Summary
初代ミクログリア培養は、新しい抗炎症分子を評価するために一般的に使用されます。本プロトコルは、新生児の子犬からミクログリアを磁気的に分離するための再現可能で関連性のある方法を記載しています。
Abstract
ミクログリアは、脳に常在するマクロファージとして、環境ストレスへの応答や脳の恒常性など、いくつかの機能の基本です。ミクログリアは、広範囲の活性化表現型を採用することができる。さらに、炎症誘発性の表現型を支持するミクログリアは、神経発達障害と神経変性障害の両方に関連しています。 インビトロ 研究は、特定の細胞型における潜在的な治療戦略を評価するための研究で広く使用されています。これに関連して、初代ミクログリア培養物を用いて in vitro でミクログリア活性化および神経炎症を研究することは、ミクログリア細胞株または幹細胞由来ミクログリアよりも関連性が高い。ただし、一部の初代培養物を使用すると、再現性が不足する可能性があります。このプロトコルは、新生児の子犬からミクログリアを磁気的に分離する再現可能で関連性のある方法を提案しています。mRNA発現定量およびCy3ビーズ貪食アッセイによる4時間および24時間後のいくつかの刺激を用いたミクログリア活性化がここで実証される。今回の研究は、幼若発生段階から生理学的に重要なミクログリアを分離するための容易に再現可能な技術を提供することが期待されます。
Introduction
ミクログリアは、初期胚発生中に神経上皮に移動する卵黄嚢の赤血球生成前駆体に由来する中枢神経系常在マクロファージ様細胞です1。免疫機能とは別に、神経発達中、特にシナプス形成、ニューロン恒常性、髄鞘形成にも重要な役割を果たします2。成人期には、ミクログリアは環境を継続的にスキャンするための長い細胞プロセスを発達させます。脳損傷や脳疾患などの恒常性破壊の場合、ミクログリアは形態学的外観を変化させてアメーバ状を採用し、損傷領域に移動し、多くの細胞保護因子または細胞毒性因子を増加させて放出する可能性があります。ミクログリアは、その発生段階および持続した傷害の種類に応じて不均一な活性化状態を有する3,4,5。この研究では、これらの活性化状態は、炎症誘発性/食性、抗炎症性、免疫調節性の3つの異なる表現型に大きく分類され、実際には状況がより複雑になる可能性があることを念頭に置いています6。
脳発達の初期段階でのin vivoミクログリア活性化の研究と神経保護戦略のスクリーニングは、(1)離乳前の動物の脆弱性、および(2)ミクログリア細胞の数が少ないため、困難な場合があります。したがって、ミクログリアに関するin vitro研究は、毒性7、8、9、神経保護戦略5、10、11、12、13、14、および共培養15、16、17、18、19、20、21に広く使用されています。.インビトロ研究では、ミクログリア細胞株、幹細胞由来のミクログリア、または初代ミクログリア培養のいずれかを使用できます。これらすべてのアプローチには長所と短所があり、選択は最初の生物学的問題によって異なります。初代ミクログリア培養を使用する利点は、均質な遺伝的背景、病原体のない履歴、および動物の死後にミクログリアが刺激される時間の制御です22。
長年にわたり、新生児と成人の両方のげっ歯類から一次ミクログリアを培養するためのさまざまな方法(フローサイトメトリー、振とう、または磁気標識)が開発されました23、24、25、26、27、28、29。本研究では、マウス新生児仔からのミクログリア単離を、マイクロビーズコーティング抗マウスCD11b25,27,29を用いた既述の磁気活性化細胞選別技術を用いて行う。CD11bは、ミクログリアを含む骨髄系細胞の表面に発現するインテグリン受容体です。脳内に炎症性の問題がない場合、ほとんどすべてのCD11b +細胞はミクログリア30です。以前に発表された他の方法23、24、25、26、27、28、29と比較して、本プロトコルは、即時のex vivoミクログリア活性化分析および一般的なin vitro初代ミクログリア培養のバランスをとる。したがって、ミクログリアは、(1)ミエリン除去なしで(P)8生後日に単離され、(2)血清なしで培養され、(3)脳単離後わずか48時間でsiRNA、miRNA、薬理学的化合物、および/または炎症刺激のいずれかに曝露されます。これらの3つの側面のそれぞれは、現在のプロトコルを関連性があり迅速なものにします。まず第一に、小児ミクログリアの使用は、インビトロでミクログリア反応性を潜在的に改変する可能性のある追加の脱髄ステップを必要とせずに、培養中の動的で反応性の生存細胞を得ることを可能にする。本プロトコルは、ミクログリアの生理学的環境にできるだけ近づけることを目的とする。実際、ミクログリアは血清に遭遇することはなく、このプロトコルも血清の使用を必要としません。さらに、培養後48時間という早い時期にミクログリアを曝露することで、ミクログリアが生理学的能力を失うことを防ぎます。
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Protocol
議定書が承認され、すべての動物は、フランス、インセルム国立サンテ・エ・ラ・レシェルシュ科学研究所の制度的ガイドラインに従って取り扱われました。P8での24匹のOF1マウス子犬(オスとメスの両方)の脳からのミクログリアの磁気分離は、6ウェル、12ウェル、または96ウェルプレートに分けて提示されます。実験作業は、無菌状態を維持するためにフードの下で行われた。
1.単離および細胞培養のための滅菌溶液の調製
- 市販の10x溶液から、Ca2+およびMg2+(HBSS-/-)を含まない1xハンクス平衡塩溶液(HBSS)50mLを調製します(材料の表を参照)。
