Summary
Les cultures primaires de microglies sont couramment utilisées pour évaluer de nouvelles molécules anti-inflammatoires. Le présent protocole décrit une méthode reproductible et pertinente pour isoler magnétiquement la microglie des nouveau-nés.
Abstract
La microglie, en tant que macrophages résidant dans le cerveau, est fondamentale pour plusieurs fonctions, y compris la réponse au stress environnemental et l’homéostasie cérébrale. La microglie peut adopter un large spectre de phénotypes d’activation. De plus, les microglies qui endossent le phénotype pro-inflammatoire sont associées à la fois à des troubles neurodéveloppementaux et neurodégénératifs. Les études in vitro sont largement utilisées dans la recherche pour évaluer les stratégies thérapeutiques potentielles dans des types cellulaires spécifiques. Dans ce contexte, l’étude de l’activation microgliale et de la neuroinflammation in vitro à l’aide de cultures microgliales primaires est plus pertinente que les lignées cellulaires microgliales ou la microglie dérivée de cellules souches. Cependant, l’utilisation de certaines cultures primaires pourrait souffrir d’un manque de reproductibilité. Ce protocole propose une méthode reproductible et pertinente d’isolement magnétique de la microglie des nouveau-nés. L’activation microgliale utilisant plusieurs stimuli après 4 h et 24 h par quantification de l’expression de l’ARNm et un dosage phagocytaire à billes de Cy3 est démontrée ici. Les travaux actuels devraient fournir une technique facilement reproductible pour isoler les microglies physiologiquement pertinentes des stades de développement juvéniles.
Introduction
Les microglies sont les cellules macrophages résidentes du système nerveux central dérivées des précurseurs érythropoïétiques du sac vitellin qui migrent vers le neuroépithélium au cours du développement embryonnaire précoce1. Outre leurs fonctions immunitaires, ils jouent également un rôle important au cours du développement neurologique, en particulier pour la synaptogenèse, l’homéostasie neuronale et la myélinisation2. À l’âge adulte, les microglies développent de longs processus cellulaires pour scanner l’environnement en continu. En cas de ruptures d’homéostasie telles qu’une lésion cérébrale ou une maladie cérébrale, les microglies peuvent modifier leur aspect morphologique pour adopter une forme amiboïde, migrer vers la zone lésée, augmenter et libérer de nombreux facteurs cytoprotecteurs ou cytotoxiques. Les microglies ont des états d’activation hétérogènes en fonction de leur stade de développement et du type de lésion subie 3,4,5. Dans cette étude, ces états d’activation sont largement classés en trois phénotypes différents : pro-inflammatoire/phagocytaire, anti-inflammatoire et immuno-régulateur, en gardant à l’esprit qu’en réalité, la situation est susceptible d’être plus complexe6.
L’étude in vivo de l’activation microgliale et le dépistage des stratégies neuroprotectrices aux premiers stades du développement du cerveau peuvent être difficiles en raison (1) de la fragilité des animaux avant le sevrage et (2) du faible nombre de cellules microgliales. Par conséquent, les études in vitro sur la microglie sont largement utilisées pour la toxicité 7,8,9, les stratégies neuroprotectrices 5,10,11,12,13,14 et les co-cultures 15,16,17,18,19,20,21 . Les études in vitro peuvent utiliser soit des lignées cellulaires microgliales, soit des microglies dérivées de cellules souches, soit une culture microgliale primaire. Toutes ces approches ont des avantages et des inconvénients, et le choix dépend de la question biologique initiale. Les avantages de l’utilisation de cultures microgliales primaires sont le fond génétique homogène, l’histoire exempte d’agents pathogènes et le contrôle du moment où les microglies sont stimulées après la mort de l’animal22.
Au fil des ans, différentes méthodes (cytométrie en flux, agitation ou marquage magnétique) ont été développées pour cultiver la microglie primaire de rongeurs, nouveau-nés et adultes 23,24,25,26,27,28,29. Dans le présent travail, l’isolement de la microglie à partir de bébés nouveau-nés de souris est effectué à l’aide de la technologie de tri cellulaire activée magnétique décrite précédemment à l’aide de CD11b25,27,29 anti-souris enrobé de microbilles. CD11b est un récepteur intégrine exprimé à la surface des cellules myéloïdes, y compris la microglie. Lorsqu’il n’y a pas de défi inflammatoire dans le cerveau, presque toutes les cellules CD11b+ sont des cellules microgliales30. Par rapport à d’autres méthodes publiées précédemment 23,24,25,26,27,28,29, le présent protocole équilibre les analyses d’activation microgliale ex vivo immédiates et la culture microgliale primaire in vitro commune. Ainsi, les microglies sont (1) isolées au jour postnatal (P)8 sans élimination de la myéline, (2) cultivées sans sérum, et (3) exposées soit à des siRNA, des miARN, des composés pharmacologiques et/ou des stimuli inflammatoires seulement 48 h après l’isolement cérébral. Chacun de ces trois aspects rend le protocole actuel pertinent et rapide. Tout d’abord, l’utilisation de la microglie pédiatrique permet d’obtenir des cellules viables dynamiques et réactives en culture sans nécessiter une étape de démyélinisation supplémentaire qui pourrait potentiellement modifier la réactivité microgliale in vitro. Le présent protocole vise à se rapprocher le plus possible de l’environnement physiologique de la microglie. En effet, les microglies ne rencontrent jamais de sérum, et ce protocole ne nécessite pas non plus l’utilisation de sérum. De plus, exposer les microglies dès 48 h après la culture les empêche de perdre leurs facultés physiologiques.
