Summary
כאן, אנו מתארים שיטת הדמיה וכימות לכלי גפיים אחוריות של מורין באמצעות טומוגרפיה ממוחשבת מיקרו-רנטגן.
Abstract
כלי הדם הם רשתות מורכבות עם מבנים דמויי עץ, ורשתות כלי דם חיוניות לשמירה על זרימת הדם ושמירה על תפקוד האיברים. הבהרת המנגנון של היווצרות כלי הדם היא אפוא שימושית ביותר להבהרת תהליכים התפתחותיים ומנגנונים פתולוגיים. כלי גב-גפיים מורין משמשים לעתים קרובות כמודל לאנגיוגנזה פיזיולוגית ופתולוגית. ההערכה מתבצעת בעיקר באמצעות שיטה דו-ממדית באמצעות מקטעי רקמות. עם זאת, שיטות להערכת מורפולוגיה כלי דם תלת מימדית (3D) מוגבלות במיוחד. מאמר זה מציג שיטה להדמיה של איברים אחוריים מוריניים באמצעות טומוגרפיה ממוחשבת (CT). שרף אטום קרינה מוזרק דרך אבי העורקים היורד, וכלי דם שלמים מלאים בצבע. על ידי התאמת הזמן של הזרקת צבע, מילוי ספציפי לעורקים אפשרי גם, ודגימות ניתן להשיג עם כל מכשיר CT מיקרו-רנטגן. שיטת ניגודיות זו מספקת טכניקה בסיסית להערכה תלת-ממדית של כלי דם מוריניים בגפיים התחתונות. יתר על כן, שיטה זו יכולה לשמש כדי לדמיין את כל כלי הדם מתחת לסרעפת ולהעריך את כלי הדם באיברי הבטן.
Introduction
כלי דם הם רשתות מורכבות עם מבנים דמויי עץ. אנגיוגנזה ויצירת כלי דם חדשים ממלאים תפקידים חיוניים בשמירה על הומאוסטזיס איברים1. אנגיוגנזה מווסתת לטיפול במחלות איסכמיות וממאירות2. לכן חיוני להבין את המנגנונים הבסיסיים של אנגיוגנזה. כלי דם אחוריים מורין משמשים לעתים קרובות כמודל שימושי למחקר כלי דם3; קשירה ipsilateral של איליאק או עורק הירך הוא מודל איסכמיה אחורית ידועה המשמש להערכת אנגיוגנזה ושיפוץ כלי דם אנגיוגנזה פיזיולוגית ופתולוגית4. עם זאת, ההערכה של אנגיוגנזה מבוצעת בעיקר על ידי כתמי סעיף, ושיטות להערכת מורפולוגיה כלי דם 3D מוגבלות במיוחד.
בהשוואה לכתמי מקטעים, CT מאפשר הדמיה תלת-ממדית. לאחרונה, Weyers ואח ' דיווח פרוטוקול מתוחכם מתאים הדמיה CT, המאפשר הדמיה של מערכת הדם הכלילית למבוגרים murine5. שינינו את השיטה שלהם כדי ליצור שיטת הכנת מדגם המתאימה להדמיית CT של כלי הדם בגפיים התחתונות6. כאן, שרף אטום קרינה מוזרק דרך אבי העורקים היורד, וכלי הדם בגפיים התחתונות מלאים בצבע. על ידי התאמת הזמן של הזרקת צבע, מילוי ספציפי לעורקים אפשרי גם, ודגימות ניתן להשיג עם כל מכשיר טומוגרפיה ממוחשב מיקרו-רנטגן. שיטת ניגודיות זו מספקת טכניקה בסיסית להערכה תלת-ממדית של כלי דם מוריניים מתחת לסרעפת ובאברי הבטן ובגפיים התחתונות.
Protocol
כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת קומאמוטו (התייחסות לאישור לא. M30-040/A2020-105), התואמים את מדריך המכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (פרסום מס '85-23, מתוקן 2011).
1. הכנה
- הכן את מנגנון הזלוף ואת מאגר vasodilator (4 מ"ג / L פפברין הידרוכלוריד, 4 g / L; אדנוזין, 1 g / L; הפרין, 1 U / mL מלוחים חוצצי פוספט (PBS)).
הערה: מכשיר ריפלוקס ורייאגנטים מרחיבי כלי דם זהים לאלה שדווחו על ידי Weyers et al.5. - חברו את הצנתר 22 G, צינור מאריך 2 מ"ל ו-stopcock תלת-כיווני (איור 1A).
