Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein juveniles Schweinemodell der orthotopen Allotransplantation der linken Lunge, das für die ESLP-Forschung entwickelt wurde. Der Fokus liegt auf Anästhesie- und Operationstechniken sowie kritischen Schritten und der Fehlerbehebung.
Abstract
Die Lungentransplantation ist der Goldstandard bei der Behandlung von Lungenerkrankungen im Endstadium, wobei jährlich weltweit über 4.600 Lungentransplantationen durchgeführt werden. Die Lungentransplantation wird jedoch durch einen Mangel an verfügbaren Spenderorganen eingeschränkt. Daher gibt es eine hohe Sterblichkeit auf der Warteliste. Die Ex-situ-Lungenperfusion (ESLP) hat die Auslastung der Spenderlunge in einigen Zentren um 15 % bis 20 % erhöht. Die ESLP wurde als Methode zur Beurteilung und Rekonditionierung von marginalen Spenderlungen eingesetzt und hat akzeptable kurz- und langfristige Ergebnisse nach der Transplantation von Extended-Criteria-Spenderlungen (ECD) gezeigt. Großtiertransplantationsmodelle (in vivo) sind erforderlich, um laufende In-vitro-Forschungsergebnisse zu validieren. Anatomische und physiologische Unterschiede zwischen Mensch und Schwein stellen erhebliche technische und anästhetische Herausforderungen dar. Ein leicht reproduzierbares Transplantationsmodell würde die In-vivo-Validierung aktueller ESLP-Strategien und die präklinische Bewertung verschiedener Interventionen zur Verbesserung der Spenderlungenfunktion ermöglichen. Dieses Protokoll beschreibt ein porcines Modell der orthotopen Allotransplantation der linken Lunge. Dazu gehören Anästhesie- und Operationstechniken, eine maßgeschneiderte chirurgische Checkliste, Fehlerbehebung, Modifikationen sowie die Vorteile und Grenzen des Ansatzes.
Introduction
Die Lungentransplantation ist die wichtigste Langzeitbehandlung für Lungenerkrankungen im Endstadium. Weltweit werden jährlich über 4.600 Lungentransplantationendurchgeführt1. Allerdings ist die Lungentransplantation derzeit mit erheblichen Einschränkungen verbunden. Zum einen stellt der Bedarf an Organen die verfügbaren Spender immer mehr in den Schatten. Obwohl die Raten von Lungentransplantationen seit 2012 jedes Jahr gestiegen sind, was auf die kombinierten Auswirkungen von mehr Kandidaten für eine Transplantation, einer Zunahme der Anzahl von Spendern und einer verbesserten Verwendung von geborgenen Organen zurückzuführen ist, ist die Sterblichkeit auf der Transplantationswarteliste nicht signifikant gesunken2. Bedenken hinsichtlich der Organqualität stellen eine weitere große Einschränkung dar, wobei die berichteten Organauslastungsraten bei nur 20 % bis 30 % liegen3,4,5. Schließlich sind die Trends bei den postoperativen Ergebnissen der Lungentransplantation weniger als zufriedenstellend, wobei die langfristigen Transplantat- und Patientenergebnisse immer noch hinter denen anderer solider Organtransplantationen zurückbleiben2.
Eine neue Technologie, die Ex-situ-Lungenperfusion (ESLP), hat das Potenzial, diese Einschränkungen abzumildern. Die ESLP wird zunehmend als Methode zur Beurteilung und Rekonditionierung von marginalen Spenderlungen eingesetzt und hat akzeptable kurz- und langfristige Ergebnisse nach der Transplantation von Extended-Criteria-Spenderlungen (ECD) gezeigt 6,7,8,9,10. Infolgedessen hat ESLP die Auslastung in einigen Zentren um 15 % bis 20 % erhöht6,7,8,9,10,11.
Eine ordnungsgemäße ESLP-Forschung erfordert die In-vivo-Validierung von In-vitro-Befunden; Es gibt jedoch nur begrenzte Literatur zu Lungentransplantationsmodellen für ESLP12,13,14,15. Darüber hinaus enthält die verfügbare Literatur nur unzureichende Details zum Anästhesiemanagement von Yorkshire-Schweinen für Lungentransplantationen, die hämodynamisch sehr instabil sein können12,13,14,15. Die Etablierung eines leicht reproduzierbaren Modells würde die In-vivo-Validierung aktueller ESLP-Strategien und die präklinische Bewertung verschiedener Interventionen zur Verringerung von Lungenischämie-Reperfusionsschäden ermöglichen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, ein porcines Modell der orthotopen Allotransplantation der linken Lunge für den Einsatz bei ESLP zu beschreiben. Das Protokoll enthält Beschreibungen der Anästhesie- und Operationstechniken, eine benutzerdefinierte chirurgische Checkliste sowie Details zur Fehlerbehebung und zu Protokolländerungen. Die Grenzen und Vorteile des Modells der Transplantation von Schweinen in der linken Lunge wurden ebenfalls in dieser Arbeit diskutiert. Dieses Manuskript beschreibt weder den Entnahmeprozess von Schweinelungen bei 35-50 kg schweren Yorkshire-Schweinen, noch behandelt es die Etablierung und Beendigung von ESLP. Dieses Protokoll bezieht sich ausschließlich auf die Transplantation des Empfängers.
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Protocol
Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care und dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt. Die Protokolle wurden vom Institutional Animal Care Committee der University of Alberta genehmigt. Dieses Protokoll wurde bei weiblichen jungen Yorkshire-Schweinen zwischen 35 und 50 kg angewendet. Schweine sind keimfreie, lebensmitteltaugliche Exemplare. Sie werden vom Swine Research and Technology Centre in Edmonton, AB, Kanada (https://srtc.ualberta.ca) bezogen. Alle Personen, die an ESLP-Verfahren beteiligt waren, hatten eine angemessene Schulung zur biologischen Sicherheit erhalten.
1. Präoperative Vorbereitungen und Anästhesie
HINWEIS: Schweine werden vor der Operation über Nacht für eine maximale Dauer von 12 Stunden nüchtern gemacht.
- Verabreichen Sie intramuskuläre Injektionen von Ketamin (20 mg/kg) und Atropin (0,05 mg/kg) als Prämedikation für das Empfängerschwein im Operationssaal.
- Legen Sie das Schwein in Rückenlage auf einen beheizten Operationstisch, um die Norrhythmie aufrechtzuerhalten, und fahren Sie mit der Maskeninduktion fort.
- Titrieren Sie die Sauerstoffdurchflussrate entsprechend dem Gewicht des Tieres und dem Anästhesiesystem.
HINWEIS: Der Sauerstofffluss sollte 20-40 ml/kg betragen. - Isofluran mit 4%-5% verabreichen und nach 1-2 min auf 3% reduzieren.
- Bewerten Sie die Tiefe der Anästhesie und stellen Sie sicher, dass das Schwein keinen Rückzugsreflex als Reaktion auf einen schädlichen Reiz hat. Wiederholen Sie dies alle 5 Minuten.
HINWEIS: Wenn eine Schmerzreaktion vorhanden ist, erhöhen Sie den Prozentsatz der Isofluran-Verabreichung, bis die angemessene Anästhesietiefe erreicht ist. In Schritt 10 dieses Abschnitts finden Sie weitere Details zur Erhaltungsanalgesie mit Ketamin und Hydromorphon. Es werden keine Lähmungsmittel verabreicht. Dies ermöglicht die Beurteilung eines Rückzugsreflexes. Ein Nasenkneifen wird als schädlicher Reiz verwendet. - Intubieren Sie das Schwein, sobald die richtige Narkosetiefe bestätigt ist. Verwenden Sie ein spezielles 10-Zoll-Laryngoskop mit flacher Klinge und Endotrachealtuben der Größe 9 oder 10 für Schweine mit einem Gewicht von 40-50 kg.
- Platzieren Sie eine Pulsoximetersonde auf der Zunge (bevorzugt) oder am Ohr und streben Sie eine Sauerstoffsättigung von über 90 % an.