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Protocol
Le protocole a été approuvé et tous les animaux ont été manipulés conformément aux directives institutionnelles de l’Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, France). L’isolement magnétique de la microglie à partir du cerveau de 24 bébés souris OF1 (mâles et femelles) à P8, divisés en plaques à 6 puits, 12 puits ou 96 puits, est présenté. Le travail expérimental a été effectué sous une hotte pour maintenir des conditions stériles.
1. Préparation de solutions stériles pour l’isolement et la culture cellulaire
- Préparer 50 ml de 1x solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) sans Ca 2+ et Mg2+ (HBSS-/-) à partir de la solution 10x disponible dans le commerce (voir le tableau des matières).
- Préparer le mélange de dissociation selon la composition fournie au tableau 1 à l’aide d’une trousse de dissociation tissulaire disponible dans le commerce (voir le tableau des matières).
- Préparer 200 ml de 1x HBSS avec Ca 2+ et Mg2+ (HBSS+/+) à partir de la solution 10x disponible dans le commerce.
- Préparez 200 ml de 1x PBS + 0,5% BSA (appelé tampon de tri cellulaire).
- Préparer les microbilles CD11b conformément au tableau 2.
- Préparer 500 mL de milieu de culture sans sérum (SFM) sans macrophages + 1 % de pénicilline-streptomycine (P/S). Fabriquer des aliquotes de tubes de 50 mL et les conserver à 4 °C. C’est ce qu’on appelle le milieu microglial plus loin dans le texte.
NOTE: Toutes les solutions d’isolement doivent être fraîchement préparées dans des conditions stériles le jour de l’expérimentation et conservées sur la glace. Le milieu de culture cellulaire microglia peut être préparé, aliquote dans des tubes de 50 ml et conservé à 4 °C pour une utilisation ultérieure. La filtration n’est pas nécessaire.
2. Dissection cérébrale
- Décapitaisez la tête du chiot à l’aide de gros ciseaux sans anesthésie générale préalable.
- Couper la peau du cou au nez en suivant la suture sagittale (15-20 mm) avec de petits ciseaux (Figure 1A-C).
- Insérez une petite pointe de ciseaux dans le foramen magnum parallèle au crâne. Couper soigneusement de chaque côté jusqu’aux yeux (Figure 1D,E).
- Coupez entre les yeux avec de petits ciseaux pour détacher le crâne et le cerveau de la tête (Figure 1F).
- À l’aide de deux pinces, saisissez le crâne près des bulbes olfactifs et déchirez-le soigneusement, en prenant soin de ne pas endommager le cerveau sous-jacent (Figure 1G-I).
- Retirez le cervelet et le bulbe olfactif à l’aide d’une lame de rasoir et coupez le cerveau en deux morceaux (Figure 1J).
- Placez les morceaux de cerveau dans une boîte de Petri contenant 30 à 40 ml de HBSS-/- (Figure 1K).
3. Dissociation cérébrale et isolement microglial magnétique
REMARQUE: Toutes les manipulations et resuspensions de cellules doivent être effectuées avec une pipette de 1 000 μL avec une grande prudence. L’application d’une action mécanique élevée peut activer ou tuer les cellules microgliales.
- Transférer 12 morceaux de cerveau (~1,2 g) par tube de dissociation contenant un mélange de dissociation conformément au tableau 1. Pour 24 petits, quatre tubes C étaient nécessaires (figure 2A-B).
- Placez les tubes C sur le dissociateur (avec le mode de chauffage). Démarrez le programme NTDK optimisé dans l’équipement conformément aux instructions du fabricant (Figure 2D).
- Centrifuger à 300 x g pendant 20 s (à 4 °C) pour recueillir toutes les cellules. Complétez la dissociation mécanique en pipetant trois fois de haut en bas avec une pipette de 1 000 μL (figure 2E).
- Transférer les cellules dans quatre tubes de 15 ml + crépines. Rincer les crépines avec 10 ml de HBSS+/+ (Figure 2F).
- Centrifuger à 300 x g pendant 10 min (à 4 °C) et retirer le surnageant. Remettez délicatement la pastille en suspension avec 10 mL de HBSS+/+ (Figure 2G).
- Centrifuger à 300 x g pendant 10 min (à 4 °C) et retirer le surnageant. Remettez délicatement la pastille en suspension avec 6 mL de tampon de tri (étape 1.4) (figure 2H).
- Centrifuger à 300 x g pendant 10 min (à 4 °C) et retirer le surnageant. Ajouter 200 μL de solution de microbilles CD11b (étape 1.5) par tube et remettre en suspension délicatement (figure 2I).
- Incuber les tubes pendant 15-20 min à 4 °C. Remettez délicatement la pastille en suspension avec 6 mL de tampon de tri (figure 2I-J).
- Centrifuger à 300 x g pendant 10 min (à 4 °C) et retirer le surnageant. Remettez délicatement la pastille en suspension avec 8 mL de tampon de tri (figure 2K).
- Suivez le programme POSSEL sur le séparateur (voir le tableau des matériaux) pour préparer huit colonnes. Transférer des cellules de 1 mL par 1 mL sur la colonne. Attendez que toutes les cellules passent avant d’ajouter une autre ml. Cellules élutées CD11b+ sur plaque d’élution stérile avec 1 mL de tampon de tri (Figure 2L).
- Regrouper les cellules CD11b+ dans un nouveau tube de 50 ml (figure 2M).