הערה: התאם את המד בהתאם לגודל החיה. עבור עכברי C57BL/6 בוגרים, 22 גרם הוא אופטימלי. - מלאו את מנגנון זלוף הלחץ במאגר מרחיב כלי הדם (איור 1A).
הערה: הימנעו מהיווצרות בועות כדי למנוע הפרעה במילוי המדיום הניגודי.
2. זלוף
- הזרקו 1 U/g הפרין ב-PBS לחלל הפנימי 30 דקות לפני הניתוח.
- להרדים לחלוטין את העכבר עם איזופלוריין ולהמית אותו על ידי נקע צוואר הרחם.
- לאחר עריפת הראש, לעשות חתך קו האמצע בעצם החזה ולתקן את בית החזה הפתוח עם סיכות.
הערה: כדי למנוע דליפה של הניגודיות, הימנע מפגיעה בסרעפת. - חותכים את אבי העורקים העולה ומסירים את הלב.
- הסר את הריאה ולחשוף את אבי העורקים היורד.
הערה: אין לפגוע באבי העורקים היורד. - חותכים את אבי העורקים היורד באלכסון כדי לחשוף את חתך הרוחב (איור 1B).
הערה: אין לקלף את אבי העורקים; מקטע אלכסוני עדיף להכנסת קטטר. - הכנס את הצנתר 22 G לתוך אבי העורקים היורד תוך הפעלת מאגר vasodilation.
הערה: החדרת הצנתר בעת הפעלת מאגר vasodilation מונעת זיהום אוויר. - הצמד את שורש הצנתר (איור 1C).
- צור קשר כדי למנוע דליפה עקב זרימה אחורית.
- יש לפזר תמיסה מחוממת של כלי דם (פפברין הידרוכלוריד, 4 גרם/ל'; אדנוזין, 1 ז/ל'; הפרין, 1 U/mL) למשך 3 דקות בלחץ קבוע בין 13 ל-15 kPa.
- Perfuse פתרון של 4% paraformaldehyde ב (PBS) במשך 3 דקות.
הערה: את הצלחת הקיבעון ניתן לאשר על ידי תנועת כף הרגל (איור 1D). - הכינו את מדיום הניגודיות ממש לפני הזלוף.
הערה: התאם את קצב הדילול בהתאם למדגם; עבור עכברים בוגרים, לערבב את הכתם ודילול ביחס של 1:1. - עצרו את הזלוף ומלאו את צינור ההרחבה ב-2 מ"ל של מדיום ניגודיות מדולל (איור 1E).
הערה: יש להזריק את המדיום הניגודי לאט כדי למנוע פגיעה בכלי הדם. - יש לפזר את מדיום הניגודיות בלחץ קבוע בין 13 ל-15 kPa.
- כדי לדמיין עורקים, בדקו את הציפורן כדי לוודא שמדיום הניגודיות הגיע לעורק (איור 1F).
- כדי לדמיין את כל כלי הדם, בדוק את הווריד התחתון של הסרעפת כדי לאשר מחזור מלא של מדיום הניגודיות.
הערה: בהתחלה, הניגודיות מכילה את פתרון vasodilating; לפיכך, זרימת הדם הנכונה שלה היא חיונית.
- סגרו את העצירה התלת-כיוונית והסירו את הצינור (איור 1G).
הערה: אם העצירה התלת-כיוונית אינה סגורה, החדות תזרום אחורה. - לדגור על המדגם לילה ב 4 °C (5 °F).F.
- הסר את העור ולתקן אותו בתמיסת פורמלדהיד 10%.
3. הדמיה
הערה: פרוטוקולי התצוגה החזותית משתנים בהתאם לסורק ה- CT. בפרוטוקול זה נעשה שימוש בסורק CT רנטגן מיקרופוקוס. יש צורך לייעל את שיטת ההדמיה על פי כל סורק CT.
- תקן את המדגם בצינור 50 מ"ל המכיל PBS.
- הנח את צינור הדגימה על השולחן.
- סרוק את הדגימה עם מתח של 50 kV וזרם של 600 μA, מה שמבטיח מרחק מיקוד למרכז של 75.2 מ"מ.
הערה: ממד של 1 voxel היה 28.7 מיקרומטר x 28.7 מיקרומטר x 28.7 מיקרומטר בהגדרה זו. - טען את נתוני התמונה שנרכשו באמצעות פיג'י, פלטפורמת קוד פתוח לניתוח תמונה ביולוגית.