HINWEIS: Die Temperatur wird über eine Nasensonde überwacht. Ein Heizkissen wird verwendet, um die Normothermie aufrechtzuerhalten. - Um die Anästhesie aufrechtzuerhalten, passen Sie den Sauerstofffluss (20-40 ml/kg) und die Inhalationsgasrate (1%-3%) an.
- Halten Sie die Einstellungen des Beatmungsgeräts bei einer Atemfrequenz von 12-30 Atemzügen/min, TV bei 6-10 ml/kg, PEEP bei 5 cm H2 O und Spitzendruck bei 20 cm H2O.
HINWEIS: Ein Standard-Überdruckbeatmungsgerät für die Intensivstation wird verwendet, um ein geschlossenes System für Anästhesie und Beatmung zu schaffen. Die Vitalwerte werden kontinuierlich überwacht und in 15-Minuten-Intervallen aufgezeichnet. ABGs werden alle 15-60 Minuten gezogen, abhängig von der Stabilität des Tieres. Obwohl Fernseher bis zu 10 ml/kg anvisiert werden, werden 6-8 ml/kg erreicht. Abbildung 1 zeigt eine schematische Übersicht über die Unterdruckbeatmung (NPV)-ESLP für das im Labor angewandte Transplantationsprotokoll. - Rasieren, waschen und aseptisch die Inzisionsstelle mit Povidon-Jod vorbereiten.
HINWEIS: Nach der Sedierung mit Ketamin/Atropin umfasst das analgetische Regime die Verabreichung von 3 mg/kg Ketamin i.v. alle 1 h (Bereich 1-3 mg/kg je nach Patientenparametern) und Hydromorphon 0,05 mg/kg i.m. alle 2 h über einen peripher eingeführten IV-Zugang in einer Ohrvene. Jede längere Dauer zwischen den Dosen führt zu einer bahnbrechenden Schmerzreaktion, wie z. B. erhöhter Herzfrequenz und abnormalen Atemmustern / Bauchmuskelbewegungen.
2. Einlegen zentralvenöser und arterieller Zugänge
- Legen Sie eine zentrale Leitung für die Verabreichung von Flüssigkeit und Heparin ein.
HINWEIS: Die gesamte intravenöse Flüssigkeitsgabe wird auf 1 ml/kg/h berechnet, und Flüssigkeitsboli werden PRN verabreicht, um einen MAP-Wert von >60 mmHg aufrechtzuerhalten. Die zentrale Linie wird auch zur Verabreichung von Steroiden, Antibiotika, Vasopressoren und Inotropika verwendet. Siehe Abbildung 2A für die Linienpositionierung.- Bereiten Sie die Haut mit einer Povidon-Jod-Vorbereitungslösung vor und lassen Sie sie vollständig trocknen. Verwenden Sie Elektrokauter, um einen 5-8 cm langen Mittellinienschnitt mittig über der Luftröhre zu machen und sich kranial von der Sternumkerbe aus zu erstrecken.
- Trennen Sie die Haut und das Unterhautfett mit Kauter.
- Teilen Sie die Mittellinienebene zwischen den Bandmuskeln und teilen Sie dann die Bindegewebsschichten, um das linke oder rechte intravaskuläre Bündel der Halsschlagader lateral der Luftröhre zu identifizieren.
- Erhalten Sie eine proximale und distale Kontrolle der Halsvene mit Seidenbändern (Größe 2-0) als Gefäßschlingen.
- Binden Sie die kraniale umschließende Bindung und ziehen Sie die proximale Bindung nach oben zurück, um den Blutfluss zu kontrollieren.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Vene mit einer Metzenbaum-Schere (siehe Materialtabelle), um eine zentrale Leitung mit zwei Anschlüssen und 7 Fr (~1/3 des Umfangs des Gefäßes) aufzunehmen.
- Lösen Sie gleichzeitig die Spannung an der proximalen Gefäßschlinge, kanülieren Sie die Vene und binden Sie sie dann fest, um die Kanüle in einer Tiefe von 10 cm in der Vene zu sichern.
- Spülen Sie den Zugang mit Heparin, schließen Sie ihn an einen IV-Zugang mit 0,9 % normaler Kochsalzlösung an und verabreichen Sie Flüssigkeit, wenn das Schwein durch Dehydrierung intravaskulär erschöpft ist.
HINWEIS: Heparin sperrt alle nicht verwendeten Ports. - Verabreichen Sie 500 mg Methylprednison und 1 g Cefazolin i.v.
- Befolgen Sie die gleichen Techniken, um die Arteria carotis communis mit einem arteriellen 7-Fr-Zugang für ein genaues Blutdruckmanagement zu kanülieren.
3. Beschaffung der linken Lunge
- Positionieren Sie das Schwein in einer rechten seitlichen Dekubitusposition.
- Führen Sie eine linksanterolaterale Thorakotomie durch (Abbildung 2).
- Bereiten Sie die Haut mit einer Povidon-Jod-Vorbereitungslösung vor und lassen Sie sie vollständig trocknen. Markieren Sie den Thorakotomie-Schnitt (20 cm) mit den folgenden Orientierungspunkten: Verwenden Sie Palpation, um die Spitze des linken Schulterblatts zu identifizieren; Identifizieren Sie auch den Processus xiphoideus unterhalb des Brustbeins durch Palpation. Verbinden Sie die beiden wie in Abbildung 2B dargestellt.
- Injizieren Sie insgesamt 10 ml 0,25%iges Bupivacain in die Inzisionslinie und zwei Rippenräume oberhalb und unterhalb der Inzision.
- Verwenden Sie Elektrokauter, um die Haut, die subkutanen Schichten und die Muskelschichten zu präparieren. Der Latissimus dorsi muss geteilt werden. Identifizieren Sie die Rippe direkt unter dem Einschnitt und kauterisieren Sie auf der Oberseite der Rippe, um die Zwischenrippenmuskeln freizulegen und gleichzeitig das neurovaskuläre Zwischenrippenbündel zu vermeiden.
- Verwenden Sie ein Mückenhämostat, um die Zwischenrippenmuskeln direkt über der Rippe zu punktieren, und tasten Sie dann mit einem Finger in der Brust nach Verwachsungen. Schieben Sie die Lunge mit einem Yankauer-Sauger oder Finger weg (siehe Materialtabelle), während Sie entlang der Oberkante der Rippe kauterisieren, um die Thorakotomie zu verlängern.
- Verlängern Sie die Thorakotomie nach vorne, bis sie 1 Zoll vom Brustbein entfernt ist. Verlängern Sie die Thorakotomie posterior auf die paraspinalen Muskeln.
- Setzen Sie einen Cooley-Sternumretraktor ein (siehe Materialtabelle), um die Thorakotomie weit (10 cm) zu öffnen (Abbildung 2C). Ziehen Sie die Lunge zurück, um die linke hemi-azygote Vene freizulegen (Abbildung 2D).
- Die linke Hemiazygosvene wird mit einer Metzenbaum-Schere und einer feinen Lauer-Vene zirkumferentiell präpariert. Umschließen Sie das Gefäß mit Seidenbändern, ligieren und transzieren Sie es dann (Abbildung 2E). Halten Sie eine Seidenkrawatte am proximalen Stumpf für zusätzliche Kontrolle.
HINWEIS: Lauer ist eine rechtwinklige Klemme oder eine Zöliakieklemme, die für die Gewebedissektion verwendet wird. - Sezieren Sie die linke Lungenarterie (PA) und die linken Lungenvenen (PV). Umschließen Sie die Venen zur Kontrolle mit Seidenkrawatten (Abbildung 2F).
HINWEIS: Die oberen PVs sind sehr klein und werden je nach individueller Anatomie an ihren Verzweigungspunkten oder am gemeinsamen Stamm genäht. Der linke Hauptstammbronchus liegt tief im PA und LA (linker Vorhof), so dass er gelegentlich nicht leicht präpariert werden kann, bis die Arterie und die Venen abgeklemmt und durchtrennt wurden (Abbildung 2G). - Verabreichen Sie 5000 Einheiten Heparin IV 5 Minuten vor dem Einklemmen der PA.