- Centrifuger à 300 x g pendant 10 min (à 4 °C) et retirer le surnageant. Remettez délicatement la pastille en suspension avec 10 mL de milieu microglial froid (étape 1.6) (Figure 2N).
- Comptez les cellules CD11b+. À P8, on devrait obtenir ~650 000 cellules par cerveau.
REMARQUE : Dans le présent protocole, les cellules étaient comptées à l’aide d’un compteur de cellules automatisé (voir le tableau des matières). - Resuspendre les cellules dans un milieu microglial froid jusqu’à une concentration finale de 650 000 à 700 000 cellules/ml et les distribuer dans des plaques de culture cellulaire.
REMARQUE : Les plaques à 6 puits sont destinées au transfert Western (2 mL par puits); les plaques de 12 puits sont destinées à l’analyse RT-qPCR (1 mL par puits) et les plaques à 96 puits sont destinées à l’analyse phagocytaire (250 μL par puits); Tous les trois ont été utilisés pour ce travail. Cependant, dans ce manuscrit, les résultats de l’analyse Western Blot ne sont pas présentés, mais il est possible de le faire avec ce protocole. - Placer les plaques à 37 °C avec 5% de CO2 pendant la nuit. Changez soigneusement le milieu avec une pipette de 1 000 μL avec un milieu microglial préchauffé.
- Placer les plaques à 37 °C avec 5% de CO2 pendant la nuit avant la stimulation.
REMARQUE: L’isolement de la microglie de plus de 36 petits et après P9 n’est pas recommandé. Cela augmentera le risque de contamination et d’accumulation de débris cellulaires pour activer la microglie.
4. Stimulations cellulaires
- Préparer les réactifs de stimulation conformément au tableau 3 en utilisant les réactifs disponibles dans le commerce (voir le tableau des matériaux).
- Ajouter le volume approprié dans chaque puits stimulé.
REMARQUE : Le volume approprié dépend de la concentration du stimulus et de la taille du puits. - Placer les plaques à 37 °C avec 5% de CO2jusqu’à la fin de la stimulation à 6 h, 24 h ou 48 h.
- Pour l’analyse Western Blot, aspirer le surnageant et ajouter 50 μL de tampon de lyse protéique (voir le tableau des matériaux) à l’aide d’une pipette. À l’aide de pointes, grattez le fond de la plaque pour détacher les cellules lysées et transférez-les dans des tubes de 1,5 mL. Conserver à -80 °C.
NOTE: Les plaques de culture peuvent être conservées pendant des années à -80 ° C si le surnageant est aspiré correctement. - Pour l’analyse RT-qPCR 6,31, aspirer le surnageant et stocker les plaques de culture directement à -80 °C jusqu’à l’extraction de l’ARNm (étape 5).
- Pour le dosage phagocytaire, veuillez consulter l’étape 6.
5. Extraction d’ARNm et analyse RT-qPCR
- Effectuer l’extraction de l’ARN, la RT-PCR et la RT-qPCR en suivant le protocole du fabricant (voir le tableau des matériaux). Voir le tableau 4 pour les séquences d’amorces 5,6,31.
- Effectuez une analyse RT-qPCR en suivant le rapport publié précédemment5.
6. Dosage phagocytaire
- Stimuler les cellules et effectuer un dosage phagocytaire pendant les 3 dernières heures de la stimulation. Par exemple, pour une stimulation de 6 h, commencez le test phagocytaire après 3 h de stimulation; et pour une stimulation de 12 h, commencer le test phagocytaire 9 h après le début de la stimulation.
- Calculez le nombre de billes nécessaires à la préparation en tenant compte du ratio (1 cellule : 50 perles). Pour un puits de la plaque de 96 puits, 8,1 x 106 perles sont nécessaires. Préparer le mélange de billes conformément au tableau 5.
REMARQUE: Vortex soigneux le flacon de billes avant de les ajouter au mélange PBS / FBS. - Incuber pendant 1 h au bain-marie à 37 °C. Vortex toutes les 10 min.
- Calculez le volume de solution à ajouter à chaque puits. Ajouter la solution et incuber pendant 3 h.
- Rincez les puits trois fois avec 1x PBS. Lire l’émission de fluorescence à 550 nm (longueur d’onde d’émission Cy3).
7. Contrôle de la qualité de la pureté
- Évaluer la pureté de l’isolement magnétique CD11b par cytométrie en flux (FACS) (avant et après le tri cellulaire), puis effectuer la RT-qPCR.
- Compter les cellules et les remettre en suspension dans le tampon FACS (PBS + 2 mM d’EDTA + 0,5% d’albumine sérique bovine) afin d’obtenir une dilution de 10 x 106 cellules/mL après les étapes 3.5 et 3.14.
- Après 15 min du Fc conventionnel bloquant 32,33, incuber les cellules pendant 15 min avec une sonde de viabilité (FVS780) et des anticorps conjugués fluorophore contre la souris CD45, CD11b, CX3CR1, ACSA-2, O4 ou leurs isotypes témoins correspondants32,33 à la concentration recommandée par les fabricants (voir tableau des matériaux).
- Laver les cellules avec un tampon FACS, fixer et perméabiliser avec un kit de perméabilisation disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).
- Effectuer à nouveau le blocage de Fc sur les cellules perméabilisées, puis incuber avec un anticorps conjugué fluorophore contre NeuN (voir Tableau des matériaux) ou son isotype témoin pendant 15 min.
- Effectuez une analyse FACS après le lavage avec le tampon FACS.
