Summary
Primaire microgliaculturen worden vaak gebruikt om nieuwe ontstekingsremmende moleculen te evalueren. Het huidige protocol beschrijft een reproduceerbare en relevante methode om microglia magnetisch te isoleren van pasgeboren pups.
Abstract
Microglia, als hersenbewoner macrofagen, zijn fundamenteel voor verschillende functies, waaronder reactie op omgevingsstress en hersenhomeostase. Microglia kunnen een groot spectrum van activeringsfenotypen aannemen. Bovendien worden microglia die het pro-inflammatoire fenotype ondersteunen geassocieerd met zowel neurologische als neurodegeneratieve aandoeningen. In vitro studies worden veel gebruikt in onderzoek om potentiële therapeutische strategieën in specifieke celtypen te evalueren. In deze context is het bestuderen van microgliale activering en neuro-inflammatie in vitro met behulp van primaire microgliale culturen relevanter dan microgliale cellijnen of van stamcellen afgeleide microglia. Het gebruik van sommige primaire culturen kan echter lijden aan een gebrek aan reproduceerbaarheid. Dit protocol stelt een reproduceerbare en relevante methode voor om microglia magnetisch te isoleren van pasgeboren pups. Microgliale activering met behulp van verschillende stimuli na 4 h en 24 h door mRNA-expressiekwantificering en een Cy3-kraal fagocytische assay wordt hier gedemonstreerd. Het huidige werk zal naar verwachting een gemakkelijk reproduceerbare techniek bieden voor het isoleren van fysiologisch relevante microglia uit juveniele ontwikkelingsstadia.
Introduction
Microglia zijn de macrofaagachtige cellen van het centrale zenuwstelsel die zijn afgeleid van erytropoëtische voorlopers van de dooierzak die migreren naar het neuro-epitheel tijdens de vroege embryonale ontwikkeling1. Afgezien van hun immuniteitsfuncties, spelen ze ook een belangrijke rol tijdens de neurologische ontwikkeling, met name voor synaptogenese, neuronale homeostase en myelinisatie2. Op volwassen leeftijd ontwikkelen microglia lange cellulaire processen om de omgeving continu te scannen. In het geval van homeostaserupturen zoals hersenletsel of hersenziekte, kunnen microglia hun morfologische uiterlijk veranderen om een amoeboïde vorm aan te nemen, naar het gewonde gebied te migreren, veel cytoprotectieve of cytotoxische factoren te verhogen en vrij te geven. Microglia hebben heterogene activeringstoestanden, afhankelijk van hun ontwikkelingsstadium en het type opgelopen letsel 3,4,5. In deze studie worden deze activeringstoestanden grofweg ingedeeld in drie verschillende fenotypen: pro-inflammatoire / fagocytische, ontstekingsremmende en immunoregulerende, rekening houdend met het feit dat de situatie in werkelijkheid waarschijnlijk complexer is6.
Het bestuderen van in vivo microgliale activering en screening op neuroprotectieve strategieën in vroege stadia van de ontwikkeling van de hersenen kan een uitdaging zijn vanwege (1) de kwetsbaarheid van dieren vóór het spenen en (2) het lage aantal microgliale cellen. Daarom worden in vitro studies op microglia veel gebruikt voor toxiciteit 7,8,9, neuroprotectieve strategieën 5,10,11,12,13,14 en co-culturen 15,16,17,18,19,20,21 . In vitro studies kunnen microgliale cellijnen, van stamcellen afgeleide microglia of primaire microgliacultuur gebruiken. Al deze benaderingen hebben voor- en nadelen en de keuze hangt af van de initiële biologische vraag. De voordelen van het gebruik van primaire microgliaculturen zijn de homogene genetische achtergrond, pathogeenvrije geschiedenis en controle van de tijd waarin de microglia worden gestimuleerd na de dood van het dier22.
In de loop der jaren werden verschillende methoden (flowcytometrie, schudden of magnetisch labelen) ontwikkeld voor het kweken van primaire microglia van knaagdieren, zowel pasgeborenen als volwassen 23,24,25,26,27,28,29. In het huidige werk wordt microglia-isolatie van muisneaatpups uitgevoerd met behulp van eerder beschreven magnetisch geactiveerde celsorteertechnologie met behulp van microbead-gecoate anti-muis CD11b 25,27,29. CD11b is een integrine-receptor die tot expressie komt aan het oppervlak van myeloïde cellen, waaronder microglia. Wanneer er geen ontstekingsuitdaging in de hersenen is, zijn bijna alle CD11b + -cellen microglia30. Vergeleken met andere eerder gepubliceerde methoden 23,24,25,26,27,28,29, balanceert het huidige protocol onmiddellijke ex vivo microgliale activeringsanalyses en gemeenschappelijke in vitro primaire microgliale cultuur. Microglia worden dus (1) geïsoleerd op postnatale dag (P)8 zonder myelineverwijdering, (2) gekweekt zonder serum en (3) blootgesteld aan siRNA, miRNA, farmacologische verbinding en/of ontstekingsprikkels slechts 48 uur na hersenisolatie. Elk van deze drie aspecten maakt het huidige protocol relevant en snel. Allereerst maakt het gebruik van pediatrische microglia het mogelijk om dynamische en reactieve levensvatbare cellen in cultuur te verkrijgen zonder dat een extra demyelinisatiestap nodig is die mogelijk de microgliale reactiviteit in vitro zou kunnen wijzigen. Het huidige protocol heeft als doel om zo dicht mogelijk bij de fysiologische omgeving van microglia te komen. Inderdaad, microglia komen nooit serum tegen, en dit protocol vereist ook niet het gebruik van serum. Bovendien voorkomt het blootstellen van microglia al 48 uur na het kweken dat ze hun fysiologische vermogens verliezen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol werd goedgekeurd en alle dieren werden behandeld volgens de institutionele richtlijnen van Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, Frankrijk). Magnetische isolatie van microglia uit de hersenen van 24 OF1 muisjongen (zowel mannelijk als vrouwelijk) op P8, verdeeld in 6-well, 12-well of 96-well platen, worden gepresenteerd. Het experimentele werk werd uitgevoerd onder een kap om steriele omstandigheden te behouden.
1. Bereiding van steriele oplossingen voor isolatie en celkweek
- Bereid 50 ml 1x Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) zonder Ca2+ en Mg2+ (HBSS-/-) uit de in de handel verkrijgbare 10x-oplossing (zie Materiaal tabel).