HINWEIS: Heparin 5000 Einheiten i.v. wird ebenfalls 5 Minuten vor dem Lösen der PA verabreicht. Für jede weitere Stunde werden 1000 Einheiten IV-Heparin verabreicht. - Klemmen Sie die PA (DeBakey-Kreuzklemme), die linke untere Pulmonalvene (Satinsky-Klemme) und den linken Bronchus (Spoon-Potts-Klemme) einzeln ab (siehe Materialtabelle). Verringern Sie das Tidalvolumen auf 5 ml/kg, sobald der linke Bronchus abgeklemmt ist.
- Durchtrennen Sie die PA, die linke Vena pulmonalis inferior und den linken Bronchus. Lassen Sie mindestens 0,5 cm Taschentuchmanschette zum Nähen bereit. Durchtrennen Sie das linke untere Lungenband und entfernen Sie den linken Lungenflügel.
HINWEIS: Die linke Lunge kann verworfen oder für die Kontrollhistologie aufbewahrt werden.
4. Beendigung des ESLP, Teilung der linken Lunge und Spülung mit Elektrolytlösung
- Klemmen Sie den Beatmungsschlauch bei maximaler Inspiration ein, beenden Sie Perfusion und Beatmung und trennen Sie die Lunge vom ESLP-Gerät.
- Wiegen Sie die Lunge, um das Ausmaß der Ödembildung zu bestimmen.
HINWEIS: Ödeme sind Gewebeschwellungen aufgrund der Ansammlung überschüssiger Flüssigkeit. - Entnehmen Sie eine Gewebebiopsie des akzessorischen Lappens, teilen Sie ihn in drei gleiche Stücke und legen Sie jeweils ein Stück in das Gel: Gel mit optimaler Schnitttemperatur (OCT), Formalin und Schockfrost in flüssigem Stickstoff.
HINWEIS: Dieser Schritt wird in der Regel im Labor des Autors ausgeführt. Die Proben werden dann für zukünftige Analysen aufbewahrt: OCT- und schockgefrorene Proben werden in einem Gefrierschrank von -80 °C aufbewahrt, und Formalinproben werden in einem ordnungsgemäß verschlossenen Behälter aufbewahrt und in 4 °C-Kühlschränken gelagert. Einzelheiten zum spezifischen ESLP-Protokoll und zur Gewebeanalyse werden an anderer Stelle veröffentlicht16. - Trennen Sie die linke Spenderlunge von der rechten Lunge. Lassen Sie 1 cm Spender-PA, 1 cm Spenderbronchus und eine geeignete Spender-LA-Manschette (~0,5 cm im Umfang) an den Empfänger-LA nähen (Abbildung 2H). Lassen Sie den linken inferioren PV und die linken oberen PVs in Kontinuität mit der Spender-LA-Wand, um spätere Anastomosen zu erleichtern.
- Wiegen Sie den linken Lungenflügel.
- Kanülieren Sie die linke PA des Spenders mit einem Tropfensauger, der an eine Infusionsleitung angeschlossen ist, und spülen Sie 500 ml extrazelluläre, kaliumarme Elektrolytkonservierungslösung auf Dextranbasis durch das Lungengefäßsystem. Befestigen Sie die Kanüle während der Spülung mit einem Seidenband in der PA und lassen Sie sie los, wenn die Spülung abgeschlossen ist.
HINWEIS: Die genannten Schritte beziehen sich auf das spezifische ESLP-Gerät, das für diese Arbeit verwendet wird, und sind möglicherweise nicht direkt auf andere Geräte anwendbar.
5. Transplantation der linken Lunge
- Führen Sie die Spenderlunge in die Brust des Empfängers ein, beginnend mit dem unteren Lappen. Zwingen Sie die Lunge nicht in Position.
HINWEIS: Der untere Brustkorb muss möglicherweise nach oben angehoben werden, um die Spenderlunge aufzunehmen, indem der Brustbein-Retraktor angezogen wird. Im Idealfall ist der Empfänger ein paar Kilogramm größer als der Spender, um eine Größenanpassung zu ermöglichen. - Die Bronchialanastomose wird zunächst mit 4-0 Prolen auf einer TF-Nadel durchgeführt (Abbildung 2I).
HINWEIS: Eine laufende End-to-End-Anastomose funktioniert gut. Schneiden Sie vor dem Nähen überschüssige Länge von den beiden Anastomosenenden ab, um ein Abknicken durch überflüssiges Gewebe zu vermeiden. - Führen Sie die LA-Anastomose als zweite mit 6-0 Prolen auf BV-1-Nadeln mit einer laufenden End-to-End-Anastomose durch. Schneiden Sie auch hier überschüssiges Gewebe ab, um ein Abknicken zu vermeiden.
HINWEIS: Der LA ist brüchig und profitiert von der kleinen BV-1-Nadel. Horizontale Bisse am Spender können erforderlich sein, um ausreichendes Gewebe zu erwerben und die Größenabweichung zu korrigieren, die durch das Nähen des Spender-IPV und SPV an der IPV/LA-Öffnung des Empfängers verursacht wird. - Die Spender-SPVs werden in die inferiore PV- und LA-Anastomose integriert, um eine venöse Drainage des linken oberen Lungenlappens zu ermöglichen (Abbildung 2J).
HINWEIS: Die verzweigten oberen Pulmonalvenen (SPVs) haben einen Durchmesser von weniger als 0,5 cm. Der gemeinsame SPV-Trunk ist unterschiedlich lang und nicht routinemäßig vorhanden, was eine direkte Anastomose zwischen Spender- und Empfänger-SPVs zu einer schlechten Option macht. - Beenden Sie die PA-Anastomose mit 6-0 Prolen auf BV-1-Nadeln mit einer laufenden End-to-End-Anastomose. Schneiden Sie auch hier überschüssiges Gewebe ab, um ein Abknicken zu vermeiden.
- Entfernen Sie die Bronchialklemme und erhöhen Sie die TVs auf 10 ml/kg.
- Bestätigen Sie die Heparinisierung, verabreichen Sie eine Kaliumverschiebung (40 mg Furosemid, 10 Einheiten Insulin, 100 ml 25%ige Dextroselösung), öffnen Sie die PA-Klemme teilweise, entlüften Sie und binden Sie die PA-Naht ab. Lösen Sie die PA-Klemme nach 10 min vollständig.
- In der Zwischenzeit entlüften Sie das LA, binden die Nähte ab und entfernen die LA-Klemme.
- Entnehmen Sie eine Reperfusionsblutgasentnahme aus der Mittellinie und eine Reperfusionsgewebebiopsie aus dem linken Mittellappen.
HINWEIS: Um eine Gewebebiopsie zu entnehmen, verwenden Sie eine Seidenkrawatte der Größe 0, um einen 1 cm großen Teil der Mittellappenspitze zu umschließen, binden Sie ihn fest, um das Gewebe zu umgarnen, und schneiden Sie dann den isolierten Teil mit einer Metzenbaum-Schere ab. Teilen Sie die Biopsie in drei gleiche Teile auf und gehen Sie wie zuvor beschrieben vor. - Führen Sie eine Bronchoskopie der linken und rechten Lunge durch, um die Bronchialanastomose zu beurteilen und Sekret abzusaugen. Führen Sie ein Bronchoskop mit einem Adapteranschluss in den Endotrachealtubus ein.
- Schließen Sie das Oszilloskop an die Absaugung an. Schieben Sie das Bronchoskop in den linken Bronchus vor. Untersuchen Sie die Bronchialanastomose (Abbildung 2N). Schieben Sie das Endoskop an den Bronchiolen entlang und saugen Sie die Flüssigkeit ab. Wiederholen Sie den Vorgang auf der rechten Seite.
HINWEIS: Achten Sie darauf, dass die Sauerstoffsättigung nicht unter 90 % fällt. Wenn die Sättigung unter diesen Wert fällt, entfernen Sie das Oszilloskop und lassen Sie den Schweine einige Minuten ununterbrochen lüften, um sich zu erholen.