- לקבוע את ערך voxel שריר באמצעות שריר gastrocnemius.
- בחר את שריר gastrocnemius באמצעות הכלי מלבן .
- בדוק את הממוצע ואת סטיית התקן (SD) מההיסטוגרמה (לנתח | היסטוגרמה).
- הגדר את צפיפות voxel שרירים כממוצע + 2SD של שריר gastrocnemius.
- הגדר את צפיפות voxel השריר כרמת הסף התחתונה (תמונה | להתאים | | סף הגדר | רמת סף נמוכה יותר).
הערה: אזור כלי הדם ואזור העצם נשארים בנתונים הבינוניים לאחר קביעת הסף.
Representative Results
ניתן לדמיין את כל כלי הדם בגפיים התחתונות אם פרוטוקול זה מבוצע כראוי (איור 2A). במודל איסכמיה של הגפיים האחוריות, עורק הירך הלא קשור פועל במקביל לווריד הירך (איור 2B), ועורק ירך קשור יכול להיות מאושר על ידי הפרעה של מדיה ניגודית (איור 2C). התוצאות חשפו התפתחות של כלי שיט נלווים (איור 2D). זרימת הדם הסביבתית נוצרת בין העורקים הפרוקסימליים לעורק הקשור ולעורק באזור הרגל התחתונה ובצדדים הגחוניים והגביים של עורק הירך. עורק העכוז התחתון המתחיל בצד הגבי של האגן ופועל בצד הרוחבי של הירך - מתרחב בחוזקה בצד האיסכמי.
כלים מלאים בניגודיות מלאים במדיום הניגודיות (איור 2E); ההפרעה בניגוד מצביעה על ערבוב של מדיה לא-קונטרסטית (למשל דם, מאגר מרחיב כלי דם או בועות) או זלוף לא מספיק של הניגודיות (איור 2F). Vasodilatation וקיבעון לא יעבוד טוב אם כלי הדם התכווצו. למרות שהדמיה CT יכולה רק לדמיין את המדיום הניגודי, ניתן לראות את העורקים על פני השטח של הגוף על ידי תצפית מקרוסקופית או סטריאומיקרוסקופית (איור 2G). לכן, קל יותר להעריך פגמים באמצעות המדיום הניגודי (איור 2H).
איור 1: מתווה ההליך. (A) מנגנון זלוף לחץ וצנתר 22 G המחוברים באמצעות צינור מאריך 2 מ"ל ופסק זמן תלת-כיווני. (ב) אבי העורקים העולה נחתך באלכסון כדי לחשוף את חתך הרוחב (חץ צהוב). (ג) הצנתר תוקן באמצעות שני סיכות (חצים צהובים). (ד) הגפיים התחתונות הקבועות נמשכות על פי קיבעון (חצים צהובים). (ה) הזרקת ניגודיות דרך עצירה משולשת. כיוון ההזרקה מצוין על ידי חץ צהוב. (ו) הציפורן האחורית מלאה בניגודיות (חץ צהוב). (ז) העצירה סגורה ומוסרת ממנגנון הזלוף. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונות של כלי שיט. (א) תמונה שלמה של העצמות והכלים האחוריים. (ב) עורק הירך (חץ אדום) וריד (חץ כחול). (ג) עורק הירך הכרוך (חץ צהוב). הפריפריה נקטעת על ידי החסימה (קו מנוקד צהוב). (ד) כלי נלווה בצד הכרוך (חצים צהובים). הקו המקווקו הצהוב מייצג את עורק הירך שנקטע. (ה) מדגם מלא היטב של העורק הספני (חץ אדום) וריד (חץ כחול). (ו) זלוף לקוי מוביל להפרעה של כלי סאפינוס (קו מנוקד צהוב). (ז) תצפית סטריאומיקרוסקופית של מדגם מייצג. עורק הירך הימני (חץ צהוב) מלא במדיום ניגודיות. (H) תצפית סטריאומיקרוסקופית של מדגם כושל. עורק הירך הימני (חץ צהוב) חסר בינוני ניגודיות. סרגלי קנה מידה = 1 מ"מ (B-F), 2 מ"מ (G, H), 10 מ"מ (A). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
דו"ח זה מציג שיטה מתוחכמת לדמיין כלי דם בפלג הגוף התחתון. ישנם מספר שלבים קריטיים בתהליך זה: הראשון הוא preperfusion לפני הזרקת מדיום ניגודיות. אם לא יוסר מספיק דם, הניגודיות לא תמלא את המערכת. בנוסף, הכללת בועות אוויר מפריעה למילוי הניגודיות; לפיכך, יש להסיר לחלוטין את האוויר במעגל. יתר על כן, מכיוון שמדיום הניגודיות אינו מתמצק מיד לאחר ההזרקה, אין להזיז את המדגם יתר על המידה.