- Bereid het dissociatiemengsel volgens de samenstelling in tabel 1 met behulp van een in de handel verkrijgbare weefseldissociatiekit (zie materiaaltabel).
- Bereid 200 ml 1x HBSS met Ca2+ en Mg2+ (HBSS+/+) uit de in de handel verkrijgbare 10x oplossing.
- Bereid 200 ml 1x PBS + 0,5% BSA (celsorteerbuffer genoemd).
- Bereid CD11b-microbeads volgens tabel 2.
- Bereid 500 ml macrofaag serumvrij kweekmedium (SFM) + 1% penicilline-streptomycine (P / S). Maak aliquots van buizen van 50 ml en bewaar ze bij 4 °C. Dit wordt later in de tekst het microgliamedium genoemd.
OPMERKING: Alle isolatieoplossingen moeten vers worden bereid onder steriele omstandigheden op de experimenteerdag en op ijs worden bewaard. Microglia celkweekmedium kan worden bereid, gealiquoteerd in buizen van 50 ml en bewaard op 4 °C voor toekomstig gebruik. Filtratie is niet nodig.
2. Hersendissectie
- Onthoofd het hoofd van de pup met een grote schaar zonder voorafgaande algemene anesthesie.
- Knip de huid van de nek tot de neus na de sagittale hechting (15-20 mm) met een kleine schaar (figuur 1A-C).
- Steek de uiteinden van een kleine schaar in het Foramen magnum parallel aan de schedel. Snijd van elke kant voorzichtig naar de ogen (figuur 1D, E).
- Knip tussen de ogen met een kleine schaar om de schedel en de hersenen los te maken van het hoofd (figuur 1F).
- Pak met twee tangen de schedel dicht bij de olfactorische bollen en scheur de schedel voorzichtig, waarbij je ervoor zorgt dat de onderliggende hersenen niet worden beschadigd (figuur 1G-I).
- Verwijder cerebellum en reukbol met een scheermesje en snijd de hersenen in twee stukken (figuur 1J).
- Plaats de hersenstukken in een petrischaaltje met 30-40 ml HBSS-/- (figuur 1K).
3. Hersendissociatie en magnetische microgliale isolatie
OPMERKING: Alle celmanipulaties en resuspensaties moeten met grote voorzichtigheid worden uitgevoerd met een pipet van 1.000 μL. Het toepassen van een hoge mechanische actie kan microgliacellen activeren of doden.
- Breng 12 hersenstukken (~1,2 g) per dissociatiebuis met dissociatiemengsel volgens tabel 1. Voor 24 pups waren vier C-Tubes nodig (figuur 2A-B).
- Plaats C-Tubes op de dissociator (met de verwarmingsmodus). Start het geoptimaliseerde NTDK-programma in de apparatuur volgens de instructies van de fabrikant (figuur 2D).
- Centrifugeer bij 300 x g gedurende 20 s (bij 4 °C) om alle cellen te verzamelen. Voltooi de mechanische dissociatie door drie keer op en neer te pipetteren met een pipet van 1.000 μL (figuur 2E).
- Breng de cellen over naar vier buizen van 15 ml + zeven. Spoel de zeven af met 10 ml HBSS+/+ (figuur 2F).
- Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten (bij 4 °C) en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet voorzichtig met 10 ml HBSS+/+ (figuur 2G).
- Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten (bij 4 °C) en verwijder het supernatant. Resuspeneer de pellet voorzichtig met 6 ml sorteerbuffer (stap 1.4) (figuur 2H).
- Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten (bij 4 °C) en verwijder het supernatant. Voeg 200 μL CD11b-microbead-oplossing (stap 1.5) per buis toe en resuspenseer voorzichtig (figuur 2I).
- Incubeer de buizen gedurende 15-20 min bij 4 °C. Resuspeneer de pellet voorzichtig met 6 ml sorteerbuffer (figuur 2I-J).
- Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten (bij 4 °C) en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet voorzichtig met 8 ml sorteerbuffer (figuur 2K).
- Volg het POSSEL-programma op de separator (zie Materiaaltabel) om acht kolommen voor te bereiden. Breng cellen 1 ml bij 1 ml over op de kolom. Wacht tot alle cellen zijn doorgegeven voordat u nog een ml toevoegt. Elute CD11b+ cellen op steriele elutieplaat met 1 ml sorteerbuffer (figuur 2L).
- Pool CD11b+ cellen in een nieuwe buis van 50 ml (figuur 2M).
- Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten (bij 4 °C) en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet voorzichtig met 10 ml koud microgliamedium (stap 1.6) (figuur 2N).
- Tel de CD11b+-cellen. Bij P8 zou men ~650.000 cellen per brein moeten verkrijgen.
OPMERKING: In het huidige protocol werden de cellen geteld met behulp van een geautomatiseerde celteller (zie Tabel van materialen). - Resuspensieer de cellen in koud microglia medium tot een eindconcentratie van 650.000-700.000 cellen/ml en dispense in celkweekplaten.
OPMERKING: De 6-well platen zijn voor Western Blot (2 ml per put); de 12-well platen zijn voor RT-qPCR-analyse (1 ml per put) en de 96-well platen zijn voor fagocytische assay (250 μL per put); alle drie werden ze voor dit werk gebruikt. In dit manuscript worden de resultaten van de Western Blot-analyse echter niet getoond, maar het is mogelijk om met dit protocol te presteren. - Zet de borden een nacht op 37 °C met 5% CO2. Vervang het medium voorzichtig met een pipet van 1.000 μL met voorverwarmd microgliamedium.
- Plaats de platen op 37 °C met 5% CO2 een nacht voor stimulatie.
OPMERKING: Het isoleren van microglia van meer dan 36 pups en na P9 worden niet aanbevolen. Dit verhoogt het risico op besmetting en ophoping van celresten om microglia te activeren.
4. Celstimulaties
- Bereid stimulatiereagentia volgens tabel 3 met behulp van de in de handel verkrijgbare reagentia (zie materiaaltabel).
- Voeg het juiste volume toe aan elke gestimuleerde put.
OPMERKING: Het juiste volume hangt af van de concentratie van de stimulus en de grootte van de put. - Plaats de platen op 37 °C met 5% CO2tot het einde van de stimulatie op 6 h, 24 h of 48 h.