- Schließen Sie das Oszilloskop an die Absaugung an. Schieben Sie das Bronchoskop in den linken Bronchus vor. Untersuchen Sie die Bronchialanastomose (Abbildung 2N). Schieben Sie das Endoskop an den Bronchiolen entlang und saugen Sie die Flüssigkeit ab. Wiederholen Sie den Vorgang auf der rechten Seite.
- Legen Sie einen formbaren Thoraxschlauch mit 20 Fr ein (Abbildung 2L), schließen Sie die Thorakotomie in drei Schichten (Abbildung 2M) und legen Sie das Schwein in Bauchlage, sobald die arteriellen Blutgase (ABGs) stabil sind (Abbildung 2O).
- Überwachen Sie das Schwein über 4 h in Bauchlage. Führen Sie alle 30 Minuten eine ABG-Analyse durch. Verabreichen Sie stündlich 1000 Einheiten Heparin nach der Reperfusion.
- Entnehmen Sie stündlich eine 10-ml-Blutprobe für die Zentrifugation und die ELISA-Analyse (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) von Entzündungsmarkern16.
HINWEIS: Die Zentrifugationsparameter werden später näher erläutert.
- Entnehmen Sie stündlich eine 10-ml-Blutprobe für die Zentrifugation und die ELISA-Analyse (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) von Entzündungsmarkern16.
6. Beurteilung der isolierten linken Lunge
- Positionieren Sie das Schwein in Rückenlage und bereiten Sie das Brustbein mit Povidon-Jod-Vorbereitungslösung erneut vor. Führen Sie eine Mittellinien-Sternotomie zur abschließenden Beurteilung der isolierten linken Lunge durch (Abbildung 2P).
- Öffnen Sie das linke Pleura mit einer Metzenbaum-Schere und entnehmen Sie eine Gewebebiopsie aus dem linken Unterlappen, wie zuvor beschrieben (HINWEIS zu Schritt 5.9).
- Öffnen Sie das akzessorische Pleura und präparieren Sie die Vena communis mit einer Metzenbaum-Schere.
HINWEIS: Diese wird später geklemmt. - Entnehmen Sie eine Blutprobe aus der LA-Anastomose mit einer 21-G-Nadel. Richten Sie die Nadel in Richtung der linken Lungenvenen und weg vom gemeinsamen linken Vorhof oder akzessorischen Lappenstamm.
- Öffnen Sie das rechte Pleura, um Platz für die rechten Hilarklemmen zu schaffen (siehe Materialtabelle). Präparieren Sie das rechte untere Lungenband bis zum Hilum. Stellen Sie sicher, dass eine Klemme um das Hilum nach oben, unten und anterior gelegt werden kann.
HINWEIS: Dadurch wird sichergestellt, dass das Hilum verschlossen ist und die gesamte Sauerstoffversorgung vom linken Lungenflügel abhängt. Die rechte Lunge wird zu diesem Zeitpunkt nicht beatmet, was sich durch ein fehlendes Aufblasen/Entleeren bei Beatmungsatmung bemerkbar machen sollte. Dazu kann der rechte Unterlappen aus der Brust gehoben werden. - Klemmen Sie die akzessorische Lappenvene mit einer DeBakey-Aortenkreuzklemme (siehe Materialtabelle), um eine akzessorische Lappendrainage in den LA zu verschließen (Abbildung 2Q).
- Klemmen Sie das rechte Hilium und entnehmen Sie die folgenden Blutproben aus der linken PV-Anastomose mit einer 21-G-Nadel, die auf die linke Lunge gerichtet ist: 0 min, 1 min, 2 min, 5 min und 10 min nach dem Abklemmen.
HINWEIS: Es werden fünf Proben entnommen, um einen Trend des Sauerstoffpartialdrucks (PaO2) zu überwachen (Abbildung 2R). Der PaO2 sollte relativ stabil bleiben, um eine ordnungsgemäße Funktion der linken Lunge darzustellen. Fünf Proben bieten auch die Gewähr für eine Qualitätsbewertung, wenn es ein Problem mit der Gerinnung von Proben oder ein Problem mit der ABG-Analyse gibt. - Durchtrennen Sie die Anastomosen und entfernen Sie den linken Lungenflügel. Durchqueren Sie die IVC, um die Euthanasie unter Narkose durch Ausblutung zu beschleunigen.
HINWEIS: Die Gesamtanästhesiezeit für das Empfängerschwein beträgt 8 Stunden. - Wiegen Sie die Spenderlunge, um die Bildung von Ödemen zu beurteilen, und untersuchen Sie sie auf das Gesamterscheinungsbild. Untersuchen Sie die PA, die Bronchus und die LA-Manschette auf Anzeichen von Blutgerinnseln oder anderen Pathologien in der Spenderlunge und dem Mediastinum des Empfängers.
- Führen Sie die abschließenden Gasanalysen durch, zentrifugieren Sie die Perfusatproben und lagern Sie die Gewebebiopsien wie zuvor beschrieben (ANMERKUNG zu Schritt 4.3).
HINWEIS: Die Zentrifugationseinstellungen sind: 112 x g, 9 Beschleunigung, 9 Verzögerung, 4 °C und 15 Minuten Dauer.
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Representative Results
Alle Ergebnisse beziehen sich auf eine 4-stündige Reperfusion nach 12 stündiger NPV-ESLP16. Während der Lungenexplantation sind mehrere klinische Ergebnisse zu erwarten (Abbildung 3). In der Regel bleibt das Schwein nach einer erfolgreichen Explantation der linken Lunge hämodynamisch stabil, kann aber aufgrund einer gefäßerweiternden Reaktion auf die Operation eine niedrig dosierte Infusion von Phenylephrin (Dosisbereich: 2-10 mg/h) benötigen. Die Herzfrequenz sollte ca. 100-120 Schläge pro Minute anstreben, die Atemfrequenz (RR) 8-30 fürSpO2 > 90 %, der mittlere arterielle Druck (MAP) > 60 mmHg, normotherm (38 °C) und das Tidalvolumen (TVs) werden bei Ein-Lungen-Beatmung mit Spitzendrücken von 20-24 cm H2O auf5 ml/kg angestrebt. Bei der Ein-Lungen-Beatmung wurde das Beatmungsvolumen um die Hälfte reduziert, um die linke Lunge vor einer Überfüllung zu schützen. Die Atemfrequenz wurde erhöht, um einen physiologischen endtidalen Kohlendioxidspiegel anzustreben (Abbildung 3). So zeigt Abbildung 3 typische hämodynamische und beatmungstechnische Parameter an kritischen Punkten des Transplantats.
Während der Lungenimplantation sind die folgenden Ergebnisse typisch. Die linke Lunge hat während des ESLP-Laufs Flüssigkeit aufgenommen und erscheint schwerer und größer als die explantierte Lunge. Aus diesem Grund sollte der Empfänger etwas größer sein als der Spender (2-4 kg), damit der Thorax die etwas ödematöse Lunge aufnehmen kann. Die Lunge benötigt sanften Druck, um durch die Thorakotomie in den Brustkorb eingeführt zu werden. Es ist einfacher, zuerst den unteren Lappen und dann den oberen Lappen einzuführen. Der Bronchus ist eine direkte End-to-End-Anastomose und sollte zuerst durchgeführt werden. 4-0 Prolen auf einer TF-Nadel wird empfohlen. Die LA-Manschetten sind sehr brüchig, aber aufgrund der Redundanz und Biegsamkeit des Gewebes nicht allzu schwierig zu nähen. 6-0 Prolene auf BV-1 Nadeln eignen sich gut für die LA-Anastomosen. Die PA ist die letzte durchgeführte Anastomose. Dieses Schiff kann mit wenig Traktion leicht reißen. Wenn sie reißt, ist es möglich, den Herzbeutel zu öffnen und die Klemme zum Nähen proximal in Richtung gesundes Gewebe zu bewegen. Auch hier funktioniert ein 6-0 Prolen auf BV-1-Nadeln gut für diese Anastomose.
