt som man blir medveten om tekniska / fysiska artefakter, utmaningar och möjliga lösningar.

Protocol

1. Experimentellt protokoll

  1. Provberedning
    OBS: Utför cellsådd och transfektering under sterila förhållanden.
    1. Placera ett rengjort täckslip per brunn i en 6-väl odlingsplatta och tvätta tre gånger med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
      OBS: Rengöringsprotokollet för täckslip beskrivs i kompletterande anmärkning 1.
    2. Tillsätt till varje brunn 2 ml av det kompletta cellodlingsmediet som innehåller fenolrött (kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 100 μg/ml penicillin och 100 μg/ml streptomycin) och håll plattan åt sidan.
    3. Odla CHO-cellerna i samma medium som innehåller fenolrött vid 37 °C och 5% CO2. Tvätta cellerna med 5 ml PBS för att ta bort de döda cellerna.
    4. Tillsätt 2 ml trypsin och inkubera i 2 min vid rumstemperatur (RT).
    5. Späd de fristående cellerna med 8 ml medium som innehåller fenolrött och blanda försiktigt genom pipettering.
    6. Räkna cellerna i en Neubauer-kammare och frö med en densitet av 1,5 x 105 celler/brunn i 6-brunnscellsodlingsplattan som innehåller täckbladen (beredda i steg 1.1.1-1.1.2).
    7. Låt cellerna växa i en inkubator (37 °C, 5% CO2) i 24 timmar för att uppnå cirka 80% sammanflöde.
    8. Späd ut 2 μg av önskat vektor-DNA (t.ex. CT-SNAP eller NT-SNAP) och 6 μL av transfektreagenset i två separata rör, var och en innehållande 500 μL av det reducerade serummediet för varje brunn och inkubera i 5 min vid RT.
    9. Blanda de två lösningarna för att få transfektblandningen och inkubera den i 20 min på RT.
    10. Under tiden tvätta de sådda CHO-cellerna en gång med steril PBS.
    11. Ersätt PBS med 1 ml/brunn fenolrött medium kompletterat med 10% FBS utan antibiotika.
    12. Tillsätt hela 1 ml transfektblandning droppvis till varje brunn och inkubera cellerna över natten vid 37 °C, i 5% CO2.
    13. För märkning av SNAP-konstruktionen, späd ut lämplig SNAP-substratstamlösning i 1 ml av mediet kompletterat med 10% FBS för att erhålla en slutlig koncentration på 1 μM.
    14. Tvätta de transfekterade cellerna en gång med PBS och tillsätt 1 ml per brunn av 1 μM SNAP substratlösning. Inkubera cellerna i 20 min vid 37 °C i 5% CO2.
    15. Tvätta cellerna tre gånger med fenolrödfritt medium och tillsätt 2 ml per brunn fenolrödfritt medium. Inkubera cellerna i 30 min vid 37 °C i 5% CO2.
    16. Överför därefter täckbladen från alla prover till bildkammaren och tvätta med 500 μL avbildningsbuffert. Tillsätt 500 μL-bildbuffert innan du går över till FRET-FCS-installationen.
  2. Kalibreringsmätningar
    OBS: FRET-FCS-installationen är utrustad med ett konfokalt mikroskopvattenmål, två laserlinjer, ett tidskorrlat system för enkel fotonräkning (TCSPC), två hybridfotomultiplierrör (PMT) och två lavinfotodioder (APD) för fotoninsamling och datainsamlingsprogramvaran. Det är mycket viktigt att justera inställningen varje gång före live cellmätningar. Den detaljerade inställningsbeskrivningen finns i kompletterande anmärkning 2. Både lasrar och alla detektorer (två PMT och två APDs) är alltid PÅ under mätningarna, eftersom alla mätningar måste utföras under identiska förhållanden. För kalibreringsmätningarna, använd ett täckslip från samma parti som cellerna såddes på, vilket minskar variationen i krageringkorrigering.
    1. För att justera fokus, pinhole och krage ring position, placera 2 nM grön kalibreringslösning på ett glastäcke och slå på 485 nm och 560 nm laser. Använd laser i pulsed interleaved excitation (PIE) läge16.
    2. Fokusera på lösningen och justera pinhole och krage ring position så att den högsta räknehastigheten och minsta konfokala volymen erhålls för att få maximal molekylär ljusstyrka.
    3. Upprepa denna process för de röda kanalerna med 10 nM röd kalibreringslösning och en blandning av båda, den gröna och röda kalibreringslösningen.
    4. Placera 10 nM DNA-lösningen på ett glasöverdrag och justera fokus-, pinhole- och krageringspositionen så att korskorrelationen mellan de gröna och röda deektionskanalerna är högst, dvs. visar den högsta amplituden.
      OBS: Steg 1.2.1 och 1.2.4 kan behöva upprepas fram och tillbaka för att hitta den optimala inriktningen. Ta 3-5 mätningar från varje kalibreringslösning i 30 s - 120 s efter att fokus, pinhole och krage ring position har justerats optimalt för de gröna och röda detektionskanalerna och den konfokala överlappningsvolymen.
    5. Mät en droppe ddH2O, bildmediet och en icke-transfekterad cell 3-5 gånger vardera i 30 s - 120 s för att bestämma bakgrundsantalet.
    6. Samla in instrumentets responsfunktion med 3-5 mätningar för 30 s - 120 s. Detta är valfritt men rekommenderas starkt.
  3. Mätningar av levande celler
    1. Hitta en lämplig cell genom att belysa med kvicksilverlampan och observera genom okulären.
      OBS: Lämpliga celler lever som visar den typiska morfologin för respektive vidhäftande cellinje. Fluorescensen av proteinet av intresse, här en ytreceptor, är synlig över hela ytan. Mindre ljusa celler är mer lämpliga än ljusare på grund av den bättre kontrasten i FCS när ett lågt antal molekyler är i fokus.
    2. Slå på båda lasrarna i PIE-läge och fokusera på membranet genom att titta på de maximala räkningarna per sekund.
      OBS: Lasereffekten kan behöva minskas för cellproverna (mindre än 5 μW vid objektivt syfte). Detta beror på de använda fluoroforerna och installationen.
    3. Observera eGFP:s automatiska och korskorrelationskurvor eller märkta SNAP-tagg som är fäst vid β2AR i onlineförhandsvisningen av datainsamlingsprogramvaran och samla in flera korta mätningar (~ 2 -10) med en förvärvstid mellan 60 -180 s.
      OBS: Excitera inte cellerna under lång tid kontinuerligt eftersom fluoroforerna kan blekas. Det beror dock på ljusstyrkan i varje cell, hur långa mätningarna kan vara och hur många mätningar totalt som kan utföras.