- Voor de Western Blot-analyse aspirateer je het supernatant en voeg je 50 μL eiwitlysisbuffer (zie Materiaaltabel) toe met een pipet. Kras met behulp van tips de onderkant van de plaat om de gelyseerde cellen los te maken en breng ze over naar buizen van 1,5 ml. Bewaren bij -80 °C.
OPMERKING: De kweekplaten kunnen jarenlang bij -80 °C worden bewaard als het supernatant correct wordt aangezogen. - Voor RT-qPCR-analyse 6,31 ademt u het supernatant op en slaat u de kweekplaten direct op bij -80 °C tot mRNA-extractie (stap 5).
- Voor de fagocytische test, zie stap 6.
5. mRNA-extractie en RT-qPCR-analyse
- Voer RNA-extractie, RT-PCR en RT-qPCR uit volgens het protocol van de fabrikant (zie materiaaltabel). Zie tabel 4 voor de primerreeksen 5,6,31.
- Voer rt-qPCR-analyse uit door het eerder gepubliceerde rapportte volgen 5.
6. Fagocytische test
- Stimuleer de cellen en voer fagocytische testen uit tijdens de laatste 3 uur van de stimulatie. Bijvoorbeeld, voor stimulatie van 6 uur, start de fagocytische assay na 3 h stimulatie; en voor stimulatie van 12 uur, start de fagocytische test 9 uur na het begin van de stimulatie.
- Bereken het aantal kralen dat nodig is om te bereiden, rekening houdend met de verhouding (1 cel: 50 kralen). Voor één put van de 96-well plaat zijn 8,1 x 106 kralen nodig. Bereid het kralenmengsel volgens tabel 5.
OPMERKING: Vortex de voorraadflacon van de kralen voorzichtig voordat u deze aan het PBS / FBS-mengsel toevoegt. - Incubeer gedurende 1 uur in een waterbad bij 37 °C. Vortex elke 10 min.
- Bereken het oplossingsvolume dat aan elke put moet worden toegevoegd. Voeg de oplossing toe en incubeer gedurende 3 uur.
- Spoel de putjes drie keer af met 1x PBS. Lees de fluorescentie-emissie bij 550 nm (Cy3-emissiegolflengte).
7. Zuiverheid kwaliteitscontrole
- Evalueer de zuiverheid van CD11b magnetische isolatie door flowcytometrie (FACS) (voor en na celsortering) en voer vervolgens de RT-qPCR uit.
- Tel de cellen en resuspendeer in FACS-buffer (PBS + 2 mM EDTA + 0,5% runderserumalbumine) om een verdunning van 10 x 106 cellen / ml te verkrijgen na stap 3,5 en stap 3,14.
- Na 15 minuten van de conventionele Fc-blokkeringvan 32,33, incubeer de cellen gedurende 15 minuten met levensvatbaarheidsonde (FVS780) en fluorofoor-geconjugeerde antilichamen tegen muis CD45, CD11b, CX3CR1, ACSA-2, O4 of hun overeenkomstige controle-isotypen32,33 in de door de fabrikanten aanbevolen concentratie (zie materiaaltabel).
- Was de cellen met FACS-buffer, fixeer en permeabiliseer met een in de handel verkrijgbare permeabilisatiekit (zie Materiaaltabel).
- Voer fc-blokkering opnieuw uit op de gepermeabiliseerde cellen en incubeer vervolgens met fluorofoor-geconjugeerd antilichaam tegen NeuN (zie materiaaltabel) of het controle-isotype gedurende 15 minuten.
- Voer FACS-analyse uit na het wassen met FACS-buffer.
- Na uitsluiting van de doubletten en de dode cellen op basis van respectievelijk morfologische parameters en FVS780-kleuring, selecteert u de gatingstrategie voor de oppervlakteexpressie van CX3CR1 (microglia), ACSA-2 (astrocyten), O4 (oligodendrocyten) en intracellulaire aanwezigheid van NeuN (neuronen) voor de analyse van het percentage positieve cellen.
- Na stap 5, extraheer mRNA en voer RT-qPCR uit om Itgam (CD11b), Cx3cr1, Olig2, Synaptophysin en Gfap mRNA te kwantificeren. Normaliseer Cq met Rpl13a-mRNA als reporter en voer een relatieve expressie uit voor Itgam-mRNA .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Microglia is de in het CZS verblijvende macrofaag die wordt geactiveerd wanneer deze wordt blootgesteld aan milieu-uitdagingen (trauma, toxische moleculen, ontsteking)4,5,6,34 (figuur 3A). In vitro studies op microglia worden vaak gebruikt om cel-autonome mechanismen gerelateerd aan die omgevingsuitdagingen te evalueren en de activeringstoestand na farmacologische of genetische manipulatie te karakteriseren. Hier wordt een benadering gepresenteerd om primaire microglia in het juveniele stadium te isoleren met behulp van magnetische gekoppelde kralen.
Een eenvoudige uitlezing voor microgliale activering in vitro is het kwantificeren van mRNA-expressie van verschillende microgliale reactiviteitsmarkers geassocieerd met een pro-inflammatoir fenotype (Cd86, Nos2, Ptgs2, Tnf) of een ontstekingsremmend fenotype (Cd206, Igf1, Arg1, Lgasl3)5,6,31. Deze fenotypen werden beschreven afhankelijk van mRNA-expressie na pro-inflammatoire (IL-1β, LPS) of ontstekingsremmende (IL-4 of IL-10) stimulus. Sommige markers worden geclassificeerd als immunoregulerende markers omdat ze worden geupreguleerd door pro- en ontstekingsremmende stimulatie (figuur 3A). Dit klassement werd eerder beschreven door ons team 5,6,31. Na 48 uur werden geïsoleerde microgliale gestimuleerd met pro- en ontstekingsremmende stimulus gedurende 4 uur of 24 uur. mRNA werd geëxtraheerd en RT-qPCR gekwantificeerde genexpressie. Na 4 uur en 24 uur worden pro-inflammatoire en immunoregulerende markers geïnduceerd door IL-1β, IL-1β + IFN-γ en LPS 5,6,31. Na 4 uur induceert IL-4-stimulatie ook de immunoregulerende marker Il-1rn6. Ze worden sterk geïnduceerd na 4 uur na IL-4-stimulatie met betrekking tot ontstekingsremmende markers. Interessant is dat Cd206 ook 24 uur na IL-1β-stimulatie6 aanzienlijk wordt geupreguleerd (figuur 3B).