- Après avoir exclu les doublets et les cellules mortes en fonction des paramètres morphologiques et de la coloration FVS780, respectivement, sélectionnez la stratégie de déclenchement pour l’expression de surface de CX3CR1 (microglie), ACSA-2 (astrocytes), O4 (oligodendrocytes) et la présence intracellulaire de NeuN (neurones) pour l’analyse du pourcentage de cellules positives.
- Après l’étape 5, extraire l’ARNm et effectuer la RT-qPCR pour quantifier Itgam (CD11b), Cx3cr1, Olig2, Synaptophysine et ARNm Gfap . Normalisez Cq en utilisant l’ARNm Rpl13a comme rapporteur et effectuez une expression relative à l’ARNm Itgam .
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Representative Results
La microglie est le macrophage résident du SNC qui s’active lorsqu’il est exposé à des défis environnementaux (traumatisme, molécules toxiques, inflammation)4,5,6,34 (Figure 3A). Les études in vitro sur la microglie sont couramment utilisées pour évaluer les mécanismes autonomes cellulaires liés à ces défis environnementaux et caractériser l’état d’activation après manipulation pharmacologique ou génétique. Ici, une approche est présentée pour isoler la microglie primaire au stade juvénile à l’aide de billes couplées magnétiques.
Une lecture facile pour l’activation microgliale in vitro consiste à quantifier l’expression de l’ARNm de plusieurs marqueurs de réactivité microgliale associés à un phénotype pro-inflammatoire (Cd86, Nos2, Ptgs2, Tnf) ou à un phénotype anti-inflammatoire (Cd206, Igf1, Arg1, Lgasl3)5,6,31. Ces phénotypes ont été décrits en fonction de l’expression de l’ARNm après un stimulus pro-inflammatoire (IL-1β, LPS) ou anti-inflammatoire (IL-4 ou IL-10). Certains marqueurs sont classés comme marqueurs immunorégulateurs parce qu’ils sont régulés à la hausse par stimulation pro et anti-inflammatoire (Figure 3A). Cette classification a été décrite précédemment par notre équipe 5,6,31. Après 48 h, les microglies isolées ont été stimulées avec un stimulus pro- et anti-inflammatoire pendant 4 h ou 24 h. L’ARNm a été extrait et la RT-qPCR a quantifié l’expression génique. A 4 h et 24 h, des marqueurs pro-inflammatoires et immuno-régulateurs sont induits par l’IL-1β, l’IL-1β + l’IFN-γ, et le LPS 5,6,31. A 4 h, la stimulation de l’IL-4 induit également le marqueur immuno-régulateur Il-1rn6. Ils sont fortement induits à 4 h après la stimulation de l’IL-4 concernant les marqueurs anti-inflammatoires. Fait intéressant, le Cd206 est également significativement régulé à la hausse 24 h après la stimulation de l’IL-1β6 (Figure 3B).
Pour évaluer l’activité phagocytaire de la microglie in vitro, des billes fluorescentes de PVC Cy3 ont été utilisées. Ils ont été prétraités avec du sérum fœtal bovin (FBS) pour faciliter leur phagocytose par microglie. Les microglies ont été polarisées vers le phénotype pro-inflammatoire par stimulation avec IL-1β + IFN-γ ou LPS pendant 3 h ou 21 h. Trois heures avant la fin de la stimulation, les billes de Cy3 ont été incubées avec des cellules microgliales. Après rinçage avec 1x PBS, l’intensité de fluorescence dans chaque puits a été quantifiée. La quantification par rapport aux puits sans billes a été exprimée et des images représentatives ont été prises (figure 4). Après 6 h de stimulation, les microglies commencent à phagocyter les billes de Cy3 uniquement sous IL-1β + IFN-γ. Après une stimulation de 24 heures, il y a une augmentation de la fluorescence Cy3 pour les deux types de stimulation. Cette augmentation de la fluorescence Cy3 met en évidence une augmentation de l’activité phagocytaire (Figure 4C).
La cytométrie en flux (FACS) et la RT-qPCR ont été réalisées pour évaluer la pureté de la culture microgliale. Différentes populations cellulaires cérébrales peuvent être distinguées par cytométrie de flux : CX3CR1 35 pour la microglie, O4 pour les oligodendrocytes 36, NeuN pour les neurones37 et ACSA-2 pour les astrocytes38. Après dissociation, toutes les cellules du cerveau sont présentes; cependant, après tri cellulaire à l’aide d’anticorps CD11b, seules les microglies et de petites quantités de cellules O4 sont présentes (Figure 5A). 48 h après la culture cellulaire primaire, seuls les marqueurs microgliaux sont trouvés tels qu’évalués par RT-qPCR (Figure 5B).