- 市販の組織解離キット(材料の表を参照)を用いて、表1に提供される組成に従って解離混合物を調製する。
- 市販の10x溶液から、Ca2+およびMg 2+(HBSS+/+)を含む1x HBSSを200 mL調製します。
- 200 mLの1x PBS + 0.5% BSA(セルソーティングバッファーと呼ばれる)を調製します。
- 表2に従ってCD11bマイクロビーズを調製する。
- 500 mLのマクロファージ無血清培養培地(SFM)+1%のペニシリン-ストレプトマイシン(P/S)を調製します。50 mLチューブをアリコートし、4°Cで保存します。 これは、本文の後半でミクログリア培地と呼ばれます。
注:すべての単離溶液は、実験日に無菌条件下で新たに調製し、氷上に保管する必要があります。ミクログリア細胞培養培地を調製し、50 mLチューブに分注し、将来の使用のために4°Cに保つことができます。ろ過は必要ありません。
2.脳解剖
- 以前の全身麻酔なしで大きなハサミを使用して子犬の頭を斬首します。
- 矢状縫合糸(15〜20 mm)に続いて、小さなハサミで首から鼻までの皮膚を切り取ります(図1A-C)。
- 頭蓋骨に平行な大孔内に小さなはさみの先端を挿入します。両側から目まで慎重にカットします(図1D、E)。
- 小さなハサミで目の間を切り、頭蓋骨と脳を頭から切り離します(図1F)。
- 2つの鉗子で、頭蓋骨を嗅球に近づけ、下にある脳を傷つけないように注意しながら頭蓋骨を慎重に引き裂きます(図1G-I)。
- かみそりの刃で小脳と嗅球を取り除き、脳を2つに切ります(図1J)。
- 脳片を30〜40 mLのHBSS-/- を含むペトリ皿に入れます(図1K)。
3. 脳解離と磁気ミクログリア分離
注:すべての細胞操作および再懸濁は、1,000 μLピペットを使用して細心の注意を払って実行する必要があります。高い機械的作用を適用すると、ミクログリア細胞を活性化または死滅させる可能性があります。
- 表1に従って解離混合物を含む解離チューブあたり12個の脳片(~1.2 g)を移します。24匹の子犬には、4本のCチューブが必要でした(図2A-B)。
- Cチューブを解離器に置きます(加熱モードを使用)。製造元の指示に従って、機器で最適化されたNTDKプログラムを開始します(図2D)。
- 300 x g で20秒間(4°Cで)遠心分離し、すべての細胞を回収します。1,000 μLのピペットで上下に3回ピペッティングすることにより、機械的解離を完了します(図2E)。
- 細胞を4本の15 mLチューブ+ストレーナーに移します。ストレーナーを10 mLのHBSS+/+ ですすいでください(図2F)。
- 300 x g で10分間(4°C)遠心分離し、上清を除去します。ペレットを10 mLのHBSS+/+ で慎重に再懸濁します(図2G)。
- 300 x g で10分間(4°C)遠心分離し、上清を除去します。ペレットを6 mLのソーティングバッファーで慎重に再懸濁します(ステップ1.4)(図2H)。
- 300 x g で10分間(4°C)遠心分離し、上清を除去します。チューブあたり200 μLのCD11bマイクロビーズ溶液(ステップ1.5)を加え、慎重に再懸濁します(図2I)。
- チューブを4°Cで15〜20分間インキュベートします。 ペレットを6 mLのソーティングバッファーで慎重に再懸濁します(図2I-J)。
- 300 x g で10分間(4°C)遠心分離し、上清を除去します。ペレットを8 mLのソーティングバッファーで慎重に再懸濁します(図2K)。
- セパレータのPOSSELプログラム( 材料表を参照)に従って、8つの列を準備します。細胞を1 mLずつカラムに移します。すべての細胞が通過するのを待ってから、別のmLを追加します。CD11b+細胞を滅菌溶出プレート上で1 mLのソーティングバッファーで溶出します(図2L)。
- CD11b+細胞を新しい50 mLチューブにプールします(図2M)。
- 300 x g で10分間(4°C)遠心分離し、上清を除去します。ペレットを10 mLの冷たいミクログリア培地で注意深く再懸濁します(ステップ1.6)(図2N)。
- CD11b +細胞をカウントします。P8では、脳あたり~650,000個の細胞が得られるはずです。
注:本プロトコルでは、細胞は自動セルカウンターを使用してカウントされました( 材料の表を参照)。 - 細胞を低温ミクログリア培地に最終濃度650,000〜700,000細胞/ mLまで再懸濁し、細胞培養プレートに分注します。
注:6ウェルプレートはウェスタンブロット用です(ウェルあたり2 mL)。12ウェルプレートはRT-qPCR分析用(ウェルあたり1 mL)、96ウェルプレートは食作用アッセイ用(ウェルあたり250 μL)用です。3つすべてがこの作業に使用されました。ただし、この原稿では、ウェスタンブロット分析の結果は示されていませんが、このプロトコルで実行することは可能です。 - プレートを5%CO2で一晩37°Cに置きます。予熱したミクログリア培地を入れた1,000 μLピペットで培地を慎重に交換します。
- 刺激の前にプレートを5%CO2で一晩37°Cに置きます。
注:36匹以上の子犬からミクログリアを分離し、P9以降はお勧めしません。これにより、ミクログリアを活性化するための細胞破片の汚染と蓄積のリスクが高まります。
4.細胞刺激
- 市販の試薬を用いて表 3 に従って刺激試薬を調製する( 材料の表参照)。
- 刺激された各ウェルに適切な量を追加します。
注:適切な容量は、刺激の濃度とウェルのサイズによって異なります。 - プレートを37°C、5%CO2で6時間、24時間、または48時間の刺激が終了するまで置きます。