Om de fagocytische activiteit van microglia in vitro te evalueren, werden fluorescerende Cy3 PVC-kralen gebruikt. Ze werden voorbehandeld met foetaal runderserum (FBS) om hun fagocytose door microglia te vergemakkelijken. Microglia werden gepolariseerd in de richting van pro-inflammatoir fenotype door stimulatie met IL-1β + IFN-γ of LPS gedurende 3 uur of 21 uur. Drie uur voor het einde van de stimulatie werden Cy3-kralen geïncubeerd met microgliale cellen. Na spoelen met 1x PBS werd de fluorescentie-intensiteit in elke put gekwantificeerd. Kwantificering ten opzichte van putten zonder kralen werd uitgedrukt en er werden representatieve beelden gemaakt (figuur 4). Na 6 uur stimulatie beginnen microglia cy3-kralen alleen te fagocyteren onder IL-1β + IFN-γ. Na een 24 uur stimulatie is er een toename van Cy3-fluorescentie voor beide soorten stimulatie. Die toename van Cy3-fluorescentie wijst op verhoogde fagocytische activiteit (figuur 4C).
Flowcytometrie (FACS) en RT-qPCR werden uitgevoerd om de zuiverheid van de microgliale cultuur te evalueren. Verschillende hersencellulaire populaties kunnen worden onderscheiden door flowcytometrie: CX3CR135 voor microglia, O4 voor oligodendrocyten36, NeuN voor neuronen37 en ACSA-2 voor astrocyten38. Na dissociatie zijn alle hersencellen aanwezig; na celsortering met behulp van CD11b-antilichaam zijn echter alleen microglia en kleine hoeveelheden O4-cellen aanwezig (figuur 5A). 48 uur na primaire celkweek worden alleen microgliamarkers gevonden zoals geëvalueerd door RT-qPCR (figuur 5B).
Figuur 1: Stapsgewijze weergave van de verwijdering van de hersenen uit de schedel. (A-C) Kleine scharen werden gebruikt om de huid van de nek naar de neus te knippen na de sagittale hechting. (D-E) De uiteinden van de kleine schaar werden in het Foramen magnum parallel aan de schedel ingebracht en van elke kant naar de ogen zorgvuldig geknipt. (F) De schedel en de hersenen werden losgemaakt van het hoofd door met een kleine schaar tussen de ogen te snijden. (G-I) De schedel werd met twee tangen dicht bij de reukbollen gegrepen en voorzichtig gescheurd om de onderliggende hersenen niet te beschadigen. (J) Het cerebellum en de reukbol werden verwijderd met een scheermesje en de hersenen werden in twee stukken gesneden. (K) De hersenstukken werden in een petrischaaltje geplaatst met 30-40 ml HBSS-/-. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schematische weergave van hersendissociaties en isolatie van microgliale cellen. (A-C) Na de hersendissectie van P8-muizen en het verwijderen van reukplampen en cerebellum, werden de hersenen eerst overgebracht naar een petrischaal met HBSS +/+, en vervolgens naar dissociatiebuizen met het dissociatiemengsel. De C-buizen werden op de dissociator geplaatst (met de verwarmingsmodus) en het NTDK-programma werd gestart (D). (E) Aan het einde van het programma werden buizen gecentrifugeerd bij 300 x g gedurende 20 s bij 4 °C; dissociatie werd vervolgens voltooid door drie keer op en neer te pipetteren met een pipet van 1.000 μL. (F) Cellen werden vervolgens overgebracht naar buizen van 15 ml + zeven van 70 μm en gespoeld met 10 ml HBSS +/+. (G) Monsters werden vervolgens gecentrifugeerd bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C, het supernatant werd verwijderd en de pellet werd geresuspendeerd met 10 ml HBSS+/+. (H) Buizen werden opnieuw gecentrifugeerd bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C; het supernatant werd verwijderd en vervolgens werd de pellet geresuspendeerd in 6 ml sorteerbuffer. (I) Buizen werden gecentrifugeerd bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C, het supernatant werd verwijderd en de CD11b-microbead (200 μL) oplossing werd toegevoegd. Buizen werden gedurende 15-20 minuten bij 4 °C geïncubeerd en vervolgens geresuspendeerd in 6 ml sorteerbuffer (J) en gedurende 10 minuten gecentrifugeerd bij 300 x g bij 4 °C. (K) Het supernatant werd verwijderd en de pellet werd zorgvuldig geresuspendeerd in 8 ml sorteerbuffer. (L) Start vervolgens het POSSEL-programma op het scheidingsteken om kolommen voor te bereiden. Cellen werden 1 ml bij 1 ml op de kolom overgebracht en CD11b-cellen werden geëlueerd op een steriele elutieplaat met 1 ml sorteerbuffer. (M) CD11b-cellen werden samengevoegd in een nieuwe buis van 50 ml en gecentrifugeerd bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C, en het supernatant werd verwijderd. (N) De pellet werd in de laatste stap zorgvuldig geresuspendeerd in 10 ml koud microgliamedium. De cellen werden geteld en verdund in het microgliale medium tot een uiteindelijke concentratie van 650.000-700.000 cellen / ml gedoseerd in celkweekplaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Microgliale activering na uiteenzetting van omgevingsuitdagingen. (A) Vereenvoudigde schematische weergave van microgliale activeringsspectrum. (B) Relatieve kwantificering van microgliale activeringsmarkers na 4 uur of 24 uur stimulatie. Tweeweg ANOVA gevolgd door Dunnett's meervoudige vergelijkingstest39 (n = 5-15); foutbalken vertegenwoordigen SEM; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Evaluatie van de fagocytische activiteit van microglia in vitro. (A) Representatieve beelden van microglia Cy3-kralen (in rood) fagocytose na stimulatie van 6 h of 24 h. De beelden werden verkregen met behulp van 20x objectief van de fluorescentiemicroscoop. Schaalbalk = 100 μm. (B) Relatieve kwantificering van fluorescentie-emissies per put. Statistieken werden uitgevoerd met behulp van tweerichtings ANOVA gevolgd door Dunnett's meervoudige vergelijkingstest (n = 4-7); foutbalken vertegenwoordigen SEM; *p < 0,05, ** p < 0,01, ***p < 0,001. (C) Representatief beeld van microglia (IBA-1 + cellen in groen) Cy3-kralen (in rood) fagocytose na 6 uur stimulatie. De beelden worden verkregen met behulp van een 40x objectief van de confocale microscoop. Schaalbalk = 300 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Evaluatie van cd11b magnetische isolatiezuiverheid door flowcytometrie voor en na celsortering. (A) Rapporteert voorbeelden van de celteller voor en na celsortering, waarbij de celconcentratie en levensvatbaarheid worden benadrukt. (B) De x-as vertegenwoordigt de celconcentratie (cel/ml) en de levensvatbaarheid (%) na cd11b-celsortering. Kolom staafdiagram; foutbalken vertegenwoordigen SEM (n = 16). Fenotypische en genexpressie analyse van celpopulatie markers voor en na CD11b+ celsortering. Na dissociatie werden CD11b+ cellen uit de hersenen van P8-muizen magnetisch gesorteerd. Expressie van microglia (CX3CR1), oligodendrocyten (O4 of Olig2 mRNA), neuronen (NeuN of Synaptophysin mRNA)) en astrocyten (ACSA-2 of Gfap mRNA) markers werd geanalyseerd voor en na het sorteren. (C) FACS-analyse van CX3CR1-, O4-, NeuN- en ACSA-2-expressie. De x-as vertegenwoordigt het percentage levende cellen en celaantallen. (D) Relatieve kwantificering van CD11b+ celexpressie van Cx3cr1, Olig2, Synaptophysine en Gfap mRNA (x-as vertegenwoordigt relatieve doel mRNA expressie ten opzichte van Itgam mRNA). Kolom staafdiagram; foutbalken vertegenwoordigen SEM (n = 7). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Oplossing | Voor één C-Tube (μL) | Voor vier C-buizen (μL) |
| Buffer X | 2850 | 11400 |
| Enzym P (Papaïne) | 75 | 300 |
| Enzym A (DNAse) | 15 | 60 |
| Buffer Y | 30 | 120 |
| Totaal | 2970 | 11880 |
Tabel 1: Bereiding van het dissociatiemengsel.