Figure 1 : Représentation étape par étape montrant l’ablation du cerveau du crâne. (A-C) De petits ciseaux ont été utilisés pour couper la peau du cou au nez après la suture sagittale. (D-E) Les extrémités des petits ciseaux ont été insérées dans le foramen magnum parallèlement au crâne, et de chaque côté aux yeux ont été soigneusement coupées. (F) Le crâne et le cerveau ont été détachés de la tête en coupant entre les yeux avec de petits ciseaux. (G-I) Le crâne a été saisi près des bulbes olfactifs avec deux pinces et déchiré avec soin pour ne pas endommager le cerveau sous-jacent. (J) Le cervelet et le bulbe olfactif ont été enlevés avec une lame de rasoir, et le cerveau a été coupé en deux morceaux. (K) Les morceaux de cerveau ont été placés dans une boîte de Petri contenant 30-40 mL de HBSS-/-. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Représentation schématique des dissociations cérébrales et de l’isolement des cellules microgliales. (A-C) Après la dissection cérébrale de souris P8 et l’élimination des bulbes olfactifs et du cervelet, les cerveaux ont d’abord été transférés dans une boîte de Petri avec HBSS +/+, puis dans des tubes de dissociation contenant le mélange de dissociation. Les tubes C ont été placés sur le dissociateur (avec le mode de chauffage) et le programme NTDK a été lancé (D). E) À la fin du programme, les tubes ont été centrifugés à 300 x g pendant 20 s à 4 °C; La dissociation a ensuite été complétée par pipetage trois fois de haut en bas avec une pipette de 1 000 μL. (F) Les cellules ont ensuite été transférées dans des tubes de 15 mL + crépines de 70 μm et rincées avec 10 mL de HBSS+/+. (G) Les échantillons ont ensuite été centrifugés à 300 x g pendant 10 minutes à 4 °C, le surnageant a été retiré et la pastille a été remise en suspension avec 10 mL de HBSS+/+. H) Les tubes sont de nouveau centrifugés à 300 x g pendant 10 min à 4 °C; le surnageant a été retiré, puis la pastille a été remise en suspension dans 6 mL de tampon de tri. (I) Les tubes ont été centrifugés à 300 x g pendant 10 minutes à 4 °C, le surnageant a été retiré et la solution de microbilles CD11b (200 μL) a été ajoutée. Les tubes ont été incubés pendant 15 à 20 minutes à 4 °C, puis remis en suspension dans 6 mL de tampon de tri (J) et centrifugés à 300 x g pendant 10 min à 4 °C. (K) Le surnageant a été retiré et la pastille a été soigneusement remise en suspension dans 8 mL de tampon de tri. (L) Ensuite, lancez le programme POSSEL sur le séparateur pour préparer les colonnes. Les cellules ont été transférées de 1 mL sur 1 mL sur la colonne, et les cellules CD11b ont été éluées sur une plaque d’élution stérile avec 1 mL de tampon de tri. (M) Les cellules CD11b ont été regroupées dans un nouveau tube de 50 mL et centrifugées à 300 x g pendant 10 minutes à 4 °C, et le surnageant a été retiré. (N) La pastille a été soigneusement remise en suspension dans 10 mL de milieu microglial froid à la dernière étape. Les cellules ont été comptées et diluées dans le milieu microglial jusqu’à une concentration finale de 650 000 à 700 000 cellules/ml distribuées dans des plaques de culture cellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Activation microgliale après exposition à des défis environnementaux. (A) Représentation schématique simplifiée du spectre d’activation microgliale. (B) Quantification relative des marqueurs d’activation microgliale après stimulation de 4 h ou 24 h. ANOVA bidirectionnelle suivie du test de comparaisons multiples39 de Dunnett (n = 5-15); les barres d’erreur représentent MEB ; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Evaluation de l’activité phagocytaire de la microglie in vitro. (A) Images représentatives de la phagocytose des billes de cy3 de microglie (en rouge) après stimulation de 6 h ou 24 h. Les images ont été acquises à l’aide de l’objectif 20x du microscope à fluorescence. Barre d’échelle = 100 μm. (B) Quantification relative des émissions de fluorescence par puits. Les statistiques ont été effectuées à l’aide d’ANOVA bidirectionnelle, suivie du test de comparaisons multiples de Dunnett (n = 4-7); les barres d’erreur représentent MEB ; *p < 0,05, ** p < 0,01, ***p < 0,001. (C) Image représentative de la microglie (IBA-1 + cellules en vert) Cy3-billes (en rouge) phagocytose après 6 h de stimulation. Les images sont acquises à l’aide d’un objectif 40x du microscope confocal. Barre d’échelle = 300 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Évaluation de la pureté de l’isolement magnétique CD11b par cytométrie en flux avant et après tri cellulaire. (A) Rapporte des exemples du compteur de cellules avant et après le tri cellulaire, en soulignant la concentration et la viabilité cellulaires. (B) L’axe des x représente la concentration cellulaire (cellule/mL) et la viabilité (%) après le tri des cellules CD11b. Graphique à barres à colonnes; les barres d’erreur représentent SEM (n = 16). Analyse phénotypique et de l’expression génique des marqueurs de population cellulaire avant et après tri cellulaire CD11b+. Après dissociation, les cellules CD11b + du cerveau des souris P8 ont été triées magnétiquement. L’expression des marqueurs de la microglie (CX3CR1), des oligodendrocytes (ARNm O4 ou Olig2), des neurones (ARNm NeuN ou Synaptophysine) et des astrocytes (ARNm ACSA-2 ou Gfap) a été analysée avant et après le tri. (C) Analyse FACS de l’expression CX3CR1, O4, NeuN et ACSA-2. L’axe des x représente le pourcentage de cellules vivantes et le nombre de cellules. (D) Quantification relative de l’expression des cellules CD11b + de Cx3cr1, Olig2, Synaptophysin et Gfap mRNA (l’axe des x représente l’expression relative de l’ARNm cible à l’ARNm d’Itgam). Graphique à barres à colonnes; les barres d’erreur représentent SEM (n = 7). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Solution | Pour un tube C (μL) | Pour quatre tubes C (μL) |
| Tampon X | 2850 | 11400 |
| Enzyme P (Papain) | 75 | 300 |
| Enzyme A (ADNase) | 15 | 60 |
| Tampon Y | 30 | 120 |
| Total | 2970 | 11880 |
Tableau 1 : Préparation du mélange de dissociation.