- ウェスタンブロット分析では、上清を吸引し、50 μLのタンパク質溶解バッファー( 材料表を参照)をピペットで加えます。チップを使用してプレートの底を引っ掻き、溶解した細胞を剥離し、1.5 mLチューブに移します。-80°Cで保存してください。
注:培養プレートは、上清が正しく吸引されていれば、-80°Cで何年も保存できます。 - RT-qPCR分析6,31の場合、上清を吸引し、mRNA抽出まで培養プレートを-80°Cで直接保存します(ステップ5)。
- 食作用アッセイについては、ステップ6を参照してください。
5. mRNA抽出とRT-qPCR分析
- 製造元のプロトコルに従って、RNA抽出、RT-PCR、およびRT-qPCRを実行します(材料表を参照)。プライマー配列5、6、31については表4を参照されたい。
- 以前に公開されたレポートに従ってRT-qPCR分析を実行します5.
6.貪食アッセイ
- 細胞を刺激し、刺激の最後の3時間の間に食作用アッセイを実行します。例えば、6時間の刺激の場合、3時間の刺激後に食作用アッセイを開始する。12時間の刺激の場合、刺激開始後9時間で貪食アッセイを開始する。
- 比率を考慮して準備に必要なビーズの数を計算します(1セル:50ビーズ)。96ウェルプレートの1ウェルには、8.1 x 106 ビーズが必要です。 表5に従ってビーズ混合物を調製する。
注意: PBS / FBS混合物に加える前に、ビーズストックバイアルを注意深くボルテックスします。 - 37°Cの水浴中で1時間インキュベートします。 10分ごとに渦を流します。
- 各ウェルに追加する溶液量を計算します。溶液を加え、3時間インキュベートする。
- 1x PBSでウェルを3回すすぎます。550 nm(Cy3発光波長)の蛍光発光を読み取ります。
7. 純度の品質管理
- フローサイトメトリー(FACS)によるCD11b磁気単離の純度(細胞選別前後)を評価し、RT-qPCRを実行します。
- 細胞をカウントし、FACSバッファー(PBS + 2 mMのEDTA + 0.5%ウシ血清アルブミン)に再懸濁して、ステップ3.5およびステップ3.14の後に10 x 106 細胞/mLの希釈液を取得します。
- 従来のFcブロッキング32,33を15分間行った後、マウスCD45、CD11b、CX3CR1、ACSA-2、O4またはそれらに対応するコントロールアイソタイプ32,33に対する生存率プローブ(FVS780)および蛍光色素標識抗体を用いて、細胞をメーカーが推奨する濃度で15分間インキュベートします(材料の表を参照)。
- 細胞をFACSバッファーで洗浄し、固定し、市販の透過処理キットで透過処理します(材料の表を参照)。
- 透過処理した細胞で再度Fcブロッキングを行い、NeuN( 材料の表を参照)またはそのコントロールアイソタイプに対する蛍光色素標識抗体とともに15分間インキュベートします。
- FACSバッファーで洗浄した後、FACS分析を実行します。
- 形態学的パラメータおよびFVS780染色に基づいてダブレットおよび死細胞をそれぞれ除外した後、陽性細胞の割合の分析のために、CX3CR1(ミクログリア)、ACSA-2(星状細胞)、O4(希突起膠細胞)、およびNeuN(ニューロン)の細胞内存在の表面発現のためのゲーティング戦略を選択します。
- ステップ5に続いて、mRNAを抽出し、RT-qPCRを実行して、 Itgam (CD11b)、Cx3cr1、Olig2、シナプトフィジン、 および Gfap mRNAを定量します。レポーターとして Rpl13a mRNAを用いてCqを正規化し、 Itgam mRNAに対する相対発現を行う。
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Representative Results
ミクログリアはCNS常在マクロファージであり、環境問題(外傷、毒性分子、炎症)にさらされると活性化されます4、5、6、34(図3A)。ミクログリアに関するin vitro研究は、これらの環境課題に関連する細胞自律メカニズムを評価し、薬理学的または遺伝子操作後の活性化状態を特徴付けるために一般的に使用されます。ここでは、磁気結合ビーズを用いて幼若期の初代ミクログリアを単離するアプローチを提示する。
in vitroでのミクログリア活性化の簡単な読み出しは、炎症誘発性表現型(Cd86、Nos2、Ptgs2、Tnf)または抗炎症表現型(Cd206、Igf1、Arg1、Lgasl3)に関連するいくつかのミクログリア反応性マーカーのmRNA発現を定量することです5,6,31。 これらの表現型は、炎症誘発性(IL-1β、LPS)または抗炎症性(IL-4またはIL-10)刺激後のmRNA発現に応じて記載された。一部のマーカーは、炎症誘発性および抗炎症性刺激によってアップレギュレーションされるため、免疫調節マーカーに分類されます(図3A)。この分類は、私たちのチーム5,6,31によって以前に説明されました。48時間後、単離されたミクログリアを4時間または24時間の間、炎症誘発性および抗炎症性刺激で刺激し、mRNAを抽出し、RT-qPCRで遺伝子発現を定量化した。4時間および24時間で、炎症誘発性および免疫調節マーカーがIL-1β、IL-1β + IFN-γ、およびLPS 5,6,31によって誘導されます。4時間で、IL-4刺激はまた、免疫調節マーカーIl-1rn6を誘導する。それらは、抗炎症マーカーに関するIL-4刺激の4時間後に強く誘導されます。.興味深いことに、Cd206はまた、IL-1β刺激6の24時間後に有意にアップレギュレーションされる(図3B)。