2. Dataanalys

  1. Dataexport
    1. Exportera korrelationskurvorna G(tc) och räknehastigheter, CR, från alla mätningar.
    2. Var noga med att korrekt definiera tidsfönstren "fråga" och "fördröja" och använd alternativet "microtime gating" i datakorrelationsprogramvaran.
      OBS: Totalt krävs tre olika korrelationer: (1) autokorrelation av den gröna kanalen i prompttidsfönstret (ACFgp), (2) autokorruprelation för de röda kanalerna i fördröjningstidsfönstret (ACFrd), och slutligen (3) korskorrelationen mellan den gröna kanalsignalen i snabbtidsfönstret med den röda kanalsignalen i fördröjningstidsfönstret (CCFPIE). Dataexporten visas steg för steg för olika programvaror i kompletterande anmärkning 3.
  2. Kalibreringsmätningar
    1. Använd autokorrelationsfunktionerna hos de gröna (ACFgp) och röda (ACFrd) fluoroforlösningarna och passa dem till en 3D-diffusionsmodell med en extra trillingterm om det behövs (eq. 1) för att kalibrera formen och storleken på den konfokala detektionsvolymen för de två använda färgkanalerna:
      Equation 1 eq. 1
      Här är b kurvans baslinje, N antalet molekyler i fokus, tD diffusionstiden (i ms) och s = z0/w0 formfaktorn för det konfokala volymelementet. Trilling blinkar eller annan fotofysik beskrivs av dess amplitud aR och avslappningstid tR.
      Alla variabler och symboler som används i protokollet visas i tabell 1.
    2. Använd de kända diffusionskoefficienterna D för den gröna kalibreringsstandarden26 och rödkalibreringsstandarden 27 och de erhållna formfaktorerna ärgröna och röda för att bestämma dimensionerna (bredd w0 och höjd z0)och volym Veff av det konfokala volymelementet (eq. 2a-c).
      Equation 2eq. 2a
      Equation 3eq. 2b
      Equation 4eq. 2c
      OBS: Mallar för beräkning av kalibreringsparametern tillhandahålls som kompletterande filer (S7).
    3. Beräkna den spektrala korsstjälken α av den gröna fluorescenssignalen (som samlas in i kanalerna 0 och 2) i de röda detektionskanalerna (kanalnummer 1 och 3) som ett förhållande mellan de bakgrundskorrigerade (BG) signalerna (eq. 3).
      Equation 5
      eq. 3
    4. Bestäm den direkta excitationen av acceptorfluoforen δ av donatorexcitationsvåglängden med förhållandet mellan den bakgrundskorrigerade räknehastigheten för de röda kalibreringsmätningarna i "prompt"-tidsfönstret (excitation med grön laser) till bakgrundskorrigerad räkningshastighet i "fördröjnings"-tidsfönstret (excitation med röd laser) (eq. 4).
      Equation 6
      eq. 4
    5. Beräkna den molekylära ljusstyrkan B hos både de gröna och röda fluoroforerna (eq. 5a-b) baserat på bakgrundskorrigerade räknehastigheter och det erhållna antalet molekyler i fokus, N, från 3D-diffusionspassningen (eq. 1):
      Equation 7eq. 5a
      Equation 8eq. 5b
    6. Montera både ACFgp och ACFrd samt CCFPIE av det dubbelmärkta DNA:t på 3D-diffusionsmodellen (eq. 1). Håll de erhållna formfaktorerna, sgrön och sröd, konstant för ACFgp respektive ACFrd. Formfaktorn för CCFPIE, sPIE, är vanligtvis mellan dessa två värden.
      OBS: I en idealisk installation, både Veff,grön och Veff, rött skulle ha samma storlek och överlappa perfekt.
    7. Bestäm amplituden vid noll korrelationstid, G0(tc), baserat på de hittade värdena för det uppenbara antalet molekyler i fokus (Ngrön, Nröd och NPIE).
    8. Beräkna amplitudförhållandet rGR och rRG för ett prov med 100% samdiffusion av gröna och röda fluoroforer (eq. 6). Tänk på att NPIE inte återspeglar antalet dubbelmärkta molekyler i fokus utan endast återspeglar 1/G0(tc).
      Equation 9och Equation 10 eq. 6
  3. Experiment med levande celler
    1. För enkelmärkta konstruktioner monterar du cellproverna på en lämplig modell. För den visade membranreceptorn sker diffusion på ett bimodalt sätt med en kort och lång diffusionstid. Dessutom måste fotofysiken och blinkningen av fluoroforerna övervägas:
      Equation 11 eq. 7
      Här är td1 och td2 de två erforderliga diffusionstiderna, och en1 är fraktionen av den första diffusionstiden.
      OBS: I motsats till kalibreringsmätningarna, där de fria färgämnena och DNA-strängarna fritt sprider sig i alla riktningar, visar membranreceptorn endast 2D-diffusion längs cellmembranen. Denna skillnad mellan 3D- och 2D-diffusion återspeglas av den modifierade diffusionstermen (jämför eq. 1), där tD i 2D-fallet inte beror på formfaktorn s för det konfokala volymelementet.
    2. Beräkna koncentrationen c av gröna eller rödmärkta proteiner från respektive N- och V-eff med hjälp av grundläggande matematik (eq. 8):
      Equation 12eq. 8
      där NA = Avogadros nummer
    3. För N-terminal SNAP-etikett och intracellulär eGFP, montera de två autokorrelationerna(ACFgp och ACFrd)i det dubbelmärkta provet med samma modell som för de enkelmärkta konstruktionerna för ACL :er (eq. 7) och CCFPIE med hjälp av en bimodal diffusionsmodell (eq. 9):
      Equation 13eq. 9
      OBS: För en global beskrivning av systemet måste alla tre kurvorna passas gemensamt: Diffusionstermen är identisk för alla tre kurvorna och den enda skillnaden är avslappningstermen för CCFPIE. Eftersom fotofysik av två fluoroforer vanligtvis inte är relaterad, krävs ingen korrelationsterm. Denna avsaknad av avslappningsvillkor resulterar i en platt CCFPIE vid korta korrelationstider. Crosstalk och direkt excitation av acceptorn på grund av donatorfluoforen kan dock visa falskt positiva amplituder och bör noggrant kontrolleras för användning av kalibreringsmätningarna.
    4. Beräkna koncentrationen c av gröna eller rödmärkta proteiner från respektive N- och V-eff med hjälp av ekvation 8.
    5. Uppskatta fraktionen eller koncentrationen, cGR eller cRG,av interagerande gröna och röda märkta proteiner från cellproverna med hjälp av de korrigeringsfaktorer som erhållits från DNA-proverna, amplitudförhållandet rGR och rRG för cellprovet och deras respektive erhållna koncentrationer (eq. 10).
      Equation 14 och Equation 15 eq. 10
    6. För C-terminal SNAP-etikett och intracellulär eGFP, montera de två autokorrelationerna(ACFgp och ACFrd)i FRET-provet som enkelmärkta prover (ekvation 7) och CCFFRET till en bimodal diffusionsmodell som innehåller en antikorrelationsterm (ekvation 11)
      Equation 16 eq. 11
      där ettf återspeglar amplituden för den totala antikorrelationen och enR och tR respektive amplitud och avslappningstid.
      OBS: Vid antikorrrelaterade fluorescensförändringar på grund av FRET kan ett eller flera antikorrelationsvillkor krävas (eq. 11), vilket resulterar i en "dipp" av CCFFRET vid låga korrelationstider som sammanfaller med en ökning av de två autokorrelationerna(ACFgp och ACFrd). Tänk dock på att fotofysik som trilling blinkar kan maskera antikorrelationstermen genom att dämpa fret-inducerad antikorrelation. En gemensam analys kompletterad med filtrerade FCS metoder kan bidra till att avslöja anti-korrelation termen. Dessutom bör tekniska artefakter som härrör från döda tider i räkneelektroniken i nanosekundernas intervall uteslutas16. Ett mer detaljerat steg-för-steg-förfarande för hur analysen ska utföras i ChiSurf28 och mallar för beräkning av konfokal volym eller molekylär ljusstyrka finns på Github-arkivet (https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS) och som kompletterande filer(kompletterande anmärkning 4 och kompletterande anmärkning 6). Dessutom kan python-skript för batchexport av data som förvärvats med Symphotime-programvaran i .ptu-format hittas där.

Representative Results

Föredömliga resultat av kalibrerings- och livecellsmätningarna diskuteras nedan. Dessutom demonstreras effekten av FRET på korskorrelationskurvorna baserat på simulerade data bredvid effekten av protein-protein-interaktion som ökar CCF PIE-amplituden.

PIE-baserad FCS-dataexport
I PIE-experiment samlas data in i tidsmärkt tidslöst läge (TTTR)29,30. Figur 1B visar fotonens ankomsttid histogram av en PIE-mätning av en dubbelmärkt DNA-sträng på den beskrivna inställningen(kompletterande anmärkning 1). Installationen har fyra identifieringskanaler. Fluorescensemissionen delas först genom polarisering i "S" och "P" riktningar (med hänvisning till det vinkelräta och parallella planet där det elektriska fältet i en ljusvåg oscillerar). För det andra delas varje polariseringsriktning sedan i två färgkanaler (grön, röd) före detektion, vilket resulterar i fyra kanaler (S-grön, S-röd, P-grön, P-röd). I det "snabba" tidsfönstret blir den gröna fluoroforen upphetsad, och signalen detekteras i både de gröna och röda kanalerna på grund av FRET. I fördröjningstiden är endast den röda fluoroforen (i den röda kanalen) synlig. Baserat på detekteringskanalerna och "prompt" kontra "fördröjda" tidsfönster kan minst fem olika korrelationskurvor (3 autokorrelationskurvor (AFS) och 2 korskorrelationskurvor (CCFs)) erhållas (figur 1C-D): (1) grön signal i prompttidsfönstret (ACFgp), (2) röd signal i snabbtidsfönstret (när det gäller FRET, ACFrp), och (3) röd signal i fördröjningstidsfönstret(ACFrd). Dessa ACF-filer rapporterar om proteinrörlighet, fotofysik (t.ex. trilling blinkande) och andra tidskorrerade ljusförändringar i fluoroforerna (t.ex. på grund av FRET). (4) Den PIE-baserade korskorrelationen CCFPIE av den gröna signalen i snabbtidsfönstret med den röda signalen i fördröjningstidsfönstret gör det möjligt att bestämma fraktionen av samdiffusion av den gröna och röda fluoroforen16. (5) Den FRET-baserade korskorrelationen CCFFRET av den gröna med den röda signalen i prompttidsfönstret är relaterad till FRET-inducerade, antikorrelaterade ljusstyrkeförändringar i de gröna och röda signalerna31,32,33.