| Solution | Pour un tube (μL) | Pour quatre tubes (μL) |
| Microbilles CD11b | 20 | 80 |
| Tampon de tri | 180 | 720 |
| Total | 200 | 800 |
Tableau 2 : Préparation de la solution de microbilles CD11b.
| Stimulation | Concentration (ng/mL) |
| IL-1β | 50 |
| IFN-γ | 20 |
| LPS | 10 |
| IL-4 | 30 |
| IL-10 | 20 |
Tableau 3 : Les réactifs de stimulation.
| Gènes | Protéine | En avant | Inverse |
| Arg1 | Arginase 1 | GTG AAG AAC CCA CGG TCT GT | GCC AGA GAT GCT TCC AAC TG |
| Cd206 | Groupe de différenciation 206 | CTT CGG GCC TTT GGA ATA AT | TAG AAG AGC CCT TGG GTT GA |
| Cd32 | Cluster de différenciation 32 | CTG GAA GAA GCT GCC AAA AC | CCA ATG CCA AGG GAG ACT AA |
| Cd86 | Cluster de différenciation 86 | GAG CGG GAT AGT AAC GCT GA | GGC TCT CAC TGC CTT CAC TC |
| Gfap | Protéine acide fibrillaire gliale | AAGCCAAGCACGAAGCTAAC | CTCCTGGTAACTGGCCGACT |
| Igf-1 | Facteur de croissance analogue à l’insuline 1 | TGG ATG CTC TTC AGT TCG TG | GCA ACA CTC ATC CAC AAT GC |
| Il1-rn | Antagoniste des récepteurs de l’interleukine 1 | TTG TGC CAA GTC TGG AGA TG | TTC TCA GAG CGG ATG AAG GT |
| Il4-ra | Antagoniste des récepteurs de l’interleukine 4 | GGA TAA GCA GAC GCG AAG C | ACT CTG GAG AGA CTT GGT TGG |
| Itgam | Intégrine alpha M | CTGGTGCTCTTGGCTCTCAT | GGCAGCTTCATTCATCATGT |
| Lgals3 | Lectine Glactoside-Binding soluble 3 | GAT CAC AAT CAT GGG CAC AG | ATT GAA GCG GGG GTT AAA GT |
| Nos2 | Oxyde nitrique synthase 2 | CCC TTC AAT GGT TGG TAC ATG G | ACA TTG ATC TCC GTG ACA GCC |
| Olig2 | Facteur de transcription des oligodendrocytes 2 | CAGCGAGCACCTCAAATCTA | GATGGGCGACTAGACACCAG |
| Ptgs2 | Prostaglandine endoperoxyde synthase 2 | TCA TTC ACC AGA CAG ATT GCT | AAG CGT TTG CGG TAC TCA TT |
| RPL13 | Protéine ribosomique L13a | ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA | GAG TCC GTT GGT CTT GAG GA |
| Socs3 | Suppresseur de cytokine 3 | CGT TGA CAG TCT TCC GAC AA | TAT TCT GGG GGC GAG AAG AT |
| Sphk1 | Sphingosine kinase 1 | TCC AGA AAC CCC TGT GTA GC | CAG CAG TGT GCA GTT GAT GA |
| Syp | Synaptophysine | ATCTCAGTGTCCCGATCCCA | GCTGTCTTCCTGGTGGGTAC |
| Tnf-α | Facteur de nécrose tumorale α | GCC TCT TCT CAT TCC TGC TT | AGG GTC TGG GCC ATA GAA CT |
Tableau 4 : Séquences d’amorces RT-qPCR.
| Stimulation | Pour 1-puits | Pour les puits n |
| Perles Cy3 (1 cellule : 50 perles) | 8, 100, 000 | X = (8, 100 000) x n |
| 1x PBS | Y =(100+X)/n | 50 |
| FBS (en anglais seulement) | 50 |
Tableau 5 : Préparation du mélange de billes pour le dosage phagocytaire.
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Discussion
Les travaux actuels présentent une culture cellulaire microgliale primaire utilisant des cellules CD11b+ triées magnétiquement. En plus de l’évaluation fonctionnelle microgliale (RT-qPCR et tests phagocytaires), la pureté de la culture microgliale a également été déterminée.
Les cultures classiques de cellules microgliales sont généralement générées à partir du cerveau du nouveau-né de rongeurs P1 ou P2 et co-culture avec des astrocytes pendant au moins 10 jours. Les microglies sont ensuite séparées mécaniquement à l’aide d’un agitateur orbital. La méthode d’isolement et de culture de microglies in vitro a été décrite pour la première fois à la fin des années 1990 à partir du cerveau de rats nouveau-nés40,41. Depuis lors, il a été largement utilisé pour analyser les phénotypes microgliaux tels que la microglie activée / au repos ou la microglie pro-inflammatoire / anti-inflammatoire. De plus, cette expérience a été fondamentale pour définir la microglie comme des cellules neurotoxiques co-cultivées avec des neurones. Cependant, en 2014, Biber et ses collaborateurs ont décrit trois inconvénients importants de l’étude de la microglie in vitro en utilisant des méthodes classiques42. (1) L’expérience utilise des cerveaux de nouveau-nés de rats / souris (P1 / P2), et ces cellules ne sont pas passées par tous les processus de maturation qui peuvent se produire in vivo. (2) Dans le milieu de co-culture, 10% FBS est utilisé; Cependant, in vivo, les microglies ne rencontrent jamais de tels composants dans un environnement « normal ». (3) Des études récentes démontrent que les microglies in vivo sont retenues par plusieurs composants inhibiteurs non présents dans la culture43,44. De plus, de nombreuses études (électrophysiologique45 et transcriptomique46,47) ont décrit la microglie primaire non stimulée comme « activée ».