ミクログリアの貪食活性を インビトロで評価するために、蛍光Cy3 PVCビーズを使用した。彼らは、ミクログリアによる食作用を促進するためにウシ胎児血清(FBS)で前処理されました。ミクログリアは、IL-1β + IFN-γまたはLPSによる刺激により、3時間または21時間炎症誘発性表現型に向かって分極しました。.刺激終了の3時間前に、Cy3ビーズをミクログリア細胞と共にインキュベートした。1x PBSでリンスした後、各ウェルにおける蛍光強度を定量化した。ビーズのないウェルを基準とした定量を発現させ、代表的な画像を撮影しました(図4)。6時間の刺激後、ミクログリアはIL-1β+IFN-γ下でのみCy3ビーズを貪食し始める。24時間の刺激後、両方の種類の刺激でCy3蛍光が増加します。Cy3蛍光の増加は、貪食活性の増加を強調しています(図4C)。
フローサイトメトリー(FACS)およびRT-qPCRを実施して、ミクログリア培養物の純度を評価しました。フローサイトメトリーでは、ミクログリアのCX3CR135、希突起膠細胞のO4、ニューロンのNeuN37、星状細胞38のACSA-2など、さまざまな脳細胞集団を区別できます。解離後、すべての脳細胞が存在します。しかし、CD11b抗体を用いた細胞選別後、ミクログリアと少量のO4細胞しか存在しません(図5A)。初代細胞培養の48時間後、RT-qPCRで評価したミクログリアマーカーのみが見出されます(図5B)。
図1:頭蓋骨からの脳の除去を示す段階的な表現。 (A-C)矢状縫合に続いて首から鼻までの皮膚を切断するために小さなはさみを使用した。(D-E)小さなはさみの先端は頭蓋骨に平行な大孔の中に挿入され、両側から目まで慎重に切断されました。(F)頭蓋骨と脳は、小さなハサミで目の間を切り裂くことによって頭から切り離されました。(G-I)頭蓋骨は2つの鉗子で嗅球の近くでつかまれ、下にある脳を傷つけないように注意深く引き裂かれました。(J)小脳と嗅球をかみそりの刃で取り除き、脳を2つに切断した。(K)脳片を30〜40mLのHBSS-/-を含むペトリ皿に入れた。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:脳の解離とミクログリア細胞の単離の模式図。 (A-C)P8マウスの脳解離および嗅球および小脳の除去後、脳を最初にHBSS+/+を有するペトリ皿に移し、次いで解離混合物を含む解離チューブに移した。Cチューブを解離器に(加熱モードで)配置し、NTDKプログラムを開始しました(D)。(E)プログラムの最後に、チューブを300 x gで4°Cで20秒間遠心分離しました。その後、1,000 μLのピペットで上下に3回ピペッティングすることで解離を完了しました。(F)次いで、細胞を15 mLチューブ+70 μmのストレーナーに移し、10 mLのHBSS+/+ですすいだ。(G)次いで、サンプルを300 x gで4°Cで10分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットを10 mLのHBSS+/+で再懸濁した。(h)チューブを再び300 x gで4°Cで10分間遠心分離した。上清を除去し、次いでペレットを6mLの選別緩衝液に再懸濁した。(i)チューブを300 x gで4°Cで10分間遠心分離し、上清を除去し、CD11bマイクロビーズ(200 μL)溶液を加えた。チューブを4°Cで15〜20分間インキュベートした後、6 mLのソーティングバッファー(J)に再懸濁し、300 x gで4°Cで10分間遠心分離しました。 (k)上清を除去し、ペレットを8 mLのソーティングバッファーに注意深く再懸濁しました。(L)次に、セパレーターでPOSSELプログラムを起動して列を準備します。細胞をカラムに1 mLずつ移し、CD11b細胞を1 mLのソーティングバッファーと共に滅菌溶出プレート上で溶出した。(m)CD11b細胞を新しい50mLチューブにプールし、300 x gで4°Cで10分間遠心分離し、上清を除去した。(n)ペレットを、最後の工程で10mLの冷ミクログリア培地に注意深く再懸濁した。細胞をカウントし、ミクログリア培地で最終濃度650,000〜700,000細胞/ mLに希釈し、細胞培養プレートに分注しました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:環境問題への暴露後のミクログリア活性化。 (A)ミクログリア活性化スペクトルの簡略模式図。(B)4時間または24時間の刺激後のミクログリア活性化マーカーの相対定量。二元配置分散分析とそれに続くダネットの多重比較検定39(n = 5-15)。エラーバーはSEMを表します。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:インビトロでのミクログリアの貪食活性の評価。 (A)6時間または24時間の刺激後のミクログリアCy3ビーズ(赤色)貪食の代表的な画像。画像は、蛍光顕微鏡の20倍対物レンズを使用して取得しました。スケールバー= 100μm。(B)ウェルあたりの蛍光放出の相対定量。統計は、二元配置分散分析とそれに続くダネットの多重比較検定(n = 4-7)を使用して実行されました。エラーバーはSEMを表します。*p < 0.05, ** p < 0.01, ***p < 0.001.(C)ミクログリア(IBA-1+緑色)のCy3ビーズ(赤色)6時間刺激後の貪食の代表写真。画像は、共焦点顕微鏡の40倍の対物レンズを使用して取得されます。