Figure 1
Figur 1: Pulsed-interfolierad excitation (PIE) baserad fluorescens (kors) korrelationsspektroskopi (F(C)CS). (A) I FCS fluorescerande märkta molekyler diffuserar fritt in och ut ur en (diffraktionsbegränsad) brännvolym formad av en fokuserad laserstråle som inducerar fluorescens inom denna lilla volym. De resulterande intensitetsfluktuationerna hos molekyler som kommer in och lämnar volymen är korrelerade och ger information om molekylernas rörlighet. (B) I PIE används två olika laserlinjer ("prompt" och "delay") för att excitera provet märkt med två olika fluoroforer ("gröna" och "röda"). Tidsskillnaden mellan båda excitationspulserna anpassas till fluorescenslivslängderna hos respektive fluoroforer så att den ena har förfallit innan den andra är upphetsad. I det dubbelmärkta provet som visas är båda fluoroforerna tillräckligt nära för att genomgå Förster Resonance Energy Transfer (FRET) från den "gröna" donatorfluoforen till den "röda" acceptorfluoforen. Således kan röda fluorescensutsläpp detekteras i "prompt" tidsfönstret vid excitation av den gröna givaren. I den använda inställningen (kompletterande anmärkning 2) används två detektorer för varje färg, en orienterad parallellt med excitationsstrålens orientering (betecknad "p") och den andra vinkelrät (betecknad "s"). (C) Tre olika autokorrelationsfunktioner kan bestämmas i ett PIE-experiment: Korrelation av i) gröna kanalsignaler i prompttidsfönstret (ACFgp), ii) röda kanalsignaler i prompttidsfönstret(ACFrp) och iii) röda kanalsignaler i fördröjningstidsfönstret (ACFrd). D) Två olika tvärkorrelationsfunktioner kan bestämmas: iv) "PIE" korskorrelationen(CCFPIE)med gröna kanalsignaler i det snabba tidsfönstret korrelerade med de röda kanalsignalerna i fördröjningsfönstret, där amplituden för denna kurva är relaterad till samspridning av fluoroforer; och v) korskorrelationen "FRET"(CCFFRET) med de gröna kanalsignalerna i prompttidsfönstret korrelerade med de röda kanalsignalerna i samma promptfönster. här är formen på denna kurva ibland snabbare än diffusion relaterad till DE FRET-inducerade intensitetsändringarna. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Kalibrering
Figur 2A-B visar en kalibreringsmätning av de enande diffusa gröna respektive röda fluoroforerna. Baserat på en passform med eq. 1 och den kända diffusionskoefficienten Dgrön26 och Dröd27 beräknas formen ( z0 och w 0) och storleken ( Veff) av detektionsvolymen med hjälp av 2a-c. Passformsresultaten från ACFgp från den gröna fluoroforen och ACFrd från den röda fluoroforen sammanfattas i figur 2C. Båda fluoroforerna uppvisar en extra avslappningstid konstant på 8,6 μs (18%) respektive 36 μs (15%). Den molekylära ljusstyrkan (eq. 5a-b) hos den gröna och röda fluoroforen uppgår till 12,5 kHz per molekyl respektive 2,7 kHz per molekyl.

För en tillförlitlig uppskattning av den konfokala volymstorleken och formen samt den molekylära ljusstyrkan rekommenderas att utföra 3-5 mätningar per kalibreringsexperiment och en gemensam (eller global) passform av alla upprepningar.

Crosstalk α (figur 2D, eq. 3) och den direkta excitationen av acceptor av den gröna lasern δ (figur 2E, eq. 4) för detta fluorofrepar ligger på ~ 15% respektive ~ 38%.

Figure 2
Figur 2: Kalibreringsmätningar av fritt diffuserande grön och röd kalibreringsstandard. (A-B) Representativ 60 s mätning av en 2 nM grön (A) och en 10 nM röd (B) kalibreringsstandard som är monterad på 3D-diffusionsmodellen inklusive en extra avslappningstid(eq. 1). Tabellen i panel (C) visar passformsresultaten och den härledda parametern baserat på eq. 2a-c och eq. 5a-b. *Diffusionskoefficienter hämtades från litteraturen26,27. d)Bestämning av den korsstjälken α av den gröna signalen i de röda kanalerna (eq. 3). Excitationsspektrumet för den gröna standarden visas i cyan, emissionsspektrumet i grönt. Excitationslaserlinjerna vid 485 nm (blå) och 561 nm (orange) visas som streckade linjer. Genomskinliga gröna lådor och magentalådor visar det insamlade utsläppsområdet(kompletterande anmärkning 2). (E) Bestämning av den direkta excitationen δ av den röda fluoroforen med 485 nm laser (eq. 4). Färgkod är identisk med (D), ljus och mörkorange visar excitation respektive emissionsspektrum för den röda standarden. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

För att bestämma och kalibrera överlappningen av den gröna och röda excitationsvolymen används en dubbelmärkt DNA-dubbelsträng (figur 3A) enligt beskrivningen ovan. Här är fluoroforerna åtskilda 40 bp ifrån varandra så att ingen FRET kan uppstå mellan de gröna och röda fluoroforerna som är fästa vid ändarna av DNA-dubbla strängar. Figur 3B visar autokorrelationerna från både fluoroforer i grönt (ACFgp) och magenta (ACFrd) och PIE-korskorrelationen, CCFPIE, i cyan. Observera att för CCFPIE är signalen i de gröna kanalerna i prompttidsfönstret korrelerad med signalen i de röda kanalerna i fördröjningstidens fönster16.

Här erhålls en genomsnittlig diffusionskoefficient för DNA-strängen av DDNA = 77 μm²/s. Mer information om beräkningen finns i steg-för-steg-protokollet, kompletterande anmärkning 4. Detta värde erhålls genom att föra in den kalibrerade gröna och röda detektionsvolymens storlek (figur 2) och respektive diffusionstider för ACFgp och ACFrd för DNA-strängen (figur 3C) i ekvation 2a. Därefter kan mängden samdiffusion, dvs.

Figure 3
Figur 3: Kalibrering av den grönröda överlappningsvolymen med hjälp av ett DNA-prov. (A) Dna-strängen som används för kalibrering har en grön och en röd kalibrering fluorofor, med ett avstånd av 40 bp däremellan. Det interdye distanserar måste vara tillräckligt stort för att utesluta FRET mellan fluoroforerna. (B) Representativ 60 s mätning av en 10 nM DNA-lösning. Autokorrelationer från både fluoroforer i grönt(ACFgp,grön standard) och magenta(ACFrd,röd standard) och PIE-crosscorrelation, CCFPIE, i blått. Tabellen i panel (C) visar passformsresultaten baserade på 3D Diffusion-modellen, inklusive en ytterligare avslappningsperiod (eq. 1) och den härledda parameterdiffusionskoefficienten för DNA, DDNA (eq. 2a),överlappningsvolymens storlek och form (eq. 2a-c) och korrigeringskvoterna rGR och rRG (eq. 6. ). Observera att värdena för den gröna och röda detektionsvolymen (märkta med *) togs från de enskilda fluoroforernas passform enligt figur 2. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Experiment med levande celler
I följande avsnitt presenteras analysen av live-cell experiment för olika β2AR konstruktioner. Eftersom β2AR är ett membranprotein är dess diffusion till stor del begränsad till en tvådimensionell diffusion(figur 4A) längs cellmembranet (med undantag för transport- eller återvinningsprocesser till eller från membranet) 2. Med begränsningen till 2D-diffusionen blir formfaktorn s = z0/w0 i eq. 1 föråldrad vilket resulterar i en förenklad diffusionsmodell (eq. 9).

Enkelmärkta konstruktioner: β2AR-IL3-eGFP och NT-SNAP-β2AR
Figur 4 visar föredömliga mätningar av konstruktionen med en etikett β2AR-IL3-eGFP (figur 4B), där eGFP sätts in i den intracellulära slingan 3, och konstruktionen NT-SNAP-β2AR (figur 4C), där SNAP-taggen är konjugerad till N-ändstationen β2AR. SNAP-taggen är märkt med ett membranimpererabelt SNAP-ytsubstrat. De representativa kurvorna visar genomsnittet av 4-6 upprepade mätningar med förvärvstider på 120-200 s vardera. Respektive autokorrelation ACFgp och ACFrd för eGFP- och SNAP-signalen är monterade på en bimodal, tvådimensionell diffusionsmodell (eq. 9). När det gäller snabb dynamik visar eGFP endast den förväntade trillingen som blinkar vid tR1 ~ 9 μs medan SNAP-signalen kräver två avslappningstider, en vid den typiska trilling blinkande tiden tR1 ~ 5 μs och en andra vid tR2 ~ 180 μs.

Fluoroforernas molekylära ljusstyrka i levande celler är 0,8 KHz (eGFP) och 1,7 kHz (SNAP) per molekyl under de angivna excitationsförhållandena (eqs. 5a-b). Koncentrationen av de märkta β2AR-konstruktioner som ingår i cellmembranet bör ligga i nano-molarområdet och kan bestämmas av det genomsnittliga antalet molekyler (punkt 9, figur 4C) och storleken på respektive konfokal volym för den gröna och röda kanalen(figur 2) med hjälp av eq. 8.

Figure 4
Figur 4: Representativ mätning av konstruktioner med en etikett. (A) I denna studie användes membranreceptorn β2AR som ett exempel. I motsats till fluoroforerna och DNA-strängen som används för kalibrering, som fritt kan flyta genom detektionsvolymen, sprids membranproteiner huvudsakligen i sidled längs membranet, beskrivet som 2-dimensionell diffusion. (B, D) ACFgp och ACFrd för konstruktionerna med en etikett β2AR-IL3-eGFP (B) och NT-SNAP-β2AR (D). Visas är genomsnittet av 4-6 mätningar som var och en samlas in för 120 -200 s. Tabellen i panel C (C) visar uppgifternas passformsresultat till den tvådimensionella diffusionsmodellen med bimodal, inklusive ytterligare avslappningsvillkor (eq. 7). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Dubbelmärkt konstruktion: NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP
I den dubbelmärkta konstruktionen NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP (kort NT-SNAP) sätts eGFP in i den intracellulära slingan 3 och SNAP-taggen konjugeras till N-ändstationen för β2AR(figur 5A). I den här konfigurationen är eGFP på insidan av membranet och SNAP på utsidan med för stora avstånd för FRET. I ett idealiskt fall skulle denna konstruktion visa 100% samspridning av den gröna och röda fluoroforen och ingen FRET-signal. Figur 5B-D visar två mätningar av NT-SNAP i två celler under två olika mätdagar. Att montera ACFgp och ACFrd av den "bättre" mätningen som visas i figur 5B med eq. 7 och CCFPIE med eq. 9, avslöjar 50- 60 molekyler i fokus för ACFgp och ACFrd, medan N-appen, alltså 1/G0(tc) ~ 114 för CCFPIE (Figur 5C ). Koncentrationen av märkta receptorer ligger i ~100 nM-intervallet enligt eq. 8. För att bestämma den genomsnittliga koncentrationen av dubbelmärkta molekyler beräknas först förhållandet mellan G0(tc) (representerat av 1 /N(app)) av CCFPIE till ACFgp respektive ACFrd(eq. 6). Därefter jämförs dessa värden, rGRcell= 0,43 och rRGcell = 0,53 med de värden som erhålls från DNA-mätningen (rGR, DNA= 0,51 och rRG,DNA = 0,79 denna mätdag). Med hjälp av proportionregeln reflekteras en rGRcell= 0,43 från EGFP-signalens ACFgp till en bråkdel av samdiffusionen (rGRcell/rGR, DNA)på 0,84, där detta värde för det andra fallet av ACFrd av SNAP-substratsignalen uppgår till 0,67. Den genomsnittliga koncentrationen av den dubbelmärkta NT-SNAP-konstruktionen kan slutligen beräknas baserat på eq. 10. I den mätning som visas i figur 5D från en annan dag är däremot koncentrationen av receptorer ganska låg och data mycket bullriga så att passformsområdet är begränsat upp till ~ 10 μs. Dessutom observeras endast en låg mängd samspridning (15-26%).