| Oplossing | Voor één buis (μL) | Voor vier buizen (μL) |
| CD11b Microbeads | 20 | 80 |
| Sorteerbuffer | 180 | 720 |
| Totaal | 200 | 800 |
Tabel 2: Bereiding van de CD11b microbead oplossing.
| Stimulatie | Concentratie (ng/ml) |
| IL-1β | 50 |
| IFN-γ | 20 |
| LPS | 10 |
| Il-4 | 30 |
| Il-10 | 20 |
Tabel 3: De stimulatiereagentia.
| Genen | Eiwit | Voorwaarts | Omkeren |
| Arg1 | Arginase 1 Zoekertjes | GTG AAG AAC CCA CGG TCT GT | GCC AGA GAT GCT TCC AAC TG |
| Cd206 | Cluster van differentiatie 206 | CTT CGG GCC TTT GGA ATA AT | LABEL AAG AGC CCT TGG GTT GA |
| Cd32 | Cluster van differentiatie 32 | CTG GAA GAA GCT GCC AAA AC | CCA ATG CCA AGG GAG ACT AA |
| Cd86 | Cluster van differentiatie 86 | GAG CGG GAT AGT AAC GCT GA | GGC TCT CAC TGC CTT CAC TC |
| Gfap | Glial fibrillary zuur eiwit | AAGCCAAGCACGAAGCTAAC | CTCCTGGTAACTGGCCGACT |
| IGF-1 | Insuline-achtige groeifactor 1 | TGG ATG CTC TTC AGT TCG TG | GCA ACA CTC ATC CAC AAT GC |
| Il1-rn | Interleukine 1 receptorantagonist | TTG TGC CAA GTC TGG AGA TG | TTC TCA GAG CGG ATG AAG GT |
| Il4-ra | Interleukine 4 receptor antagonist | GGA TAA GCA GAC CCG AAG C | ACT CTG GAG AGA CTT GGT TGG |
| Itgam | Integrine alpha M | CTGGTGCTCTTGGCTCTCAT | GGCAGCTTCATTCATCATGT |
| LGALS3 | Lectine Glactoside-Binding oplosbaar 3 | GAT CAC AAT KAT GGG CAC AG | ATT GAA GCG GGG GTT AAA GT |
| Nos2 | Stikstofmonoxidesynthase 2 | CCC TTC AAT GGT TGG TAC ATG G | ACA TTG ATC TCC GTG ACA GCC |
| Olig2 | Oligodendrocytentranscriptiefactor 2 | CAGCGAGCACCTCAAATCTA | GATGGGCGACTAGACACCAG |
| Ptgs2 | Prostaglandine endoperoxidesynthase 2 | TCA TTC ACC AGA CAG ATT GCT | AAG CGT TTG CGG TAC TCA TT |
| RPL13 | Ribosomaal eiwit L13a | ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA | GAG TCC GTT GGT CTT GAG GA |
| Socs3 | Suppressor van cytokine 3 | CGT TGA CAG TCT TCC GAC AA | TAT TCT GGG GGC GAG AAG BIJ |
| Sphk1 | Sfingosinekinase 1 | TCC AGA AAC CCC TGT GTA GC | CAG CAG TGT GCA GTT GAT GA |
| Syp | Synaptophysine | ATCTCAGTCCCGATCCCA | GCTGTCTTCCTGGTGGGTAC |
| Tnf-α | Tumornecrosefactor α | GCC TCT TCT KAT TCC TGC TT | AGG GTC TGG GCC ATA GAA CT |
Tabel 4: RT-qPCR primer sequenties.
| Stimulatie | Voor 1-put | Voor n-putten |
| Cy3 Kralen (1 cel : 50 kralen) | 8, 100, 000 | X = (8, 100, 000) x n |
| 1x PBS | Y =(100+X)/n | 50 |
| FBS | 50 |
Tabel 5: Bereiding van het kralenmengsel voor fagocytische assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het huidige werk presenteert een primaire microgliale celcultuur met behulp van magnetisch gesorteerde CD11b + -cellen. Naast de microgliale functionele evaluatie (RT-qPCR en fagocytische assays) werd ook de microgliale cultuurzuiverheid bepaald.