スケールバー= 300μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:細胞選別前後のフローサイトメトリーによるCD11b磁気単離純度の評価 。 (A)細胞選別前後のセルカウンターの例を報告し、細胞濃度と生存率を強調しています。(B)x軸はCD11b細胞ソーティング後の細胞濃度(細胞/mL)および生存率(%)を表す。縦棒グラフ;エラーバーはSEM(n = 16)を表します。CD11b+細胞選別前後の細胞集団マーカーの表現型および遺伝子発現解析。解離後、P8マウス脳由来のCD11b+細胞を磁気的に選別した。ミクログリア(CX3CR1)、希突起膠細胞(O4または Olig2 mRNA)、ニューロン(NeuNまたは シナプトフィジン mRNA))、およびアストロサイト(ACSA-2または Gfap mRNA)マーカーの発現をソーティングの前後に分析しました。(C) CX3CR1、O4、NeuN、およびACSA-2発現のFACS解析。X 軸は、生きている細胞の割合と細胞数を表します。(D) Cx3cr1、 Olig2、 シナプトフィジン、 および Gfap mRNAのCD11b+細胞発現の相対定量(x軸は Itgam mRNAに対する相対標的mRNA発現を表す)。縦棒グラフ;エラーバーはSEMを表します(n = 7)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 解決 | Cチューブ1本分(μL) | Cチューブ4本用(μL) |
| バッファ X | 2850 | 11400 |
| 酵素P(パパイン) | 75 | 300 |
| 酵素A(DNAse) | 15 | 60 |
| バッファ Y | 30 | 120 |
| トータル | 2970 | 11880 |
表1:解離混合物の調製。
| 解決 | 1本のチューブ(μL) | 4本のチューブ用(μL) |
| CD11bマイクロビーズ | 20 | 80 |
| ソートバッファ | 180 | 720 |
| トータル | 200 | 800 |
表2:CD11bマイクロビーズ溶液の調製。
| 刺激 | 濃度 (ng/mL) |
| IL-1β | 50 |
| IFN-γ | 20 |
| 組合 | 10 |
| IL-4 | 30 |
| IL-10 | 20 |
表3:刺激試薬。
| 遺伝子 | 蛋白質 | フォワード | 逆 |
| 引数1 | アルギナーゼ1 | GTG AAG AAC CCA CGG TCT GT | GCC AGA GAT GCT TCC AAC TG |
| CD206 | 分化クラスター206 | CTT CGG GCC TTT GGA ATA AT | TAG AAG AG AG CCT TGG GTT GAのタグ |
| CD32 | 分化のクラスター32 | CTG GAA GAA GCT GCC AAA AC | CCA ATG CCA AGG ギャグ アクト AA |
| CD86 | 分化のクラスター 86 | ギャグ CGG ガット アグト AAC GCT GA | GGC TCT CAC TGC CTT CAC TC |
| グファップ | グリア線維性酸性タンパク質 | AAGCCAAGCAAGCAAGCTAAC | CTCCTGGTAACTGGCCGACT |
| IGF-1 | インスリン様成長因子1 | TGG ATG CTC TTC AGT TCG TG | GCA ACA CTC ATC CAC AAT GC |
| Il1-rn | インターロイカイン1受容体拮抗薬 | TTG TGC CAA GTC TGG AGA TG | TTC TCA GAG CGG ATG AAG GT |
| イル4-ラ | インターロイカイン4受容体拮抗薬 | GGA TAA GCA GAC CCG AAG C | アクト CTG ギャグ アガ CTT ggt TGG |
| イトガム | インテグリンアルファM | CTGGTGCTCTCTTTGGCTCTCAT | GGCAGCTTCATTCATCATGT |
| Lgals3 | レクチングラクトシド結合可溶性3 | GAT CAC AAT CAT GGG CAC AG | ATT GAA GCG GGG GTT AAA GT |
| その2 | 一酸化窒素合成酵素2 | CCC TTC AAT GGT TGG TAC ATG G | ACA TTG ATC TCC GTG ACA GCC |
| オリグ2 | 希突起膠細胞転写因子2 | CAGCGGAGCACCTCAAATCTA | ガットググガクタガカッカ |
| Ptgs2 | プロスタグランジンエンドペルオキシド合成酵素2 | TCA TTC ACC AGA CAG ATT GCT | AAG CGT TTG CGG TAC TCA TT |
| Rpl13 | リボソームタンパク質L13a | ACA GCC アクト CTG ギャグ ギャグ AA | ギャグ ティッカー GTT GTT CTT ギャグ ガ |
| ソックス3 | サイトカイン3の抑制因子 | CGT TGA CAG TCT TCC GAC AA | TAT TCT GGG GGC GAG AAG AT |
| Sphk1 | スフィンゴシンキナーゼ1 | TCC AGA AAC CCC TGT GTA GC | CAG CAG TGT GCA GTT GAT GA |
| シップ | シナプトフィジン | ATCTCAGTGTCCCGACCCCA | GCTGTCTTCCTGGTGTGTAC |
| TNF-α | 腫瘍壊死因子 α | GCC TCT TCT CAT TCC TGC TT | AGG GTC TGG GCC ATA GAA CT |
表4:RT-qPCRプライマー配列。
| 刺激 | 1ウェル用 | nウェル用 |
| Cy3ビーズ(1セル:50ビーズ) | 8, 100, 000 | X = (8, 100, 000) x n |
| 1x PBS | Y =(100+X)/n | 50 |
| ティッカー | 50 |
表5:貪食アッセイのためのビーズ混合物の調製。
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Discussion
現在の研究では、磁気的に選別されたCD11b +細胞を使用した初代ミクログリア細胞培養を示しています。ミクログリア機能評価(RT-qPCRおよび食細胞アッセイ)に加えて、ミクログリア培養純度も決定しました。
古典的なミクログリア細胞培養は、通常、P1またはP2げっ歯類の新生児脳から生成され、星状細胞と少なくとも10日間共培養されます。次に、ミクログリアはオービタルシェーカーを使用して機械的に分離されます。ミクログリアをin vitroで単離して培養する方法は、1990年代の終わりに新生児ラットの脳から初めて記載された40,41。それ以来、活性化/休止ミクログリアや炎症誘発性/抗炎症性ミクログリアなどのミクログリア表現型の分析に広く使用されています。さらに、この実験は、ミクログリアをニューロンと共培養した神経毒性細胞として定義するための基礎となっています。しかし、2014年に、Biberと共同研究者は、古典的な方法を使用してin vitroでミクログリアを研究することの3つの重大な欠点を説明しました42。(1)実験はラット/マウスの新生児脳(P1/P2)を用いており、これらの細胞はin vivoで起こりうるすべての成熟過程を通過しなかった。(2)共培養培地では、10%FBSが使用されます。しかし、生体内では、ミクログリアは「通常の」環境でそのような成分に遭遇することはありません。(3)最近の研究は、in vivoミクログリアが培養物に存在しないいくつかの阻害成分によって抑制されていることを示しています43,44。さらに、多くの研究(電気生理学的45およびトランスクリプトミクス46,47)は、刺激されていない一次ミクログリアを「活性化された」と説明しました。
本方法は、磁気的に細胞選別技術を用いてミクログリア培養物を生成する代替技術を提案する。このプロトコルでは、ミクログリアは、動物が死亡してからわずか数時間後に、共培養ステップなしで収穫されます。さらに、ミクログリアは、他のプロトコルでの共培養を含む10〜14DIVと比較して、刺激前にインビトロ(DIV)で2日間しか培養されない。これにより、ミクログリアの生理学的条件に近づくことができます。ミクログリアをインビトロで培養するこの手順は、以前に公開された25、26、27、28、29である。現在の研究は、ミエリン除去ステップなしで使用する動物の数を減らすために標準化された、新生児マウスのための最適化されたプロトコルを提示した。
初代ミクログリア培養に使用するマウスの数を減らすために、OF1株のP8で作業することにしました。OF1株の脳発生のこの段階では、同じ年齢のC57BL6/J系統マウス脳あたり50万個のミクログリア細胞とは対照的に、脳あたり最大75万個のミクログリア細胞が得られました。C57BL6/J株は、ミクログリア培養の異なる発生段階で公開されています27,28。本プロトコルは、この変異に関連するミクログリアの貪食特性を評価するためにFmr1KOマウスで使用され、RT-qPCRによるミクログリア活性化表現型を評価するためにLysMCre:Dicerfl/+マウスでも使用されています。したがって、C57BL/6 Jマウス系統での作業は、(1)同じ発生段階で脳あたりのミクログリア細胞が少ないこと、および(2)機械的活性化のために死にやすいミクログリアの脆弱性のために、OF1株で作業するよりも少し困難です(トラブルシューティングのセクションを参照)。
初代ミクログリア培養のために選択された発達段階に応じて、髄鞘形成はP5頃から始まるため、考慮する必要があります。古典的なミクログリア培養(P0-2)では、髄鞘形成は問題ではありません。しかしながら、ミクログリアを単離するための他の公表された方法では、ミエリンは、パーコール勾配または抗ミエリン抗体を用いて除去される25、26、28、29。本プロトコルでは、動物は髄鞘形成がすでに始まっているときにP8で安楽死させる。ペレットをすすぐために大量が使用され、新しく形成されたミエリンは追加の手順なしで除去することができる。これは、トラブルシューティング方法の 1 つです(「デブリ」セクションを参照)。
製造業者および以前に公表されたミクログリア磁気絶縁は、10%FBS-1%P / S 25,26,27,28,29を添加したDMEM F-12培地を使用した。Biberら42は、ミクログリアがin vivoで血清に接触することはめったにないことを説明しました。実際、中枢神経系の細胞外液にタンパク質や生理活性因子が含まれていることはめったにありません29。そのため、本プロトコルでは無血清マクロファージ(SFM)培地+ 1%P / Sが使用されています。
磁気活性化細胞選別(MACS)プロトコルはまた、いくつかの修飾を用いて出生後ラットミクログリアを単離および培養することができる25,29。ラットミクログリアは、マイクロビーズコーティングされた抗ラットCD11b / cを使用して実際に単離されます。ただし、脳のサイズはP8マウスよりも大きいため、カラムごとに解離チューブごとに1つの脳のみを使用する必要があります。ミクログリアは、髄鞘形成除去ステップ29を含む以前に公開されたプロトコールにおいてP10−14ラット脳から単離された。培養培地に関する以前のコメントにもかかわらず、ラットミクログリア培養では、F-12培地+ 10%FBSおよび12ウェルプレートあたり550,000〜600,000細胞がダウンストリームアプリケーションに推奨されます。
トラブルシューティング
解離: 表 1に記載される解離混合物は、OF1マウスにおいてP8で解離および進行することができる脳の最大量について計算される。さらに脳を追加すると、ステップ3.2の最後に解離を完了できず、解離していない脳組織が見つかります。この場合、解離していない組織を含むチューブでNTDKプログラムを実行し、他のチューブを4°Cに保つことをお勧めします。
ストレーナーおよび/またはカラムの詰まり:前述のように、解離混合物は、ステップ3.5中にストレーナーを通過できる脳組織の最大量に対して計算されます。より多くの脳が追加されると、ろ過に時間がかかる場合がありますが、最終的には通過します。すべての細胞懸濁液がろ過されるまで、ストレーナーの上部で細胞懸濁液を慎重に再懸濁することをお勧めします。
ステップ3.12の間、実験者は標識された細胞懸濁液を磁場内のカラムに通さなければなりません。手順のこの段階でカラムが詰まる可能性があります(1)チューブごとに解離する脳組織が多すぎる場合、(2)再懸濁量が正しくない場合、または(3)機械的に誘発された細胞死がある場合(一部のDNAが存在する可能性があります)。その場合は、200μLのチップで目に見えるDNAを慎重に除去することをお勧めします。
機械的に誘導される細胞死および/または活性化:ここで説明するプロトコルは、機械的活性化を回避するという1つの主要な課題を提示します。そのためには、穏やかにピペットで移動し、遠心分離速度を低く保つことが重要です。そうでない場合、未熟なミクログリアは機械的ストレスのために死ぬか、活性化される可能性があり、RT-qPCR結果に大きなばらつきをもたらします。
破片:この手順では、髄鞘形成が始まったばかりのときに動物をP8で安楽死させるため、ミエリンを正確に除去する手順はありません。発生のこの段階では、ミエリンは遠心分離によって容易に除去することができる。この手順に記載される再懸濁量は、最大ミエリンを除去するように計算される。尊重されない場合、ミエリンは培養ウェルの細胞破片として現れる可能性があります。実験者は、2日目に培地を交換して培養ウェルで観察した場合、それを完全に除去することはできません。ミクログリア細胞はこの破片を貪食する傾向があり、刺激前のミクログリア活性化状態に影響を与え、実験の再現性に影響を与える可能性があります。
前述のすべてのトラブルシューティング(解離、ストレーナーおよび/またはカラムの詰まり、機械的に誘発された細胞死および/または活性化、および破片)は、細胞カウント時に得られるCD11b+細胞の数の変動につながる可能性があります(図5B)。最終的なセル収量を最適化するために、これに細心の注意を払うことをお勧めします。
汚染:このプロトコルでは、ミクログリア細胞はSFM培地+ 1%P / Sで培養されます。したがって、培地の汚染を避けるために、P/Sを添加した後、50 mLチューブに培地を分注することをお勧めします。さらに、すべての実験は無菌条件下で可能な限り実行する必要があります。
mRNAの量/質:私たちのチームは、miRNAまたはsiRNAトランスフェクションに取り組んでいます。本プロトコルは、プロトコルをわずかに変更するだけで磁気トランスフェクションを使用するそのようなアプリケーションと高度に互換性があります。実験者は、RT-qPCR用の高品質のmRNAを得るために、12ウェルプレートあたり700,000個の細胞を回収する必要があります。本研究ではRNAseqは行っていませんが、以前は、私たちのチームは12ウェルプレートあたり500,000細胞を使用してRNAseqのmRNA抽出を行っていました48。
結論として、このプロトコルは再現可能であり、幼若発生段階でミクログリアを分離するための新しい標準となることが期待されます。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
図はBioRenderを使用して作成されました。研究は、Inserm、パリ大学、Horizon 2020(PREMSTEM-874721)、Fondation de France、Fondation ARSEP、Fondation pour la Recherche sur le Cerveau、Fondation Grace de Monaco、およびInvestissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRISおよびInvestissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.E.からの追加助成金によって資金提供されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti mouse CD11b BV421 | Sony Biotechnology | 1106255 | |
| Anti mouse CD45 BV510 | Sony Biotechnology | 1115690 | |
| Anti mouse CX3CR1 PE Cy7 | Sony Biotechnology | 1345075 | |
| Anti mouse NeuN PE | Milli-Mark | FCMAB317PE | |
| anti mouse O4 Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-120-016 | |
| BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit | BD Biosciences | 554655 | |
| Bovine Serum Albumin | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Confocal microscope | Leica TCS SP8 | ||
| D-PBS (10x) | Thermo Scientific | 14200067 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | |
| Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353043 | |
| Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353072 | |
| Falcon tubes 50 mL | Dutscher | 352098 | |
| Fc blocking reagent (Mouse CD16/32) | BD Biosciences | 553142 | |
| Fluorescence microscope | Nikon ECLIPSE TE300 | ||
| gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes) | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14065049 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14185045 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-rad | 1725006CUST | |
| Iscript c-DNA synthesis | Bio-rad | 1708890 | |
| Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red | Sigma-Aldrich | L2776-1mL | |
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5 | Sigma-Aldrich | L2880 | |
| Macrophage-SFM serum-free medium | Thermo Scientific | 12065074 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
| Mouse IgG1 PE | Millipore | MABC002H | |
| Mouse IgG2a PE Cy7 | Sony Biotechnology | 2601265 | |
| Mouse IL1 beta | Miltenyi Biotec | 130-101-684 | |
| Multi-24 Column Blocks | Miltenyi Biotec | 130-095-691 | |
| MultiMACS Cell24 Separator | Miltenyi Biotec | ||
| Neural Tissue Dissociation Kit - Papain | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| Nucleocounter NC-200 | Chemometec | ||
| Nucleospin RNA Plus XS | Macherey Nagel | 740990.5 | |
| Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
| OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Rat IgG2b, k BV421 | BD Biosciences | 562603 | |
| Rat IgG2b, k BV510 | Sony Biotechnology | 2603230 | |
| REA control (S) PE vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-104-616 | |
| REA control (S) Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-113-445 | |
| Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D System | 485-MI | |
| Recombinant Mouse IL-10 Protein | R&D System | 417-ML | |
| Recombinant Mouse IL-4 Protein | R&D System | 404-ML | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Viability probe (FVS780) | BD Biosciences | 565388 |
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