Figure 5
Bild 5:Dubbelmärkt NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP-konstruktion. (A) I den dubbelmärkta konstruktionen sätts eGFP in i den intracellulära slingan 3 och SNAP-taggen fäst vid N-ändstationen för β2AR (NT-SNAP). (B, D) ACFgp, ACFrd och CCFPIE med två mätningar av den dubbelmärkta konstruktionen. Uppgifterna är lämpliga för en tvådimensionell diffusionsmodell(eq. 9, CCFPIE) och inkluderar ytterligare avslappningsvillkor (eq. 7, ACFgp och ACFrd). Tabellen i panel (C) visar passformsresultaten och den härledda parameterkoncentrationen (eq. 8), förhållandet mellan korrelationsamplituden vid noll korrelationstid (G0(tc) och fraktionen av samdiffusionsmolekyler (eq. 10). Observera att mätningarna förvärvades på olika dagar, vilket innebär att något annorlunda faktor för amplitudkorrigeringen användes (B: rGR, DNA = 0,51 och r RG,DNA = 0,79; D: rGR,DNA = 0,51 och rRG,DNA = 0,56). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Dubbelmärkt konstruktion som genomgår FRET: β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP
I den dubbelmärkta konstruktionen β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP (figur 6A)sätts eGFP in i den intracellulära slingan 3 som är identisk med NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP-konstruktionen med SNAP-taggen ansluten till C-terminus. Här är båda etiketterna på samma sida av cellernas plasmamembran, så att fluoroforerna är i närheten så att FRET inträffar enligt den släckta eGFP-livslängden(kompletterande anmärkning 5). Med tanke på flexibiliteten hos relativt ostrukturerade proteinregioner som C-terminus34 och minst två olika proteinkonformationer av GPCRs35,"high FRET" (HF) eller "low FRET" (LF), kan dynamiska förändringar i FRET-effektiviteten på grund av eGFP-SNAP-avståndsförändringar observeras och identifieras med ett antikorrelationsbegrepp i CCFFRET (orange kurva i figur 6B ). FRET fluktuationer har visat sig vara antikorreserade eftersom receptorn endast kan vara i ett tillstånd i taget, antingen HF eller LF. Gemensam (eller global) passform av alla fem korrelationskurvor (figur 6B) avslöjar ~ 70% av långsamt diffuserande molekyler vid ~ 100 ms medan resten diffuserar med ~ 1 ms. Alla autokorrelationer och CCFFRET visar avslappningsvillkor vid 37 μs och 3 μs; de korrelationer som domineras av röd signal(ACFrp, ACFrd och CCFFRET) visar en ytterligare långsam komponent ~ 50 ms (figur 6C).

FRET-inducerade förändringar på CCFFRET under olika förhållanden(figur 6D) demonstreras genom en serie simuleringar av ett tvåstatssystem med en fluktuationstid på 70 μs mellan LF- och HF-tillstånd. Vid byte från LF till HF-tillstånd observeras förändringar i den antikorrelaterade signalen i snabbtidsfönstret: Den gröna signalen minskar och den röda signalen ökar (vice versa för HF-> LF-växling). Om HF-LF-växling sker på tidsskalor snabbare än diffusionstiden, med andra ord under molekylens uppehållstid i fokus, kan hastigheten härledas från antikorrelationen i CCFFRET6,31,36. Observera att dynamiska processer som är långsammare än diffusionstiden inte kan observeras i FCS.

I den här demonstrationen antogs två olika FRET-scenarier, som visade antingen en måttlig eller maximal förändring i FRET-effektiviteten mellan de två staterna. Simuleringarna utfördes med Burbulator37 och överväga frånvaro eller förekomst av trilling blinkande och ökande mängd givaren crosstalk i de röda kanalerna. Diffusionstermen modellerades som en bimodal fördelning med 30% av snabbspridande molekyler vid tD1 = 1 ms och resten av molekylerna som diffuseras långsamt med tD2 = 100 ms. Totalt simulerades 107 fotoner i en 3D Gaussian-formad volym med w0 = 0,5 μm och z0 = 1,5 μm, en lådstorlek på 20 och NFCS = 0,01.

Figur 6E-F visar simuleringsresultaten för FRET-inducerad korskorrelation CCFFRET för måttlig (figur 6E) och maximal FRET-kontrast ( figur6F) i frånvaro (fasta linjer) och närvaro av trilling blinkande (streckade linjer). Fret-inducerad antikorrelation kan lätt ses i figur 6F. Effekten "dämpning" vid tillsats av ytterligare trillingtillstånd minskar korrelationsamplituden (figur 6E-F)38,39.

Figure 6
Bild 6: Simulering av dubbelmärkt prov som visar dynamisk FRET. (A) Dubbelmärkt β2AR med en eGFP insatt i den intracellulära slingan 3 och en C-terminal SNAP-tagg. Båda fluoroforerna är tillräckligt nära för att genomgå FRET och visar förändringar i FRET-effektiviteten om receptorn genomgår proteindynamik. (B)Autokorrelation (ACFgp, ACFrp och ACFrd, passar med eq. 7) och korskorrelationskurvor(CCFFRET (eq. 7) och CCFPIE (eq. 9)) av ett exempelmätning. Tabellen på panelen (C) visar passformsresultaten. (D-F) För att visa inverkan av experimentell parameter på den förväntade, FRET-inducerad antikorrelation termen, 12 simuleringar utfördes, där förändringen i FRET effektivitet (liten eller stor), olika mängd givaren crosstalk i acceptor kanaler (0%, 1% eller 10%) och avsaknad och närvaro av triplet blinkning modellerades. Jämviktsfraktionen av båda FRET-tillstånd antogs till 50:50 och deras växelkurser justerades så att den erhållna avslappningstiden tR = 70 μs. Mer information om simuleringarna finns i texten. (E) CCFFRET av simuleringsresultaten med en måttlig FRET-kontrast och i avsaknad av crosstalk (mörkorange), 1% crosstalk (orange) och 10% crosstalk (ljusorange). Heldragna linjer visar resultat i avsaknad av trilling, streckade linjer i närvaro av trilling. (F) CCFFRET av simuleringsresultaten med maximal FRET-kontrast. Färgkoden är identisk med (E). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Men i den simulering som mest liknar de experimentella förhållandena (α = 10%, 15% trilling blinkande och måttlig FRET-kontrast, streckad gul linje i figur 6E), är antikorrelationstermen nästan minskad. Figur 7 visar resultatet av att analysera dessa simulerade data med hjälp av den information som kodats i fotonens ankomsttid histogram (dvs. fluorescenslivslängden) med hjälp av Fluorescence Lifetime Correlation Spectroscopy (FLCS)17,19 eller artfiltrerad FCS (fFCS)18. Här används fluorescenslivslängderna för de kända HF- och LF-arterna (figur 7A) för att generera vikter eller "filter" (figur 7B) som tillämpas under korrelationsförfarandet. I de erhållna art-auto- och korskorrelationskurvorna (figur 7C-D) kan sambandet tydligt observeras.