שיטה זו שימושית כדי להעריך את היווצרות מוגברת של כלי דם ומחזור הדם, כגון זרימת הדם בטחונות. לעומת זאת, כמגבלה, קשה להעריך כלי דם מצומצמים, שכן קשה להבחין בין היצרות לבין ירידה מלאכותית במדיום ניגודיות. בנוסף, זה מאתגר להעריך את כלי הדם בעצמות, כמו ההפרדה של דם ועצמות קשה.
שיטה חלופית להדמיה תלת-ממדית היא חיסון. באמצעות טכניקת ניקוי הרקמות, מספר שיטות זמינות עבור הדמיה 3D7. חיסון הוא יתרון כפי שהוא מאפשר כתמים של חלבונים ספציפיים באמצעות נוגדנים. דו"ח שנערך לאחרונה מאתגר הדמיה לכל הגוף בהתבסס על חיסון8; עם זאת, הדמיה מבוססת CT אינה דורשת טיפול מקדים לניקוי רקמות.
שיטה זו מאפשרת הדמיה של כל כלי הדם מתחת לסרעפת, כולל איברי הבטן. אנגיוגנזה באיברי הבטן יש השפעה חזקה על שמירה על הומאוסטזיס ופיתוח מחלות9,10. כמו פרוטוקול זה היה מותאם להערכה של כלי הגפיים התחתונות, פרימינג ספציפי לאיברים יאפשר הדמיה של אנגיוגנזה הקשורים לכל גורם, כגון דלקת או גידולים.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
Acknowledgments
אנו מודים ליסויו קימורה, מגומי נגהירו וסאקו טוקונאגה על התמיכה הטכנית המצוינת בניסויים בבעלי חיים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | TERUMO | SS-01T | |
| 10% Formalin Solution | Fujifilm-Wako | 068-03841 | |
| 10x phosphate-buffered saline (-) (PBS) | Fujifilm-Wako | 163-25265 | Prepare 1x PBS |
| 22 G catheter (22 G S5 x 1" V(F)) | MEDIKIT | HP2140 | Only catheter is used. |
| 23 G needle | TERUMO | NN-2325R | Use as a pin |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Fujifilm-Wako | 163-20145 | |
| 5 mL syringe | |||
| 5-0 Suture with needle | Alfresa Pharma Corporation | ER1205SB45 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251-5G | For vasodilating solution |
| Dumont #55 Forceps | FST | No.11255-20 | |
| Extension tube | TOP | X2-FL50 | |
| Falcon 50 mL tube | CORNING | 352098 | |
| Graefe Forceps | FST | No.11051-10 | |
| Heparin Sodium 5,000 units/5 mL | Mochida Co. Ltd. | 224122458 | |
| Isoflurane | Fujifilm-Wako | 099-06571 | |
| Microfil Injection Compounds | Flow Tech Inc. | MV-117 | Mix liquid MV-Compound (stain) and MV-Diluent 1: 1 |
| Papaverine hydrochloride | Fujifilm | 164-18002 | For vasodilating solution |
| Small Animal Anesthetizer | Muromachi Kikai Co. Ltd. | MK-A100ecoW-ST | |
| Spring Scissors - Angled to Side | FST | No.15006-09 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | FST | No.14001-12 | |
| three-way cock | TERUMO | TS-TR1K | |
| Transfer pipette | SAMCO SCIENTIFIC | SM262-1S | Use for mixing contrast medium |
| X-ray CT scanner | Toshiba IT & Control Systems Corporation | TOSHIBA TOSCANNER 32300 FPD |
References
- Folkman, J.
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS One. 8 (12), 84047 (2013).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
- Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. Retrograde perfusion and filling of mouse coronary vasculature as preparation for micro computed tomography imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3740 (2012).
- Arima, Y., et al. Evaluation of collateral source characteristics with 3-dimensional analysis using micro-X-ray computed tomography. Journal of the American Heart Association. 7 (6), 007800 (2018).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Fernandez, M., et al.
- Li, S., et al. Angiogenesis in pancreatic cancer: current research status and clinical implications. Angiogenesis. 22 (1), 15-36 (2019).