Klassieke microgliacelculturen worden vaak gegenereerd uit P1- of P2-knaagdierneaatheren en co-cultuur met astrocyten gedurende ten minste 10 dagen. Microglia worden vervolgens mechanisch gescheiden met behulp van een orbitale shaker. De methode om microglia in vitro te isoleren en te kweken werd voor het eerst beschreven aan het einde van de jaren 1990 uit de hersenen van pasgeboren ratten40,41. Sindsdien is het op grote schaal gebruikt om microgliale fenotypen te analyseren, zoals geactiveerde / rustende microglia of pro-inflammatoire / ontstekingsremmende microglia. Bovendien is dit experiment van fundamenteel belang geweest voor het definiëren van microglia als neurotoxische cellen die samen met neuronen worden gekweekt. In 2014 beschreven Biber en medewerkers echter drie belangrijke nadelen van het bestuderen van microglia in vitro met behulp van klassieke methoden42. (1) Het experiment maakt gebruik van ratten/muizenneushersenen (P1/P2) en deze cellen hebben niet alle rijpingsprocessen doorlopen die in vivo kunnen optreden. (2) In het cocultuurmedium wordt 10% FBS gebruikt; in vivo komen microglia dergelijke componenten echter nooit tegen in een "normale" omgeving. (3) Recente studies tonen aan dat in vivo microglia worden beperkt door verschillende remmende componenten die niet in de kweek aanwezig zijn43,44. Bovendien beschreven veel studies (elektrofysiologische45 en transcriptomische 46,47) niet-gestimuleerde primaire microglia als "geactiveerd".
De huidige methode stelt een alternatieve techniek voor om microgliaculturen te genereren met behulp van magnetisch cel gesorteerde technologie. Met dit protocol worden microglia slechts enkele uren nadat het dier sterft geoogst zonder enige co-kweekstap. Bovendien worden microglia slechts 2 dagen in vitro (DIV) gekweekt vóór stimulatie in vergelijking met 10-14 DIV, inclusief co-kweek in andere protocollen. Dit maakt het mogelijk om dichter bij de microgliale fysiologische omstandigheden te komen. Deze procedure voor het kweken van microglia in vitro werd eerder gepubliceerd 25,26,27,28,29. Het huidige werk presenteerde een geoptimaliseerd protocol voor pasgeboren muizen, gestandaardiseerd voor het verminderen van het aantal gebruikte dieren en zonder myelineverwijderingsstap.
Om het aantal muizen dat wordt gebruikt voor primaire microgliacultuur te verminderen, hebben we besloten om te werken bij P8 in de OF1-stam. In dit stadium van de hersenontwikkeling in DE1-stam werden tot 750.000 microgliale cellen per brein verkregen, in tegenstelling tot 500.000 microgliale cellen per C57BL6 / J-stammuishersenen op dezelfde leeftijd. C57BL6/J stam is gepubliceerd in een ander ontwikkelingsstadium voor microglia cultuur27,28. Het huidige protocol is ook gebruikt met Fmr1KO-muizen om fagocytische eigenschappen van microglia gekoppeld aan deze mutatie te evalueren en LysMCre: Dicerfl /+ muizen om microgliale activering fenotypes te beoordelen door RT-qPCR. Het werken met C57BL/6 J muizenstam is dus iets uitdagender dan het werken aan OF1-stam vanwege (1) minder microgliale cellen per hersenen in hetzelfde ontwikkelingsstadium en (2) kwetsbaarheid van microglia die meer vatbaar zijn voor afsterven als gevolg van mechanische activering (zie de sectie probleemoplossing).
Afhankelijk van het ontwikkelingsstadium dat is gekozen voor primaire microgliacultuur, moet myelinisatie worden overwogen omdat het begint rond P5. In een klassieke microgliale cultuur (bij P0-2) is myelinisatie geen probleem; in andere gepubliceerde methoden om microglia te isoleren, wordt myeline echter verwijderd met behulp van Percoll-gradiënt of anti-myeline-antilichamen 25,26,28,29. In het huidige protocol worden dieren geëuthanaseerd op P8 wanneer de myelinisatie al is begonnen; grote volumes worden gebruikt om pellets te spoelen en de nieuw gevormde myeline kan zonder extra procedure worden verwijderd. Dit kan een methode zijn om problemen op te lossen (zie het gedeelte Puin).
De fabrikant en eerder gepubliceerde microgliale magnetische isolatie gebruikte DMEM F-12 media aangevuld met 10% FBS - 1% P / S 25,26,27,28,29. Biber et al.42 beschreven dat microglia zelden in vivo contact maken met serum. Inderdaad, de extracellulaire vloeistof van het centrale zenuwstelsel bevat zelden eiwitten en bioactieve factoren29. Daarom wordt in het huidige protocol serumvrije macrofaag (SFM) medium + 1% P/S gebruikt.
Het MACS-protocol (Magnetic-activated cell sorting) kan ook postnatale rattenmicroglia isoleren en kweken met enkele modificaties25,29. Rat microglia worden inderdaad geïsoleerd met behulp van Microbead-gecoate anti-rat CD11b / c. Omdat de hersengrootte echter groter is dan P8-muizen, mag slechts één brein per dissociatiebuis per kolom worden gebruikt. Microglia werden geïsoleerd uit P10-14 rattenhersenen in eerder gepubliceerde protocollen, waaronder de myelinisatieverwijderingsstap29. Ondanks de eerdere opmerkingen over kweekmedium, worden voor microgliale cultuur van ratten F-12 media + 10% FBS en 550.000-600.000 cellen per 12-well plaat aanbevolen voor downstream-toepassingen.
Probleemoplossing
Dissociatie: Het dissociatiemengsel zoals beschreven in tabel 1 wordt berekend voor de maximale hoeveelheid hersenen die kan worden gedissocieerd en bij OF1-muizen bij P8 kan verlopen. Als er meer hersenen worden toegevoegd, kan dissociatie niet worden voltooid aan het einde van stap 3.2 en wordt niet-gedissocieerd hersenweefsel gevonden. In dit geval wordt aanbevolen om het NTDK-programma op de buis uit te voeren met niet-gedissocieerd weefsel en de andere buizen op 4 °C te houden.
Verstopte zeef en/of kolom: Zoals eerder beschreven, wordt het dissociatiemengsel berekend voor de maximale hoeveelheid hersenweefsel die tijdens stap 3.5 door de zeef kan gaan. Als er meer hersenen worden toegevoegd, kan de filtratie langer duren, maar uiteindelijk zal het passeren. Het wordt aanbevolen om de celsuspensie op de bovenkant van de zeef zorgvuldig te resuspenderen totdat alle celsuspensie is gefilterd.