La présente méthode propose une technique alternative pour générer des cultures de microglies en utilisant la technologie de tri cellulaire magnétique. Avec ce protocole, les microglies ne sont récoltées que quelques heures après la mort de l’animal sans aucune étape de co-culture. De plus, les microglies ne sont cultivées que 2 jours in vitro (DIV) avant la stimulation par rapport à 10-14 DIV, y compris la co-culture dans d’autres protocoles. Cela permet de se rapprocher des conditions physiologiques microgliales. Cette procédure de culture de microglies in vitro a déjà été publiée 25,26,27,28,29. Les travaux actuels ont présenté un protocole optimisé pour les souris nouveau-nées, standardisé pour réduire le nombre d’animaux utilisés et sans étape d’élimination de la myéline.
Pour réduire le nombre de souris utilisées pour la culture primaire de microglies, nous avons décidé de travailler à P8 dans la souche OF1. À ce stade du développement cérébral dans la souche OF1, jusqu’à 750 000 cellules microgliales par cerveau ont été obtenues, contre 500 000 cellules microgliales par cerveau de souris souche C57BL6/J au même âge. La souche C57BL6/J a été publiée à un stade de développement différent pour la culture de la microglie27,28. Le présent protocole a également été utilisé avec des souris Fmr1KO pour évaluer les propriétés phagocytaires de la microglie liée à cette mutation et LysMCre: Dicerfl/+ mice pour évaluer les phénotypes d’activation microgliale par RT-qPCR. Ainsi, travailler avec la souche de souris C57BL/6 J est un peu plus difficile que de travailler sur la souche OF1 en raison (1) du nombre de cellules microgliales par cerveau au même stade de développement et (2) de la fragilité des microglies qui sont plus susceptibles de mourir en raison de l’activation mécanique (voir la section dépannage).
Selon le stade de développement choisi pour la culture primaire de la microglie, la myélinisation doit être envisagée puisqu’elle commence autour de P5. Dans une culture microgliale classique (à P0-2), la myélinisation n’est pas un problème; cependant, dans d’autres méthodes publiées pour isoler la microglie, la myéline est éliminée à l’aide du gradient Percoll ou des anticorps anti-myéline25,26,28,29. Dans le protocole actuel, les animaux sont euthanasiés à P8 lorsque la myélinisation a déjà commencé; De grands volumes sont utilisés pour rincer les granulés et la myéline nouvellement formée peut être éliminée sans aucune procédure supplémentaire. Il peut s’agir d’une méthode de dépannage (voir la section Débris).
Le fabricant et l’isolation magnétique microgliale précédemment publiée utilisaient des milieux DMEM F-12 complétés par 10% FBS - 1% P / S 25,26,27,28,29. Biber et coll.42 ont décrit que les microglies entrent rarement en contact avec le sérum in vivo. En effet, le liquide extracellulaire du système nerveux central contient rarement des protéines et des facteurs bioactifs29. C’est pourquoi le milieu macrophage sans sérum (SFM) + 1% P/S est utilisé dans le présent protocole.
Le protocole de tri cellulaire activé magnétique (MACS) permet également d’isoler et de cultiver la microglie postnatale du rat avec quelques modifications25,29. Les microglies de rat sont en effet isolées à l’aide de CD11b/c anti-rat enrobé de microbilles. Cependant, étant donné que la taille du cerveau est supérieure à celle des souris P8, un seul cerveau par tube de dissociation et par colonne doit être utilisé. Les microglies ont été isolées à partir de cerveaux de rats P10-14 dans des protocoles précédemment publiés, y compris l’étape29 d’élimination de la myélinisation. Malgré les commentaires précédents sur le milieu de culture, pour la culture microgliale chez le rat, le milieu F-12 + 10% FBS et 550 000-600 000 cellules par plaque de 12 puits sont recommandés pour les applications en aval.
Dépannage
Dissociation : Le mélange de dissociation décrit dans le tableau 1 est calculé pour la quantité maximale de cerveau qui peut être dissociée et se poursuivre à P8 chez les souris OF1. Si plus de cerveau est ajouté, la dissociation ne peut pas être complétée à la fin de l’étape 3.2, et le tissu cérébral non dissocié sera trouvé. Dans ce cas, il est recommandé d’exécuter le programme NTDK sur le tube avec du tissu non dissocié et de maintenir les autres tubes à 4 °C.
Crépine et/ou colonne obstruée : Comme décrit précédemment, le mélange de dissociation est calculé pour la quantité maximale de tissu cérébral qui peut traverser la crépine à l’étape 3.5. Si plus de cerveau est ajouté, la filtration peut prendre plus de temps, mais finalement, il passera à travers. Il est recommandé de remettre soigneusement en suspension la suspension cellulaire sur le dessus de la crépine jusqu’à ce que toute la suspension cellulaire soit filtrée.
Au cours de l’étape 3.12, l’expérimentateur doit faire passer la suspension cellulaire marquée à travers une colonne à l’intérieur du champ magnétique. La colonne peut être obstruée à ce stade de la procédure (1) si trop de tissu cérébral est dissocié par tube, (2) si le volume de remise en suspension n’est pas correct, ou (3) s’il y a une mort cellulaire induite mécaniquement (un peu d’ADN peut être présent); dans ce cas, il est recommandé d’enlever soigneusement l’ADN visible avec une pointe de 200 μL.