Figure 7
Figur 7: Livstidsfiltrerad FCS kan hjälpa till att avslöja proteindynamikbaserade fluktuationer i FRET-effektivitet i prover med hög korsstjälk, betydande trilling blinkande eller andra fotofysiska eller experimentella egenskaper som maskerar fret-inducerad antikorrelation i CCFFRET. Här visas metoden exemplarisk för de data som visas i figur 6E för simuleringen som innehåller 10% crosstalk och 5% trilling blinkande. (A) Normaliserade fluorescensintensitetsförfallsmönster för de två FRET-arterna (ljus- och mörkgrön för hög respektive låg FRET) respektive IRF (grå). Mönstret för den parallella detekteringskanalen visas i heldragna linjer, streckade linjer för den vinkelräta detekteringskanalen. (B) Viktningsfunktionen eller "filtret" genererades baserat på mönstren i (A), färgkoden är identisk med (A). Observera att endast signalen i de gröna detekteringskanalerna, och därmed fret-inducerad givarsläckning, beaktas här. c)Fyra olika artselektiva korrelationer erhålls: art-autokorrelationer av låg FRET-stat(sACFLF-LF, mörkgrön) och det högaFRET-tillståndet (sACFHF-HF,ljusgrönt) och de två artkorskorsrelationerna mellan den låga FRET till det höga FRET-tillståndet(sCCFLF-HF,mörkorange) och vice versa(sCCFHF-LF , orange). SCCF visar tydligt sambandet i μs-intervallet. Streckade svarta linjer visar anfallen. sACF passade med eq. 9 och sCCF med eq. 11. Tabellen på panelen (D) visar passformsresultaten. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

CCFPIE amplitud för att studera protein-proteininteraktion (PPI)
Slutligen är ett vanligt användningsfall för PIE-baserade FCS i levande celler att studera interaktionen mellan två olika proteiner. Här är avläsningsparametern CCFPIE:samplitud , eller mer exakt förhållandet mellan autokorrigeringsförstudningarna ACFgp och ACFrd till ccf-cirkelnsamplitud . För att visa effekten av ökad samdiffusion på CCFPIEhar simuleringar utförts baserat på de två enkelmärkta konstruktionerna, β2AR-IL3-eGFP och NT-SNAP-β2AR (figur 8A). Figur 8B visar hur ccfPIE:s amplitud ökar när fraktionen av samdiffusionsmolekyler ändras från 0 % till 100 %. Observera att en 1% crosstalk av grön signal i de röda kanalerna i fördröjningstidsfönstret lades till med diffusionskomponenterna på annat sätt modellerade enligt ovan.

Figure 8
Figur 8: CCFPIE kan användas för att studera interaktionen mellan två proteiner. (A) Här simulerades en samtransfekteringsstudie av β2AR-IL3-eGFP med NT-SNAP-β2AR (som bär en "röd" SNAP-etikett). (B) För en ökande mängd medspridande molekyler (0% (mörkblå) -> 100% (ljusblå)) ökar amplituden G(tc). Diffusions termen modellerades igen som en bimodal fördelning med 30% av snabb diffusion molekyler vid tD1 = 1 ms och resten av molekylerna diffusing långsamt med tD2 = 100 ms. Dessutom lades 1% korstalk av grön signal till det röda fördröjningstidsfönstret. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Symbol Betydelse (gemensam enhet)
α crosstalk av den gröna fluoroforen efter grön excitation i de röda detektionskanalerna (%)
a1 fraktion av den första diffusionskomponenten i bimodal diffusionsmodell av membranreceptorer
af total amplitud för antikorrelationstermen
ettR amplitud av fotofysik /trilling blinkar
b baslinje/förskjutning av en korrelationskurva
B molekylljuset hos en fluorofor ((kilo)antal per molekyl och sekund)
BG bakgrund (t.ex. från ett lämpligt referensexempel: ddH2O, buffert, oöverstedad cell osv.)
c koncentration
HP Räknehastighet (KHz eller (kilo-) antal per sekund)
δ direkt excitation av den röda fluoroforen efter grön excitation (%)
D diffusionskoefficient (μm²/s)
G(tc) korrelationsfunktion
N antal molekyler i fokus
NA Avogadros nummer (6.022*1023 Mol-1)
rGR, rRG amplitudförhållandet för grön eller röd autokorrelationsfunktion och den PIE-baserade tvärkorrelationsfunktionen
s formfaktor för konfokal volymelement
tc korrelationstid (vanligtvis i millisekund)
tD diffusionstid (vanligtvis i millisekund eller mikrosekund)
tR avslappningstid för fotofysik (vanligtvis i mikrosekunder)
tT avslappningstid för trilling blinkar (vanligtvis i mikrosekunder)
w0 halvbredd av konfokalt volymelement (μm)
z0 halvhöjd av konfokal volymelement (μm)

Tabell 1: Lista över variabler och förkortningar. För användning av symboler och definition i fluorescens- och FRET-experiment rekommenderas riktlinjerna för FRET-gemenskapen40.

KOMPLETTERANDE FILER:

SuppNote1_Coverslip rengöring.docx Klicka här för att ladda ner den här filen.

SuppNote2_Confocal installationsprogrammet.docx Klicka här för att hämta den här filen.

SuppNote3_Data exportera.docx Klicka här för att ladda ner den här filen.

SuppNote4_FCCS kalibreringsanalys med ChiSurf.docx Klicka här för att ladda ner den här filen.

SuppNote5_Fluorescence livstids histogram.docx Klicka här för att ladda ner den här filen.

S6_Scripts.zip Klicka här för att ladda ner den här filen.

S7_Excel_templates.zip Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

FCS-tekniker i GPCR gör det möjligt att bedöma rörlighet och interaktioner av receptorer inuti levande celler41. Fördelen med FRET-FCS-tekniken är att GPCR:s konformationsdynamik, tillsammans med rörlighet, kan undersökas. Att utföra FRET-FCS i levande celler är dock utmanande och kräver celler som visar lågt (eller maximalt måttligt) uttryck för det fluorescerande märkta proteinet av intresse, en välkalibrerad installation och en bra pipeline för att analysera data. Här diskuteras först de kritiska punkterna i provberedning och experimentellt förfarande om biologiska, spektroskopiska och tekniska synpunkter.

Kritiska experimentella steg inkluderar att minimera bakgrunden och autofluorescens (genom att använda omfattande rengjorda täckslipar och fenolröda fria medier), optimering av transfekteringsförhållanden (t.ex. mängden plasmid-DNA och tid efter transfektion) för att uppnå låga uttrycksnivåer och effektiv märkning. Naturligtvis är det också viktigt att se till att det märkta proteinets funktion inte hämmas. I experiment med levande celler fattas därför beslutet för märkningsstrategin och etikettpositionen ofta till förmån för fluorescerande proteiner eller SNAP / CLIP-taggen fäst vid den flexibla N- eller C-terminus42,43. Alternativa märkningsstrategier som att sätta in en onaturlig aminosyra med en reaktiv sidokedja för märkning med en organisk fluorofor har dykt upp under de senaste åren44.

För pie-FCS med dubbla färger, där endast interaktionen mellan två molekyler av intresse ska undersökas, kan fluoroforerna väljas från en stor mängd etablerade fluorescerande proteiner eller SNAP/CLIP-substrat. Här bör spektroskopimässigt målet vara att välja ett par så att lite crosstalk eller direkt acceptor excitation uppstår. Dessutom bör de valda fluoroforerna vara fotobara och visa liten eller ingen blekning under de valda experimentella förhållandena. Det rekommenderas att välja fluoroforer i det röda spektralområdet eftersom (1) autofluorescensbakgrunden från cellen reduceras och (2) excitationsljuset är av längre våglängd, alltså mindre fototoxisk14. Fotobleaching kan minimeras genom att först genomföra en så kallad "power series", där lasereffekten ökar stegvis och den molekylära ljusstyrkan observeras. Det optimala excitationsintensitetsintervallet ligger i det linjära intervallet för resultaten45.

Om de två etiketterna ska rapportera också om proteinkonformationell dynamik genom FRET är valet av tillgängliga fluoroforer mer begränsat. Här bör det möjliga minimala/maximala avståndet mellan de två fluoroforerna uppskattas i förväg, t.ex. baserat på tillgängliga strukturer eller molekylstorlek, och ett fluoroforpar valt med en rimlig Försterradie R0 så att FRET faktiskt kan förekomma20.

Här valdes eGFP och en SNAP-tagg för märkning, och SNAP-taggen var märkt med antingen ett intracellulärt eller ett membranimpererabelt ytsubstrat. Spektrat liknar dem som visas i figur 2C-D. Denna kombination av fluoroforer visar hög korsstjälke av eGFP i de röda detekteringskanalerna och direkt acceptor excitation av SNAP-substratet genom den gröna excitationen i snabbtidsfönstret och resulterar i en betydande "falsk" signal i de röda kanalerna i snabbtidsfönstret. Helst bör båda värdena, korsprat och direkt acceptor excitation, inte överstiga 5%5,6,38. Med en Försterradie på 57 Å är den dock idealisk för att undersöka avståndet mellan etiketterna i β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP-konstruktion som kan utvärderas från den släckta eGFP-livslängden (kompletterande anmärkning 5).

Tekniskt sett, liksom för alla fluorescensspektroskopiexperiment, bör enheten vara väl anpassad och ha lämpliga excitationskällor, utsläppsfilter och känsliga detektorer. För att undvika artefakter från detektorefterverkning på μs-tidsskalan bör minst två detektorer av varje färg finnas, som kan korskorrelateras. I modern tidskorrelaterad single photon counting electronics spelar dödtiden för detektionskortet i ns-tidsintervallet knappast en roll på grund av de oberoende routningskanalerna, men det kan kontrolleras som föreslagits av Müller et al 16 förutsatt att tidsintervallet ligger i tidsintervallet under μs/ns. Dessutom, för ännu högre tidsupplösningar i ps-intervallet, bör varje detekteringskanal fördubblas, dvs fyra detektorer per färg bör användas, för att också kringgå detektorns döda gånger2,15,29,46. Medan den genomsnittliga fluorescenslivslängden kan uppskattas med hjälp av icke-polariserad fluorescensdetektering, måste utsläppet samlas in polariseringsberoende för analys av avståndet (~fördelningen) mellan fluoroforerna. Detta beror på att effektiviteten i energiöverföringen i FRET beror på de två fluoroforernas inriktning. Mer detaljerad information finns här20,28,47. Slutligen är avståndet mellan snabb- och fördröjningspulsen avgörande i PIE-experimenten och bör väljas så att fluoroforernas fluorescensintensitet till stor del har förmultnat (figur 1B). En vanlig regel är att placera de två pulserna 5x fluorescenslivslängden ifrån varandra, dvs. för eGFP med en fluorescenslivslängd på 2,5 ns ska avståndet vara 12,5 ns vid minst22.