Zum Zeitpunkt der Reperfusion wurden die folgenden Trends festgestellt. Sobald der Bronchus gelöst ist und der Fernseher wieder auf 10 ml/kg erhöht wird, beginnt sich der linke Lungenflügel aufzublähen. Obwohl das Ziel bei 10 ml/kg für das Tidalvolumen lag, wurden im Allgemeinen 6-8 ml/kg erreicht, was in den ersten 2-3 Stunden der Reperfusion schrittweise erreicht wird, abhängig vom verwendeten ESLP-Protokoll und der Qualität der implantierten Lunge. In seltenen Fällen kann es zu einem kleinen Luftleck kommen, das mit einem einfachen Stich an der Vorderwand behoben werden kann. Die hintere Wand ist schwieriger zu reparieren und muss verpackt werden. Es sollten große Anstrengungen unternommen werden, um Luftleckagen aus der Bronchialanastomose zu vermeiden. Bei der Bronchoskopie erscheint der rechte Lungenflügel normal und der linke Lungenflügel ist typischerweise ödematös. Die Nahtleitung wird inspiziert und ca. 50-100 ml klare Flüssigkeit werden aus den Atemwegen abgesaugt. Der Fernseher fällt während des Ansaugens deutlich von 300 s auf 20 s ab, daher sollte dieser Vorgang schnell durchgeführt werden, damit sich das Schwein erholen kann. Wenn die arterielle Sättigung unter 90 % fällt, sollte die Bronchoskopie abgebrochen werden, und das Schwein sollte sich über 1-2 Minuten der Beatmung erholen. Das erste arterielle Blutgas (ABG) ist in der Regel normal, da die rechte Lunge gut funktioniert, während sich die linke Lunge erholt.
Die proaktive Verabreichung von Furosemid, Dextrose und Insulin zum Zeitpunkt der Reperfusion dient dazu, einen dramatischen Kaliumanstieg durch intrazelluläre Verschiebung abzumildern. Das Kalium steigt während 60-120 Minuten der Reperfusion vorhersehbar an (Tabelle 1). Tabelle 1 zeigt eine Stichprobe von ABGs über Transplantation mit 4 h Reperfusion nach 12 h normothermer Unterdruckbeatmung (NPV) ESLP. Während der 4-stündigen Reperfusion sind etwa zwei bis vier Schichten erforderlich, um Kalium < 5 mmol/L zu halten. Wenn der Trend nach oben zeigt und als schneller Wechsel zwischen zwei Gasen erscheint, die in 30-Minuten-Intervallen gezogen werden, ist das Ziel K+< 4,5 mmol/L. Die Verschiebungen umfassen 40 mg Furosemid, 100 ml 25%ige Dextrose (D25) und 10 Einheiten normales Insulin, das als IV-Schub über die zentrale Linie verabreicht wird. Gelegentlich benötigt das Schwein nach 30-60 Minuten Reperfusion eine niedrig dosierte Dobutamin-Infusion (1,5-5 μg/kg/min) zusammen mit Phenylephrin (2-10 mg/h), um eine sich entwickelnde vasoplegische Reaktion zu behandeln. Es ist vorzuziehen, Phenylephrin ausschließlich in dieser Situation zu verwenden. Dobutamin kann jedoch ein nützliches zusätzliches Inotrop sein, um einen mittleren arteriellen Druck von mehr als 60 mmHg aufrechtzuerhalten, insbesondere wenn die Herzfrequenz bradykard ist.
Nach dem Verschluss der Thorakotomie und dem Drehen des Schweins in Bauchlage zeigt sich eine Verbesserung der Beatmung und Hämodynamik. Die Modifikation kann drastisch sein und über 5-10 Minuten auftreten, aber gelegentlich dauert die Reaktion 1 h. Das Tidalvolumen nimmt zu, wenn der Druck/das Gewicht von der rechten Lunge genommen wird, und die linke Lunge wird weiterhin mit verbesserter Compliance und Rekrutierung ventiliert. Eine erneute Bronchoskopie kann weiter durchgeführt werden, um die Atemwege nach einer Lageänderung freizumachen. In den folgenden 4 Stunden sinkt der Phenylephrinbedarf, die Fernseher nähern sich dem Zielwert von 10 ml/kg und die ABGs stabilisieren sich (Tabelle 1). Um es noch einmal zu wiederholen: Wenn Fernseher mit einem Gehalt von 10 ml/kg anvisiert werden, werden in der Regel Fernseher im Bereich von 6-8 ml/kg erreicht (Abbildung 3).
Zum Zeitpunkt der abschließenden Untersuchung der isolierten linken Lunge wurde ein stabiles Verhaltensmuster beobachtet. Das Schwein ist in Rückenlage für die Sternotomie hämodynamisch weniger tolerant und benötigt möglicherweise zusätzliche Vasopressorunterstützung. Die Inspektion der linken Lunge zeigt unterschiedliche Grade einer leichten Hyperämie aufgrund einer ischämischen Reperfusionsverletzung (IRI). Die rechte Lunge scheint normal zu sein. Beim Abklemmen des rechten Hilums wird das Schwein sinustachykard (120-140 Schläge pro Minute) und 100 % des Herzzeitvolumens werden in die linke Lunge umgeleitet. Das angestrebte Tidalvolumen wird zu diesem Zeitpunkt nicht verringert, da der gesamte Prozess 10 Minuten dauert. Das Schwein bleibt bis zur 5-Minuten-Marke stabil, aber das Herz kann zwischen 5 und 10 Minuten Kammerflimmern entwickeln, und möglicherweise ist eine manuelle Herzmassage erforderlich, um die Durchblutung des linken Lungenflügels fortzusetzen. Der linke Lungenflügel wird explantiert, gewogen und die Anastomosen werden auf Durchgängigkeit untersucht. Das Schwein stirbt schnell zum Zeitpunkt der Exsanguination, die mit der Explantation der zuvor transplantierten Lunge zusammenfällt.
Eine erfolgreiche Transplantation hat vorhersagbare Ergebnisse nach dem Experiment (Tabelle 1 und Abbildung 4). Abbildung 4 zeigt typische Änderungen des P:F-Verhältnisses und die Ödembildung während des Transplantationsprotokolls. In der Regel erfährt die linke Lunge eine Gewichtszunahme von ca. 35 % (+/-15 %). Zu diesem Gewicht trägt jedoch Restblut im Kreislauf bei. Das PF-Verhältnis sinkt bei der Reperfusion um etwa 100, da die linke Lunge bei der Oxygenierung nicht sofort wirksam ist, aber diese Diskrepanz verbessert sich über 2-3 Stunden. Bei der Beurteilung der isolierten linken Lunge nach 4 h bleibt das PF-Verhältnis stabil oder sinkt leicht. Im Allgemeinen ähnelt das isolierte Gas der linken Lunge nach 10 Minuten der abschließenden Gasanalyse nach 12 h ESLP (Tabelle 1). Dies hängt jedoch vollständig vom verwendeten ESLP-Protokoll und dem Umfang der anfallenden IRI ab. Eine erfolglose Transplantation kann durch eine Gerinnung des LPA verursacht werden, was zu einem Infarkt der Lunge führt, die nicht mit Sauerstoff versorgt wird. Ebenso kann die Dauer der Transplantation die Qualität der reperfundierten Lungenfunktion beeinträchtigen. Eine Implantationsoperation sollte zwischen 30-60 Minuten dauern. Längere Operationen setzen die Spenderlunge einer schädlichen warmen ischämischen Zeit aus, die die ischämische Reperfusionsschädigung verschlimmert und die Ergebnisse des experimentellen ESLP-Protokolls verfälschen kann. Das spezifische ESLP-Protokoll eines bestimmten Experiments kann zu einer nicht funktionierenden Lunge führen, die nach der Transplantation trotz offener Anastomosen nicht mit Sauerstoff versorgt wird. Solche isolierten Gase aus der linken Lunge sind sehr dunkel gefärbt (sauerstoffarm) mit einem niedrigen Sauerstoffpartialdruck (PaO2).