Mort et/ou activation cellulaire induite mécaniquement : Le protocole décrit ici présente un défi principal : éviter l’activation mécanique. Pour ce faire, il est essentiel de pipeter doucement et de maintenir la vitesse de centrifugation basse. Sinon, la microglie immature peut mourir en raison du stress mécanique ou s’activer, ce qui entraîne une grande variabilité des résultats de la RT-qPCR.
Débris: Dans cette procédure, les animaux sont euthanasiés à P8 lorsque la myélinisation commence tout juste, et il n’y a donc pas de procédure pour éliminer précisément la myéline. À ce stade de développement, la myéline peut facilement être éliminée par centrifugation. Les volumes de remise en suspension décrits dans cette procédure sont calculés pour éliminer le maximum de myéline. Si elle n’est pas respectée, la myéline pourrait apparaître sous forme de débris cellulaires dans les puits de culture. L’expérimentateur ne peut pas l’enlever complètement lorsqu’il est observé dans des puits de culture en changeant le milieu le jour 2. Les cellules microgliales ont tendance à phagocyter ces débris, ce qui peut affecter l’état d’activation microgliale avant la stimulation et donc affecter la reproductibilité expérimentale.
Tous les dépannages décrits précédemment (dissociation, crépine et/ou colonne obstruée, mort cellulaire induite mécaniquement et/ou activation, et débris) peuvent entraîner une variabilité du nombre de cellules CD11b+ obtenues lors du comptage cellulaire (Figure 5B). Nous vous recommandons d’y porter une grande attention pour optimiser le rendement cellulaire final.
Contamination: Dans ce protocole, les cellules microgliales sont cultivées en milieu SFM + 1% P/s. Le milieu SFM peut facilement être contaminé. Par conséquent, il est recommandé d’aliquoter le milieu dans des tubes de 50 mL après avoir ajouté du P/S pour éviter la contamination du milieu. De plus, toutes les expériences doivent être effectuées autant que possible dans des conditions stériles.
Quantité/qualité de l’ARNm : Notre équipe travaille sur les transfections miARN ou siRNA. Le protocole actuel est hautement compatible avec de telles applications utilisant la transfection magnétique avec une légère modification du protocole; l’expérimentateur doit récolter 700 000 cellules par plaque de 12 puits pour obtenir un ARNm de haute qualité pour la RT-qPCR. Bien que RNAseq ne soit pas effectué dans la présente étude, auparavant, notre équipe a effectué une extraction d’ARNm pour RNAseq en utilisant 500 000 cellules par plaque de 12 puits48.
En conclusion, ce protocole peut être reproduit, et on s’attend à ce qu’il s’agisse d’une nouvelle norme pour isoler la microglie à un stade de développement juvénile.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Les figurines ont été créées à l’aide de BioRender. La recherche est financée par l’Inserm, l’Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), la Fondation de France, la Fondation ARSEP, la Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, la Fondation Grace de Monaco, et une subvention complémentaire d’Investissement d’Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS et Investissement d’Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti mouse CD11b BV421 | Sony Biotechnology | 1106255 | |
| Anti mouse CD45 BV510 | Sony Biotechnology | 1115690 | |
| Anti mouse CX3CR1 PE Cy7 | Sony Biotechnology | 1345075 | |
| Anti mouse NeuN PE | Milli-Mark | FCMAB317PE | |
| anti mouse O4 Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-120-016 | |
| BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit | BD Biosciences | 554655 | |
| Bovine Serum Albumin | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Confocal microscope | Leica TCS SP8 | ||
| D-PBS (10x) | Thermo Scientific | 14200067 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | |
| Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353043 | |
| Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353072 | |
| Falcon tubes 50 mL | Dutscher | 352098 | |
| Fc blocking reagent (Mouse CD16/32) | BD Biosciences | 553142 | |
| Fluorescence microscope | Nikon ECLIPSE TE300 | ||
| gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes) | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14065049 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14185045 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-rad | 1725006CUST | |
| Iscript c-DNA synthesis | Bio-rad | 1708890 | |
| Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red | Sigma-Aldrich | L2776-1mL | |
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5 | Sigma-Aldrich | L2880 | |
| Macrophage-SFM serum-free medium | Thermo Scientific | 12065074 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
| Mouse IgG1 PE | Millipore | MABC002H | |
| Mouse IgG2a PE Cy7 | Sony Biotechnology | 2601265 | |
| Mouse IL1 beta | Miltenyi Biotec | 130-101-684 | |
| Multi-24 Column Blocks | Miltenyi Biotec | 130-095-691 | |
| MultiMACS Cell24 Separator | Miltenyi Biotec | ||
| Neural Tissue Dissociation Kit - Papain | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| Nucleocounter NC-200 | Chemometec | ||
| Nucleospin RNA Plus XS | Macherey Nagel | 740990.5 | |
| Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
| OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Rat IgG2b, k BV421 | BD Biosciences | 562603 | |
| Rat IgG2b, k BV510 | Sony Biotechnology | 2603230 | |
| REA control (S) PE vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-104-616 | |
| REA control (S) Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-113-445 | |
| Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D System | 485-MI | |
| Recombinant Mouse IL-10 Protein | R&D System | 417-ML | |
| Recombinant Mouse IL-4 Protein | R&D System | 404-ML | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Viability probe (FVS780) | BD Biosciences | 565388 |
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