Efter att ha specificerat alla överväganden för det experimentella förfarandet diskuteras data och dess analys mer detaljerat. Som nämns i protokollavsnittet måste inställningens inriktning kontrolleras dagligen, inklusive analysen av kalibreringsmätningarna. De data som visas i figur 2A-C, t.ex. visar en extra avslappningskomponent i intervallet 8–40 μs. Typisk trilling blinkande av den gröna kalibreringfluoforen är känd för att förekomma i intervallet 2-10 μs13,15,48. Den långsamma avslappningskomponent som krävs i alla kurvor i DNA-provet (figur 3C), för långsam för faktisk trilling blinkar, kan härröra från DNA-interaktioner med fluoroforerna39. Denna komponent skulle dock inte förväntas i CCFPIE, och kommer sannolikt från restkorsstjäl. Det är därför mycket tillrådligt att utföra analysen av kalibreringsproverna direkt innan du fortsätter till cellexperimenten för att bedöma kvaliteten på dagens inriktning.

Korrekt kalibrering av den konfokala överlappningsvolymen kräver ett prov med 100% samdiffusion av den gröna och röda etiketten. Här används fluorescerande märkt dubbelsträngat DNA. Båda DNA-strängarna kan skräddarsys för att ha önskade fluoroforer på önskat avstånd från varandra. De designade strängarna kan glödgas med högt utbyte. God laboratoriesed rekommenderar dock att man kontrollerar DNA-strängarnas integritet och märkningsgrad genom agarosgelelektrofores och mäter absorptionsspektrumet. Utbytet av den dubbelsträngade enheten bör också kontrolleras eftersom denna kalibreringsmätning kritiskt bygger på antagandet att det finns en 100% samdiffusion av det gröna med den röda etiketten. Om antagandet inte är giltigt kan korrigeringsfaktorer behöva tillämpas16,22. I de kalibreringsmätningar som visas i figur 2 och figur 3erhölls en detektionsvolym på 1,4 fL respektive 1,9 fL i den gröna respektive röda kanalen. Denna storleksskillnad förväntas för en inställning med nästan diffraktionsbegränsade excitationsvolymer(kompletterande anmärkning 2). Under detta tillstånd skalar storleken på excitationsvolymen med excitationsvåglängden. Detta förklarar i sin tur de olika korrelationsamplituder som observerats i figur 3B. De härledda korrigeringsfaktorerna rGR = 0,56 och rRG = 0,72 korrekta för denna storleksavvikelse och potentiell icke-perfekt överlappning av de två excitationsvolymerna3,4.

Figur 4, figur 5, figur 6och figur 7 visar arbetsflödet för en PIE-F(C)CS-baserad studie som syftar till att förstå konformationsproteindynamik. För det första fungerar de två enkelmärkta konstruktionerna β2AR-IL3-eGFP och NT-SNAP-β2AR som kontroller för att karakterisera fluoroforegenskaperna i celler i avsaknad av respektive annan fluorofor(figur 4). Därefter fungerar den dubbelmärkta konstruktionen NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP som bär en SNAP-tagg vänd mot cellens exteriör och en eGFP på den cytoplasmiska sidan som en "100% samdiffusionskontroll"(figur 5). Den sista konstruktionen, β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP, bär både fluoroforer på den cytoplasmiska sidan och tillräckligt nära varandra för att genomgå FRET. Här, igen en 100% samdiffusion skulle förväntas i kombination med anti-korrelerade intensitetsfluktuationer i de gröna och röda kanalerna signaler i snabb tidsfönstret, dvs. efter givaren excitation, på grund av proteindynamik som påverkar FRET effektivitet31,32,33. Denna dynamik kan visas som antikorrelation i CCFFRET (figur 6-7).

Alla GPCR-β2AR-konstruktioner visar bimodal diffusion på cellmembranet(figur 4A). Medan β2AR-IL3-eGFP endast visar den förväntade trillingen blinkande (figur 5B)13,15,visar NT-SNAP-β2AR ytterligare en långsam avslappningstid(figur 5C-D). Det är troligt att tR2 kan härröra från obundet SNAP-substrat. Detta skulle kunna förklaras genom ytterligare experiment, t.ex. genom att även mäta diffusionen och fotofysiska egenskaper hos det använda SNAP-substratet i en vattenlösning. Observera att ett enkelt experiment för att skilja mellan diffusions- och avslappningstider är att ändra pinholet i den konfokala installationen, dvs. öka den effektiva volymen: Medan diffusionstiderna ökar med ökande effektiva volymer, är avslappningsvillkor oförändrade13. När du bestämmer koncentrationen av fluorescerande protein (FP) baserat på passformsresultaten, var medveten om att FPs i allmänhet genomgår en mognadsprocess, där kromoforen slutligen bildas12. Denna mognadstid kan skilja sig från FP till FP förutom fotofysik som beror på den lokala kemiska miljön13,15. Den faktiska proteinkoncentrationen i det prov som rapporteras av FCS underskattas således vanligtvis, vilket kan korrigeras om fraktionen av icke-fluorescerande FPs kan bestämmas i experimentet. Slutligen är det lämpligt att kontrollera fluoroforspektrat i levande celler för att korrigera värdena för α och δ, om så krävs, eftersom de flesta fluoroforer reagerar känsligt för sin miljö13,15,48. Bakgrunden som ska subtrahera bestäms av signalen som samlas in i icke-transfekterade celler. Dessutom bör autokorrelationen för respektive annan färgkanal och CCFPIE kontrolleras för att kunna identifiera falska signaler(kompletterande anmärkning 4 - figur 30).

De två mätningarna från NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP (figur 5D), där fluoroforerna ligger på olika sidor av membranet, förvärvades på olika dagar och visar vikten av statistik i tidsupplöst enmolekylfluorescens. Här kan de olika resultaten bero på den olika graden av märkning: I en cell resulterade den högre graden av märkning och medelvärde av mätningar i relativt lågt brus (figur 5B), medan från den andra cellen kunde endast två mätningar samlas in (figur 5A). Förutom att samla in en tillräcklig mängd data är det viktigt att utvärdera resultaten i tid och kanske optimera märkningsstrategin. Vid utformningen av experimenten är det viktigt att komma ihåg att FRET är känsligt, men begränsat till avstånd upp till 10 nm och "blinda" annars. I vårt fall indikeras denna "blindhet" av den oförändrade eGFP-fluorescenslivslängden (kompletterande anmärkning 5). I konstruktionen β2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP(figur 6A)kan FRET fastställas utifrån den släckta eGFP-livslängden (kompletterande anmärkning 5). Ingen antikorrelationsterm observeras dock (figur 6B), vilket innebär att FRET antingen inte fluktuerar eller vid en tidsskala som är långsammare än diffusionstiden. Upp till tre ytterligare avslappningsvillkor krävs i ACFgp, ACFrp, ACFrd och CCFFRET (figur 6C). Den långsamma komponenten i ACFrp, ACFrd och CCFFRET kan bero på acceptor blekning och, naturligtvis, påverkar det erhållna värdet av den långsamma diffusion som finns i dessa kurvor (~ 350 ms jämfört med 117 ms i ACFgp). tD i den röda kanalen ska vara något större än i den gröna kanalen på grund av de olika stora konfokala volymerna (figur 2) - men endast med en faktor som är jämförbar med storleksskillnaden. Den mycket snabba avslappningstiden på 3 μs återspeglar trilling blinkningen av fluoroforerna13,15,48, medan den långsammare avslappningstiden på 37 μs kan bero på FRET: På samma sätt, eftersom FRET inducerar ett antikorrelation i CCFFRET,förväntas positiva korrelationer i autokorrelationerna31,32,33. Förekomsten av denna term som "positiv" i CCFFRET och dess närvaro i ACFrd kan förklaras med den höga korsstjälken och bör förklaras ytterligare. Observera att CCFPIE är platt vid korta korrelationstider som förväntat.

Å andra sidan bör det noteras att förekomsten av FRET i ett intressesystem leder till icke-linjära effekter på korrelationskurvorna6. Den molekylära ljusstyrkan, t.ex. hos en molekyl, skalas in i korrelationsamplituden i kvadrat och varje FRET-tillstånd (och de alltid närvarande molekylerna utan aktiv receptor) visar olika molekylär ljusstyrka. I själva verket minskar FRET den uppenbara koncentrationen av gröna molekyler som detekteras (dvs. ökar ACFgp amplitud) och antalet röda molekyler (bestäms från röd-prompt) överskattas5. Båda effekterna påverkar mängden interaktion som härrör från både CCFFRET och CCFPIE. Global analys som visas t.ex. för den intramolekylära dynamiken i Calmodulin 31,32 eller Syntaxin33 kan dock avslöja proteindynamiken. När den är noggrant kalibrerad får den genomsnittliga FRET-effektiviteten extraheras från de relativa CCFPIE- och ACF-amplituderna22,medan de begränsande tillstånden kan bestämmas från analysen av donatorfluorescensens livslängdsfördelning33.