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Protokolls für die Transplantation der linken Lunge eines Schweines. Schematische Darstellung eines 12-stündigen NPV-ESLP-Laufs mit anschließender linker Lungentransplantation bei einem Yorkshire-Schwein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Fotos des Protokolls für die Transplantation der linken Lunge eines Schweines. (A) Platzierung der inneren Halsschlagader und der gemeinsamen Halsschlagader. (B) Thorakotomie-Inzision. (C) Thorakotomie. (D) Linke hemi-azygote Vene. (E) Ligierte linke hemi-azygote Vene. (F) Isolierung der Pulmonalvenen. (G) Geklemmte linke Vorhofmanschette, linker Bronchus und linker Lungenarterie. (H) Linke Spenderlunge mit Pulmonalvenen-, Bronchial- und PA-Manschetten. (I) Anastomose der Pulmonalarterie. (J) Linker Lungenflügel transplantiert und abgeklemmt. (K) Lunge neu positioniert. (L) Thoraxschlauch positioniert. (M) Verschluss der Thorakotomie. (N) Bronchiale Anastomose. (O) Schwein in Bauchlage. (P) Sternotomie. (Q) Zubehörlappen geklemmt (rechter Lungenflügel geklemmt, aber nicht gezeigt). (R) Blutproben aus der linken Pulmonalvene wurden aus der Pulmonalvenenanastomose (Blutung aus der vorherigen Punktionsstelle) entnommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Überwachungs- und Beatmungsparameter für die Transplantation der linken Lunge bei Schweinen. (A) Typische Parameter für den Empfänger vor der Transplantation. (B) Typische Parameter beim Explantat der linken Lunge des Empfängers. (C) Typische Parameter 4 Stunden nach der Transplantation des linken Lungenspenders. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: P:F-Verhältnis und Gewichtszunahme vor und nach der Transplantation. (A) PaO2:FiO2-Verhältnisse während der gesamten Transplantation. (B) Gewichtszunahme der linken Lunge während der Transplantation nach 12 h NPV-ESLP. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Arterielle Blutgase (100% FiO2) | Im lebenden Organismus Empfänger | T0 Reperfusion | T1 Reperfusion | T2-Reperfusion | T3 Reperfusion | T4 Reperfusion | Isolierte Vorklemme für die linke Lunge | Isolierte linke Lunge nach Klemme (0 min) | Isolierte linke Lunge Post-Clamp (1 min) | Isolierte linke Lunge Post-Clamp (5 min) | Isolierte linke Lunge nach Klemme (10 min) |
| Blutgaswerte | |||||||||||
| Ph | 7.402 | 7.327 | 7.284 | 7.402 | 7.421 | 7.479 | 7.504 | 7.399 | 7.371 | 7.423 | 7.435 |
| pCO2 (mmHg) | 47.7 | 57.3 | 56.4 | 36.9 | 35.3 | 35.6 | 34.2 | 45.6 | 48.1 | 40.6 | 36.6 |
| pO2 (mmHg) | 299 | 184 | 165 | 355 | 358 | 300 | 327 | 287 | 207 | 335 | 249 |
| Oximetrie-Werte | |||||||||||
| Hb (g/dl) | 11.2 | 12.5 | 11.3 | 11.6 | 10.3 | - | 17.1 | 11.7 | 13.5 | 16.3 | 13.8 |
| sO2 (%) | 100.1 | 99.2 | 99 | 99.8 | 99.8 | - | 99.9 | 100.2 | 99.7 | 99.8 | 99.9 |
| Elektrolyt-Werte | |||||||||||
| K+ (mmol/L) | 4.5 | 6.2 | 4.4 | 4 | 4.1 | 4.6 | 5.2 | 5.4 | 5.3 | 6.9 | 7.4 |
| Na+ (mmol/L) | 141 | 143 | 140 | 245 | 145 | 144 | 140 | 141 | 139 | 137 | 136 |
| Ca2+ (mmol/L) | 0.99 | 0.88 | 0.81 | 0.74 | 0.66 | 0.61 | 0.36 | 0.98 | 0.42 | 0.36 | 0.38 |
| Cl- (mmol/L) | 97 | 97 | 95 | 101 | 100 | 96 | 91 | 102 | 94 | 91 | 94 |
| Osm (mmol/kg) | 287 | 287.9 | 293.7 | 292.4 | 297.5 | 293.5 | 284.7 | 287.1 | 282.9 | 278.2 | 277.1 |
| Metaboliten-Werte | |||||||||||
| Glukose (mmol/L) | 4,2 | 2.7 | 13.4 | 2.8 | 8.3 | 5 | 5.1 | 4.9 | 4.5 | 4.6 | 4.2 |
| Laktat (mmol/L) | 1.2 | 1.3 | 3.8 | 2.5 | 1.3 | 1.2 | 1.4 | 1.8 | 1.4 | 1.9 | 2.7 |
| Säure-Base-Status | |||||||||||
| HCO-3 (mmol/L) | 29 | 29.1 | 25.9 | 22.4 | 22.5 | 26.1 | 26.7 | 27.6 | 27.1 | 26.1 | 24.1 |
Tabelle 1: Blutgasanalyse nach Transplantation der linken Lunge nach 12 h ESLP. Ca+, Kalzium-Ion; Cl-, Chlorid-Ion; Hb, Hämoglobin; HCO3-, Bicarbonat-Ion; K+, Kalium-Ion; Na+, Natrium-Ion; Osm, Osmolarität; paCO2, arterieller Partialdruck von Kohlendioxid; PaO2, arterieller Partialdruck von Sauerstoff; sO2, Sauerstoffsättigung; isolierte linke Lungenklemme, rechtes Hilum offen; Isolierte linke Lunge nach der Klemmung, 1 Minute nach Klemmung des rechten Hilums.
Ergänzungsdatei 1: Checkliste für die chirurgische Sicherheit bei der Transplantation des linken Lungenflügels. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Dieses Protokoll umfasst mehrere kritische chirurgische Schritte, und eine Fehlerbehebung ist erforderlich, um eine erfolgreiche Transplantation und Lungenbeurteilung zu gewährleisten. Juvenile Schweinelungen sind im Vergleich zu erwachsenen menschlichen Lungen unglaublich empfindlich, so dass der operierende Chirurg beim Umgang mit Schweinelungen vorsichtig sein muss. Dies gilt insbesondere nach einem 12-stündigen ESLP-Lauf, da das Organ Flüssigkeitsvolumen angenommen hat und anfällig für Verletzungen durch übermäßige Manipulation ist. Jeder übermäßige Druck führt zu Atelektase oder Trauma der experimentellen Lunge, was sich auf die Bewertungsergebnisse auswirkt. Ebenso sind die Gefäßstrukturen beim Jungschwein sehr empfindlich. Es ist wichtig, eine Torsion der PA-Klemme zu vermeiden, da dies zu einem Riss oder einer Dissektion der Gewebeschichten führen kann. Ein Riss in der PA erfordert die Öffnung des Perikards, um Zugang zu einem proximaleren Teil der linken PA zu erhalten, der mit der implantierenden Lunge anastomosiert werden kann. Eine DeBakey-Gefäßklemme hat ein niedriges Profil, das gut in das Operationsfeld passt, aber dieses Instrument kann Verletzungen an der empfindlichen PA verursachen, wenn der Chirurg nicht vorsichtig ist. Es ist hilfreich, die Klemme mit einem Seidenband zu fixieren, das an den Vorhängen eingerastet wird, um ein Lösen oder Verdrehen zu verhindern. Kritisch ist auch die Bronchoskopie der transplantierten Lunge nach dem Abklemmen der Bronchialanastomose. Nach 12 Stunden ESLP und Transplantation befindet sich oft Flüssigkeit in den Atemwegen der Spenderlunge. Das Absaugen dieser Flüssigkeit ist wichtig, um eine optimale Wiederherstellung der Funktion der linken Lunge und damit die Beurteilung nach 4 h Reperfusion zu gewährleisten. Nachdem die Bronchoskopie und die erste ABG mit zufriedenstellenden Kaliumwerten zurückgekehrt sind, ist es wichtig, einen Thoraxschlauch einzuführen, den Schnitt zu schließen und das Schwein in Bauchlage zu legen. Die Hämodynamik und Belüftung des Schweins sind in Bauchlage deutlich stabiler, wobei der Brustkorb wieder angenähert ist. Ein erhöhter Kaliumspiegel > 5,5 mmol/l in diesem Stadium birgt das Risiko eines Bradykard-Stillstands und erfordert eine Notfall-Wiedereröffnung und eine manuelle Herzmassage, um die Durchblutung zu unterstützen, was am besten vermieden wird. Aufgrund des signifikanten Risikos einer Hyperkaliämie und eines Bradykard-Stillstands bei der Reperfusion ist es wichtig, serielle ABGs durchzuführen, die bei der Reperfusion beginnen und alle 30 Minuten bis zur 4-stündigen Exblution wiederholt werden. ABGs liefern wichtige Messwerte für die Sauerstoffversorgung, den Partialdruck von Kohlendioxid (PCO2), Kalium und Glukose. Diese vier Komponenten genau zu überwachen und angemessen zu behandeln, ist für ein erfolgreiches Experiment von entscheidender Bedeutung. Eine kontinuierliche Telemetriemessung ist auch wichtig, um T-Wellenspitzen im Zusammenhang mit Hyperkaliämie und der Erwartung einer Bradykardie zu überwachen. In der Endphase des Experiments ist es entscheidend, das rechte Lungenhilum und den akzessorischen Lappen abzuklemmen, bevor endgültige Blutproben aus der LA-Anastomose entnommen werden. Das rechte Hilum versorgt den akzessorischen Lungenlappen mit Blut, und der akzessorische Lappen entwässert neben der linken inferioren Pulmonalvene, oft über einen gemeinsamen Stamm. Der rechte Hilum und der Zubehörlappen müssen separat geklemmt werden, um sicherzustellen, dass keine rechte Lungenfunktion durch Blutvermischung zu den LA-Gasen der Probe beiträgt. Es wird empfohlen, die ABG-Probe der linken Lunge aus der PV-Anastomose oder knapp darüber hinaus zu entnehmen.