Tijdens stap 3.12 moet de experimentator de gelabelde celsuspensie door een kolom in het magnetisch veld laten gaan. De kolom kan in dit stadium van de procedure verstopt raken (1) als er te veel hersenweefsel per buis wordt gedissocieerd, (2) als het resuspensievolume niet correct is, of (3) als er een mechanisch geïnduceerde celdood is (sommige DNA kan aanwezig zijn); in dat geval is het aan te raden om het zichtbare DNA met een tip van 200 μL voorzichtig te verwijderen.
Mechanisch geïnduceerde celdood en/of activering: Het hier beschreven protocol vormt één belangrijke uitdaging: het vermijden van mechanische activering. Om dit te doen, is het van cruciaal belang om voorzichtig te pipetteren en de centrifugatiesnelheid laag te houden. Zo niet, dan kunnen onrijpe microglia sterven als gevolg van de mechanische stress of geactiveerd worden, wat leidt tot een hoge variabiliteit in RT-qPCR-resultaten.
Puin: In deze procedure worden dieren geëuthanaseerd op P8 wanneer de myelinisatie net begint, en daarom is er geen procedure om myeline precies te verwijderen. In dit stadium van ontwikkeling kan myeline gemakkelijk worden verwijderd door centrifugatie. Resuspensievolumes die in deze procedure worden beschreven, worden berekend om de maximale myeline te verwijderen. Als het niet wordt gerespecteerd, kan myeline verschijnen als celresten in kweekputten. De experimentator kan het niet volledig verwijderen wanneer het wordt waargenomen in kweekputten door het medium op dag 2 te veranderen. Microgliale cellen hebben de neiging om dit puin te fagocyteren, wat de microgliale activeringstoestand vóór stimulatie kan beïnvloeden en dus de experimentele reproduceerbaarheid kan beïnvloeden.
Alle eerder beschreven probleemoplossing (dissociatie, verstopte zeef en/of kolom, mechanisch geïnduceerde celdood en/of activering en puin) kan leiden tot variabiliteit in het aantal CD11b+ cellen dat wordt verkregen bij het tellen van cellen (figuur 5B). We raden aan om hier veel aandacht aan te besteden om de uiteindelijke celopbrengst te optimaliseren.
Contaminatie: In dit protocol worden microgliale cellen gekweekt in SFM-medium + 1% P/S. SFM-medium kan gemakkelijk worden verontreinigd. Daarom wordt aanbevolen om het medium na het toevoegen van P / S in buizen van 50 ml te aliquoteren om mediumverontreiniging te voorkomen. Bovendien moeten alle experimenten zoveel mogelijk onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd.
mRNA kwantiteit/kwaliteit: Ons team werkt aan miRNA of siRNA transfecties. Het huidige protocol is zeer compatibel met dergelijke toepassingen met behulp van magnetische transfectie met een kleine wijziging van het protocol; de experimentator moet 700.000 cellen per 12-well plaat oogsten om hoogwaardig mRNA voor RT-qPCR te krijgen. Hoewel RNAseq niet wordt uitgevoerd in de huidige studie, heeft ons team eerder mRNA-extractie uitgevoerd voor RNAseq met behulp van 500.000 cellen per 12-well plaat48.
Kortom, dit protocol kan worden gereproduceerd en het zal naar verwachting een nieuwe standaard zijn voor het isoleren van microglia in een juveniel ontwikkelingsstadium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Figuren zijn gemaakt met Behulp van BioRender. Onderzoek wordt gefinancierd door Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco, en een aanvullende subsidie van Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS en Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti mouse CD11b BV421 | Sony Biotechnology | 1106255 | |
| Anti mouse CD45 BV510 | Sony Biotechnology | 1115690 | |
| Anti mouse CX3CR1 PE Cy7 | Sony Biotechnology | 1345075 | |
| Anti mouse NeuN PE | Milli-Mark | FCMAB317PE | |
| anti mouse O4 Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-120-016 | |
| BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit | BD Biosciences | 554655 | |
| Bovine Serum Albumin | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Confocal microscope | Leica TCS SP8 | ||
| D-PBS (10x) | Thermo Scientific | 14200067 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | |
| Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353043 | |
| Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353072 | |
| Falcon tubes 50 mL | Dutscher | 352098 | |
| Fc blocking reagent (Mouse CD16/32) | BD Biosciences | 553142 | |
| Fluorescence microscope | Nikon ECLIPSE TE300 | ||
| gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes) | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14065049 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14185045 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-rad | 1725006CUST | |
| Iscript c-DNA synthesis | Bio-rad | 1708890 | |
| Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red | Sigma-Aldrich | L2776-1mL | |
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5 | Sigma-Aldrich | L2880 | |
| Macrophage-SFM serum-free medium | Thermo Scientific | 12065074 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
| Mouse IgG1 PE | Millipore | MABC002H | |
| Mouse IgG2a PE Cy7 | Sony Biotechnology | 2601265 | |
| Mouse IL1 beta | Miltenyi Biotec | 130-101-684 | |
| Multi-24 Column Blocks | Miltenyi Biotec | 130-095-691 | |
| MultiMACS Cell24 Separator | Miltenyi Biotec | ||
| Neural Tissue Dissociation Kit - Papain | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| Nucleocounter NC-200 | Chemometec | ||
| Nucleospin RNA Plus XS | Macherey Nagel | 740990.5 | |
| Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
| OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Rat IgG2b, k BV421 | BD Biosciences | 562603 | |
| Rat IgG2b, k BV510 | Sony Biotechnology | 2603230 | |
| REA control (S) PE vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-104-616 | |
| REA control (S) Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-113-445 | |
| Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D System | 485-MI | |
| Recombinant Mouse IL-10 Protein | R&D System | 417-ML | |
| Recombinant Mouse IL-4 Protein | R&D System | 404-ML | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Viability probe (FVS780) | BD Biosciences | 565388 |
References
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
- Wright-Jin, E. C., Gutmann, D. H. Microglia as dynamic cellular mediators of brain function. Trends in Molecular Medicine. 25 (11), 967-979 (2019).
- Hellstrom Erkenstam, N., et al. Temporal characterization of microglia/macrophage phenotypes in a mouse model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 286 (2016).
- Chhor, V., et al. Role of microglia in a mouse model of paediatric traumatic brain injury. Brain, Behavior, and Immunity. 63, 197-209 (2017).
- Van Steenwinckel, J., et al. Decreased microglial Wnt/beta-catenin signalling drives microglial pro-inflammatory activation in the developing brain. Brain. 142 (12), 3806-3833 (2019).