Med tanke på att FRET-kontrasten i levande cellexperiment med stora fluoroforer som eGFP sannolikt är ännu lägre än vad som antas för simuleringarna i figur 6 och att den direkta excitationen av acceptorn inte lades till i simuleringen, kan förklara varför identifieringen av antikorrelationen i experiment med levande celler är mycket utmanande. Ett lovande analysalternativ bygger på att den information som kodas i fotonens ankomsttid histogram (figur 1B) är tillgängliga på grund av den tidskorrerade enskilda fotonräkningsdatainsamlingen29,30. Om fluorescenslivslängden (~mönster) hos de två (eller fler) (FRET) arterna inuti provet är kända (figur 7A), "filter" eller vikter kan väljas som appliceras under korrelationsprocessen (figur 7B)17,18,19. De korrelationskurvor som erhålls på detta sätt representerar inte längre korrelationen mellan detektionskanaler utan snarare de automatiska eller korskorresbringande mellan två olika (FRET) arter, som således bytt namn till arter-ACF (sACF) eller art-CCF (sCCF). Om du tillämpar den här metoden på simulerade data med måttlig FRET-kontrast, hög korsstjälk och trilling blinkar återställs antikorrelationstermen (figur 7C-D). Det bör dock noteras att avslappningstider kan erhållas men förhållandet till amplitud går förlorat18. Detta tillvägagångssätt har tillämpats tidigare i levande cellexperiment, t.ex. för att studera egfr:s interaktion med dess antagonist49 eller för att separera fluorescensen från proteiner som är fästa vid eGFP-varianter med exceptionellt korta och långa fluorescenslivslängder50.

Medan PIE-baserade FRET-mätningar i renade proteiner till stor del används för att studera proteindynamik3622, i levande celler fokuserar den på att förstå protein-proteininteraktioner. Detta tillvägagångssätt har tillämpats för att studera regleringen av MAP-kinasaktivitet i jäst51 eller för att lösa interaktionen mellan membranproteiner med deras cytosolutiska bindningspartner som sammanfattas i den senaste artikeln52. Här kan komplikationer uppstå när betydande crosstalk av gröna fluoroforer fortfarande finns i fördröjningstidsfönstret för de röda kanalerna eller röd signal i de gröna kanalerna i prompttidsfönstret. Den förstnämnda kan orsakas av en otillräcklig fördröjning av den röda pulsen med avseende på den gröna pulsen medan båda effekterna härrör från alltför starkt överlappande excitation och emissionsspektra för de valda fluoroforerna. Det rekommenderas att kontrollera respektive enkelmärkt konstruktioner noggrant och korrekt för falskt positiva CCF PIE-amplituder, särskilt i celler där autofluorescens med mycket kort fluorescenslivslängd kan vara en annan komplicerande faktor22.

Sammanfattningsvis har FRET-FCS-metoden som beskrivs här stor potential att förstå protein-proteininteraktioner och proteindynamik i levande celler vid nära fysiologiska koncentrationer. I detta protokoll lades fokus på de erforderliga kalibreringsmätningarna och den nödvändiga kvantitativa analysen som ska utföras vid mätningar av levande celler. För detta ändamål visades olika livecellmätningar kompletterade med simuleringar. Simuleringarna ger den allmänna förståelsen här eftersom parametern kan varieras systematiskt med skräddarsydda passformsmodeller som beskriver respektive datas specifika rörlighet och fotofysiska egenskaper. Analysen utfördes med programvaruverktyg med öppen källkod med ett omfattande steg-för-steg-protokoll och lättanpassade mallar. Slutligen kommer de tekniska framstegen, och därmed tillgången till färdiga att köpa stabila PIE-FCS-system tillsammans med spridningen av programvara med öppen källkod för dataanalys, att göra denna teknik mer och mer tillgänglig för en större forskargemenskap för att så småningom nysta upp proteininteraktion och dynamik i levande celler med högsta känslighet.

Disclosures

Författarna har inga konflikter att deklarera.

Acknowledgments

Detta projekt stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB/TR 240, projektnummer 374031971, Project INF) till J.B och K.G.H.

Vi tackar Rudolf Virchow Center för ekonomiskt stöd och Core Unit Fluorescence Imaging för teknisk support. Dessutom tackar vi Ashwin Balakrishnan för grundlig korrekturläsning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x Telescope in 4f configuration with five lenses Qioptiq, Rhyl, UK G063126000 Optics
2x Band pass filters Brightline AHF, Tübingen, Germany HC 525/50 and HC 600/52 Filter
2x Dichroic beam splitter AHF, Tübingen, Germany HC BS F38-573 Filter
6-well culture plate Nunc Thermo Scientific (Waltham, USA) 140675 Reagent
Alexa Fluor 488 NHS Ester (green calibration standard) Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) A20000 Reagent
Alexa Fluor 568 NHS Eater (red calibration standard) Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) A20003 Reagent
ASI stage PZ-2000 XYZ Visitron Systems GmbH, Puchheim, Germany WK-XYB-PZ-IX71 Microscope Parts
Attofluor Cell Chamber, 35 mm diameter for  25 mm round coverslips Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) A7816 Glass coverslip holder
Avalanche photodiode Perkin Elmer (SPCM-AQR-14) Laser Components GmbH, Olching, Germany SPCM-AQR-14 Single photon counting detector
Beamsplitter Newport, Darmstadt, Germany 10FC16PB.3 Filter
Biorender (Software) Science Suite Inc - o/a BioRender (Toronto, Canada) --- Software used to create GPCR sketch, https://app.biorender.com/
Chinese hamster ovary (CHO) cell line ATCC CCL-61 Cell lines
ChiSurf (Data analysis Software) Thomas-Otavio Peulen, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, USA --- tttrlib-based software to analyze fluorescence correlation data and fluorescence decay histograms, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf
Tutorial: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&t=2s
Ref: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017)
Chloroform Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) 472476-2.5L Reagent
DMSO AppliChem GmbH (Darmstadt, Germany) A3672,0250 Reagent
DNA strand (40 bp fluorophore distance) IBA Lifesciences GmbH (Göttingen, Germany) --- Reagent, 5’ CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3’, 3’ GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5’
Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (with and without phenol red) GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) P04-41250, P04-41650 Reagent
Ethanol (absolute) Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) 34852-1L-M Reagent
Erythrosin B,Dye content >=95 % Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) 200964-5G Reagent, Instrument Response function, solve in EtOH to 10 mg/mL
Fetal Bovine Serum (FBS) Biochrom  (Berlin, Germany) S 0615 Reagent
Fluorescence Light Source X-Cite 120 Q Excelitas Technologies, Ontario, Canada XI120-Q-5060 Microscope Parts
Fluorescent SNAP-substrate cell : SNAP Cell TMR- STAR New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany) S9105S Reagent
Fluorescent SNAP-substrate surface : DY-549 New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany) S9112S Reagent
Glass coverslips (Dimensions: diameter 24 mm, thickness 0.13 - 0.16 mm) Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany) 111640 Reagent
Laser Controller Picoquant, Berlin, Germany 910020 (PDL 828-S "SEPIA II") Optics
Laser lines (480 nm and 560 nm) Picoquant, Berlin, Germany 912485 (LDH-D-C-485), 912561 (LDH-D-TA-560) Optics
Lipofectamine 2000 Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) 11668-019 Reagent
MFD suite (Software) AG Seidel, Heinrich-Heine-University Duesseldorf, Germany --- Software package for analysis of single-molecule fluorescence experiments including e.g. Kristine (correlation of tttr data), Burbulator (simulation of single-molecule experiment), https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis
Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25.4 mm Thorlabs, Bergkirchen, Germany AC254-150-A-ML Second part of Beam expander
Neubauer Chamber (deepness 0.1 mm) Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany) 640110 Reagent
Olympus IX 71 stand Olympus, Hamburg, Germany IX2-ILL100 Microscope Parts
Opti-MEM (Reduced-Serum Medium) GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) 31985-047 Reagent
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) 049M4857V Reagent
Phosphate-buffered Saline (PBS) GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) 14190144 Reagent
Pinhole (50 µM) Newport, Darmstadt, Germany PNH-50 Pinhole
PMT Hybrid-40 Picoquant, Berlin, Germany 932200 (PMA Hybrid 40) Single photon counting detector
Python scripts (Software) Katherina Hemmen, Rudolf-Virchow Center for Integrative and Translational Imaging, University Wuerzburg, Germany --- Collection of self-written Python scripts based on tttrlib (https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib) used to (1) determine the average count rates, (2) correlate the data and (3) build fluorescence decay histograms, https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS
Quad band beamsplitter (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1) AHF, Tübingen, Germany F73-421PH Filter
Single mode fiber polarization keeping, NA = 0.08 with collimator Picoquant, Berlin, Germany 02126 Optics
Sodium Hydroxide (NaOH) Carl Roth (Karlsruhe, Germany) 6771.1 Reagent
SymPhotime x64 Software (Data collection and data export software) Picoquant, Berlin, Germany 931073 (SPT64-1+2 single user ) Time-tag time-resolved (tttr) data collection at the self-built FCCS setup, data export
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system Hydraharp 400 Picoquant, Berlin, Germany 930010 (Hydraharp 400) Optics
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) T4299-100ml Reagent
Unmounted Achromatic Doublets, ARC: 400 - 700 nm, D=12.7 mm, F=-20 mm Thorlabs, Bergkirchen, Germany ACN127-020-A First part of Beam expander
Water immersion objective (UPlanSApo 60x/1.20 W) Olympus, Hamburg, Germany UPLSAPO60XW Objective