Es wurden mehrere Änderungen an diesem Protokoll vorgenommen, zusammen mit einer erheblichen Fehlerbehebung der beschriebenen Methoden. Zunächst wurde versucht, die Implantation mittels medianer Sternotomie durchzuführen; Die Exposition war jedoch aufgrund der Ausrichtung des Schweine-PA, des Bronchus und des LA suboptimal. Der Ansatz wurde erfolgreich durchgeführt, aber bei nachfolgenden Operationen wurde eine Thorakotomie versucht, um die Exposition zu verbessern. Dies erwies sich als ein optisch und technisch überlegener chirurgischer Ansatz. Eine weitere wesentliche Änderung war die Entwicklung und Implementierung einer chirurgischen Sicherheits-/Protokoll-Checkliste (Supplementary File 1). Es gab eine erhebliche Lernkurve für alle beteiligten Teammitglieder, und diese Experimente sind ressourcenintensiv. Es wurde eine Checkliste entwickelt, die die Entwicklung des Kommunikations- und Dokumentenprotokolls anleitet (Ergänzungsdatei 1). Die Checkliste ermöglichte es, das Protokoll für ein schnelleres Lernen zu systematisieren und zu vereinfachen. Auch das Heparinisierungsprotokoll wurde modifiziert. Zwei der ersten zehn durchgeführten Transplantationen litten an einer Ischämie der linken Lunge aufgrund von Gerinnselbildung in der linken PA. Anfänglich wurden 5000 Einheiten Heparin IV 5 Minuten vor der PA-Klemmung und weitere 5000 Einheiten 5 Minuten vor der PA-Abklemmung verabreicht. Die Dosierfrequenz wurde auf 5000 Einheiten pro Stunde nach dem Ausspannen der PA erhöht, und seit der Einführung dieses Ansatzes gab es keine Probleme mit Blutungen oder PA-Gerinnung. Es wurde eine Strategie entwickelt, die weniger Heparin verwendet, um die Kosten zu kontrollieren, mit einer Dosis von 5000 Einheiten IV-Heparin 5 Minuten vor der PA-Klemmung und 5 Minuten vor der teilweisen Abklemmung der PA. Darauf folgen stündlich 1000 Heparin-Boli pro Stunde für den Rest des Falles. Es gab keinen Zugang zur ACT-Analyse, die das genaueste Mittel wäre, um die Angemessenheit der Heparinisierung zu ermitteln.
Das Abklemmen der PA wurde ebenfalls von einem plötzlichen Abklemmen zu einem Ansatz modifiziert, der über 10 Minuten allmählich wieder den vollen Fluss in die transplantierte Lunge einführt. Die linke untere PV- und LA-Manschette bleibt beim Lösen der PA geklemmt, um eine antegrade Entlüftung zu ermöglichen. Der vollständige PA-Fluss erzeugte einen erheblichen Druck auf die empfindlichen LA-Nahtlinien und einen erheblichen Druck innerhalb des Lungengefäßsystems, was schädlich wirkte. Längeres Lösen von PA ermöglicht die vorläufige Entlüftung des LA mit einer allmählichen Erhöhung des Durchflusses im Gegensatz zu einem plötzlichen Lösen und einem plötzlichen Anstieg des Durchflusses. Längeres Lösen schützt die Nahtleitungen und das Lungenendothel vor einem plötzlichen Druckanstieg. Auch bei ESLP trägt ein ischämischer Insult der transplantierten Lunge und der Zelltod zu einer signifikanten Freisetzung von Kalium in den Kreislauf des Schweins nach ischämischer Reperfusion bei. Für die proaktive Behandlung der Hyperkaliämie wurde das Protokoll so modifiziert, dass das Kalium zum Zeitpunkt der Reperfusion präventiv verschoben wurde, indem 40 mg Furosemid i.v., 100 ml 25%ige Dextrose (D25) und 10 Einheiten normales Insulin verabreicht wurden. Dadurch wird das Zielkalium auf den ABGs innerhalb der ersten Stunde der Reperfusion aufrechterhalten, und das Schwein kann früher im Experiment sicher gebeugt werden, was die Transplantatfunktion unterstützt. Aus hämodynamischer Sicht wird das Protokoll so modifiziert, dass Phenylephrin als vorherrschende Vasopressor-Unterstützung verwendet wird. Vasopressin erwies sich als weniger wirksam. Gelegentlich wurde ein niedrig dosierter Tropf von Dobutamin durchgeführt, um das Herzzeitvolumen zu erhöhen, zusammen mit einer Phenylephrin-Infusion zur Aufrechterhaltung des Blutdrucks. Dennoch wird Dobutamin aufgrund seiner arrhythmogenen Eigenschaften sparsam eingesetzt. Abschließend wurde die Beurteilung der isolierten linken Lunge modifiziert. Nach dem Abklemmen des rechten Lungenhilums wurden die LA-Gase zunächst aus dem Körper des LA entnommen, nachdem das Herz-Cephalod angehoben wurde; Die Gasmischung aus der Nebenkeulendrainage in den LA führte jedoch zu falsch hohen PaO2-Messwerten. Nun werden die Proben distal der LA-Anastomosenlinie entnommen, nachdem die rechte Lunge und der akzessorische Lappen einzeln abgeklemmt wurden. Diese Proben werden 0, 1, 2, 5 und 10 Minuten nach dem Abklemmen des rechten Hilums entnommen und stellen eine genauere Darstellung der isolierten linken Lungenfunktion dar. Eine manuelle Herzmassage kann zwischen 5 und 10 Minuten erforderlich sein. Die jüngste Protokollverbesserung betrifft die Anastomosen der oberen Lungenvene (SPV). Anfangs waren die Empfänger-SPVs aufgrund ihres kleinen Kalibers und ihrer Gerinnungsneigung übernäht. Dennoch kam es gelegentlich zu einer Verstopfung des oberen Lappens des Spenders, da die Kollateraldrainage zwischen den Schweinen variabel und unzureichend war. Um hier Abhilfe zu schaffen, wurden die Spender-SPV und IPV in die IPV/LA-Anastomose des Empfängers integriert, wodurch alle Probleme mit der venösen Drainage und der Lungenstauung beseitigt wurden. Dieses Protokoll wird mit zunehmender Erfahrung weiter modifiziert werden.
Es gibt mehrere Einschränkungen bei dieser Methode der Transplantation der linken Lunge. Das Modell wurde nur mit einem Zeitraum von 4 Stunden bewertet, der nur die transplantierte Lungenfunktion in der akuten postoperativen Phase nach 12 h ESLP berücksichtigt. Dieses Protokoll wurde mit Blick auf die Genesung des Tieres entwickelt. In dieser Funktion muss es jedoch noch getestet werden. Die technische Operation erfordert erhebliches chirurgisches Geschick und erfordert einen ausgebildeten Chirurgen oder einen sehr selbstständigen chirurgischen Auszubildenden. Es gibt viele Möglichkeiten, dass fatale Fehler auftreten, die das gesamte Experiment gefährden würden, und die richtige chirurgische Technik ist erforderlich, um solche Gefahren zu vermeiden oder zu beheben. Die einzig richtige Beurteilung der transplantierten Lunge erfolgt ganz am Ende der Reperfusion. Die native rechte Lunge ist in der Lage, den Sauerstoffbedarf des Schweins zu decken und zufriedenstellende ABGs zu produzieren. Wenn die rechte Lunge vollständig am Hilum eingeklemmt ist, wird sie daran gehindert, frischen Sauerstoff, eine frische, sauerstoffarme Blutversorgung und eine sauerstoffreiche Blutdrainage zu erhalten. Dies ist ein entscheidender Moment für die Bestimmung der Funktion der transplantierten linken Lunge, da 100 % des Herzzeitvolumens in die transplantierte Lunge umgeleitet wird, die allein für die systemische Sauerstoffversorgung verantwortlich ist.
Es gibt mehrere Vorteile dieser Methode gegenüber bestehenden/alternativen Methoden. Nach Durchsicht der Literatur12,13,14,15 ist diese Methode die detaillierteste und reproduzierbarste nach einer anfänglichen Lernkurve von 1 oder 2 Schweinen in den Händen eines jungen herzchirurgischen Auszubildenden oder voll qualifizierten Chirurgen. Die Bedienung ist unkompliziert; Die Hämodynamik des Schweins (einschließlich seiner Anfälligkeit für tödliche Arrhythmien) schafft jedoch eine Lernmöglichkeit für diejenigen, die daran gewöhnt sind, erwachsene Menschen zu operieren, die aus kardiopulmonaler Sicht robuster sind. Die Methoden zur isolierten Beurteilung der Funktion der linken Lunge sind zwar kurz, aber einfach durchzuführen und hochgradig reproduzierbar. Insbesondere liefert diese Methodik mehr Details über das Anästhesiemanagement, als derzeit in der Literatur verfügbar ist.
Die In-vivo-Transplantation ist für die ESLP- und Lungentransplantationsforschung unerlässlich. ESLP ist die wichtigste Entwicklung in der Lungentransplantation seit der Einführung von Medikamenten gegen Abstoßungsreaktionen, wobei einige Zentren bereits von den erhöhten Organauslastungsraten profitieren, die diese Technologie ermöglicht 6,7,8,9,10,11,12. Weitere Fortschritte in diesem Forschungsbereich sind erforderlich, um die Sterblichkeit auf der Warteliste zu verringern und die Zugänglichkeit von ESLP-Plattformen zu erweitern. Die In-vitro-Analyse mit ESLP profitiert von der in vivo Bewertung und Bestätigung eines Großtiermodells. Große Tiermodelle, die In-vitro-Befunde bestätigen, sind oft für die Genehmigung klinischer Forschungsstudien für Entwicklungslabore erforderlich. Diese Methode bietet eine zuverlässige und relativ einfache Transplantationsmethode für Labore, die ESLP-Forschung durchführen.
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Disclosures
DHF hält Patente auf Ex-situ-Organperfusionstechnologien und -methoden. DHF und JN sind Gründer und Hauptaktionäre von Tevosol, Inc.
Acknowledgments
Diese Forschung wird im Auftrag der Universitätsklinikstiftung gefördert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABL 800 FLEX Blood Gas Analyzer | Radiometer | 989-963 | |
| Adult-Pediatric Electrostatic Filter HME - Small | Covidien | 352/5877 | |
| Allison Lung Retractor | Pilling | 341679 | |
| Arterial Filter | SORIN GROUP | 01706/03 | |
| Backhaus Towel Clamp | Pilling | 454300 | |
| Bovine Serum Albumin | MP biomedicals | 218057791 | |
| Biomedicus Pump | Maquet | BPX-80 | |
| Bronchoscope | |||
| Cable Ties – White 12” | HUASU International | HS4830001 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C69-500G | |
| Cooley Sternal Retractor | Pilling | 341162 | |
| CUSHING Gutschdressing Forceps | Pilling | 466200 | |
| Debakey-Metzenbaum Dissecting | Pilling | 342202 | |
| Scissors | Pilling | 342202 | |
| DeBakey Peripheral Vascular Clamp | Pilling | 353535 | |
| Debakey Straight Vascular Tissue Forceps | Pilling | 351808 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G5767-500G | |
| Drop sucker | |||
| Endotracheal Tube 9.0mm CUFD | Mallinckrodt | 9590E | |
| Flow Transducer | BIO-PROBE | TX 40 | |
| Infusion Pump | Baxter | AS50 | |
| Inspire 7 M Hollow Fiber Membrane Oxygenator | SORIN GROUP | K190690 | |
| Intercept Tubing Connector 3/8" x 1/2" | Medtronic | 6013 | |
| Intercept Tubing 1/4" x 1/16" x 8' | Medtronic | 3108 | |
| Intercept Tubing 3/8" x 3/32" x 6' | Medtronic | 3506 | |
| Laryngoscope | N/A | N/A | Custom-made with 10-inch blade |
| Metzenbaum Dissecting Scissors | Pilling | 460420 | |
| Medical Carbon Dioxide Tank | Praxair | 5823115 | |
| Medical Oxygen Tank | Praxair | 2014408 | |
| Medical Nitrogen Tank | Praxair | NI M-K | |
| Mosquito Clamp | Pilling | 181816 | |
| Harken Auricle Clamp | |||
| Organ Chamber | Tevosol | ||
| PlasmaLyte A | Baxter | TB2544 | |
| Poole Suction Tube | Pilling | 162212 | |
| Potassium Phosphate | Fischer Scientific | P285-500G | |
| PERFADEX Plus | XVIVO | 19811 | |
| Satinsky Clamp | Pilling | 354002 | |
| Scale | TANITA | KD4063611 | |
| Silicon Support Membrane | Tevosol | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 792519-1KG | |
| Sodium Chloride 0.9% | Baxter | JB1324 | |
| Sorin XTRA Cell Saver | SORIN GROUP | 75221 | |
| Sternal Saw | Stryker | 6207 | |
| Surgical Electrocautery Device | Kls Martin | ME411 | |
| TruWave Pressure Transducer | Edwards | VSYPX272 | |
| Two-Lumen Central Venous Catheter 7fr X2 | Arrowg+ard | CS-12702-E | |
| Vorse Tubing Clamp | Pilling | 351377 | |
| Willauer-Deaver Retractor | Pilling | 341720 | |
| Yankauer Suction Tube | Pilling | 162300 | |
| 0 ETHIBOND Green 1X36" Endo Loop 0 | ETHICON | D8573 | |
| 0 PDS II CP-1 2x27” | ETHICON | Z467H | |
| 1 VICRYL MO-4 1x18” | ETHICON | J702D | |
| 2-0 SILK Black 12" x 18" Strands | ETHICON | SA77G | |
| 4-0 PROLENE Blue TF 1x24” | ETHICON | 8204H | |
| 6-0 PROLENE Blue BV 2x30” | ETHICON | M8776 | |
| 21-Gauge Needle |
References
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