- Chhor, V., et al. Characterization of phenotype markers and neuronotoxic potential of polarised primary microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 32, 70-85 (2013).
- Di Pietro, P., et al. Bisphenol A induces DNA damage in cells exerting immune surveillance functions at peripheral and central level. Chemosphere. 254, 126819 (2020).
- Roque, P. J., Dao, K., Costa, L. G. Microglia mediate diesel exhaust particle-induced cerebellar neuronal toxicity through neuroinflammatory mechanisms. Neurotoxicology. 56, 204-214 (2016).
- Yun, H. S., Oh, J., Lim, J. S., Kim, H. J., Kim, J. S. Anti-inflammatory effect of wasp venom in BV-2 microglial cells in comparison with bee venom. Insects. 12 (4), 297 (2021).
- Nair, S., et al. Lipopolysaccharide-induced alteration of mitochondrial morphology induces a metabolic shift in microglia modulating the inflammatory response in vitro and in vivo. Glia. 67 (6), 1047-1061 (2019).
- Fleiss, B., et al. The anti-inflammatory effects of the small molecule pifithrin-micro on BV2 microglia. Developmental Neuroscience. 37 (4-5), 363-375 (2015).
- Dean, J. M., et al. Microglial MyD88 signaling regulates acute neuronal toxicity of LPS-stimulated microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (5), 776-783 (2010).
- Tang, Y., Wolk, B., Nolan, R., Scott, C. E., Kendall, D. A. Characterization of subtype selective cannabinoid CB2 receptor agonists as potential anti-inflammatory agents. Pharmaceuticals (Basel). 14 (4), 378 (2021).
- Liu, C. P., et al. miR146a reduces depressive behavior by inhibiting microglial activation. Molecular Medicine Reports. 23 (6), 463 (2021).
- Aquino, G. V., Dabi, A., Odom, G. J., Zhang, F., Bruce, E. D. Evaluating the endothelial-microglial interaction and comprehensive inflammatory marker profiles under acute exposure to ultrafine diesel exhaust particles in vitro. Toxicology. 454, 152748 (2021).
- You, J. E., Jung, S. H., Kim, P. H. The effect of Annexin A1 as a potential new therapeutic target on neuronal damage by activated microglia. Molecules and Cells. 44 (4), 195-206 (2021).
- Xie, Z., et al. By regulating the NLRP3 inflammasome can reduce the release of inflammatory factors in the co-culture model of tuberculosis H37Ra strain and rat microglia. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 637769 (2021).
- Ogunrinade, F. A., et al. Zanthoxylum zanthoxyloides inhibits lipopolysaccharide- and synthetic hemozoin-induced neuroinflammation in BV-2 microglia: roles of NF-kappaB transcription factor and NLRP3 inflammasome activation. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 73 (1), 118-134 (2021).
- Fernandez-Arjona, M. D. M., Leon-Rodriguez, A., Lopez-Avalos, M. D., Grondona, J. M. Microglia activated by microbial neuraminidase contributes to ependymal cell death. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 15 (2021).
- Du, S., et al. Primary microglia isolation from postnatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62237 (2021).
- Boccazzi, M., et al. The immune-inflammatory response of oligodendrocytes in a murine model of preterm white matter injury: the role of TLR3 activation. Cell Death & Disease. 12 (2), 166 (2021).
- Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 242 (2018).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L.
- Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
- Harms, A. S., Tansey, M. G. Isolation of murine postnatal brain microglia for phenotypic characterization using magnetic cell separation technology. Methods in Molecular Biology. 1041, 33-39 (2013).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
- Montilla, A., Zabala, A., Matute, C., Domercq, M. Functional and metabolic characterization of microglia culture in a defined medium. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 22 (2020).
- Krishnan, M. L., et al. Integrative genomics of microglia implicates DLG4 (PSD95) in the white matter development of preterm infants. Nature Communications. 8 (1), 428 (2017).
- Bokobza, C., et al. miR-146b protects the perinatal brain against microglia-induced hypomyelination. Annals of Neurology. 91 (1), 48-65 (2021).
- Villapol, S., et al. Early sex differences in the immune-inflammatory responses to neonatal ischemic stroke. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3809 (2019).
- Rosiewicz, K. S., et al. Comparison of RNA isolation procedures for analysis of adult murine brain and spinal cord astrocytes. Journal of Neuroscience Methods. 333, 108545 (2020).
- Fleiss, B., et al.
- Pawelec, P., Ziemka-Nalecz, M., Sypecka, J., Zalewska, T. The Impact of the CX3CL1/CX3CR1 axis in neurological disorders. Cells. 9 (10), 2277 (2020).
- Reynolds, R., Cenci di Bello, I., Dawson, M., Levine, J. The response of adult oligodendrocyte progenitors to demyelination in EAE. Progress in Brain Research. 132, 165-174 (2001).
- Duan, W., et al. Novel insights into NeuN: From neuronal marker to splicing regulator. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1637-1647 (2016).
- Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
- Lee, S., Lee, D. K. What is the proper way to apply the multiple comparison test. Korean Journal of Anesthesiology. 71 (5), 353-360 (2018).
- Chao, C. C., Hu, S., Molitor, T. W., Shaskan, E. G., Peterson, P. K. Activated microglia mediate neuronal cell injury via a nitric oxide mechanism. Journal of Immunology. 149 (8), 2736-2741 (1992).
- Boje, K. M., Arora, P. K. Microglial-produced nitric oxide and reactive nitrogen oxides mediate neuronal cell death. Brain Research. 587 (2), 250-256 (1992).
- Biber, K., Owens, T., Boddeke, E. What is microglia neurotoxicity (Not). Glia. 62 (6), 841-854 (2014).
- Biber, K., Neumann, H., Inoue, K., Boddeke, H. W. Neuronal 'On' and 'Off' signals control microglia. Trends in Neurosciences. 30 (11), 596-602 (2007).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
- Boucsein, C., Kettenmann, H., Nolte, C. Electrophysiological properties of microglial cells in normal and pathologic rat brain slices. European Journal of Neuroscience. 12 (6), 2049-2058 (2000).
- Beutner, C., et al. Unique transcriptome signature of mouse microglia. Glia. 61 (9), 1429-1442 (2013).
- Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, Suppl. 1 117-125 (2009).
- Srivastava, P. K., et al. A systems-level framework for drug discovery identifies Csf1R as an anti-epileptic drug target. Nature Communications. 9 (1), 3561 (2018).