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hess, S. T., Huang, S. H., Heikal, A. A., Webb, W. W. Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: A review. Biochemistry. 41 (3), 697-705 (2002).
  2. Haustein, E., Schwille, P. Ultrasensitive investigations of biological systems by fluorescence correlation spectroscopy. Methods. 29 (2), 153-166 (2003).
  3. Bacia, K., Kim, S. A., Schwille, P. Fluorescence cross-correlation spectroscopy in living cells. Nature Methods. 3 (2), 83-89 (2006).
  4. Bacia, K., Schwille, P. Practical guidelines for dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nature Protocols. 2 (11), 2842-2856 (2007).
  5. Kohl, T., Heinze, K. G., Kuhlemann, R., Koltermann, A., Schwille, P. A protease assay for two-photon crosscorrelation and FRET analysis based solely on fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (19), 12161-12166 (2002).
  6. Sahoo, H., Schwille, P. FRET and FCS--friends or foes. Chemphyschem. 12 (3), 532-541 (2011).
  7. Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. Enzyme Kinetics by Isothermal Titration Calorimetry: Allostery, Inhibition, and Dynamics. Frontiers in Molecular Bioscience. 7, 583826 (2020).
  8. Yanase, Y., et al. Surface plasmon resonance for cell-based clinical diagnosis. Sensors (Basel). 14 (3), 4948-4959 (2014).
  9. Freedberg, D. I., Selenko, P. Live cell NMR. Annual Review of Biophysics. 43, 171-192 (2014).
  10. Nishida, N., Ito, Y., Shimada, I. In situ structural biology using in-cell NMR. Biochimica et Biophysica Acta General Subjects. 1864 (2), 129364 (2020).
  11. Schwille, P., Meyer-Almes, F. J., Rigler, R. Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy for multicomponent diffusional analysis in solution. Biophysical Journal. 72 (4), 1878-1886 (1997).
  12. Balleza, E., Kim, J. M., Cluzel, P. Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells. Nature Methods. 15 (1), 47-51 (2018).
  13. Haupts, U., Maiti, S., Schwille, P., Webb, W. W. Dynamics of fluorescence fluctuations in green fluorescent protein observed by fluorescence correlation spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (23), 13573-13578 (1998).
  14. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
  15. Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. Photodynamic properties of green fluorescent proteins investigated by fluorescence correlation spectroscopy. Chemical Physics. 250 (2), 171-186 (1999).
  16. Müller, B. K., Zaychikov, E., Bräuchle, C., Lamb, D. C. Pulsed interleaved excitation. Biophysical Journal. 89 (5), 3508-3522 (2005).
  17. Böhmer, M., Wahl, M., Rahn, H. -J., Erdmann, R., Enderlein, J. Time-resolved fluorescence correlation spectroscopy. Chemical Physics Letters. 353 (5), 439-445 (2002).
  18. Felekyan, S., Kalinin, S., Sanabria, H., Valeri, A., Seidel, C. A. M. Filtered FCS: Species Auto- and Cross-Correlation Functions Highlight Binding and Dynamics in Biomolecules. Chemphyschem. 13 (4), 1036-1053 (2012).
  19. Kapusta, P., Wahl, M., Benda, A., Hof, M., Enderlein, J. Fluorescence lifetime correlation spectroscopy. Journal of Fluorescence. 17 (1), 43-48 (2007).
  20. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool-understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  21. Elson, E. L., Magde, D. Fluorescence Correlation Spectroscopy .1. Conceptual Basis and Theory. Biopolymers. 13 (1), 1-27 (1974).
  22. Hendrix, J., Lamb, D. C. Pulsed interleaved excitation: principles and applications. Methods Enzymol. 518, 205-243 (2013).
  23. Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization. Biopolymers. 13 (1), 29-61 (1974).
  24. Thompson, N. L. Topics in Fluorescence Spectroscopy. Lakowicz, J. R. , Plenum Press. 337-378 (1991).
  25. Cole, N. B. Site-specific protein labeling with SNAP-tags. Current protocols in protein science. 73, 1-16 (2013).
  26. Petrásek, Z., Schwille, P. Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical Journal. 94 (4), 1437-1448 (2008).
  27. Siegel, A. P., Baird, M. A., Davidson, M. W., Day, R. N. Strengths and Weaknesses of Recently Engineered Red Fluorescent Proteins Evaluated in Live Cells Using Fluorescence Correlation Spectroscopy. International Journal of Molecular Sciences. 14 (10), 20340-20358 (2013).
  28. Peulen, T. O., Opanasyuk, O., Seidel, C. A. M. Combining Graphical and Analytical Methods with Molecular Simulations To Analyze Time-Resolved FRET Measurements of Labeled Macromolecules Accurately. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (35), 8211-8241 (2017).
  29. Wahl, M., Rahn, H. J., Gregor, I., Erdmann, R., Enderlein, J. Dead-time optimized time-correlated photon counting instrument with synchronized, independent timing channels. Review of Scientific Instruments. 78 (3), 033106 (2007).
  30. Wahl, M., et al. Scalable time-correlated photon counting system with multiple independent input channels. Review of Scientific Instruments. 79 (12), 123113 (2008).
  31. Price, E. S., Aleksiejew, M., Johnson, C. K. FRET-FCS Detection of Intralobe Dynamics in Calmodulin. The Journal of Physical Chemistry B. 115 (29), 9320-9326 (2011).
  32. Price, E. S., DeVore, M. S., Johnson, C. K. Detecting intramolecular dynamics and multiple Forster resonance energy transfer states by fluorescence correlation spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (17), 5895-5902 (2010).
  33. Margittai, M., et al. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (26), 15516-15521 (2003).
  34. Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318 (5854), 1258-1265 (2007).
  35. Manglik, A., et al. Structural Insights into the Dynamic Process of beta2-Adrenergic Receptor Signaling. Cell. 161 (5), 1101-1111 (2015).
  36. Olofsson, L., et al. Fine tuning of sub-millisecond conformational dynamics controls metabotropic glutamate receptors agonist efficacy. Nature Communications. 5 (1), 5206 (2014).
  37. Kalinin, S., Valeri, A., Antonik, M., Felekyan, S., Seidel, C. A. Detection of structural dynamics by FRET: a photon distribution and fluorescence lifetime analysis of systems with multiple states. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (23), 7983-7995 (2010).
  38. Hom, E. F. Y., Verkman, A. S. Analysis of coupled bimolecular reaction kinetics and diffusion by two-color fluorescence correlation spectroscopy: Enhanced resolution of kinetics by resonance energy transfer. Biophysical Journal. 83 (1), 533-546 (2002).
  39. Widengren, J., Schweinberger, E., Berger, S., Seidel, C. A. M. Two new concepts to measure fluorescence resonance energy transfer via fluorescence correlation spectroscopy: Theory and experimental realizations. Journal of Physical Chemistry A. 105 (28), 6851-6866 (2001).
  40. Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
  41. Briddon, S. J., Kilpatrick, L. E., Hill, S. J. Studying GPCR Pharmacology in Membrane Microdomains: Fluorescence Correlation Spectroscopy Comes of Age. Trends in Pharmacological Sciences. 39 (2), 158-174 (2018).
  42. Barak, L. S., et al. Internal trafficking and surface mobility of a functionally intact beta2-adrenergic receptor-green fluorescent protein conjugate. Molecular Pharmacology. 51 (2), 177-184 (1997).
  43. Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (2), 743 (2013).
  44. Nikić, I., Kang, J. H., Girona, G. E., Aramburu, I. V., Lemke, E. A. Labeling proteins on live mammalian cells using click chemistry. Nature Protocols. 10 (5), 780-791 (2015).
  45. Robert, T. Y., Haibing, T. Measuring protein dynamics in live cells: protocols and practical considerations for fluorescence fluctuation microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (9), 1-24 (2014).
  46. Felekyan, S., et al. Full correlation from picoseconds to seconds by time-resolved and time-correlated single photon detection. Review of Scientific Instruments. 76 (8), 083104 (2005).
  47. Forster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung Und Fluoreszenz. Annalen Der Physik. 2 (1-2), 55-75 (1948).
  48. Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. Fluorescence Correlation Spectroscopy of Triplet-States in Solution - a Theoretical and Experimental-Study. Journal of Physical Chemistry. 99 (36), 13368-13379 (1995).
  49. Chen, J., Irudayaraj, J. Fluorescence lifetime cross correlation spectroscopy resolves EGFR and antagonist interaction in live cells. Analytical Chemistry. 82 (15), 6415-6421 (2010).
  50. Stefl, M., Herbst, K., Rubsam, M., Benda, A., Knop, M. Single-Color Fluorescence Lifetime Cross-Correlation Spectroscopy In Vivo. Biophysical Journal. 119 (7), 1359-1370 (2020).
  51. Maeder, C. I., et al. Spatial regulation of Fus3 MAP kinase activity through a reaction-diffusion mechanism in yeast pheromone signalling. Nature Cell Biololy. 9 (11), 1319-1326 (2007).
  52. Christie, S., Shi, X., Smith, A. W. Resolving Membrane Protein-Protein Interactions in Live Cells with Pulsed Interleaved Excitation Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 53 (4), 792-799 (2020).

Tags

Biokemi nummer 178
Fluorescens spektroskopi med dubbla färger för att studera protein-proteininteraktion och proteindynamik i levande celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hemmen, K., Choudhury, S.,… More

Hemmen, K., Choudhury, S., Friedrich, M., Balkenhol, J., Knote, F., Lohse, M. J., Heinze, K. G. Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells. J. Vis. Exp. (178), e62954, doi:10.3791/62954 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter